Articolo metodologico

Isolamento di mutanti nulli/alterati di interazione utilizzando il saggio a due ibridi di lievito

DOI:

10.3791/66423

⸱

29 dicembre 2023

 ,  , 
1Graduate School of Engineering, Kochi University of Technology, 2School of Engineering Science, Kochi University of Technology

In questo articolo

Sommario

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Le interazioni delle biomolecole, come le interazioni proteina-proteina, sono la base molecolare delle funzioni biologiche. Se i mutanti con interazione nulla/alterata che mancano specificamente dell'interazione rilevante possono essere isolati, saranno di grande aiuto per comprendere le funzioni di questa interazione. Questo articolo presenta un modo efficiente per isolare i mutanti con interazione, null/impromesse.

Abstract

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Le interazioni proteina-proteina sono uno dei processi più basilari che sono alla base dei fenomeni biologici. Uno dei modi più semplici e migliori per comprendere i ruoli e le funzioni di una specifica interazione proteina-proteina è confrontare il fenotipo del wild-type (con la relativa interazione proteina-proteina) e quelli dei mutanti che non hanno la relativa interazione. Pertanto, se tali mutanti possono essere isolati, aiuteranno a chiarire i processi biologici correlati. La procedura a due ibridi di lievito (Y2H) è un approccio potente non solo per rilevare le interazioni proteina-proteina, ma anche per isolare mutanti nulli/alterati dall'interazione. In questo articolo, viene presentato un protocollo per isolare mutanti con interazione/alterazione utilizzando la tecnologia Y2H. In primo luogo, viene costruita una libreria di mutazioni combinando la reazione a catena della polimerasi e un'efficiente tecnologia di clonazione senza soluzione di continuità, che esclude in modo efficiente il vettore vuoto dalla libreria. In secondo luogo, i mutanti con interazione nulla/alterata vengono sottoposti a screening mediante il saggio Y2H. A causa di un trucco nel vettore Y2H, i mutanti indesiderati, come quelli con mutazioni frameshift e nonsenso, vengono eliminati in modo efficiente dal processo di screening. Questa strategia è semplice e può quindi essere applicata a qualsiasi combinazione di proteine la cui interazione può essere rilevata dal sistema a due ibridi.

Introduzione

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Le interazioni tra biomolecole sono la parte più basilare dei fenomeni biologici. Le interazioni proteina-proteina costituiscono una parte significativa di tali interazioni. Pertanto, l'identificazione dei partner di interazione di una proteina di interesse è fondamentale per chiarire ulteriormente la funzione della proteina/gene di interesse. Il metodo a due ibridi di lievito (Y2H) è una tecnica popolare per identificare le interazioni proteina-proteina in vivo1. In questo sistema, due proteine (X e Y) la cui interazione deve essere testata sono fuse rispettivamente al dominio di legame del DNA (DB) e al dominio di attivazione trascrizionale (AD). La proteina di fusione DB-X si lega a una sequenza di riconoscimento del dominio DB; quindi, quando le proteine X e Y interagiscono, la proteina di fusione AD-Y si trova in prossimità della sequenza di riconoscimento. Di conseguenza, viene attivata la trascrizione del gene reporter a valle della sequenza di riconoscimento. Pertanto, la presenza o l'assenza di attività del gene reporter può essere utilizzata per determinare la presenza o l'assenza dell'interazione proteina-proteina1.

Una volta identificato uno specifico partner di interazione della proteina di interesse, dovrebbero essere eseguite ulteriori analisi per chiarire la funzione biologica dell'interazione. A questo scopo, se i mutanti delle proteine che compromettono o rimuovono l'interazione proteina-proteina specifica possono essere isolati, serviranno come potenti strumenti. Il sistema Y2H può essere utilizzato direttamente per isolare tali mutanti mediante lo screening di cloni "negativi all'interazione", a partire dal clone "positivo all'interazione" di tipo selvatico. Per accelerare questo processo, sono stati sviluppati sistemi Y2H "inversi" (rY2H) 2,3. Nei sistemi rY2H, i ceppi di lievito ospite ospitano geni marcatori contro-selezionabili come geni reporter, il che significa che le cellule di lievito crescono solo quando le proteine AD-Y e DB-X non interagiscono.

Sebbene entrambi i sistemi Y2H e rY2H permettano l'isolamento di mutanti negativi all'interazione, il processo di isolamento dei mutanti è laborioso perché non tutti i candidati ottenuti dallo screening portano il tipo di mutazioni desiderato (di solito mutazioni missenso). Il problema più serio è che una frazione significativa di candidati presenta mutazioni frameshift o nonsenso, ed è necessario eseguire il western blotting per escludere cloni indesiderati. Per ovviare a questo problema, sono stati sviluppati nuovi vettori plasmidici4. In questi vettori, KanMX, un marcatore di resistenza ai farmaci, è posizionato fuori dal fotogramma a valle del dominio DB o AD. Il gene marcatore diventa in-frame con il dominio DB o AD solo quando viene inserito il gene di interesse. Quando una o più mutazioni casuali vengono introdotte nel gene di interesse, i mutanti indesiderati, come quelli con mutazioni frameshift o nonsenso, possono essere facilmente eliminati eseguendo la selezione della resistenza ai farmaci e i candidati portatori di mutazioni missenso desiderabili possono essere facilmente identificati con lo screening Y2H4. Questo articolo presenta un protocollo per isolare mutanti con interazione/alterazione di una proteina di interesse utilizzando questa strategia.

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Protocollo

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1. Costruzione della biblioteca dei mutanti

  1. Impostare la reazione a catena della polimerasi (PCR) (un esempio è mostrato di seguito). Generalmente, preparare 50 μL della reazione, che è divisa in dieci aliquote da 5 μL, e amplificare il frammento genico bersaglio in una macchina PCR4.
    NOTA: Gli utenti devono selezionare una polimerasi appropriata per introdurre efficacemente le mutazioni. Se il frammento di DNA da amplificare è corto, è necessaria una polimerasi con un tasso di errore più elevato, come la Taq polimerasi, che manca di attività di correzione di bozze. Se il frammento di DNA da amplificare è lungo, è necessaria una polimerasi più fedele per ridurre il numero di mutazioni. Le mutazioni si verificano ogni poche centinaia di paia di basi dopo 30 cicli di amplificazione con la normale Taq polimerasi4. Nei risultati rappresentativi, è stata utilizzata una diversa Taq polimerasi (vedi Tabella dei materiali), che ha una fedeltà maggiore rispetto alla normale Taq polimerasi, e il tasso di mutazione era di uno su 600 coppie di basi. Un esempio delle miscele PCR, i dettagli del primer e le condizioni di reazione sono forniti nel File supplementare 1.
  2. Al termine della PCR, combinare tutte le aliquote della reazione, confermare che i frammenti di DNA di interesse sono stati amplificati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio, ecc. e purificare il DNA5.
  3. Assemblare il frammento di DNA generato nella fase 1.2 con il vettore Y2H appropriato utilizzando una strategia di clonazione "senza soluzione di continuità" (Figura 1).
    NOTA: Il sistema di clonazione senza soluzione di continuità, come l'assemblaggioGibson 6, riduce al minimo la contaminazione della libreria mutante costruita da vettori vuoti generati tramite autolegatura. Un elenco dei vettori Y2H è fornito nella Tabella 1. Possono essere preparati mediante digestione BamHI prima del montaggio. Tutti i plasmidi sono disponibili nell'ambito del National BioResource Project - lievito (vedi Tabella dei Materiali).
  4. Introdurre la miscela di reazione generata nella fase 1.3 in cellule competenti di Escherichia coli preparate secondo un protocollo di trasformazione di E. coli altamente efficiente (ad esempio, Inoue et al.7). Distribuire tutte le cellule competenti su diverse piastre LB (1% triptone, 0,5% estratto di lievito, 1% NaCl e 2% agar) contenenti antibiotici appropriati (vedi Tabella dei materiali). A questo punto, distribuire una piccola quantità (~1/100 della reazione totale) sulla stessa piastra di selezione per calcolare il titolo della libreria. Incubare le piastre a 37 °C per una notte.
  5. Una volta che è apparso un gran numero di colonie di E. coli , raschiare tutte le cellule dalla superficie della piastra utilizzando un anello di plastica usa e getta. Recupera il DNA plasmidico da queste cellule utilizzando i metodi più diffusi, come la lisi alcalina8. Allo stesso tempo, contare il numero di colonie che compaiono dopo aver sparso piccole aliquote della miscela di trasformazione sulla piastra. Utilizzando questo numero, stimare il numero totale di cloni indipendenti nella libreria.
    NOTA: A questo punto, raccogli alcune colonie indipendenti (4-6) che appaiono sulla piastra su cui sono state sparse le piccole aliquote della reazione di trasformazione, coltivale separatamente e isola i plasmidi da esse per confermare che praticamente tutti i cloni portano i frammenti di DNA desiderati5. Sono disponibili molti kit commerciali per isolare i plasmidi da E. coli. Il numero di colonie che compaiono sulla piastra dopo aver sparso piccole aliquote può essere contato manualmente.
  6. Misura la concentrazione del pool di DNA della libreria. Di solito, poche centinaia di nanogrammi di DNA di libreria sono sufficienti per ottenere diverse migliaia di trasformanti nella fase successiva.
    NOTA: Si consiglia di misurare la concentrazione di DNA utilizzando un colorante fluorescente che si lega al DNA perché la misurazione di A260 è spesso imprecisa.

2. Trasformazione del lievito con la libreria mutante e la replica plating

  1. Introdurre la libreria mutante nel ceppo di lievito ospite (TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ) per il saggio Y2H utilizzando circa 100 ng di DNA. Pre-trasformare le cellule ospiti con il plasmide "esca".
    1. Dopo la procedura di trasformazione, sospendere le cellule di lievito in acqua sterile e distribuire aliquote di diverse quantità su apposite piastre (solitamente terreno SC privo di leucina e triptofano: SC-LW [0,67% base azotata di lievito, 2% glucosio, 1,546 g/L di miscela SC a doppio drop-out -Leu -Trp e 2% agar, vedi Tabella dei materiali]). Incubare queste piastre per una notte a 30 °C.
      NOTA: Il protocollo standard, come il metodo11 dell'acetato di litio-PEG con ~5 × 106 cellule a crescita logaritmica, è sufficiente per la trasformazione del lievito. È possibile utilizzare anche un altro metodo con un'elevata efficienza di trasformazione, come l'elettroporazione.
  2. Il giorno successivo, quando compaiono minuscole colonie, selezionare le piastre con un numero appropriato di cellule (500-2000) e fare delle repliche da esse come segue.
  3. Posizionare due fogli di carta da filtro su un blocco di replica per realizzare diverse repliche (il mezzo è SC-LW e SC-LW contenente kanamicina) (vedi Tabella dei materiali). Incubare a 30 °C per 1-2 giorni.
    NOTA: La concentrazione di kanamicina (G418) è di 600 μg/mL. Non utilizzare il velluto per la placcatura delle repliche perché la risoluzione delle colonie andrà persa.
  4. Una volta che le colonie sono cresciute, confronta le piastre e scegli i candidati. Eseguire un test del colore Y2H (vedere il passaggio 3) se il lacZ viene utilizzato come reporter.
    NOTA: Per il reporter Y2H, lacZ è solitamente più efficace nel rilevare un'interazione debole rispetto a HIS3.

3. Saggio del colore Y2H

  1. Posizionare un foglio di carta da filtro tagliato in anticipo alla dimensione appropriata sulla piastra di replica preparata utilizzando il passaggio 2. Fare attenzione a non formare bolle d'aria tra la carta da filtro e la piastra.
    NOTA: Utilizzare carta da filtro n. 4A o carta da filtro di grado 50 (vedere la tabella dei materiali). Per il saggio del colore è possibile utilizzare qualsiasi SC-LW o SC-LW contenente piastre di kanamicina, realizzate mediante placcatura di replica.
  2. Quando la carta da filtro sulla piastra è completamente inumidita (quando il colore della carta da filtro cambia completamente), posizionare sopra diversi fogli di carta assorbente e farlo entrare in contatto con la carta da filtro per rimuovere l'umidità in eccesso. Rimuovere il tovagliolo di carta quando assorbe l'acqua e cambia colore. Ripeti questo processo due o tre volte.
  3. Raccogli i bordi della carta da filtro con una pinzetta, staccala rapidamente dalla piastra, immergila nell'azoto liquido e congelala. Se l'azoto liquido non è disponibile, posizionare la carta da filtro su un vassoio di plastica con la colonia rivolta verso l'alto e metterla immediatamente in congelatore (da -20 °C a -80 °C) per congelarla completamente.
  4. Togliete la carta da filtro congelata e mettetela, con la colonia rivolta verso l'alto, su un tovagliolo di carta asciutto per scongelarla. Immediatamente dopo lo scongelamento, posizionare la carta da filtro, con la colonia rivolta verso l'alto, su un'altra carta da filtro posta su un vassoio di plastica o un contenitore sigillabile e imbevuta di tampone Z (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl e 1 mM MgSO4, pH 7,0) contenente X-gal (5-bromo-5-cloro-3-indolil-β-D-galattoside) e 2-mercaptoetanolo9 (vedi Tabella dei materiali). Fare attenzione a non lasciare che si formino bolle d'aria tra la carta da filtro superiore e inferiore.
  5. Copri la vaschetta di plastica contenente la carta da filtro e mettila in un contenitore ermetico o in un sacchetto di plastica. Chiudere il contenitore ermetico o il sacchetto di plastica e incubarlo a 37 °C fino a quando non appare un colore blu.
  6. Quando appare un colore blu, posizionare la carta da filtro con la colonia rivolta verso l'alto su circa 500 μL di soluzione di arresto (1 M Na2CO3) posta su un vassoio di plastica pulito. La soluzione di arresto si assorbe rapidamente; Pertanto, rimuovere immediatamente il filtro, posizionarlo su un tovagliolo di carta fresco con la colonia rivolta verso l'alto e lasciarlo asciugare.
  7. Dopo che il tovagliolo di carta è stato sostituito e il filtro è sufficientemente asciutto, utilizzare uno scanner o un altro dispositivo per acquisire i dati.

4. Recupero e conferma dei cloni candidati

  1. Selezionare i cloni bianchi e candidati KanR dalla lastra originale della replica (o dalla lastra replicata non utilizzata per il saggio del colore). Gli esempi sono illustrati nella Figura 1C. Confermare che i cloni candidati sono bianchi e KanR rimasticandoli come un piccolo cerotto su terreno SC-LW contenente kanamicina e incubandoli a 30 °C per 1-2 giorni. Fai almeno due serie o fai repliche il giorno successivo.
    NOTA: Le colonie bianche dovrebbero essere selezionate perché le colonie blu pallido potrebbero mantenere l'interazione.
  2. Una volta che i cloni candidati sono cresciuti bene, ripetere il saggio del colore con almeno una piastra generata nel passaggio 4.1 come descritto nel passaggio 3 e confermare che rimangano bianchi e non diventino blu (Figura 2A).
    NOTA: Quando si rifanno le striature dei candidati, non trasportare grandi quantità di cellule. Troppe cellule rendono impossibile distinguere i cloni KanR e KanS .
  3. Prelevare i cloni ancora bianchi e KanR generati al punto 4.2 dai resti della piastra e farli crescere indipendentemente in 1 mL di terreno di selezione (SC-L o SC-W, a seconda del vettore utilizzato per la costruzione della libreria) per una notte a 30 °C.
  4. Trasferire la coltura in una microprovetta e raccogliere le cellule mediante centrifugazione (~15.000 × g, per 10-30 secondi a temperatura ambiente). Isolare l'intero DNA dal pellet cellulare come segue.
  5. Sospendere il pellet cellulare in 400 μL di tampone di lisi (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8,0) e 1 mM EDTA) contenente 1 μL ciascuno di 2-mercaptoetanolo e 20 mg/mL di Zimoliasi 100T (vedere la Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 30 minuti per digerire le pareti cellulari. A questo punto, mescolare delicatamente capovolgendo il tubo ogni 5-10 minuti.
  6. Quando la sospensione cellulare è diventata opaca o traslucida, aggiungere un volume uguale di una miscela di fenolo-cloroformio-alcol isoamilico (25:24:1) e mescolare bene agitando a velocità moderata per 10-20 s.
  7. Centrifugare le microprovette in una microcentrifuga per 5 minuti alla massima velocità (~15.000 × g, a temperatura ambiente) e recuperare la fase acquosa contenente DNA in una nuova microprovetta. Aggiungere 0,8 volumi di isopropanolo e mescolare bene capovolgendo il tubo.
  8. Lasciare la provetta a temperatura ambiente per 2-3 minuti e poi centrifugare in una microcentrifuga per 4-5 minuti alla massima velocità (~15.000 × g, a temperatura ambiente) per far precipitare il DNA.
  9. Rimuovere il surnatante e lavare il precipitato con circa 500 μl di etanolo al 70%. Rimuovere completamente l'etanolo e asciugare brevemente il precipitato.
  10. Aggiungere 20 μl di tampone TE (10 mM Tris-Cl (8,0) e 1 mM EDTA) al precipitato, mescolare brevemente e lasciare la provetta per una notte a temperatura ambiente per sciogliere il precipitato.
    NOTA: Se gli utenti hanno fretta, mantenere i tubi a 37-50 °C. Il precipitato di DNA si dissolverà in poche ore.
  11. Una volta che il pellet è completamente sciolto, trasformare E. coli con una piccola quantità di questa soluzione di DNA.
    NOTA: Circa 0,5 μL di soluzione di DNA sono sufficienti se si utilizza E. coli con un'elevata efficienza di trasformazione.
  12. Quando compaiono colonie di E. coli , raccogli diverse colonie indipendenti, coltivale e recupera i plasmidi con metodi standard, come la lisi alcalina.
  13. Introdurre il DNA plasmidico ottenuto nel passaggio 4.12 nelle cellule ospiti Y2H che ospitano il plasmide esca. Quando compaiono i trasformanti, controllarli con il saggio del colore (dovrebbero apparire bianchi) e con il western blotting4 (dovrebbero esprimere una proteina della dimensione desiderata).
    NOTA: Il metodo post-alcalino12 è un modo semplice e veloce per preparare un estratto di cellule intere dal lievito.
  14. Se i due criteri di cui sopra sono soddisfatti, determinare il sito di mutazione dei cloni mediante sequenziamento nucleotidico4.

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Risultati

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Recentemente, è stato scoperto che la metà C-terminale della proteina Pol2 (Pol2-C) interagisce con Mcm10. Entrambe le proteine sono essenziali per l'inizio della replicazione del DNA e, quindi, per la crescita cellulare nel lievito Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Per aiutare a comprendere il significato biologico di questa interazione, i mutanti di Pol2-C che non hanno alcuna o diminuita interazione con Mcm10 sono s...

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Discussione

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Questo articolo descrive come isolare mutanti con interazione/alterati utilizzando il saggio Y2H. Tali mutanti sono potenti strumenti per analizzare la funzione di una proteina di interesse. Per isolare tali mutanti, i saggi rY2H sono stati sviluppati in precedenza modificando il ceppo ospiteY2H 2,3. Tuttavia, non hanno ridotto notevolmente la quantità di manodopera. Al contrario, i mutanti possono essere isolati con questo metodo senza una quantità significativa...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Y. Tanaka ha eseguito il miglioramento tecnico di Y2H. Questo lavoro è supportato dalla sovvenzione JSPS KAKENHI numero JP22K06336 e dall'Istituto per la fermentazione di Osaka.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.5 M EDTA (8.0)Nacalai Tesque Inc.14347-21
Soluzione SDS al 10%Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.313-90275
2-mercaptoetanoloFujifilm Wako Pure Chemical Corp.135-07522
2-propanoloKishida Chemical Co., Ltd.110-64785
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-Gal)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.021-07852
AgarFormediumAGR60
Ampicillina SodioFujifilm Wako Pure Chemical Corp.68-52-3
Tag anti-HA mAb-HRP-DirecT  Medico & Laboratori biologici Co. Ltd.M180-7
DNA da testicoli di salmoneMerck KGaA.D1626
EtanoloMerck KGaA.9-0770-4-4L-J
Carta da filtro per il sollevamento di colonie (Grado 50)Whatman, Cytiva1450-090
Carta da filtro per sollevamento di colonie (No.4A)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.
Carta da filtro per replicaplating (No.1)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.
G-418 SolfatoFujifilm Wako Pure Chemical Corp.075-05962
Acido cloridricoKishida Chemical Co., Ltd.230-37585
KClFujifilm Wako Pure Chemical Corp.163-03545
Acetato di litio diidratoNacalai Tesque Inc.20604-22
MgSO4&toro; 7H2OFujifilm Wako Pure Chemical Corp.131-00405
Na2HPO4&toro; 12H2ONacalai Tesque Inc.10039-32-4
NaClNacalai Tesque Inc.31319-45
NaH2PO4&toro; 2H2ONacalai Tesque Inc.31717-25
Tovagliolo di cartaAS ONE Corp.7-6200-02
Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico 25:24:1Nacalai Tesque Inc.25970-56
DNA plasmidico: il progetto nazionale di biorisorse - lievito (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Kit di isolamento plasmidicoNippon Genetics Co., Ltd.FG-90502
Polietilenglicole #4.000Nacalai Tesque Inc.11574-15
SC doppio forcellino -Leu -TrpFormediumDSCK172
Kit di clonazione senza saldatura (montaggio In-Fusion)Takara Bio Inc.#639648
Latte scremato in polvereFujifilm Wako Pure Chemical Corp.190-12865
Streptomicina solfatoFujifilm Wako Pure Chemical Corp.3810-74-0
Taq polimerasi (GoTaq Green Master Mixes)Promega Corp.M7122
TRIS (idrossimetil) amminometanoFormediumTRIS01
Triton X-100Nacalai Tesque Inc.12967-45
TriptoneThermoFisher scientifico Inc.
Tween 20Nacalai Tesque Inc.35624-15
Estratto di lievitoThermoFisher scientific Inc.212750
Lievito Base di Azoto (YNB)per medioCYN0210
Zimoliasi 100TNacalai Tesque Inc.Codice 07665-55
0141109000011150, 211705

Riferimenti

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