Il virus adeno-associato viene prodotto in coltura cellulare in sospensione e purificato mediante centrifugazione a gradiente di densità a doppio iodixanolo. Sono incluse misure per aumentare la resa totale del virus, diminuire il rischio di precipitazione del virus e concentrare ulteriormente il prodotto finale del virus. I titoli finali attesi raggiungono10-12 particelle virali/mL e sono adatti per l'uso preclinico in vivo .
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Articolo metodologico
Produzione e purificazione in coltura in sospensione di virus adeno-associati mediante centrifugazione a gradiente di densità di iodixanolo per applicazioni in vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive la produzione e la purificazione di virus adeno-associati ricombinanti (rAAV) mediante centrifugazione a gradiente di densità dello iodio, un metodo sierotipo-agnostico di purificazione dell'AAV descritto per la prima volta nel 1999. I vettori rAAV sono ampiamente utilizzati nelle applicazioni di terapia genica per veicolare transgeni a vari tipi di cellule umane. In questo lavoro, il virus ricombinante è prodotto dalla trasfezione di cellule Expi293 in coltura in sospensione con plasmidi che codificano per il transgene, il capside vettore e i geni helper adenovirali. La centrifugazione a gradiente di densità dello iodixanolo purifica le particelle AAV complete in base alla densità delle particelle. Inoltre, in questa metodologia ormai onnipresente sono incluse tre fasi al fine di aumentare la resa totale del virus, diminuire il rischio di precipitazione a causa della contaminazione delle proteine e concentrare ulteriormente il prodotto virale finale, rispettivamente: precipitazione di particelle virali da terreni cellulari utilizzando una soluzione di polietilenglicole (PEG) e cloruro di sodio, l'introduzione di un secondo ciclo di centrifugazione a gradiente di densità dello iodixanolo, e lo scambio di tamponi tramite un filtro centrifugo. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere costantemente titoli nell'intervallo di10-12 particelle virali/mL di eccezionale purezza per l'uso in vivo .
Introduzione
I vettori virali adeno-associati ricombinanti (rAAV) sono strumenti ampiamente utilizzati per il trattamento di malattie genetiche, tra cui l'atrofia muscolare spinale, la distrofia retinica e l'emofilia A 1,2,3. I vettori rAAV sono ingegnerizzati per mancare dei geni virali presenti nell'AAV4 wild-type, un piccolo virus icosaedrico senza involucro con un genoma lineare di DNA a singolo filamento di 4,7 kb. L'AAV è stato scoperto per la prima volta negli anni '60 come contaminante dei preparati di adenovirus5. Nonostante le sue ....
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Protocollo
La composizione delle soluzioni e dei tamponi utilizzati in questo protocollo è fornita nella Tabella 1.
| Soluzione | Composizione | |
| Tampone di lisi AAV | 1,2 mL di soluzione 5 M di NaCl | |
| 2 mL di soluzione 1 M Tris-HCl pH 8,5 | ||
| 80 uL di soluzione di 1 M di MgCl2 | ||
| mQ acqua fino a 40 mL | ||
| Soluzione di precipitazione AAV | ||
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Risultati
Questo metodo può essere utilizzato per ottenere titoli di almeno10-12 particelle virali per ml. Un titolo può essere ottenuto (Figura 3) mediante qPCR utilizzando i primer ITR forniti nella Tabella supplementare 1, mediante ddPCR o con qualsiasi altro metodo di titolazione. Titoli non ottimali potrebbero derivare dall'uso di un gene cap che codifica per un capside con scarsa efficienza di confezionamento.
Un'altra possibile fo.......
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Discussione
Il protocollo di purificazione a gradiente di densità a doppio iodixanolo è il metodo universale perché è applicabile a qualsiasi variante mutante AAV, indipendentemente dalla loro specificità recettoriale. I primi metodi di purificazione dell'AAV si basavano sulla densità delle particelle e includevano la centrifugazione isopicnica in CsCl e la centrifugazione continua a gradiente di densità del saccarosio19. Successivamente, sono stati sviluppati approcci sierotipo-specifici, che hanno fatto uso.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni da segnalare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Centrifuga da banco 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| pompa peristaltica a 8 canali | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Contacellulare automatizzato | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E centrifuga ad alta velocità | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Armadio di sicurezza biologica | Incubatore 322491101 | ||
| CO2 con agitatore... | Fissato a 8% CO2 e 37 ° C | ||
| Provette da centrifuga coniche | Thermo Scientific 339652 | 50 mL | |
| Provette da centrifuga coniche | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Micropipette monouso | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillari |
| salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza CaCl2 e MgCl2 (DPBS) (10 volte) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL | Nikon | ||
| Expi293 Mezzo di espressione | Gibco | A1435101 | |
| celle Expi293F | Gibco | A14527 | |
| Punte filtranti | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 &; L |
| Puntali filtranti | USA Scientific | 1120-8810 | 200 &; micro; L |
| Puntali filtranti | USA Scientific | 1120-1810 | 20 &; micro; L |
| Puntali filtranti | USA Scientific | 1121-3810 | 10 &; micro; L |
| Aghi ipodermici | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Secchiello per il ghiaccio con coperchio | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotore | Beckman Coulter | 368690 | |
| Soluzione di cloruro di magnesio (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Supporto e morsetto in metallo | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Provette per microcentrifuga | Eppendorf | 22600028 | 1,5 mL |
| Pinza | |||
| Optima XE-90 Ultracentrifuga | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Ridotto Siero Medio | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep Terreni a gradiente di densità (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | Soluzione di iodixanolo al 60% |
| P1000 | Pipet Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Fenolo rosso soluzione | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmide pCapsid | De novo o Addgene, ecc. | N/A | Abbiamo usato pACGrh74. |
| Plasmide pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmide pTransgene | De novo o Addgene, ecc. | N/A | Abbiamo utilizzato pdsAAV-GFP. |
| Soluzione di poliolo Pluronic F-68 (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polietilenglicole 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polietilenimmina HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Diluire in acqua a 40 μ M |
| Provette da centrifuga in polipropilene, sterili | Corning | 431123 | 500 mL |
| Provette da centrifuga in polipropilene, sterili | Corning | 430776 | 250 mL |
| Provette Optiseal in polipropilene | Beckman Coulter | 361625 | |
| Pipette sierologiche | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Pipette sierologiche | Alkali Scientific | SP225-B | da 25 mL |
| Alkali Scientific | SP210-B | ||
| Pipette sierologiche | Alkali Scientific | SP205-B | da 5 mL |
| Fisherbrand | PBV1000 | 1 L | |
| Flaconi shaker | Fisherbrand | PBV50-0 | da 500 mL |
| Fisherbrand | PBV250 | 250 mL | |
| Palloni agitatori | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Soluzione di cloruro di sodio (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Siringhe sterili | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Filtro per siringa | Millipore | SLGV013SL | 0,22 micron |
| Tris-HCl pH 8,5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue soluzione | Gibco | 15250061 | |
| Montaggio rack tubo | Beckman Coulter | 361646 | |
| Distanziali tubo (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubi per pompa peristaltica | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Tipo 70 Ti rotore in titanio ad angolo fisso | Beckman Coulter | 337922 | |
| Congelatore a bassissima temperatura | Impostato a -70 ° C | ||
| Concentratore centrifugo Vivaspin 20 | Sartorius | VS2041 | |
| Bagnomaria | Impostato a 37 ° E |
Riferimenti
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S.
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Ristampe e permessi
