Articolo metodologico

Generazione di retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane

DOI:

10.3791/66246

⸱

22 dicembre 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Senior Department of Ophthalmology, The Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital, 3Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Radiation Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive un sistema di induzione retinica neurale 3D ottimizzato che riduce l'adesione e la fusione degli organoidi retinici con elevata ripetibilità ed efficienza.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La retinopatia è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo. Indagare la sua patogenesi è essenziale per la diagnosi precoce e il trattamento tempestivo della retinopatia. Sfortunatamente, le barriere etiche ostacolano la raccolta di prove da parte degli esseri umani. Recentemente, numerosi studi hanno dimostrato che le cellule staminali pluripotenti umane (PSC) possono essere differenziate in organoidi retinici (RO) utilizzando diversi protocolli di induzione, che hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening dei farmaci e le terapie basate sulle cellule staminali. Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato per generare la retina neurale (NR) che riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione, aumentando il tasso di successo della produzione fino al giorno 60. Basato sulla capacità delle PSC di auto-riorganizzarsi dopo la dissociazione, combinata con alcuni fattori complementari, questo nuovo metodo può guidare in modo specifico la differenziazione delle NR. Inoltre, l'approccio è semplice, conveniente, mostra una notevole ripetibilità ed efficienza, presenta prospettive incoraggianti per modelli personalizzati di malattie retiniche e fornisce un abbondante serbatoio cellulare per applicazioni come la terapia cellulare, lo screening farmacologico e i test di terapia genica.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'occhio funge da fonte primaria di informazioni tra gli organi sensoriali umani, con la retina che è il principale tessuto sensoriale visivo negli occhi dei mammiferi1. La retinopatia è una delle principali cause globali di malattie oculari, che porta alla cecità2. Circa 2,85 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di vari gradi di disabilità visiva a causa della retinopatia3. Di conseguenza, indagare la sua patogenesi è fondamentale per una diagnosi precoce e un trattamento tempestivo. La maggior parte degli studi sulla retinopatia umana si è concentrata principalmente su modelli animali 4,5,6. Tuttavia, la retina umana è un tessuto complesso e multistrato che comprende vari tipi di cellule. I tradizionali sistemi di coltura cellulare bidimensionale (2D) e i sistemi di modelli animali in genere non riescono a ricapitolare fedelmente il normale sviluppo spazio-temporale e il metabolismo farmacologico della retina umana nativa 7,8.

Recentemente, le tecniche di coltura 3D si sono evolute per generare organi simili ai tessuti da cellule staminali pluripotenti (PSCs)9,10. Gli organoidi retinici (RO) generati da PSC umane in un sistema di coltura in sospensione 3D non solo contengono sette tipi di cellule retiniche, ma mostrano anche una struttura stratificata distinta simile alla retina umana in vivo 11,12,13. Gli RO umani derivati da PSC hanno guadagnato popolarità e ampia disponibilità e sono attualmente i migliori modelli in vitro per lo studio dello sviluppo e della malattia della retina umana14,15. Negli ultimi decenni, numerosi ricercatori hanno dimostrato che le PSC umane, comprese le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), possono differenziarsi in RO utilizzando vari protocolli di induzione. Questi progressi hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening farmacologico e le terapie basate sulle cellule staminali 16,17,18.

Tuttavia, la generazione di retina neurale (NR) da cellule staminali pluripotenti umane (PSC) è un processo complesso, ingombrante e dispendioso in termini di tempo. Inoltre, le variazioni da lotto a lotto negli organoidi tissutali possono portare a una minore riproducibilità dei risultati19,20. Numerosi fattori intrinseci ed estrinseci possono influenzare la resa degli organoidi retinici (RO), come il numero o la specie di cellule di partenza e l'uso di fattori di trascrizione e composti a piccole molecole 21,22,23. Da quando il primo RO umano è stato generato dal laboratorio Sasai11, nel corso degli anni sono state proposte molteplici modifiche per migliorare la facilità e l'efficacia del processo di induzione 13,21,24,25. Purtroppo, ad oggi, non è stato stabilito alcun protocollo gold standard per la generazione di RO in tutti i laboratori. In effetti, c'è un certo grado di discrepanza negli RO risultanti da diversi metodi di induzione, così come un'ampia variazione nell'espressione dei marcatori retinici e nella robustezza della loro struttura22,26. Questi problemi possono complicare gravemente la raccolta dei campioni e l'interpretazione dei risultati dello studio. Pertanto, è necessario un protocollo di differenziamento più consolidato e robusto per massimizzare l'efficienza con una minima eterogeneità di generazione di RO.

Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato basato su una combinazione di Kuwahara et al.12 e Döpper et al.27 con istruzioni dettagliate. Il nuovo metodo riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione degli organoidi, aumentando il tasso di successo della generazione di NR. Questo sviluppo è molto promettente per la modellazione delle malattie, lo screening dei farmaci e le applicazioni di terapia cellulare per i disturbi della retina.

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Protocollo

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Questo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico Istituzionale dell'Ospedale Generale Cinese del PLA. La linea ESC WA09 (H9) è stata ottenuta dall'Istituto di Ricerca WiCell.

1. Terreni di coltura e preparazione dei reagenti

  1. Terreno di coltura ESC umano e soluzione di passaggio
    1. Terreno di mantenimento (MM): Preparare 500 mL di MM completo (terreno basale + supplemento 5x; vedere la tabella dei materiali) in modo asettico. Scongelare 5 volte l'integratore a temperatura ambiente (RT) o per una notte a 2-8 °C. Mescolare bene prima dell'uso fino a quando l'integratore non è privo di torbidità.
    2. Matrice extracellulare (ECM) all'1%: utilizzare un puntale per pipette pre-raffreddato e provette sterili per erogare 200 μL di ECM (vedere la tabella dei materiali) per provetta su ghiaccio. Conservare le provette in un congelatore a -20 °C. Sciogliere l'ECM su ghiaccio e diluire con DMEM/F12 preraffreddato a 1:100.
    3. 0,5 mM pH = 8,0 EDTA: Per preparare 500 mL di EDTA 0,5 mM, aggiungere 500 μL di EDTA 0,5 M e 0,9 g di NaCl a 500 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) (vedi Tabella dei materiali). Mescolare accuratamente e conservare a 2-8 °C.
  2. Mezzo di differenziazione retinica
    1. Terreno chimicamente definito privo di fattore di crescita (gfCDM): preparare il gfCDM combinando il 45% di GlutaMAX di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM-GlutaMAX), il 45% di F12-GlutaMAX di prosciutto (F12-Glutamax), il 10% di sostituzione del siero knockout (KSR), l'1% di concentrato lipidico di colesterolo e 450 μM di tioglicerolo (vedere la tabella dei materiali).
  3. Composti di piccole molecole
    1. Y-27632 2HCl: Aggiungere 50 mg di polvere di Y-27632 a 3,122 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Erogare e conservare Y-27632 (vedere la tabella dei materiali) ad una concentrazione di 50 mM a -80 °C per 2 anni, al riparo dalla luce. Diluire lo stock 2.500 volte (20 μM) per l'uso, equivalente a 0,4 μL di Y-27632 per mL di gfCDM.
    2. IWR1-endo: Aggiungere 2,4424 mL di DMSO per sciogliere 10 mg di IWR1-endo (vedere la tabella dei materiali) per ottenere una soluzione madre di 10 mM. Dosare le aliquote e conservarle a -80 °C per un massimo di 2 anni. Aggiungere 0,3 μL di 10 mM IWR1-endo per mL di gfCDM per la concentrazione di 3 μM per induzione.
    3. SB431542: Per preparare 50 mM SB431542, aggiungere 10 mg di SB431542 (vedi Tabella dei materiali) a 0,5203 mL di DMSO e mescolare accuratamente. Conservare a -80 °C in solvente per un massimo di 2 anni. Per la preparazione di SB431542 a una concentrazione di lavoro di 10 μM, aggiungere 2 μL della soluzione madre 50 mM a 10 mL di gfCDM.
    4. LDN-193189 2HCl: Sciogliere 5 mg di LDN-193189 2HCl (vedere la tabella dei materiali) in 10,4297 mL di DMSO per ottenere 1 mM di soluzione madre. Conservare a -20 °C o -80 °C (come raccomandato dal produttore). Aggiungere 0,1 μL di materiale ogni 10 mL di gfCDM, ottenendo 100 nM di LDN-193189 per l'induzione.
    5. Proteina morfogenetica 4 dell'osso umano ricombinante (BMP4): ricostituita a 50-200 μg/mL in HCl 4 mM (vedi Tabella dei materiali). Conservare a 2 °C a 8 °C per 1 mese o a -20 °C per 1 anno dopo la ricostituzione. Eseguire l'induzione di NR utilizzando 1,5 nM BMP4.
  4. Terreno di coltura NR a lungo termine
    1. Acido retinoico (RA): Misurare 6 mg di polvere di RA (vedere la tabella dei materiali) e aggiungere a 3,9941 mL di DMSO. Conservare in aliquote di 5 mM a −80 °C e consumare entro 3 mesi. Per ottenere una concentrazione di lavoro di 0,5 μM, aggiungere 10 μL della miscela principale a 100 mL di mezzo di differenziazione della retina neurale (NRDM). Aggiungere poco prima dell'uso.
      NOTA: Tenere al riparo dalla luce durante la preparazione e la conservazione.
    2. Taurina: aggiungere la polvere di taurina (vedi Tabella dei materiali) del peso di 200 mg a 7,9904 mL di DMSO per ottenere una soluzione madre di 200 mM. Erogare e conservare a 2-8 °C. Una concentrazione di lavoro di 0,1 mM di taurina si ottiene aggiungendo 50 μL della soluzione madre per 100 mL di NRDM.
    3. NRDM: Comporre NRDM con DMEM/F12-GlutaMAX medium, integratore di N2 all'1%, siero bovino fetale al 10%, AR 0,5 mM e taurina 0,1 mM (vedere la tabella dei materiali). Conservare a 2-8 °C per un massimo di 2 settimane o 6 mesi a -20 °C per garantire l'attività dei componenti.
  5. Tampone bloccante: Diluire 1:9 con DPBS per ottenere una soluzione di lavoro al 10% per l'uso (vedi Tabella dei Materiali). Conservare a -20 °C per un massimo di 5 anni.
    NOTA: Eseguire tutte le altre procedure in una cabina di biosicurezza di Classe II per garantire la sterilità, ad eccezione della pesatura. Se è necessaria l'aggiunta di reagenti pesati durante il processo di preparazione, utilizzare filtri da 0,22 μm per la filtrazione.

2. Coltura di H9-ESC

  1. Scongelamento degli H9-ESC
    1. Aggiungere 1 mL di ECM all'1% a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare per 1 ora in incubatrice a 37 °C in atmosfera con il 5% di CO2 .
      NOTA: Evitare l'aggiunta di ECM lungo le pareti del pozzetto, perché potrebbe attaccarsi alla superficie.
    2. Prelevare un materiale crioviale H9-ESC dal serbatoio di azoto liquido e agitarlo rapidamente in acqua a 37 °C per 30 s.
      NOTA: Non lasciare che il flaconcino si scongeli completamente.
    3. Rimuovere il flaconcino e sterilizzarlo accuratamente con alcol spray disinfettante al 75%. Aggiungere l'H9-ESC scongelato dal crioviale a una provetta da 15 mL contenente 9 mL MM con 10 μM Y-27632.
    4. Centrifugare la provetta a 190 × g per 5 minuti a RT. Rimuovere con cautela la maggior parte del surnatante con una pipetta da 1 mL, lasciando circa 50 μL di surnatante per evitare la perdita di cellule.
    5. Aggiungere 1 mL di MM contenente 10 μM di Y27632 al sedimento cellulare e risospendere delicatamente il sedimento cellulare con una pipetta da 1 mL pipettando su e giù 5-10 volte.
    6. Rimuovere il rivestimento ECM dopo 1 ora di incubazione. Aggiungere 2 mL di MM preriscaldato contenente 10 μM Y-27632 a ciascun pozzetto.
    7. Erogare 0,5 mL di sospensione cellulare per pozzetto. Agitare delicatamente la piastra lateralmente per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.
    8. Incubare la piastra a 37 °C con il 5% di CO2 per almeno 24 ore senza toccarla.
    9. Cambiare il mezzo ogni giorno. Quando la densità del clone raggiunge il 70% e oltre, è necessario il passaggio.
  2. Passaggio di H9-ESC
    1. Preparare la piastra rivestita con ECM come descritto sopra (passaggio 2.1.1) e aggiungere 2 mL di MM per pozzetto.
    2. Rimuovere il terreno esausto dalle piastre a 6 pozzetti. Lavare ogni pozzetto due volte con 1 ml di DPBS.
    3. Lavare ogni pozzetto due volte aggiungendo lentamente 1 mL di EDTA e incubando con 1 mL di EDTA per 4-7 minuti a RT.
      NOTA: Durante l'incubazione, esaminare la piastra a 6 pozzetti per 3 minuti al microscopio. Procedere immediatamente al passaggio successivo se la maggior parte delle cellule sta per staccarsi dalla capanna. Evitare l'incubazione prolungata per ridurre l'impatto negativo sulle cellule.
    4. Eliminare l'EDTA e aggiungere 1 mL di MM per interrompere la digestione.
    5. Picchiettare delicatamente la piastra del pozzetto fino a quando la maggior parte delle cellule non si è staccata.
    6. Trasferire con cautela la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL con una pipetta da 5 mL. Risospendere delicatamente le colonie H9-ESC su e giù per 3-5 volte per mescolarle con una pitetta di Pasteur. Trasferire 20-100 μL di sospensione cellulare in una nuova piastra di coltura a 6 pozzetti rivestita con ECM e agitarla avanti e indietro.
    7. Quando la densità cellulare è rilevata come sufficiente al microscopio, incubare la piastra a 37 °C con il 5% di CO2 per almeno 24 ore senza toccarla.
    8. Cambia il supporto ogni giorno. Al 70% di densità del clone e oltre, è necessario il passaggio.

3. Generazione di NR umani

NOTA: Una volta che le colonie raggiungono circa il 70% di confluenza, possono essere indirizzate verso la differenziazione in organoidi retinici (RO) utilizzando i passaggi procedurali descritti nella Figura 1.

  1. Giorno 0 - Formazione del corpo embrioide (EB)
    1. Dopo aver lavato le cellule con 2 mL di DPBS, aggiungere 0,5 mL di CDS (vedere la tabella dei materiali) contenente 20 μM Y27632 al pozzetto. Incubare per 3 minuti a 37 °C in incubatore umidificato al 5% di CO2 .
      NOTA: Controllare al microscopio. Ridurre il più possibile il tempo di incubazione per evitare effetti dannosi sulle cellule.
    2. Interrompere la digestione aggiungendo 3 mL di MM contenente 20 μM Y27632. Centrifugare a 190 × g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
    3. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di gfCDM contenente 20 μM Y27632 e contare le cellule. Aggiungere il volume corrispondente per 1,2 × 106 cellule (1,2 × 104 cellule per pozzetto) a 10 mL di gfCDM, che è pre-incorporato con 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 e 100 nM LDN-193189 (vedere la tabella dei materiali).
    4. Aggiungere 100 μL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di pozzetti conici con fondo a 96 V. Mettere la piastra in un'incubatrice umidificata al 5% di CO2 fino al giorno 6.
      NOTA: Non spostare le stoviglie per almeno 24 ore per migliorare l'aderenza degli EB.
  2. Giorno 6 - Induzione della retina
    1. Il giorno 6, aggiungere 10 mL di gfCDM contenente 55 ng/mL di BMP4 per consentire un cambio completo del terreno di coltura sugli EB. Rimettere la piastra nell'incubatrice.
      NOTA: Pipettare verso le pareti del pozzetto conico con fondo a 96 V per evitare bolle d'aria. Evitare di prendere organoidi quando si cambia il terreno.
    2. Effettuare il cambio semi-medio il giorno 9, il giorno 12 e il giorno 15. Sostituire metà del terreno con gfCDM fresco per diluire gradualmente il BMP4.
  3. Giorno 18 - Cultura NR a lungo termine
    1. Il giorno 18, trasferire con cura gli EB formati in provette da centrifuga da 15 mL utilizzando pipette Pasteur da 5 mL e risciacquare delicatamente con NRDM. Trasferire gli EB su piastre a 6 o 24 pozzetti a basso adsorbimento (vedere la tabella dei materiali). Rimettere la piastra nell'incubatrice.
    2. Sostituire il terreno con NRDM fresco ogni 3 giorni.
      NOTA: Spegnere la luce durante il cambio del fluido perché l'AR è sensibile alla luce. Rimuovere gli organoidi mal differenziati e separare gli organoidi aderenti al microscopio.

4. Analisi delle NR umane

  1. Montaggio degli RO
    1. Selezionare diverse generazioni di H9-ESC per indurre tre lotti di RO.
      NOTA: Per valutare il tasso di successo dell'induzione, vengono calcolate tre piastre del numero di NR di formatura per ciascuno dei tre metodi valutati (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 e il metodo modificato nel presente studio). L'induzione è considerata efficace se la microscopia ottica rivela la formazione di strutture simili a quelle neuroepiteliali al giorno 30.
  2. Colorazione immunofluorescente di RO
    1. Trasferire 3-5 RO in provette da 1,5 mL. Pipettare il terreno in eccesso e lavare gli RO una volta con 1 mL di DPBS a RT. Lasciare che gli RO affondino e rimuovere con cautela i DPBS. Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% (vedere la tabella dei materiali) per provetta da 1,5 mL e fissare a 4 °C.
      NOTA: RO il giorno 6 e il giorno 18, fissare 2 ore. Fissare per 12 ore il giorno 30 e 14 ore il giorno 60.
    2. Dopo la fissazione, disidratare con alcool a gradiente. Lasciare riposare gli RO per 15 minuti ciascuno con alcol al 50%, 60% e 70% e successivamente per 10 minuti ciascuno con alcol all'80%, 90%, 95%, 100% e 100%. Quindi, aggiungere una miscela 1:1 di alcol al 100% e xilene per 10 minuti, seguita da xilene due volte per 10 minuti ciascuna.
    3. Posizionare gli RO in stampi metallici riempiti di paraplasto fuso (vedi Tabella dei materiali) per 40 minuti, quindi spegnere gli stampi su ghiaccio per fissare gli RO. Posizionare le scatole da incasso negli stampi e congelarle a -20 °C per una notte. Successivamente, staccare con cautela le scatole da incasso. Infine, conservali presso RT.
    4. Creare sezioni continue (spessore 5 μm) con un'affettatrice per paraffina. Fissare le fette sui vetrini del microscopio di adesione, asciugarle e conservarle a RT.
    5. Eseguire la deceratura e la reidratazione prima della riparazione dell'antigene12,27.
    6. Aggiungere 10 mL di soluzione per il recupero dell'antigene citrato 20x pH 6,0 (vedere la tabella dei materiali) a 190 mL di ddH2O (H2O a doppia distillazione). Scaldare nel microonde in modalità alta per 4 minuti fino all'ebollizione. Dopo aver aggiunto le sezioni di paraffina, riscaldare le sezioni in modalità bassa per 20 minuti per completare la riparazione dell'antigene.
    7. Lasciare raffreddare naturalmente le sezioni di paraffina in un'area ventilata e poi metterle in una camera umida.
    8. Usa un pap pen (vedi Tabella dei materiali) per delineare le sezioni. Incubare con Triton X-100 allo 0,2% a RT per 30 minuti per rompere le membrane, quindi lavare i vetrini tre volte con TPBS, per 5 minuti ciascuno.
    9. Bloccare con siero d'asina al 10% diluito in DPBS a RT per 1 ora in camera umida con 10 μL per area di colorazione.
    10. Aggiungere gli anticorpi primari diluiti in siero d'asina al 10%. Incubare per una notte a 4 °C in camera umida. Lavare i campioni tre volte con TPBS per 10 minuti ciascuno per rimuovere l'anticorpo non legato.
      NOTA: Gli anticorpi primari sono i seguenti: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulina III (1: 250) e anti-NESTIN (1: 200) (vedi Tabella dei materiali).
    11. Incubare con anticorpi secondari diluiti in DPBS per 1 ora a RT in camera umidificata. Ripetere la fase di lavaggio con TPBS tre volte per 10 minuti ciascuna.
      NOTA: Tenere al buio per evitare l'estinzione dell'anticorpo secondario fluorescente. Gli anticorpi secondari sono Alexa Fluor 488 coniugato con IgG anti-topo asino e Alexa Fluor 568 coniugato con IgG anti-coniglio asino ad una diluizione di 1:400 (vedi Tabella dei materiali).
    12. Incubare con DPBS contenente DAPI (1: 500; vedere la tabella dei materiali) per 10 minuti a RT al buio. Lavare tre volte con TPBS per 10 minuti ciascuna.
    13. Far cadere una quantità adeguata di sigillante antifluorescente (vedere la tabella dei materiali) sul vetrino e coprire con i vetrini di copertura.
    14. Visualizzare utilizzando un analizzatore quantitativo di cellule tissutali a flusso (vedere la tabella dei materiali) o simile.
    15. Conservare i vetrini a -20 °C al buio dopo l'analisi microscopica.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una panoramica grafica del protocollo modificato è mostrata nella Figura 1. Le H9-ESC sono state utilizzate per generare RO quando le cellule sono state cresciute fino a una densità del 70%-80%. Sospensioni a cella singola di H9-ESC in 96 pozzetti conici con fondo a V si sono aggregate il giorno 1 e hanno formato EB rotondi ben circoscritti entro il giorno 6. Con l'aumentare del tempo di coltura, il volume degli EB è aumentato gradualmente. Il giorno 30, le strutture simili a neuroepiteliali...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli RO umani possono ricapitolare spazialmente e temporalmente lo sviluppo della retina fetale e i RO precoci mostrano un alto grado di somiglianza con la retina fetale a stadi equivalenti di sviluppo15. In termini di morfologia tissutale ed espressione molecolare, l'RO umana rispecchia da vicino l'effettivo stato di crescita del tessuto retinico, offrendo opportunità straordinarie e senza precedenti nei campi della modellazione delle malattie, dello screening dei farmaci e della medicina rigenera...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,01 M TPBSServicebioG0002Lavaggio fette
4% ParaformaldeideServicebioG1101-500MLFissare organoidi retinici
5 mL PipettaPasteur NEST Biotechnology318516Pipetta organoidi retinici
96 pozzetti conici con fondo a VSumitomo BakelitMS-9096VZ
Vetrini per microscopio ad adesioneCITOTEST188105Fette fisse
AggreWell mediumSTEMCELL Technologies5893
Etanolo medio anidroSINOPHARM10009218Disidratare 
Anti-CHX10Santa Cruzsc-365519Anticorpo primario
antidissolvenzaZSGB-BIOZLI-9556
Anti-KI67Abcamab16667Anticorpo primario
Anti-NESTINSigmaN5413Anticorpo primario Anti-neuronale
di classe III β-Tubulina (TUJ1)BeyotimeAT809Anticorpo primario
Anti-PAX6Abcamab195045Anticorpo primario
Soluzione di dissociazione cellulare (CDS)STEMCELL Technologies7922Dissociazione cellulare
CHIR99021SelleckchemS2924GSK-3&alfa;/β Concentrato
lipidi per colesteroloGibco12531018250&volte;
Soluzione per il recupero dell'antigene citratoServicebioG1202-250ML20×, pH 6.0
CS10STEMCELL Technologies1001061Terreno di congelamento cellulare
DAPIRoche10236276001Controcolorante nucleare
Dimetil solfossido (DMSO)SigmaD2650
DMEM/F12Gibco11330032Medium
DMEM/F12-GlutaMAXGibco10565018Asino medio
anti-topo Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32766Anticorpo secondario
Asino anti-coniglio Alexa Fluor 568InvitrogenA10042Anticorpo secondario
Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA)BiosharpBL518A0,5 M, pH 8,0, dissociazione cellulare
Matrice extracellulare (ECM)Corning354277Piastre di rivestimento
F12-GlutamaxGibco31765035
Siero fetale bovinoGibcoA5669701
Analizzatore quantitativo di cellule tissutali a flussoTissueGnosticsTissueFAXS PlusSezioni di scansione
IMDM-GlutaMAXGibco31980030Medium
IWR1-endoSelleckchemS7086inibitore
WntGibcodi ricambio 10828028
LDN-193189 2HClSelleckchemS7507Inibitore BMP
Piastre a 24 pozzetti a bassa adesioneCorning3473
Piastre a 6 pozzetti a bassa adesioneCorning3471
Terreno di manutenzione (MM)STEMCELL Technologies85850Integratore di
N2medio Gibco17502048
Siero d'asino normaleSolarbioSL050Tampone bloccante
ParaplastLeica39601006Inclusione tissutale
PBS pH 7.4 basico (1x)GibcoC10010500BTSenza Ca+,Mg+
Proteina morfogenetica ossea umana riconbinante-4(rhBMP4)R& D314-BPFattore proteico chiave
Acido retinoicoSigmaR2625Polvere, tenere al riparo dalla luce
SB431542SelleckchemS1067ALK5-inibitore
SU5402SelleckchemS7667Inibitore della tirosin-chinasi
Super PAP PenZSGB-BIOZLI-9305
TaurinaSigmaT0625-10G
TiogliceroloSigmaM1753
Triton X-100SigmaX100Permeabilizzazione
WA09 linea di cellule staminali embrionaliWiCell Research InstituteLinea cellulare
XileneSINOPHARM10023418Decerazione
Y-27632 2HCLSelleckchemS1049ROCK-inibitore
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Riferimenti

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