Occlusione LAD attivata da remoto utilizzando un catetere a palloncino in topi che respirano spontaneamente

Sommario

Questo articolo presenta una tecnica unica a torace chiuso per indurre il danno da ischemia-riperfusione miocardica (IRI) nei topi. Il metodo presentato consente ai topi di respirare spontaneamente mentre inducono a distanza l'ischemia miocardica. Ciò fornisce l'accesso all'animale per studiare i processi dinamici di ischemia e riperfusione in situ e in tempo reale tramite imaging non invasivo.

Abstract

L'infarto miocardico acuto (AMI) è una condizione cardiovascolare diffusa e ad alta mortalità. Nonostante i progressi nelle strategie di rivascolarizzazione per l'IMA, spesso porta a danno da ischemia-riperfusione miocardica (IRI), amplificando il danno cardiaco. I modelli murini fungono da strumenti vitali per studiare sia il danno acuto che il rimodellamento miocardico cronico in vivo. Questo studio presenta una tecnica unica a torace chiuso per l'induzione remota dell'IRI miocardica nei topi, consentendo lo studio della fase molto precoce dell'occlusione e della riperfusione utilizzando l'imaging in vivo come la risonanza magnetica o la PET. Il protocollo utilizza un metodo di occlusione remota, che consente un controllo preciso sull'inizio dell'ischemia dopo la chiusura del torace. Riduce i traumi chirurgici, consente la respirazione spontanea e migliora la coerenza sperimentale. Ciò che distingue questa tecnica è il suo potenziale per l'imaging simultaneo non invasivo, inclusi gli ultrasuoni e la risonanza magnetica (MRI), durante gli eventi di occlusione e riperfusione. Offre un'opportunità unica per analizzare le risposte dei tessuti quasi in tempo reale, fornendo informazioni critiche sui processi durante l'ischemia e la riperfusione. Sono stati condotti test sistematici approfonditi di questo approccio innovativo, misurando i marcatori di necrosi cardiaca per l'infarto, valutando l'area a rischio utilizzando la risonanza magnetica con mezzo di contrasto e colorando gli infarti nella fase di maturazione della cicatrice. Attraverso queste indagini, è stato posto l'accento sul valore dello strumento proposto nell'avanzamento degli approcci di ricerca al danno da ischemia-riperfusione miocardica e nell'accelerazione dello sviluppo di interventi mirati. I risultati preliminari che dimostrano la fattibilità della combinazione del protocollo sperimentale innovativo proposto con tecniche di imaging non invasive sono qui presentati. Questi risultati iniziali evidenziano il vantaggio dell'utilizzo della culla per animali appositamente costruita per indurre a distanza l'ischemia miocardica e contemporaneamente condurre scansioni MRI.

Introduzione

L'infarto miocardico acuto (IMA), una condizione cardiovascolare globale prevalente, è associato ad alti tassi di mortalità e morbilità¹. Nonostante i progressi tecnologici che hanno consentito strategie di rivascolarizzazione precoci ed efficaci per i pazienti con infarto miocardico, i pazienti continuano a manifestare un danno da ischemia-riperfusione miocardica (IRI) dopo questi interventi². Pertanto, è fondamentale comprendere i meccanismi fondamentali e formulare approcci per mitigare l'IRI. L'IRI rappresenta uno stato fisiopatologico complesso che coinvolge una moltitudine di intricati processi biologici. Questi comprendono la morte cellulare regolata, le risposte allo stress ossidativo, l'infiammazione, la guarigione delle ferite, la fibrosi e il rimodellamento ventricolare. I modelli animali, come i topi, sono stati di grande importanza per la ricerca IRI e sono ampiamente utilizzati grazie al loro rapporto costo-efficacia, alla rapida riproduzione e alla ricchezza di informazioni meccanicistiche provenienti dai modelli transgenici³.

Questo protocollo presenta una tecnica innovativa per indurre a distanza l'IRI in topi che respirano spontaneamente con un torace chiuso, imitando più da vicino la patologia umana. L'occlusione remota è stata ottenuta utilizzando un catetere a palloncino posizionato a una certa distanza dal miocardio per occludere l'arteria discendente anteriore sinistra (LAD). Questo approccio offre un accesso continuo al cuore pulsante nei momenti esatti dell'occlusione e della riperfusione, facilitando le modalità di imaging simultanee, tra cui l'ecografia o la risonanza magnetica (MRI). Questi metodi non invasivi potrebbero fornire informazioni cruciali sulle risposte tissutali prima, durante e dopo gli eventi di occlusione e riperfusione.

Esistono varie tecniche chirurgiche per indurre l'IRI in modelli murini. Il trauma chirurgico derivante dalla toracotomia in modelli di legatura coronarica a torace aperto innesca una risposta immunitaria che influisce su diversi meccanismi associati all'ischemia e alla riperfusione. L'attivazione del sistema immunitario innato ha il potenziale per influenzare l'estensione dell'infarto del miocardio⁴. La tecnica adattata proposta fornisce un potenziale approccio per esplorare il pre e postcondizionamento miocardico e possibilmente ridurre l'impatto della risposta immunitaria innata al trauma chirurgico negli studi IRI murini riducendo al minimo il periodo di tempo del torace aperto a un massimo di 5 minuti. Inoltre, la tecnica di nuova concezione potrebbe anche contribuire a ridurre le sequele pro-infiammatorie causate dal danno polmonare indotto dal ventilatore⁵. Tuttavia, gli effetti combinati di questo nuovo metodo a torace chiuso richiederebbero ulteriori indagini approfondite.

La convalida approfondita della tecnica proposta è stata condotta confrontandola con il metodo tradizionale, che prevede l'esposizione del LAD attraverso la dissezione chirurgica del torace e l'occlusione indotta dalla legatura per 30 minuti. Sono stati confrontati i risultati di entrambe le tecniche, che includevano misurazioni della troponina che riflettevano le dimensioni dell'infarto cardiaco, valutazioni dell'area a rischio utilizzando la risonanza magnetica con aumento del contrasto al gadolinio, la colorazione istologica con tripfenil tetrazolio cloruro (TTC) e la determinazione delle dimensioni finali della cicatrice tramite la colorazione Sirius Red (SR). Il risultato dimostra la robustezza e l'efficacia dell'approccio proposto per lo studio del danno da ischemia-riperfusione in modelli murini.

Protocollo

Questo protocollo sugli animali è stato approvato ed è conforme alle linee guida e ai regolamenti stabiliti dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale (ECD) dell'Università Cattolica di Lovanio. Tutte le politiche sviluppate dall'ECD locale seguono le normative dell'Unione Europea relative al benessere degli animali da laboratorio come dichiarato nella Direttiva 2010/63/UE. Tutti i test descritti di seguito sono stati eseguiti su topi maschi C57BL/6 di 8-12 settimane (peso corporeo = 20-23 g). Gli esperimenti acuti rappresentano animali che sono stati immediatamente sacrificati dopo l'intervento chirurgico. Gli esperimenti di sopravvivenza hanno rappresentato un follow-up di quattro settimane, compresa la misurazione della troponina, la risonanza magnetica e la colorazione SR.

1. Anestesia e intubazione endotracheale

1. Somministrare farmaci pre-anestesia utilizzando una miscela di ketamina (7,5 mg/kg; Nimatek 100 mg/mL), xilazina (1 mg/kg; Rompun, 20 mg/mL) e acepromazina (0,1 mg/kg; Placivet, 10 mg/mL) (KXA) (vedi Tabella dei materiali) con diluente salino allo 0,9% per via intraperitoneale. Ciò consente un'intubazione più fluida e meno invasiva.
2. Posizionare il topo in una camera di induzione (vedi Tabella dei materiali) e invocare l'anestesia utilizzando isoflurano al 2,5% in ossigeno puro con una portata di 1 L/min fino alla perdita del raddrizzamento e al riflesso di pizzicamento delle dita.
3. Trasferire l'animale su un cuscinetto riscaldato (±38 °C) e posizionarlo supino con la testa rivolta verso il chirurgo. Fissare la coda e le zampe anteriori con del nastro adesivo sul pad. Assicurarsi che gli arti anteriori non siano eccessivamente tesi, in quanto ciò può compromettere la respirazione.
4. Posizionare una sutura di seta 2-0 (vedi Tabella dei materiali) attorno agli incisivi superiori e fissare la sutura sul bordo del cuscinetto per tendere il topo. Se necessario, collegare un portaaghi per mantenere la tensione sulla sutura. Mantenere l'animale anestetizzato utilizzando isoflurano al 2% in ossigeno al 100% con un flusso di 1 L/min utilizzando un cono nasale.
5. Posizionare una fonte di luce appena rostrale dello sterno, rimuovere il cono nasale e posizionare l'apporto di isoflurano sul ventilatore. Intubare il topo usando una pinza sollevando la lingua verso l'alto e tenendo in mano un laringoscopio autocostruito per sollevare ulteriormente la parte basale della lingua e visualizzare le corde vocali.
6. Posizionare un tubo tracheale autocostruito utilizzando un catetere da 18 G su un ago smussato tra le corde vocali. Sollevare il catetere, estrarre l'ago smussato e collegare il tubo con il ventilatore per topi (vedere Tabella dei materiali).
7. Utilizzare un connettore a forma di Y modificato (vedere la Tabella dei materiali) per collegare il tubo di intubazione al ventilatore. Il corretto posizionamento del tubo tracheale può essere confermato giudicando l'espansione simmetrica del torace.
8. Impostare il volume corrente (mL) al peso corporeo (BW) (g) x 7 e la velocità di ventilazione a 53,5 x (BW (g)^-0,26) colpi al minuto e, se necessario, regolarlo in base al peso corporeo di un particolare mouse⁶ (ad esempio, per un mouse da 25 g il volume corrente è 175 mL a 140 colpi al minuto).
9. Ridurre l'isoflurano all'1% in ossigeno al 100%, poiché l'animale rimarrà anestetizzato a causa della premedicazione. Tuttavia, valutare regolarmente la profondità dell'anestesia eseguendo un pizzicamento delle dita dei piedi. Adattare la concentrazione di isoflurano in base alla profondità dell'anestesia.
10. Applicare una goccia di unguento oftalmico per prevenire la secchezza durante l'anestesia.

2. Installazione dello strumento IRI

NOTA: Rimuovere tutto il nastro adesivo e posizionare l'animale sulla piastra di base dell'utensile IRI appositamente costruito. I dettagli sulle proprietà dello strumento IRI sono menzionati nel file supplementare 1.

1. Fissare la piastra di base dello strumento IRI remoto appositamente costruito in posizione laterale davanti al chirurgo. Fissa la coda e le zampe usando del nastro adesivo. Fissare la testa utilizzando la sutura di seta 2-0 attorno agli incisivi superiori per evitare movimenti accidentali (Figura 1).
2. Inserire la sonda termica rettale (vedi Tabella dei materiali) per monitorare la temperatura corporea e utilizzare una lampada riscaldante a infrarossi sopra l'animale per mantenere la temperatura intorno ai 37 °C. Prestare attenzione a una distanza sufficiente tra l'animale e la lampada per evitare il surriscaldamento.
3. Posizionare gli elettrodi dell'ago ECG in tutte e quattro le zampe per osservare e registrare la frequenza cardiaca e la forma d'onda dell'ECG. Fissare la sonda rettale e gli elettrodi ECG alla piattaforma utilizzando del nastro adesivo.
4. Applicare la crema depilatoria sul lato sinistro del torace per rimuovere i peli e creare un campo chirurgico chiaro.
   NOTA: Limitare il tempo di applicazione e prestare attenzione alla completa rimozione della crema per evitare ustioni chimiche.

3. Toracotomia

1. Eseguire la preparazione asettica della pelle utilizzando la soluzione di betadina, quindi posizionare un telo chirurgico sul torace sinistro per garantire un ambiente sterile. Utilizzare attrezzature sterilizzate per eseguire la procedura. Praticare un'incisione cutanea verticale nella parte centrale del muscolo pettorale a circa 1 cm di lunghezza e a 2 mm di distanza dal bordo sternale sinistro.
2. Sputa il muscolo pettorale per esporre le costole sottostanti. Evitare lesioni accidentali all'imbarcazione. Se si verifica sanguinamento, utilizzare applicatori di cotone per fermare qualsiasi sanguinamento.
3. Visualizza le costole e identifica gli spazi intercostali osservando il polmone che si gonfia attraverso la parete toracica sottile e semitrasparente. Aprire la cavità toracica utilizzando le forbici chirurgiche praticando un'incisione di 6-8 mm nel terzo spazio intercostale. Assicurarsi che l'incisione si trovi a una distanza minima di 2 mm dal bordo sternale in cui si trova l'arteria toracica interna.
4. Inserire un piccolo speculum per l'occhio di ratto (vedi Tabella dei materiali) nello spazio intercostale. Questo funzionerà come un divaricatore di costole (Figura 1A).
5. Sollevare delicatamente il pericardio con una pinza curva e separarlo.
6. Metti un pezzetto di cotone sopra il polmone e spingi delicatamente verso il basso.

4. Preparazione LAD

1. Il LAD appare di colore rosso vivo e corre dall'aorta sotto il padiglione auricolare sinistro verso l'apice. Il posizionamento ideale per la legatura è di circa 2 mm più basso della punta del padiglione auricolare sinistro. Utilizzare il tronco polmonare come marcatore per identificare il padiglione auricolare sinistro e ottimizzare la visualizzazione LAD utilizzando l'afflusso di luce (Figura 2).
2. Utilizzare un ago conico per far passare una sutura in polipropilene 7-0 attorno al LAD. Non posizionare l'ago troppo in profondità, in quanto può entrare nel ventricolo sinistro, né troppo superficiale, in quanto può danneggiare la LAD.
3. Rimuovere il pezzetto di cotone e controllare se il polmone sinistro è ancora ventilato.
4. Rimuovere il divaricatore delle costole.
5. Assicurarsi che la sutura abbia una lunghezza minima di 15 cm su entrambe le estremità. Taglia l'ago.
6. Posizionare un pezzo di tubo PE-50 da 1 mm su un pezzo di tubo PE-10 da 15 mm (vedi Tabella dei materiali). Guidare entrambe le estremità della sutura attraverso il tubo in PE-10 e spostare il tubo in PE con l'estremità più spessa contro il cuore.

5. Chiusura del torace ed estubazione

1. Applicare un po' di gel di acido fusidico sullo spazio intercostale aperto e lasciare defluire delicatamente l'aria intratoracica rimanente ostruendo brevemente il deflusso del ventilatore. È possibile aggiungere ulteriore gel di acido fusidico alla parte esterna del tubo in PE per impedire l'ingresso di aria nel torace.
2. Chiudere il muscolo pettorale con un punto X in polipropilene 5-0 sopra e sotto il livello del tubo PE e assicurarsi che la parte ispessita del tubo PE sia al di sotto del livello del muscolo.
3. Chiudere la pelle con due punti X in polipropilene 5-0 sopra e due sotto il tubo in PE (Figura 1B e Figura 3).
4. Con il torace chiuso, l'animale può respirare di nuovo spontaneamente. Svezzare l'animale dal ventilatore riducendo lentamente il volume corrente e la frequenza respiratoria. Quando l'animale inizia a respirare, scollegare spontaneamente con cautela il tubo del ventilatore, ma tenerlo in posizione fino a quando non si osserva un modello di respirazione stabile.
5. Collegare l'alimentazione di isoflurano con un ogiva posizionato sopra il naso dell'animale e fissato sulla piastra di base.

6. Montaggio dello strumento IR remoto

1. Posizionare la parte laterale verticale nella piastra di base inserendola nelle fessure.
2. Utilizzare un gancio sottile per recuperare le due estremità della sutura e tirarle attraverso il foro centrale nella parte laterale dietro il palloncino (vedi Tabella dei materiali).
3. Guidare una delle estremità delle suture sopra e intorno al palloncino. Proseguire con l'altra estremità della sutura sotto e intorno al palloncino. Applicare il gel di acido fusidico per una guida più fluida della sutura.
4. Guidare le estremità della sutura attraverso le fessure sulla parte superiore della parte laterale. Sulla parte distale della sutura, applicare un peso di 2,1 g per mantenere in posizione ciascuna estremità della sutura (Figura 1C e Figura 4).
   NOTA: La configurazione dei pesi appropriati è soggetta a modifiche e deve essere testata in anticipo. Per ulteriori informazioni, vedere la Figura 1 supplementare e il File 1 supplementare . La progettazione remota dell'utensile IRI è fornita nella Figura 2 supplementare.

7. Induzione di ischemia e riperfusione

1. Indurre l'ischemia gonfiando prontamente il palloncino utilizzando la pompa vascolare a palloncino fino a 2 bar. Bloccare la pompa. Controllare visivamente se il palloncino è gonfiato e i pesi sono sollevati (Figura 4).
2. Confermare l'ischemia osservando il cambiamento nel tracciato ECG.
3. Lasciare il palloncino gonfiato per il tempo stabilito secondo il protocollo di studio specifico (30 minuti negli esperimenti presentati).
4. Arrestare l'occlusione semplicemente sbloccando la pompa. Sgonfiare accuratamente il palloncino. Controllare visivamente se il palloncino è sgonfio e i pesi sono abbassati.

8. Smontaggio dello strumento IR remoto

1. Tagliare la sutura e il tubo tra l'animale e la parte laterale e rimuovere con cura la parte laterale.
2. Applicare il gel di acido fusidico nel sito di inserimento del tubo nel torace. Usa una pinza curva per spingere delicatamente la pelle contro il tubo e usa un'altra pinza per estrarre il tubo. Tagliare la sutura rimanente vicino alla pelle.
3. Posizionare una sutura extra di polipropilene 5-0 per chiudere il sito di uscita del tubo e ridurre al minimo il rischio di ingresso di aria nel torace.

9. Fine della narcosi e recupero

1. Interrompere l'apporto di isoflurano e consentire all'animale di svegliarsi in un ambiente silenzioso, caldo e ricco di ossigeno.
2. Verificare che il topo non sia in difficoltà respiratoria osservandolo fino al completo recupero. Fornire 0,3 ml di soluzione fisiologica sterile (a temperatura corporea) mediante iniezione intraperitoneale per prevenire la disidratazione.
3. Per l'analgesia post-operatoria, somministrare un analgesico oppioide (buprenorfina, 0,1 mg/kg) per via sottocutanea prima che l'animale sia deambulante. Controllare i topi ogni 4-6 ore per le successive 24-48 ore quando viene fornita la buprenorfina per assicurarsi che i topi rispondano ai farmaci antidolorifici e per determinare se sono necessari ulteriori farmaci antidolorifici. Un ulteriore supporto dovrebbe includere un gel o una poltiglia dietetica standard raccomandata per la cura di supporto posizionata sul pavimento della gabbia dopo l'intervento.

Risultati

La convalida della capacità di indurre l'ischemia è stata eseguita mediante quattro test: colorazione con trifenil tetrazolio cloruro (TTC) e rosso Sirio (SR), misurazione della troponina cardiaca I e imaging RM con aumento tardivo del gadolinio (LGE). La significatività statistica è stata valutata utilizzando il test non parametrico di Mann-Whitney, considerando le dimensioni limitate del campione. La significatività statistica è stata attribuita a p < 0,05.

Gli esperimenti acuti (colorazione TTC, n = 15) non hanno avuto guasti tecnici e tutti gli animali sono stati inclusi. Questi esperimenti acuti includevano esperimenti di follow-up immediato (troponina cardiaca I, RM LGE, colorazione rossa Sirius, n = 12) e hanno avuto un tasso di sopravvivenza dell'85% e dell'80% rispettivamente per le tecniche di occlusione remota e standard, durante un periodo di 4 settimane.

Colorazione con cloruro di trifenile tetrazolio
La colorazione TTC (Triphenyl tetrazolium chloride) in un modello murino di danno da ischemia-riperfusione nel cuore misura macroscopicamente il fenomeno della vitalità miocardica mostrando la perdita di funzione dell'enzima deidrogenasi. Questo metodo di colorazione aiuta a distinguere tra le aree del cuore che sono ancora vitali (vive) e quelle che sono diventate non vitali a causa dell'ischemia. Il miocardio vitale si colora di rosso con TTC, mentre l'area ischemica rimane pallida o non colorata perché l'enzima deidrogenasi non è più funzionale. Ciò fornisce informazioni critiche sull'entità del danno tissutale subito dopo l'inizio dell'ischemia. La colorazione è stata eseguita per i gruppi IRI standard (n = 7) e IRI remoti (n = 8) immediatamente dopo 30 minuti di ischemia. La Figura 5 mostra fette colorate rappresentative per un animale, con fette di tessuto che attraversano dalla base verso l'apice. I risultati della colorazione TTC sono presentati nella Figura 6 e non mostrano differenze significative tra le due tecniche IRI. La colorazione TTC è stata eseguita come descritto da Fishbein et ^al.7.

Risonanza magnetica tardiva per l'aumento del gadolinio
Per misurare in modo non invasivo l'estensione dell'area ischemica, la risonanza magnetica LGE è stata impiegata 24 ore dopo l'occlusione per i gruppi IRI standard (n = 5) e IRI remoti (n = 5). Le specifiche dettagliate dell'acquisizione sono fornite nel file supplementare 1. L'area a rischio è misurata come la percentuale di tessuto del ventricolo sinistro nelle tre fette più apicali che supera i criteri di soglia dettagliati nel File supplementare 1. La rappresentazione grafica nella Figura 7 dimostra che non sono state osservate differenze significative tra la nuova tecnica di occlusione remota proposta e il metodo convenzionale "a torace aperto" nella valutazione delle misurazioni dell'area a rischio.

Colorazione rosso Sirius
L'infarto del miocardio, una conseguenza dell'ischemia miocardica, rappresenta un problema serio per le persone che soffrono di ischemia perché provoca una riduzione della massa contrattile del cuore, compromettendo la sua capacità di pompare il sangue in modo efficiente. La Figura 8 spiega ulteriormente i risultati utilizzando la colorazione Sirius Red 4 settimane dopo l'occlusione per confermare la posizione della formazione della cicatrice in base all'area a rischio rappresentata dalla risonanza magnetica LGE e misurare l'estensione del tessuto cicatriziale. La colorazione è stata eseguita per i gruppi IRI standard (n = 5) e IRI remoti (n = 5). Le aree rosso vivo segnano il nucleo necrotico dell'infarto, mentre le parti arancioni marcano il tessuto vitale. Infine, la Figura 9 riporta le dimensioni finali delle cicatrici misurate utilizzando la colorazione Sirius Red su entrambe le tecniche. La dimensione della cicatrice è calcolata come l'area dell'infarto colorato divisa per l'area totale della parete libera del ventricolo sinistro nella lastra della sezione di tessuto apicale con uno spessore di 2,4 mm. La colorazione con Rosso Sirio è stata eseguita secondo Rittié⁸.

Troponina cardiaca I
Oltre alle tecniche di imaging e colorazione, lo studio ha anche valutato il danno cardiaco utilizzando la troponina cardiaca I come marcatore. I campioni di sangue sono stati raccolti 24 ore dopo l'intervento chirurgico per i gruppi IRI standard (n = 8) e IRI remoti (n = 8). La Figura 10 mostra il valore della troponina cardiaca I, dimostrando che non ci sono differenze significative quando si confronta la nuova tecnica di occlusione remota con la tecnica IRI standard.

A dimostrazione della fattibilità del concetto proposto, vengono forniti anche i risultati preliminari dell'induzione dell'ischemia da una postazione remota con imaging simultaneo non invasivo. Ciò è stato ottenuto utilizzando lo strumento di occlusione remota personalizzato, che è stato posizionato all'interno della culla per animali per la risonanza magnetica e posizionato al centro dello scanner per la risonanza magnetica. I risultati mostrati nella Figura 11 dimostrano le differenze nel contrasto dell'immagine (livelli di luminosità) tra le regioni infartuate e non infartuate. Il tracciato ECG che mostra il tipico sopraslivellamento ST come marcatore che conferma l'occlusione riuscita del LAD mentre l'animale è posizionato all'interno dello scanner RM è presentato nella Figura 12B, mentre la Figura 12A mostra il tracciato ECG prima dell'occlusione.

Questo approccio completo fornisce una comprensione dettagliata degli effetti della nuova tecnica di occlusione remota proposta su ischemia, necrosi e danno cardiaco nel modello sperimentale rispetto al metodo convenzionale "open chest".

Figura 1: Immagini rappresentative che dimostrano la preparazione dell'animale come indicato nel protocollo. (A) Toracotomia con inserimento del divaricatore costale. (B) Chiusura del torace con un tubo PE-10 che esce dal torace e guida la sutura attorno al LAD. (C) Posizionamento dell'animale all'interno dello strumento IRI remoto assemblato. Notare i due pesi da 2,1 g che bloccano ciascuna estremità della sutura e poggiano sulla parte laterale della culla IRI remota. La parte laterale è posizionata e tenuta in posizione dai ritagli nella piastra di base dell'utensile. Il catetere a palloncino vascolare è sgonfio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Visualizzazione ex vivo del LAD (freccia bianca) e del padiglione auricolare sinistro (freccia nera). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Vista schematica dall'alto verso il basso della configurazione sperimentale, che illustra la posizione dello strumento utilizzato per l'occlusione remota. Creato con BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Schema che illustra l'uso dello strumento per l'occlusione remota da una vista laterale. (A) Dall'inizio dell'intervento, l'animale viene posizionato nella parte inferiore. Dopo aver chiuso la cassapanca, la parte laterale viene installata in posizione. A questo punto, il palloncino è ancora sgonfio e i pesi sono appoggiati sulla parte inferiore. (B) Il gonfiaggio del catetere a palloncino solleverà i pesi (contrassegnati da frecce) e causerà l'occlusione del LAD con conseguente ischemia al miocardio. L'occlusione riuscita si vede nei cambiamenti nel tracciato ECG. Sgonfiare il palloncino ripristinerà il flusso sanguigno attraverso il LAD. Creato con BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini rappresentative di fette di cuore di topo colorate con trifenil tetrazolio cloruro (TTC). Le fette si spostano dalla base all'apice da sinistra a destra, a partire dalla riga superiore. (A) IRI standard. (B) IRI remoto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Risultati della colorazione TTC. La colorazione TTC è stata eseguita 24 ore dopo l'occlusione per misurare le dimensioni dell'infarto. I punti dati sono presentati come medie con SEM dei gruppi IRI standard (n = 7) e IRI remoti (n = 8). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Risonanza magnetica tardiva per l'aumento del gadolinio. Area a rischio a 24 ore dopo l'occlusione come delineato su tre fette più apicali (escluso l'apice stesso) ottenute con LGE MRI. I punti dati sono presentati come medie con SEM dei gruppi IRI standard (n = 5) e IRI remoti (n = 5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Validazione del dispositivo di occlusione remota mediante risonanza magnetica dopo la procedura di ischemia/riperfusione. Confronto rappresentativo tra l'area a rischio come delineato nelle immagini LGE MR a 1 giorno dopo l'occlusione e il tessuto cicatriziale definitivo colorato con Sirius Red a 4 settimane dopo l'occlusione. (A-B) Fette dell'asse corto di un animale con occlusione remota e da banco, rispettivamente. La freccia indica l'area delimitata a rischio. (C-D) Sezioni istologiche colorate con Sirius Red degli stessi animali confermano che la formazione finale della cicatrice corrisponde alla delineazione dell'area a rischio con la risonanza magnetica a 24 ore dopo l'occlusione. LV = ventricolo sinistro. Barra della scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Risultati della colorazione del rosso Sirius. La colorazione Sirius Red è stata eseguita 4 settimane dopo l'occlusione per misurare l'entità della formazione di cicatrici. I punti dati sono presentati come medie con SEM dei gruppi IRI standard (n = 5) e IRI remoti (n = 5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Quantificazione della concentrazione di troponina I cardiaca nel siero di topo ottenuta a 24 ore dall'occlusione. I punti dati di cTnI sono presentati come medie con SEM di gruppi IRI standard (n = 8) e IRI remoti (n = 8). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Vengono mostrati i risultati preliminari ottenuti utilizzando lo strumento di occlusione remota proposto in combinazione con l'acquisizione simultanea della risonanza magnetica. Viene presentata la stessa fetta del ventricolo medio con orientamento dell'asse corto di un animale prima, al momento e subito dopo l'occlusione. A sinistra, la fetta dell'immagine rappresentativa mostra i bordi miocardici all'inizio dell'esperimento (prima di innescare l'IRI). Al centro, la stessa fetta dell'asse corto viene mostrata dopo 30 minuti di ischemia indotta da remoto. Il cloruro di manganese (MnCl) è stato utilizzato come mezzo di contrasto per evidenziare la regione infartuata (contrassegnata in giallo). La luminosità è stata regolata manualmente e saturata per evidenziare le diverse regioni del tessuto. Notare la differenza di luminosità tra il setto e la parete libera laterale (contrassegnata in giallo). A destra, utilizzando le stesse impostazioni di luminosità di prima, viene mostrata la stessa fetta dell'asse corto a 20 minuti dopo l'occlusione (fase di riperfusione). La freccia indica la regione con maggiore luminosità rispetto al tempo di occlusione, stabilendo l'assorbimento del mezzo di contrasto nella fase di riperfusione e il restringimento della regione ipointensa iniziale come delineato al momento dell'occlusione. LV = ventricolo sinistro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12: Tracciato ECG acquisito utilizzando il sistema di monitoraggio MRI per confermare l'insorgenza dell'ischemia. (A) Tracciato ECG normale acquisito prima dell'occlusione remota. (B) Traccia ECG catturata subito dopo il gonfiaggio del palloncino nello stesso animale. La freccia indica l'elevazione nel segmento ST, tipicamente considerata un marker di insorgenza riuscita dell'ischemia. Si osserva anche un aumento della frequenza cardiaca e respiratoria, oltre a una diminuzione dell'ampiezza del segnale. L'animale viene posizionato al centro dello scanner RM nelle fasi di occlusione e riperfusione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Configurazione dei pesi. Grafico di tutti i pesi in funzione dello spostamento del dinamometro utilizzando il sistema remoto a palloncino (blu) vs. Il sistema di pulegge originale (arancione). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Progettazione di utensili IRI remoti. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Dettagli sulle proprietà dello strumento IRI e sulle tecniche di acquisizione e analisi delle immagini. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La nuova tecnica di occlusione remota introdotta in questo studio offre una piattaforma unica per far progredire la ricerca nel campo della modellazione delle lesioni da ischemia-riperfusione, evitando la necessità di manipolazione diretta dei vasi durante l'intervento chirurgico iniziale e consentendo l'imaging multimodale simultaneo del miocardio riperfuso precocemente. La caratterizzazione completa, comprese le misurazioni della troponina-I, la risonanza magnetica con contrasto LGE, la TTC e la colorazione SR, mostra che la tecnica proposta è equivalente all'attuale standard aureo (ad esempio, legatura LAD a torace aperto)⁹.

La tecnica proposta presenta molteplici vantaggi rispetto al tradizionale approccio di legatura LAD "aperto". In primo luogo, riduce il tempo di apertura del torace durante l'intervento chirurgico a soli 15 minuti, rispetto al tempo di occlusione (30-60 minuti) più il tempo chirurgico (15 minuti) richiesto nell'approccio tradizionale. Questa chirurgia a cuore aperto ridotta al minimo può mitigare il danno tissutale e l'infiammazione, ma necessiterebbe di ulteriori indagini. Inoltre, la chiusura precoce della toracotomia consente lo svezzamento ventilatorio, consentendo così la respirazione spontanea sotto isoflurano durante gli esperimenti di ischemia-riperfusione. Ciò ha il potenziale per ridurre il danno polmonare indotto dal ventilatore e l'infiammazione associata, consentendo anche una risposta fisiologicamente più accurata all'ischemia miocardica e alla riperfusione¹⁰.

Inoltre, la tecnica di occlusione remota offre un maggiore controllo sui tempi esatti dell'induzione dell'ischemia. Come prova di concetto, sono stati dimostrati la fattibilità e i risultati preliminari dell'induzione e del controllo dell'ischemia miocardica da remoto, mentre l'animale è stato posizionato al centro dello scanner RM. La capacità di avviare con precisione l'ischemia dopo la chiusura del torace consente ai ricercatori di programmare interventi terapeutici o indagini aggiuntive e sincronizzare l'insulto ischemico tra i soggetti sperimentali. Questo maggiore controllo può portare a un'induzione più accurata e coerente dell'IRI, che è fondamentale per gli studi meccanicistici e terapeutici. Tuttavia, l'estensione marginale dell'inalazione di isoflurano durante la configurazione della risonanza magnetica cardiaca potrebbe rappresentare un limite per questo studio. Vale a dire, l'esposizione prolungata all'isoflurano potrebbe avere ulteriori effetti cardioprotettivi, come dimostrato in studi murini, e richiederebbe ulteriori indagini per il modello proposto¹¹.

La variazione dell'entità della lesione indotta è una sfida comune nei modelli IRI, spesso derivante da differenze nell'esecuzione chirurgica o da un'anatomia variabile¹². È importante sottolineare che un'adeguata formazione del chirurgo avrà un impatto sui tassi di mortalità in questo modello al di là di altre variabili riconosciute come il posizionamento di LAD, la durata dell'esperimento, i ceppi di topo e il background genetico¹³. Anche la scelta di agenti anestetici e analgesici può influenzare i risultati. Per esperienza, questo modello mostra un tasso di mortalità complessivo vicino al 15%. L'implementazione di una rigorosa gestione del dolore e di un monitoraggio vigile degli animali può ridurre ulteriormente la mortalità.

Una delle direzioni convincenti indicate da questo lavoro è la potenziale applicazione della tecnica dell'occlusione remota nella valutazione degli interventi terapeutici nelle prime fasi dell'occlusione o della riperfusione.

In conclusione, la tecnica di occlusione remota rappresenta un progresso promettente nella modellazione IRI, potenzialmente affinando gli studi meccanicistici e accelerando le terapie mirate. La sua capacità di ridurre il trauma chirurgico, migliorare il controllo sui tempi di ischemia e migliorare la coerenza sperimentale ne sottolinea l'importanza. Esplorando ulteriormente l'adattabilità della tecnica, i ricercatori possono sbloccare il suo pieno potenziale e contribuire a una comprensione più accurata delle prime fasi dell'induzione dell'ischemia, della riperfusione e del danno da ischemia-riperfusione che l'accompagna. Inoltre, l'effetto di diverse strategie di trattamento può ora essere osservato durante queste fasi iniziali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sutura in seta 2-0	Sharpoint Products	DC-2515N
Sutura in polipropilene 5-0 Sutura	in polipropilene Ethicon	8710H
7-0 Sutura in polipropilene	Ethicon	8206H
ACCLARENT Dispositivo di gonfiaggio a palloncino	Johnson& Johnson MedTech	BID30
Acepromazina	Kela
BD Vialon 18 G	BD	381347
BD Vialon 20 G	BD	381334
Soluzione di Betadine	Purdue Pharma	25655-41-8
Buprenorfina (Buprenex iniettabile)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
Carp Zoom Styl Knijplood 2,1 g (pesi da pesca in piombo)	Visdeal.nl
Dumont #3 Pinze	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Pinze	Fine Science Tools	11251-30
Forbici Fine Science Tools		14040-10
Fucidina gel	Leo Pharma
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
KD Mouse/Rat Eye Speculum	World Precision Instruments	501897
KD mouse/rat eye speculum	World Precision Instruments 501897
ketamina	Dechra
Sorgente luminosa		Zeiss	KL 1500
	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germania	BioSpec 70/30
NatriumChloride 0.9%	Baxter
Lampada termica a infrarossi notturna	Zoo Med Laboratories, Inc.	RS-75
ParaVision	Bruker BioSpin	versione 6.0.1
tubo in polietilene PE-10	SAI Tecnologie di infusione	PE-10
tubo in polietilene PE-50	SAI Tecnologie di infusione	PE-50
strumento IRI remoto (PMMA)	fatto in casa
	strumenti Indus Segmento
v4.0	Medviso, segment.heiberg.se	R12067
Sequenza di eco gradiente auto-gated	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germania	IntraGate, ParaVision 6.0.1
Portaaghi allungato sottile	Fine Science Tools	12005-15
Camera di induzione per topi/ratti Sure-Seal	World Precision Instruments	EZ-178
Connettori per tubi, polietilene, forma a Y	Westlab	072025-0001
Catetere per dilatazione Ultraverse 035 PTA: palloncino RBP da 5 mm x 40 mm, 17 ATM su catetere lungo 130 cm	Bard Peripheral Vascular, Inc.
Veet (crema depilatoria)	Reckitt Benkiser Healthcare
Ventilatore, MiniVent Modello 845	Hugo Sachs	73-0043
Vidisic	BAUSCH & LOMB PHARMA	685313
Xilazina	Bayer

Sistema di risonanza magnetica LCD Software monitor chirurgico per roditori 00801741092671