Produzione e purificazione in coltura in sospensione di virus adeno-associati mediante centrifugazione a gradiente di densità di iodixanolo per applicazioni in vivo

I vettori virali adeno-associati ricombinanti (rAAV) sono strumenti ampiamente utilizzati per il trattamento di malattie genetiche, tra cui l'atrofia muscolare spinale, la distrofia retinica e l'emofilia A ^1,2,3. I vettori rAAV sono ingegnerizzati per mancare dei geni virali presenti nell'AAV⁴ wild-type, un piccolo virus icosaedrico senza involucro con un genoma lineare di DNA a singolo filamento di 4,7 kb. L'AAV è stato scoperto per la prima volta negli anni '60 come contaminante dei preparati di adenovirus⁵. Nonostante le sue piccole dimensioni del capside, che limitano la dimensione del transgene che può essere impacchettato a un massimo di 4,9 kb escludendo ITRs⁶, l'AAV è utile per il rilascio del transgene perché non è patogeno nell'uomo, consente l'espressione del transgene in molti tipi di cellule in divisione e non in divisione e ha effetti immunogenici limitati⁷.

Come membri del genere dependoparvovirus, la produzione di rAAV si basa sull'espressione di geni helper presenti nell'adenovirus o nel virus dell'herpes simplex⁸. Sono state sviluppate diverse strategie per produrre rAAV, ma la produzione in cellule HEK293 trasformate con i geni adenovirali E1A/E1B helper è il metodo più consolidato utilizzato oggi⁹. L'approccio generale alla produzione di rAAV inizia con la trasfezione di cellule HEK293 con tre plasmidi contenenti il transgene all'interno di ripetizioni terminali invertite (ITR), geni AAV rep e cap e geni helper adenovirali aggiuntivi, rispettivamente. Settantadue ore dopo la trasfezione, le cellule vengono raccolte e processate per purificare rAAV contenente il transgene.

Nello sviluppo di nuovi vettori rAAV per scopi terapeutici, un obiettivo importante è la produzione di vettori con una maggiore efficienza di trasduzione. Un aumento dell'efficienza di trasduzione delle cellule bersaglio significherebbe una diminuzione della dose clinica necessaria di rAAV, diminuendo così la probabilità di effetti immunogenici avversi che vanno dalla neutralizzazione mediata da anticorpi a tossicità acute^10,11. Per migliorare l'efficacia di trasduzione dei vettori rAAV, è possibile apportare modifiche al genoma impacchettato o al capside. I metodi praticabili per regolare l'efficacia della trasduzione attraverso la progettazione del genoma impacchettato includono l'incorporazione di promotori forti e tessuto-specifici, una selezione ponderata degli elementi di elaborazione dell'mRNA e l'ottimizzazione della sequenza codificante per migliorare l'efficienza della traduzione¹². Le alterazioni del capside vengono effettuate con l'obiettivo di aumentare il tropismo per i tipi di cellule umane bersaglio. Gli sforzi verso lo sviluppo di nuovi capsidi vettoriali di trasporto del transgene rAAV sono generalmente caratterizzati da un focus sulla progettazione razionale di capsidi AAV con mutazioni specifiche che hanno come bersaglio specifici recettori cellulari o sull'evoluzione diretta per identificare capsidi con tropismo per specifici tipi di cellule da librerie di capsidi combinatori ad alta complessità senza mirare a un recettore specifico (sebbene alcuni gruppi combinino questi approcci)^{13, 14,15}. Nell'approccio dell'evoluzione diretta, le librerie combinatorie del capside sono costruite utilizzando una particolare spina dorsale del sierotipo con regioni variabili mutate all'esterno del capside¹⁶. Le librerie combinatorie di capsidi sono spesso costruite a partire da sierotipi AAV non originati nell'uomo, riducendo il rischio di immunità preesistente durante l'uso clinico¹⁰. Pertanto, i metodi di purificazione che possono essere applicati a qualsiasi sierotipo sono ideali per eliminare la necessità di un'ottimizzazione sierotipo-specifica per i sierotipi meno comunemente usati che fungono da spina dorsale per queste librerie.

La centrifugazione a gradiente di densità dello iodixanolo viene utilizzata per purificare titoli elevati di rAAV con elevata infettività¹⁷. In questo protocollo, l'rAAV viene prodotto in coltura cellulare in sospensione per ridurre la quantità di lavoro necessaria per produrre grandi titoli di AAV. È inclusa anche una fase di centrifugazione per eliminare il lisato cellulare per ridurre la presenza di proteine contaminanti e diminuire il rischio di precipitazione del virus. Questo protocollo è un metodo economico per produrre preparati di rAAV ad alta purezza adatti all'uso preclinico.

La composizione delle soluzioni e dei tamponi utilizzati in questo protocollo è fornita nella Tabella 1.

Tabella 1: Composizioni delle soluzioni utilizzate in questo protocollo.

1. Tripla trasfezione delle cellule Expi293

1. Seme: Expi293 cellule (vedi Tabella dei materiali) ad una densità iniziale di 5 x 10⁵ cellule vitali (vc)/mL.
2. Lasciare incubare le cellule a 37 °C con l'8% di CO₂ e una velocità dell'agitatore di 125 giri/min fino a raggiungere una densità di 3-5 x 10⁶ vc/mL. Monitora la densità e la vitalità cellulare utilizzando l'esclusione del blu di tripano con un contatore di cellule automatizzato (vedi Tabella dei materiali).
3. Quando le cellule raggiungono la densità cellulare desiderata, dividerle da 1 a 10 aggiungendo terreni freschi in modo che il loro volume totale sia dieci volte il loro volume originale. Se necessario, trasferire le cellule in un pallone più grande. Ritorno all'incubazione.
4. Continuare ad espandere le cellule come descritto nei passaggi 1.2-1.3 fino a raggiungere una densità di almeno 2 x 10⁶ vc/mL in 250 mL di terreno in un matraccio da 1 L.
5. Il giorno prima della trasfezione, diluire le cellule a 2 x 10⁶ vc/mL in 250 mL di terreno, scartando le cellule in eccesso se necessario. Incubare le cellule per una notte.
6. Il giorno della trasfezione, centrifugare metà delle cellule a 58 x g per 5 minuti a 18 °C. Risospendere il pellet cellulare nello stesso volume (125 ml) di terreno fresco. La vitalità cellulare dovrebbe essere vicina al 98%.
7. Preparare due provette coniche da 50 ml. Etichettare uno "PEI" e l'altro "DNA".
8. Nella provetta conica marcata PEI, diluire 1,2 mL di PEI (polietilenimmina, vedere la tabella dei materiali) per un volume totale di 12,5 mL in terreni OptiMEM.
9. Nella provetta conica marcata con DNA, preparare una soluzione equimolare di DNA plasmidico per un totale di 500 μg di DNA in un volume totale di 12,5 mL in terreni OptiMEM.
10. Aggiungere la soluzione di DNA alla soluzione di PEI, capovolgere più volte per combinare accuratamente e lasciare incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
    NOTA: È fondamentale che la soluzione di DNA-PEI sia lasciata incubare per tutti i 10 minuti in modo che il PEI formi complessi carichi con il DNA.
11. Dopo che la soluzione di DNA-PEI è stata incubata per 10 minuti, utilizzare una pipetta sierologica per applicare lentamente la soluzione di DNA-PEImax alle cellule Expi293. Rimettere le cellule trasfettate nell'incubatrice e lasciarle incubare per 72 ore (Figura 1).

Figura 1: Cellule Expi293 che esprimono GFP due giorni dopo la trasfezione. Dopo la trasfezione con un plasmide contenente un gene per la GFP, le cellule Expi293 esprimono transitoriamente eGFP. La morfologia cellulare è rotonda. L'immagine è stata catturata con un tempo di esposizione di 15 ms. Le immagini al microscopio vengono acquisite utilizzando un microscopio invertito dotato di illuminazione a epifluorescenza e un obiettivo 10x/0,30. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Purificazione del vettore rAAV

1. Dopo 72 ore, trasferire le cellule in sospensione in due provette coniche da 250 mL e centrifugarle a 415 x g per 10 minuti a 4 °C.
2. Versare il terreno surnatante in una nuova provetta conica da 500 mL e conservare a 0 °C su ghiaccio per una successiva lavorazione.
3. Risospendere ciascun pellet cellulare in 10 mL di tampone di lisi AAV (Tabella 1). Raggruppare i due lisati insieme in una delle provette. Sciacquare l'altra provetta con altri 5 mL di tampone di lisi AAV, quindi aggiungerla ai lisati raggruppati. Congelare a -70 °C.
   NOTA: A questo punto l'esperimento può essere messo in pausa. Conservare il terreno surnatante a -70 °C anziché su ghiaccio.
4. Aggiungere un volume 1:4 di soluzione di precipitazione AAV al mezzo surnatante del passaggio 2.2. Capovolgere più volte per mescolare accuratamente e incubare a 0 °C su ghiaccio per almeno 2 ore o per tutta la notte.
5. Centrifugare la soluzione incubata a 3000 x g per 1 h a 4 °C.
6. Scartare il surnatante e risospendere il pellet contenente precipitato virale in 5 mL di tampone di lisi AAV.
7. Scongelare il lisato cellulare a 37 °C a bagnomaria.
8. Raggruppare il precipitato virale con il lisato cellulare. Questo è il lisato grezzo. Sciacquare la provetta di centrifugazione che conteneva il precipitato virale con altri 5 mL di tampone di lisi AAV e raggrupparla con il lisato grezzo.
9. Congelare il lisato grezzo a -70 °C, quindi scongelare a 37 °C. Ripeti questo ciclo ancora una volta.
   NOTA: Il lisato grezzo non deve essere lasciato a 37 °C per un periodo superiore a quello necessario per lo scongelamento.
10. Una volta scongelato per la terza volta, aggiungere immediatamente 4 μL di benzonasi al lisato grezzo, capovolgere per mescolare e incubare per 30 minuti a 37 °C.
11. Centrifugare il lisato grezzo per 10 minuti a 650 x g a 18 °C.
12. Trasferire il surnatante in una provetta conica pulita da 50 ml. Questo è il virus grezzo. Scartare il pellet.
13. Centrifugare il virus grezzo per altri 30 minuti a 3000 x g a 18 °C per eliminare le proteine contaminanti.
14. Trasferire il surnatante in una provetta conica pulita da 50 ml. Questo è il virus chiarificato.
    NOTA: A questo punto l'esperimento può essere messo in pausa. Congelare il virus chiarificato a -70 °C.
15. Installare la pompa peristaltica multicanale con quattro tubi peristaltici (vedere la tabella dei materiali). Fissare i capillari a entrambe le estremità di ciascun tubo.
16. Posizionare i capillari sul lato di ingresso della pompa in un becher riempito con acqua deionizzata. Posizionare i capillari sul lato di uscita della pompa in un bicchiere vuoto. Far funzionare la pompa peristaltica a 25.0 giri/min per lavare il tubo con acqua deionizzata (DI).
17. Una volta lavato accuratamente, svuotare il tubo peristaltico facendo funzionare la pompa fino a riempire il tubo solo con aria. Appoggiare tutti i capillari su una salvietta pulita e priva di lanugine.
18. Posizionare quattro provette per ultracentrifuga in un rack sul lato di uscita della pompa.
19. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 mL per erogare con cura 10 mL di virus chiarificato in ciascuna provetta per ultracentrifuga. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria.
    NOTA: Il volume di virus chiarificato in ciascuna provetta può essere allungato fino a 12 mL per provetta, se necessario. Ridurre la quantità di iodixanolo al 60% in modo appropriato nel passaggio 2.25 di seguito.
20. Il virus chiarificato viene ricoperto con frazioni di iodixanolo (Tabella 1) dalla densità più bassa alla densità più alta utilizzando la pompa peristaltica. La frazione del 15% viene aggiunta per prima, seguita dalla frazione del 25%, dalla frazione del 40% e infine dalla frazione del 60%. Trasferire 22 mL (5,5 mL per provetta per ultracentrifuga) della frazione di iodixanolo al 15% in una provetta conica pulita da 50 mL. Posizionare i capillari sul lato di ingresso della pompa nel tubo, facendo attenzione che tutti i capillari tocchino il fondo del tubo.
21. Avviare la pompa e lasciare che il tubo si riempia con la frazione di iodixanolo. Quando la frazione di iodixanolo raggiunge le estremità dei capillari sul lato di uscita della pompa, arrestare la pompa.
22. Inserire un capillare di uscita in ciascuna provetta di ultracentrifuga con il virus chiarificato, facendo attenzione che i capillari tocchino il fondo di ciascuna provetta di ultracentrifuga.
    NOTA: È di fondamentale importanza che non rimanga aria nei capillari. Lo iodixanolo può fluire attraverso il tubo peristaltico a velocità leggermente diverse, quindi assicurarsi che ogni singolo capillare di uscita sia completamente riempito di iodixanolo prima di inserirlo nel virus chiarificato. Potrebbe essere necessario arrestare e avviare la pompa più volte.
23. Avviare la pompa e lasciare che le provette dell'ultracentrifuga si riempiano. Quando l'ultima frazione del 15% sta per essere immessa nei capillari di ingresso, arrestare la pompa. È fondamentale che nessuna bolla d'aria penetri nel tubo peristaltico.
    NOTA: Se le bolle d'aria entrano nei capillari di ingresso, la pompa può essere brevemente fatta funzionare nella direzione inversa per spingerle di nuovo fuori.
24. Trasferire 22 mL (5,5 mL per provetta per ultracentrifuga) della frazione di iodixanolo al 25% nella provetta conica da 50 mL. Fare attenzione che tutti i capillari tocchino il fondo del tubo e avviare la pompa. Quando l'ultima frazione del 25% sta per essere immessa nei capillari di ingresso, arrestare la pompa.
25. Ripetere il passaggio 2.24 con 20 mL (5 mL per provetta per ultracentrifuga) della frazione di iodixanolo al 40% e poi con 24 mL (6 mL per provetta per ultracentrifuga) della frazione al 60%.
26. Se nella provetta per l'ultracentrifuga è rimasto ancora del volume vuoto, continuare ad aggiungere altra frazione del 60% fino a quando le provette dell'ultracentrifuga non sono completamente riempite di liquido.
27. Riempi ogni tubo fino a quando il lisato non forma una cupola sopra la parte superiore ma non trabocca dal tubo. Arrestare la pompa e rimuovere con cautela ogni capillare di uscita, facendo attenzione a non disturbare il gradiente di iodixanolo.
28. Tappare ogni provetta per ultracentrifuga con un distanziatore e caricarla in un rotore Type 70 Ti (vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: Assicurarsi che il rotore sia adeguatamente bilanciato. Non tentare di utilizzare l'ultracentrifuga senza un'adeguata formazione.
29. Caricare il rotore Type 70 Ti nell'ultracentrifuga e centrifugare a 489.000 x g per 1 ora a 18 °C.
30. Dopo la centrifugazione, scaricare il rotore dall'ultracentrifuga. Utilizzare una pinza ad ago per rimuovere con cautela ciascuna provetta di ultracentrifuga dal rotore, facendo attenzione a non disturbare il gradiente di iodixanolo.
31. Utilizzare un supporto ad anello di supporto con morsetto per fissare una provetta per ultracentrifuga.
32. Collegare un ago da 20 GA a una siringa da 5 ml e mettere da parte. Utilizzare una salvietta priva di lanugine per rimuovere il tappo dalla provetta per ultracentrifuga.
33. Penetrare la parete della provetta per ultracentrifuga con l'ago circa 3 mm al di sotto dell'interfaccia iodixanolo al 40%-60% (Figura 2).
34. Aspirare lentamente l'interfaccia e parte della frazione del 40%. Evitare di aspirare la parte superiore della frazione al 40%, per un prelievo totale di circa 4 mL.
35. Tenendo un dito sulla parte superiore aperta della provetta per ultracentrifuga, estrarre la siringa e trasferire la frazione AAV aspirata in una provetta conica da 50 mL. Gettare la siringa in un contenitore per oggetti taglienti. Scartare la provetta per ultracentrifuga.
36. Ripetere i passaggi 2.31-2.35 per ciascuna provetta per ultracentrifuga.
37. Diluire la frazione di AAV aspirata circa due volte nel tampone di lisi AAV fino a un volume di 40 mL.
38. Sciacquare il tubo peristaltico come descritto nei passaggi 2.16-2.17.
    NOTA: A questo punto l'esperimento può essere messo in pausa. Conservare la frazione di AAV diluita a 0 °C per una notte.
39. Caricare 20 mL ciascuno della frazione AAV diluita in due nuove provette per ultracentrifuga.
40. Per il secondo ciclo di centrifugazione in gradiente di densità dello iodio, la frazione AAV diluita viene sottoposta come descritto sopra utilizzando solo 10 mL (5 mL per provetta per ultracentrifuga) della frazione al 40% e 14 mL (7 mL per provetta per ultracentrifuga) della frazione al 60%. Ripetere i passaggi 2.29-2.36 per l'ultracentrifugazione e l'aspirazione.
    NOTA: Prima di riporre la pompa peristaltica e il tubo, sciacquare il tubo con acqua deionizzata come descritto nei passaggi 2.16-2.17.

Figura 2: Gradiente di iodixanolo con interfaccia di iodixanolo al 40%-60% etichettata. (A) Primo gradiente di iodixanolo. Il rosso fenolo è utilizzato nelle frazioni di iodixanolo al 40% e al 60% di iodixanolo. Appare come un colore diverso a causa della differenza di pH tra le due frazioni. La freccia indica dove deve essere inserita la siringa per raccogliere la frazione rAAV, appena sotto l'interfaccia iodixanolo 40%-60%. (B) Secondo gradiente di iodixanolo. In questa fase vengono utilizzate solo le frazioni di iodixanolo al 40% e al 60%. La freccia indica il punto in cui la siringa deve essere inserita per raccogliere la frazione rAAV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Scambio tampone e concentrazione del virus

1. Dopo aver ottenuto la frazione AAV dal secondo ciclo di centrifugazione a gradiente di densità dello iodixanolo, diluirla due volte con una soluzione tampone AAV.
2. Equilibrare il filtro centrifugo aggiungendo 20 mL di soluzione tampone AAV sulla parte superiore del filtro. Centrifugare l'apparecchio a 3000 x g a 18 °C per 5 minuti ed eliminare il flusso.
3. Aggiungere la frazione AAV diluita al filtro centrifugo. Centrifugare l'apparecchio a 3000 x g a 18 °C per 5 minuti ed eliminare il flusso.
4. Aggiungere 20 mL di soluzione tampone AAV nella parte superiore del filtro. Centrifugare l'apparecchio a 3000 x g a 18 °C per 5 minuti ed eliminare il flusso.
   NOTA: Se la membrana del filtro centrifugo si ostruisce, causando un flusso inefficiente della soluzione, utilizzare con cautela una micropipetta P200 per aspirare su e giù la soluzione nella parte superiore del filtro. Prestare la massima attenzione a non toccare il filtro con il puntale della micropipetta.
5. Ripetere il passaggio 3.4 altre due volte.
   NOTA: Assicurarsi che l'AAV non sia eccessivamente concentrato mantenendo almeno 1 mL di volume nella parte superiore del filtro. Potrebbe essere necessario regolare i tempi di centrifugazione per evitare un'eccessiva concentrazione. Se l'AAV è troppo concentrato, possono verificarsi precipitazioni.
6. Per un titolo finale compreso tra 10^{e 12} vg/mL, ridurre il virus a un volume finale di circa 1 mL.
   NOTA: A seconda della spina dorsale del sierotipo utilizzato e dell'efficienza di confezionamento del virus, potrebbe essere necessario concentrare il virus in un volume inferiore.
7. Utilizzare una micropipetta p1000 per trasferire l'AAV concentrato dalla parte superiore del filtro centrifugo in una provetta per microcentrifuga. Utilizzare una micropipetta p200 per lavare il filtro centrifugo con 50 μL di tampone AAV per raccogliere eventuali virus rimanenti e raggrupparli con il resto dell'AAV concentrato.
8. Mettere da parte un'aliquota di 2 μL dell'AAV concentrato per la titolazione. Vedere la Tabella supplementare 1 per visualizzare i primer ITR che possono essere utilizzati per la qPCR.
9. Passare l'AAV concentrato attraverso un filtro per siringa da 0,2 μm per sterilizzarlo.
   NOTA: Quando si sterilizza un piccolo volume, fare attenzione a selezionare un filtro per siringa con un diametro ridotto per ridurre al minimo la perdita di virus. L'uso di un filtro a basso legame proteico di piccolo diametro si tradurrà in una perdita virale minima (dati non mostrati).
10. L'AAV sterilizzato può essere utilizzato immediatamente per trasdurre le cellule o conservato a 4 °C per l'uso entro quattro settimane. Deve essere conservato a -70 °C per una conservazione a lungo termine.

Questo metodo può essere utilizzato per ottenere titoli di almeno10-12 particelle virali per ml. Un titolo può essere ottenuto (Figura 3) mediante qPCR utilizzando i primer ITR forniti nella Tabella supplementare 1, mediante ddPCR o con qualsiasi altro metodo di titolazione. Titoli non ottimali potrebbero derivare dall'uso di un gene cap che codifica per un capside con scarsa efficienza di confezionamento.

Un'altra possibile fonte di risultati non ottimali è la scarsa efficienza di trasduzione delle cellule Expi293. Si raccomanda di avere cellule ad una densità di 3-4 x 106 vc/mL il giorno della trasfezione e che la vitalità cellulare sia vicina al 98%. Nel presente studio, gli autori hanno ottenuto un titolo di 1,07 x 1012 vg seguendo questo protocollo. Questa resa è in linea con le precedenti rese ottenute dal confezionamento AAVrh7418.

Figura 3: Determinazione del titolo mediante qPCR. La curva 1 è stata generata con una concentrazione standard di 3,66 x 1011 vg/mL, la curva 2 è stata generata con una concentrazione standard di 3,66 x 1010 vg/mL, la curva 3 è stata il campione finale di AAV concentrato, la curva 4 è stata generata con una concentrazione standard di 3,66 x 109 vg/mL e la curva 5 è stata generata con una concentrazione standard di 3,66 x 108 vg/mL. Ogni reazione qPCR è stata eseguita in duplicato. (A) curva di amplificazione qPCR. Gli standard sono stati generati mediante diluizione seriale di uno standard AAV tittered mediante ddPCR. La concentrazione dello standard non diluito era di 3,66 x 1012 vg/mL. (B) Curva standard generata mediante qPCR. L'AAV prodotto è risultato avere una concentrazione di 1,85 x 1011 vg/mL in 5,75 mL, per una resa totale di 1,07 x 1012 vg. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Sequenze di primer avanti e indietro per ripetizioni terminali invertite (ITR) AAV. Fare clic qui per scaricare il file.

Gli autori non hanno divulgazioni da segnalare.