Isolamento di mutanti nulli/alterati di interazione utilizzando il saggio a due ibridi di lievito

Le interazioni tra biomolecole sono la parte più basilare dei fenomeni biologici. Le interazioni proteina-proteina costituiscono una parte significativa di tali interazioni. Pertanto, l'identificazione dei partner di interazione di una proteina di interesse è fondamentale per chiarire ulteriormente la funzione della proteina/gene di interesse. Il metodo a due ibridi di lievito (Y2H) è una tecnica popolare per identificare le interazioni proteina-proteina in vivo¹. In questo sistema, due proteine (X e Y) la cui interazione deve essere testata sono fuse rispettivamente al dominio di legame del DNA (DB) e al dominio di attivazione trascrizionale (AD). La proteina di fusione DB-X si lega a una sequenza di riconoscimento del dominio DB; quindi, quando le proteine X e Y interagiscono, la proteina di fusione AD-Y si trova in prossimità della sequenza di riconoscimento. Di conseguenza, viene attivata la trascrizione del gene reporter a valle della sequenza di riconoscimento. Pertanto, la presenza o l'assenza di attività del gene reporter può essere utilizzata per determinare la presenza o l'assenza dell'interazione proteina-proteina¹.

Una volta identificato uno specifico partner di interazione della proteina di interesse, dovrebbero essere eseguite ulteriori analisi per chiarire la funzione biologica dell'interazione. A questo scopo, se i mutanti delle proteine che compromettono o rimuovono l'interazione proteina-proteina specifica possono essere isolati, serviranno come potenti strumenti. Il sistema Y2H può essere utilizzato direttamente per isolare tali mutanti mediante lo screening di cloni "negativi all'interazione", a partire dal clone "positivo all'interazione" di tipo selvatico. Per accelerare questo processo, sono stati sviluppati sistemi Y2H "inversi" (rY2H) ^2,3. Nei sistemi rY2H, i ceppi di lievito ospite ospitano geni marcatori contro-selezionabili come geni reporter, il che significa che le cellule di lievito crescono solo quando le proteine AD-Y e DB-X non interagiscono.

Sebbene entrambi i sistemi Y2H e rY2H permettano l'isolamento di mutanti negativi all'interazione, il processo di isolamento dei mutanti è laborioso perché non tutti i candidati ottenuti dallo screening portano il tipo di mutazioni desiderato (di solito mutazioni missenso). Il problema più serio è che una frazione significativa di candidati presenta mutazioni frameshift o nonsenso, ed è necessario eseguire il western blotting per escludere cloni indesiderati. Per ovviare a questo problema, sono stati sviluppati nuovi vettori plasmidici⁴. In questi vettori, KanMX, un marcatore di resistenza ai farmaci, è posizionato fuori dal fotogramma a valle del dominio DB o AD. Il gene marcatore diventa in-frame con il dominio DB o AD solo quando viene inserito il gene di interesse. Quando una o più mutazioni casuali vengono introdotte nel gene di interesse, i mutanti indesiderati, come quelli con mutazioni frameshift o nonsenso, possono essere facilmente eliminati eseguendo la selezione della resistenza ai farmaci e i candidati portatori di mutazioni missenso desiderabili possono essere facilmente identificati con lo screening Y2H⁴. Questo articolo presenta un protocollo per isolare mutanti con interazione/alterazione di una proteina di interesse utilizzando questa strategia.

1. Costruzione della biblioteca dei mutanti

1. Impostare la reazione a catena della polimerasi (PCR) (un esempio è mostrato di seguito). Generalmente, preparare 50 μL della reazione, che è divisa in dieci aliquote da 5 μL, e amplificare il frammento genico bersaglio in una macchina PCR⁴.
   NOTA: Gli utenti devono selezionare una polimerasi appropriata per introdurre efficacemente le mutazioni. Se il frammento di DNA da amplificare è corto, è necessaria una polimerasi con un tasso di errore più elevato, come la Taq polimerasi, che manca di attività di correzione di bozze. Se il frammento di DNA da amplificare è lungo, è necessaria una polimerasi più fedele per ridurre il numero di mutazioni. Le mutazioni si verificano ogni poche centinaia di paia di basi dopo 30 cicli di amplificazione con la normale Taq polimerasi⁴. Nei risultati rappresentativi, è stata utilizzata una diversa Taq polimerasi (vedi Tabella dei materiali), che ha una fedeltà maggiore rispetto alla normale Taq polimerasi, e il tasso di mutazione era di uno su 600 coppie di basi. Un esempio delle miscele PCR, i dettagli del primer e le condizioni di reazione sono forniti nel File supplementare 1.
2. Al termine della PCR, combinare tutte le aliquote della reazione, confermare che i frammenti di DNA di interesse sono stati amplificati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio, ecc. e purificare il DNA⁵.
3. Assemblare il frammento di DNA generato nella fase 1.2 con il vettore Y2H appropriato utilizzando una strategia di clonazione "senza soluzione di continuità" (Figura 1).
   NOTA: Il sistema di clonazione senza soluzione di continuità, come l'assemblaggio^{Gibson 6}, riduce al minimo la contaminazione della libreria mutante costruita da vettori vuoti generati tramite autolegatura. Un elenco dei vettori Y2H è fornito nella Tabella 1. Possono essere preparati mediante digestione BamHI prima del montaggio. Tutti i plasmidi sono disponibili nell'ambito del National BioResource Project - lievito (vedi Tabella dei Materiali).
4. Introdurre la miscela di reazione generata nella fase 1.3 in cellule competenti di Escherichia coli preparate secondo un protocollo di trasformazione di E. coli altamente efficiente (ad esempio, Inoue et al.7). Distribuire tutte le cellule competenti su diverse piastre LB (1% triptone, 0,5% estratto di lievito, 1% NaCl e 2% agar) contenenti antibiotici appropriati (vedi Tabella dei materiali). A questo punto, distribuire una piccola quantità (~1/100 della reazione totale) sulla stessa piastra di selezione per calcolare il titolo della libreria. Incubare le piastre a 37 °C per una notte.
5. Una volta che è apparso un gran numero di colonie di E. coli , raschiare tutte le cellule dalla superficie della piastra utilizzando un anello di plastica usa e getta. Recupera il DNA plasmidico da queste cellule utilizzando i metodi più diffusi, come la lisi alcalina⁸. Allo stesso tempo, contare il numero di colonie che compaiono dopo aver sparso piccole aliquote della miscela di trasformazione sulla piastra. Utilizzando questo numero, stimare il numero totale di cloni indipendenti nella libreria.
   NOTA: A questo punto, raccogli alcune colonie indipendenti (4-6) che appaiono sulla piastra su cui sono state sparse le piccole aliquote della reazione di trasformazione, coltivale separatamente e isola i plasmidi da esse per confermare che praticamente tutti i cloni portano i frammenti di DNA desiderati⁵. Sono disponibili molti kit commerciali per isolare i plasmidi da E. coli. Il numero di colonie che compaiono sulla piastra dopo aver sparso piccole aliquote può essere contato manualmente.
6. Misura la concentrazione del pool di DNA della libreria. Di solito, poche centinaia di nanogrammi di DNA di libreria sono sufficienti per ottenere diverse migliaia di trasformanti nella fase successiva.
   NOTA: Si consiglia di misurare la concentrazione di DNA utilizzando un colorante fluorescente che si lega al DNA perché la misurazione di A₂₆₀ è spesso imprecisa.

2. Trasformazione del lievito con la libreria mutante e la replica plating

1. Introdurre la libreria mutante nel ceppo di lievito ospite (TAT-7 (L40-ura3)^9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)_8-lacZ) per il saggio Y2H utilizzando circa 100 ng di DNA. Pre-trasformare le cellule ospiti con il plasmide "esca".
   1. Dopo la procedura di trasformazione, sospendere le cellule di lievito in acqua sterile e distribuire aliquote di diverse quantità su apposite piastre (solitamente terreno SC privo di leucina e triptofano: SC-LW [0,67% base azotata di lievito, 2% glucosio, 1,546 g/L di miscela SC a doppio drop-out -Leu -Trp e 2% agar, vedi Tabella dei materiali]). Incubare queste piastre per una notte a 30 °C.
      NOTA: Il protocollo standard, come il metodo¹¹ dell'acetato di litio-PEG con ~5 × 10⁶ cellule a crescita logaritmica, è sufficiente per la trasformazione del lievito. È possibile utilizzare anche un altro metodo con un'elevata efficienza di trasformazione, come l'elettroporazione.
2. Il giorno successivo, quando compaiono minuscole colonie, selezionare le piastre con un numero appropriato di cellule (500-2000) e fare delle repliche da esse come segue.
3. Posizionare due fogli di carta da filtro su un blocco di replica per realizzare diverse repliche (il mezzo è SC-LW e SC-LW contenente kanamicina) (vedi Tabella dei materiali). Incubare a 30 °C per 1-2 giorni.
   NOTA: La concentrazione di kanamicina (G418) è di 600 μg/mL. Non utilizzare il velluto per la placcatura delle repliche perché la risoluzione delle colonie andrà persa.
4. Una volta che le colonie sono cresciute, confronta le piastre e scegli i candidati. Eseguire un test del colore Y2H (vedere il passaggio 3) se il lacZ viene utilizzato come reporter.
   NOTA: Per il reporter Y2H, lacZ è solitamente più efficace nel rilevare un'interazione debole rispetto a HIS3.

3. Saggio del colore Y2H

1. Posizionare un foglio di carta da filtro tagliato in anticipo alla dimensione appropriata sulla piastra di replica preparata utilizzando il passaggio 2. Fare attenzione a non formare bolle d'aria tra la carta da filtro e la piastra.
   NOTA: Utilizzare carta da filtro n. 4A o carta da filtro di grado 50 (vedere la tabella dei materiali). Per il saggio del colore è possibile utilizzare qualsiasi SC-LW o SC-LW contenente piastre di kanamicina, realizzate mediante placcatura di replica.
2. Quando la carta da filtro sulla piastra è completamente inumidita (quando il colore della carta da filtro cambia completamente), posizionare sopra diversi fogli di carta assorbente e farlo entrare in contatto con la carta da filtro per rimuovere l'umidità in eccesso. Rimuovere il tovagliolo di carta quando assorbe l'acqua e cambia colore. Ripeti questo processo due o tre volte.
3. Raccogli i bordi della carta da filtro con una pinzetta, staccala rapidamente dalla piastra, immergila nell'azoto liquido e congelala. Se l'azoto liquido non è disponibile, posizionare la carta da filtro su un vassoio di plastica con la colonia rivolta verso l'alto e metterla immediatamente in congelatore (da -20 °C a -80 °C) per congelarla completamente.
4. Togliete la carta da filtro congelata e mettetela, con la colonia rivolta verso l'alto, su un tovagliolo di carta asciutto per scongelarla. Immediatamente dopo lo scongelamento, posizionare la carta da filtro, con la colonia rivolta verso l'alto, su un'altra carta da filtro posta su un vassoio di plastica o un contenitore sigillabile e imbevuta di tampone Z (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl e 1 mM MgSO₄, pH 7,0) contenente X-gal (5-bromo-5-cloro-3-indolil-β-D-galattoside) e 2-mercaptoetanolo⁹ (vedi Tabella dei materiali). Fare attenzione a non lasciare che si formino bolle d'aria tra la carta da filtro superiore e inferiore.
5. Copri la vaschetta di plastica contenente la carta da filtro e mettila in un contenitore ermetico o in un sacchetto di plastica. Chiudere il contenitore ermetico o il sacchetto di plastica e incubarlo a 37 °C fino a quando non appare un colore blu.
6. Quando appare un colore blu, posizionare la carta da filtro con la colonia rivolta verso l'alto su circa 500 μL di soluzione di arresto (1 M Na₂CO₃) posta su un vassoio di plastica pulito. La soluzione di arresto si assorbe rapidamente; Pertanto, rimuovere immediatamente il filtro, posizionarlo su un tovagliolo di carta fresco con la colonia rivolta verso l'alto e lasciarlo asciugare.
7. Dopo che il tovagliolo di carta è stato sostituito e il filtro è sufficientemente asciutto, utilizzare uno scanner o un altro dispositivo per acquisire i dati.

4. Recupero e conferma dei cloni candidati

1. Selezionare i cloni bianchi e candidati Kan^R dalla lastra originale della replica (o dalla lastra replicata non utilizzata per il saggio del colore). Gli esempi sono illustrati nella Figura 1C. Confermare che i cloni candidati sono bianchi e Kan^R rimasticandoli come un piccolo cerotto su terreno SC-LW contenente kanamicina e incubandoli a 30 °C per 1-2 giorni. Fai almeno due serie o fai repliche il giorno successivo.
   NOTA: Le colonie bianche dovrebbero essere selezionate perché le colonie blu pallido potrebbero mantenere l'interazione.
2. Una volta che i cloni candidati sono cresciuti bene, ripetere il saggio del colore con almeno una piastra generata nel passaggio 4.1 come descritto nel passaggio 3 e confermare che rimangano bianchi e non diventino blu (Figura 2A).
   NOTA: Quando si rifanno le striature dei candidati, non trasportare grandi quantità di cellule. Troppe cellule rendono impossibile distinguere i cloni Kan^R e Kan^S .
3. Prelevare i cloni ancora bianchi e Kan^R generati al punto 4.2 dai resti della piastra e farli crescere indipendentemente in 1 mL di terreno di selezione (SC-L o SC-W, a seconda del vettore utilizzato per la costruzione della libreria) per una notte a 30 °C.
4. Trasferire la coltura in una microprovetta e raccogliere le cellule mediante centrifugazione (~15.000 × g, per 10-30 secondi a temperatura ambiente). Isolare l'intero DNA dal pellet cellulare come segue.
5. Sospendere il pellet cellulare in 400 μL di tampone di lisi (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8,0) e 1 mM EDTA) contenente 1 μL ciascuno di 2-mercaptoetanolo e 20 mg/mL di Zimoliasi 100T (vedere la Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 30 minuti per digerire le pareti cellulari. A questo punto, mescolare delicatamente capovolgendo il tubo ogni 5-10 minuti.
6. Quando la sospensione cellulare è diventata opaca o traslucida, aggiungere un volume uguale di una miscela di fenolo-cloroformio-alcol isoamilico (25:24:1) e mescolare bene agitando a velocità moderata per 10-20 s.
7. Centrifugare le microprovette in una microcentrifuga per 5 minuti alla massima velocità (~15.000 × g, a temperatura ambiente) e recuperare la fase acquosa contenente DNA in una nuova microprovetta. Aggiungere 0,8 volumi di isopropanolo e mescolare bene capovolgendo il tubo.
8. Lasciare la provetta a temperatura ambiente per 2-3 minuti e poi centrifugare in una microcentrifuga per 4-5 minuti alla massima velocità (~15.000 × g, a temperatura ambiente) per far precipitare il DNA.
9. Rimuovere il surnatante e lavare il precipitato con circa 500 μl di etanolo al 70%. Rimuovere completamente l'etanolo e asciugare brevemente il precipitato.
10. Aggiungere 20 μl di tampone TE (10 mM Tris-Cl (8,0) e 1 mM EDTA) al precipitato, mescolare brevemente e lasciare la provetta per una notte a temperatura ambiente per sciogliere il precipitato.
    NOTA: Se gli utenti hanno fretta, mantenere i tubi a 37-50 °C. Il precipitato di DNA si dissolverà in poche ore.
11. Una volta che il pellet è completamente sciolto, trasformare E. coli con una piccola quantità di questa soluzione di DNA.
    NOTA: Circa 0,5 μL di soluzione di DNA sono sufficienti se si utilizza E. coli con un'elevata efficienza di trasformazione.
12. Quando compaiono colonie di E. coli , raccogli diverse colonie indipendenti, coltivale e recupera i plasmidi con metodi standard, come la lisi alcalina.
13. Introdurre il DNA plasmidico ottenuto nel passaggio 4.12 nelle cellule ospiti Y2H che ospitano il plasmide esca. Quando compaiono i trasformanti, controllarli con il saggio del colore (dovrebbero apparire bianchi) e con il western blotting⁴ (dovrebbero esprimere una proteina della dimensione desiderata).
    NOTA: Il metodo post-alcalino¹² è un modo semplice e veloce per preparare un estratto di cellule intere dal lievito.
14. Se i due criteri di cui sopra sono soddisfatti, determinare il sito di mutazione dei cloni mediante sequenziamento nucleotidico⁴.

Recentemente, è stato scoperto che la metà C-terminale della proteina Pol2 (Pol2-C) interagisce con Mcm10. Entrambe le proteine sono essenziali per l'inizio della replicazione del DNA e, quindi, per la crescita cellulare nel lievito Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Per aiutare a comprendere il significato biologico di questa interazione, i mutanti di Pol2-C che non hanno alcuna o diminuita interazione con Mcm10 sono stati isolati utilizzando il metodo qui descritto.

È stata costruita una libreria di mutazioni seguendo il metodo descritto nella fase 1. I frammenti di DNA di Pol2-C sono stati amplificati con GoTaq polimerasi e clonati nel vettore Gal4AD (pST2525) utilizzando l'enzima In-Fusion. Il numero di cloni indipendenti nella libreria è stato stimato in 5000.

Come descritto nel passaggio 2, il DNA del plasmide di libreria è stato introdotto nel ceppo ospite Y2H TAT-7, che è stato pre-trasformato con il plasmide LexA-Mcm10. Le cellule sono state distribuite su una piastra SC-LW e replicate su piastre SC-LW e SC-LW+G418 il giorno successivo. Le repliche sono state sottoposte al test del colore come descritto nella fase 3. Alcuni dei risultati del saggio del colore sono mostrati nella Figura 1C.

Quarantasette colonie che erano bianche nel saggio del colore e resistenti al G418 sono state isolate come primi candidati da circa 8500 trasformanti. Sono stati nuovamente testati con il test del colore e 25 dei 47 cloni sono stati confermati come bianchi (Figura 2A). Questi 25 cloni sono stati mantenuti come candidati. I DNA plasmidici candidati sono stati recuperati da ciascuno dei 25 candidati come descritto nella fase 4. Sono stati reintrodotti in cellule ospiti di lievito Y2H che ospitano LexA-Mcm10 e testati con il saggio del colore, e sono stati selezionati 16 cloni privi di colore. Per confermare ulteriormente che si trattava di mutanti missenso Pol2-C, l'espressione della proteina Pol2-C è stata confermata mediante western blotting. Dodici candidati presentavano una banda in una posizione quasi identica a quella del controllo positivo (proteina di fusione Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX, m.w. calcolata: 158,8 kDa) (Figura 2B). Il test del colore ha mostrato che questi 12 cloni non interagivano con Mcm10 (Figura 2C). Dopo aver determinato le sequenze nucleotidiche di questi cloni, è stato confermato che tutti avevano una o più mutazioni missenso. Il numero di mutazioni missenso variava da uno a cinque (dati non mostrati). In media, si è verificata circa una mutazione missenso ogni 1000 basi.

Figura 1: Schemi dell'approccio basato su Y2H per lo screening di mutanti nulli/alterati all'interazione. (A) Il sistema Y2H. (B) Strategia per isolare mutanti con interazione-null/impromesse. 1: Il vettore Y2H di nuova costruzione contiene una copia del gene KanMX a valle del tag Y2H, del dominio DB e dell'AD. È importante sottolineare che questo gene KanMX manca di un codone iniziale ed è fuori dal frame con il tag Y2H. Pertanto, non ci si aspetta che il gene KanMX sia espresso da questo vettore. Quando il frammento di DNA amplificato con PCR viene inserito nel vettore, il gene KanMX viene inserito nel frame con il tag Y2H ed espresso. Di conseguenza, solo i plasmidi che ospitano l'inserto wild-type o un inserto con una o più mutazioni missenso possono esprimere il gene KanMX, che conferisce resistenza a G418. I plasmidi con una o più mutazioni nonsenso o frameshift non possono esprimere il gene KanMX. 2: La libreria mutante costruita nella fase 1 viene introdotta nelle cellule di lievito ospiti Y2H. Quando compaiono i trasformanti, vengono create delle repliche. Confrontando l'espressione di uno o più geni reporter e la resistenza a G418, è possibile selezionare candidati di mutanti con interazione nulla/alterata. (C) Un esempio di screening. La libreria plasmidica, che conteneva Gal4-AD e un frammento di DNA Pol2-C mutagenizzato mediante PCR, è stata introdotta nel ceppo ospite Y2H TAT-7, che è stato pre-trasformato con il plasmide LexA-Mcm10. Vengono mostrate le immagini delle cellule prima (a sinistra) e dopo (al centro) il saggio a colori e delle cellule coltivate su una piastra SC-LW+G418 (a destra). Esempi di candidati di mutanti con interazione/alterati e falsi candidati sono indicati rispettivamente da punte di freccia bianche e nere. (D) Sequenza di DNA attorno al sito di clonazione dei vettori Y2H, AD (in alto) e DB (in basso). Viene mostrata la sequenza dagli ultimi dieci amminoacidi (aa) del tag Y2H (rosso) alla porzione corrispondente ai primi dieci aa di KanMX (verde). Vengono mostrati anche i siti di riconoscimento di SmaI e BamHI. Le posizioni dei primer PCR sono mostrate in basso quando il sito BamHI viene utilizzato come sito di clonazione. Gli stessi primer si applicano per clonare il gene di interesse negli altri plasmidi (pST2303/2523). Questa cifra è stata modificata da Tanaka et al.4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Un esempio del processo di screening di mutanti con interazione nulla/alterata. (A) Le 47 colonie isolate come cloni candidati, come mostrato nella Figura 1C, sono state nuovamente coltivate su terreno SC-LW contenente G418 e sottoposte al saggio del colore. +: controllo positivo (Wt Pol2-C), -: controllo negativo (vettore). I cloni candidati, in numero da 1 a 25, sono stati coltivati per recuperare i plasmidi. (B) I plasmidi sono stati recuperati da ciascun clone candidato in (A), introdotti nelle cellule ospiti Y2H e nuovamente sottoposti al saggio del colore. Sedici di loro erano bianchi (mancavano di colore). Da essi sono stati preparati estratti di cellule intere ed è stato eseguito il western blotting con un anticorpo monoclonale anti-HA. Il numero sul pannello corrisponde al numero in (A). Sono state eseguite analisi di diversi cloni plasmidici indipendenti recuperati da ciascun candidato, ad eccezione del #6. (C) Risultati del saggio del colore per i 12 cloni finali. I numeri corrispondono a quelli in (A). #16, che ha mantenuto l'interazione con Mcm10, è stato utilizzato come controllo positivo nel saggio del colore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Elenco dei vettori Y2H contenenti KanMX out-of-frame con il tag Y2H.

File supplementare 1: Un esempio delle miscele PCR, i dettagli del primer e le condizioni di reazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.