Method Article

Differenziamento e caratterizzazione di osteoclasti da cellule staminali pluripotenti indotte umane

DOI:

10.3791/66527

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March 22nd, 2024

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1Department of Bioengineering, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Orthopedics and Trauma Surgery, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta il differenziamento degli osteoclasti umani dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e descrive i metodi per la caratterizzazione degli osteoclasti e dei precursori degli osteoclasti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive in dettaglio la propagazione e il passaggio delle iPSC umane e la loro differenziazione in osteoclasti. In primo luogo, le iPSC vengono dissociate in una sospensione unicellulare per un ulteriore utilizzo nell'induzione del corpo embrioide. A seguito dell'induzione mesodermica, i corpi embrioidi subiscono una differenziazione ematopoietica, producendo una popolazione di cellule ematopoietiche fluttuanti. Successivamente, le cellule ematopoietiche prelevate subiscono una fase di maturazione del fattore stimolante le colonie di macrofagi e, infine, il differenziamento degli osteoclasti. Dopo la differenziazione degli osteoclasti, gli osteoclasti sono caratterizzati dalla colorazione per TRAP in combinazione con una colorazione nucleare verde metile. Gli osteoclasti sono osservati come policarioni TRAP+ multinucleati. La loro identificazione può essere ulteriormente supportata dalla colorazione con la catepsina K. I saggi di riassorbimento osseo e minerale consentono la caratterizzazione funzionale, confermando l'identità degli osteoclasti in buona fede. Questo protocollo dimostra un metodo robusto e versatile per differenziare gli osteoclasti umani dalle iPSC e ne consente una facile adozione in applicazioni che richiedono grandi quantità di osteoclasti umani funzionali. Potrebbero essere previste applicazioni nei settori della ricerca sulle ossa, sul cancro, sull'ingegneria tissutale e sulla ricerca sulle endoprotesi.

Introduction

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Gli osteoclasti (OC) sono tipi di cellule di derivazione ematopoietica 1,2, versatili che sono comunemente usati dai ricercatori in aree come la ricerca sulle malattie ossee 3,4, la ricerca sul cancro 5,6, l'ingegneria tissutale 7,8 e la ricerca sull'endoprotesi 9,10. Ciononostante, il differenziamento degli OC può essere impegnativo in quanto la fusione di precursori mononucleari in OC multinucleati è necessaria per creare OC funzionali11. Diversi fattori biologici, come l'attivatore del recettore del ligando NF-κB (RANKL) e il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), sono necessari per la differenziazione dell'OC. È stato riportato che M-CSF ha un effetto positivo sulla proliferazione cellulare, sulla sopravvivenza cellulare e sull'espressione di RANK 12,13,14. D'altra parte, RANKL si lega a RANK, che attiva cascate di segnalazione a valle che inducono l'osteoclastogenesi. L'attivazione è mediata dal fattore 6 associato al recettore del TNF (TRAF6), che porta alla degradazione del fattore nucleare del potenziatore genico del polipeptide leggero kappa nell'inibitore delle cellule B, alfa (IκB-α), una proteina legante che lega i dimeri NF-kB16,17. Quindi, la degradazione di IκB-α rilascia dimeri di NF-kB, che poi traslocano nel nucleo e inducono l'espressione dei fattori di trascrizione c-Fos e del fattore nucleare delle cellule T attivate 1 (NFATc1). Questo, a sua volta, innesca la trascrizione di una moltitudine di proteine correlate al differenziamento OC15,18. Le proteine sovraregolate come DC-Stamp e Atp6v0d2 mediano la fusione cellula-cellula dei precursori OC, portando alla formazione del sincizio 19,20,21.

Per quanto riguarda le cellule primarie umane, le PBMC CD34+ e CD14+ sono attualmente i tipi cellulari più utilizzati per il differenziamento in OC22. Tuttavia, questo approccio è limitato dall'eterogeneità all'interno della popolazione CD34+ di cellule raccolte da donatori23 e dalla loro limitata espandibilità. Le iPSC umane rappresentano una fonte alternativa per gli OC. Poiché possono essere propagati indefinitamente24, consentono l'espandibilità e l'upscaling della produzione di OC. Ciò consente la differenziazione di un gran numero di OC, il che facilita la ricerca OC.

Sono stati pubblicati diversi protocolli per la differenziazione delle iPSC in OC 25,26,27. L'intero processo di differenziazione può essere suddiviso in una parte di propagazione delle iPSC, una parte di differenziazione mesodermica ed ematopoietica e una parte di differenziazione OC. La propagazione delle iPSC prima del processo di differenziazione consente l'aumento della produzione di OC prima della differenziazione. Esistono diversi approcci per quanto riguarda il differenziamento mesodermico ed ematopoietico. Tradizionalmente, la formazione di corpi embrioidi (EB) è stata utilizzata per differenziare le cellule ematopoietiche, ma gli approcci basati sul monostrato rappresentano un'altra strategia di differenziamento ematopoietico che non richiede l'induzione di EB. Ciononostante, i sistemi basati su monostrato sembrano richiedere un'ulteriore ottimizzazione, poiché noi e altri abbiamo trovato gli approcci basati sull'EB più robusti per la differenziazione degli OC.

Qui, descriviamo la differenziazione delle OC dalle iPSC umane utilizzando un protocollo basato su EB. Questo protocollo è stato adattato da Rössler et al.26 e modificato per aumentare la robustezza e consentire la crioconservazione durante il processo di differenziazione. In primo luogo, abbiamo raccolto cellule ematopoietiche solo una volta dopo 10 giorni di differenziazione. Le cellule ematopoietiche sono state quindi crioconservate per consentire una maggiore flessibilità durante il processo di differenziazione. Inoltre, abbiamo aumentato la densità di semina delle cellule ematopoietiche da 1 x 105 a 2 x 105 cellule/cm2 per la differenziazione OC. È stato utilizzato un terreno umano più recente privo di siero iPSC (hiPSC-SFM, vedi Tabella dei materiali) e il rivestimento dei pozzetti è stato eseguito con 200-300 μg/mL di un estratto di membrana basale (vedi Tabella dei materiali) invece dello 0,1% di gelatina. La penicillina/streptomicina non è stata aggiunta ai media.

Il protocollo di Rössler et al.26 è stato originariamente adattato da una iPSC a un protocollo di differenziazione dei macrofagi28 che utilizza la formazione di EB per la differenziazione ematopoietica. Mentre la formazione di EB è stata utilizzata per un lungo periodo di tempo dai ricercatori per la differenziazione ematopoietica29,30, in letteratura sono stati descritti diversi metodi di induzione di EB, come l'aggregazione spontanea, la centrifugazione in una piastra a pozzetti a fondo tondo, la coltura a goccia sospesa, la coltura di bioreattori, la coltura di tubi conici, il vaso laterale a rotazione lenta e la coltura di gel micromold31. Questo protocollo utilizza la centrifugazione di iPSC dissociate in una piastra a pozzetti a fondo tondo per avvicinare le singole cellule iPSC l'una all'altra e consentire la formazione di sfere (EB), come descritto di seguito.

Protocol

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NOTA: Tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo sono riportati nella Tabella dei materiali. Se non diversamente specificato, tutti i fluidi sono stati pre-bilanciati a 37 °C prima dell'uso. Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a 37 °C e utilizzando la modalità di accelerazione/decelerazione più lenta. Se non diversamente specificato, il surnatante viene sempre rimosso utilizzando pipette di vetro Pasteur monouso.

1. Scongelamento e propagazione delle iPSC umane

  1. Un giorno prima dello scongelamento delle iPSC, rivestire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di un estratto di membrana basale a una concentrazione di 200-300 μg/mL. Posizionare la piastra a pozzetto a 4 °C per una notte.
  2. Il giorno successivo, scongelare e trasferire le cellule in una provetta da 15 ml utilizzando una pipetta P1000. A goccia, aggiungere 5-7 mL di DMEM/F-12 con 15 mM di HEPES.
  3. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min. Rimuovere delicatamente le cellule dalla centrifuga e assicurarsi di non disturbare il pellet cellulare.
  4. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta di vetro Pasteur e risospendere le cellule in 1 mL di terreno privo di siero hiPSC (hiPSC-SFM contenente 10 μM di inibitore della Rho chinasi (ROCK) Y-27632) utilizzando P1000 con punte a foro largo.
  5. Aspirare l'estratto di membrana basale dal pozzetto rivestito il giorno precedente (passaggio 1.1) e trasferire 1 mL di hiPSC-SFM con 10 μM Y-27632 nel pozzetto. Aggiungere le iPSC risospese al pozzetto per raggiungere un volume finale di 2 mL per pozzetto.
  6. Agitare la piastra per distribuire uniformemente gli aggregati iPSC prima di metterli in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 .
  7. Eseguire cambi di terreno a giorni alterni utilizzando hiPSC-SFM (senza l'aggiunta dell'inibitore ROCK Y-27632). Le iPSC di solito raggiungono il 70-80% di confluenza dopo 3-4 giorni di propagazione.

2. Passaging di iPSC

  1. Un giorno prima del passaggio delle iPSC, rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con un estratto di membrana basale a una concentrazione di 200-300 μg/mL. Posizionare la piastra a pozzetto a 4 °C per una notte.
    NOTA: Verificare che le cellule abbiano raggiunto circa il 70-80% di confluenza. Assicurarsi che le iPSC non diventino eccessivamente confluenti (oltre l'80% di confluenza), in quanto ciò promuoverà la differenziazione spontanea.
  2. Iniziare a far passare le iPSC rimuovendo le regioni differenziate o le regioni con molti aggregati di iPSC morti sotto lo stereomicroscopio utilizzando puntali per pipette da 10 μL o 20 μL o un raschietto per cellule. Le regioni differenziate appariranno di colore più denso o più bianco.
    NOTA: Gli aggregati cellulari raschiati possono ancora attaccarsi parzialmente al fondo del pozzetto.
  3. Lavare più volte il fondo del pozzetto con una pipetta P1000 a foro largo per rimuovere eventuali aggregati che potrebbero essere ancora parzialmente attaccati al fondo del pozzetto.
  4. Scartare il terreno esaurito in cui sono state coltivate le iPSC che contiene gli aggregati di iPSC staccati. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
  5. Successivamente, aggiungere 1 mL di Dispase 5 U/mL per pozzetto. I bordi delle colonie di iPSC si solleveranno dalla piastra del pozzetto, che può essere osservata al microscopio stereoscopico dopo 3-5 minuti di incubazione a temperatura ambiente.
  6. Rimuovere con cautela Dispase per evitare di rimuovere gli aggregati leggermente staccati e aggiungere 1 mL di DMEM/F-12 con 15 mM di HEPES. Utilizzare un sollevatore cellulare monouso per tagliare gli aggregati in piccole dimensioni. La consistenza delle dimensioni degli aggregati di iPSC può essere migliorata con uno strumento di passaggio delle cellule staminali.
  7. Lavare via gli aggregati iPSC affettati con il terreno nel pozzetto e trasferire il terreno con gli aggregati in una provetta conica da 15 mL utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL o P1000 con una punta a foro largo.
  8. Sciacquare il pozzetto con DMEM/F-12 e trasferire il terreno nella provetta da 15 mL con gli aggregati iPSC.
  9. Centrifugare gli aggregati di iPSC affettati a 200 x g per 3 minuti. Rimuovere il surnatante con una pipetta di vetro Pasteur e aggiungere 2 mL di hiPSC-SFM per rimuovere e risospendere le iPSC utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL o P1000 con puntali a foro largo.
  10. Aspirare l'estratto di membrana basale rimanente dalle piastre a pozzetti prerivestite e aggiungere 1 mL di hiPSC-SFM a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti.
  11. Trasferire le iPSC in nuovi pozzetti di una piastra a 6 pozzetti in modo che il volume finale sia di 2 mL di hiPSC-SFM per pozzetto utilizzando un P1000 con punte a foro largo. A seconda della linea iPSC, i rapporti di divisione devono essere ottimizzati. In questo caso, è stato utilizzato un rapporto di divisione 1:6.
  12. Controllare il pozzetto per gli aggregati galleggianti e le dimensioni degli aggregati allo stereomicroscopio. Idealmente, la dimensione dell'aggregato dovrebbe essere compresa tra 50 e 200 μm.
  13. Agitare la piastra del pozzetto per distribuire uniformemente le cellule sulla piastra dopo che gli aggregati sono stati trasferiti e incubare a 37 °C al 5% di CO2 fino al 70-80% di confluenza.

3. Congelamento delle iPSC

  1. Per congelare le cellule iPSC, le cellule di passaggio come descritto sopra (vedere il passaggio del protocollo "2. Passaggio di iPSC"). Dopo che le cellule sono state tagliate in colonie e lavate via dal fondo del pozzetto (passaggio 2.10), centrifugare gli aggregati affettati a 200 x g per 3 minuti. Aspirare il surnatante.
  2. Aggiungere 1 mL di terreno di crioconservazione senza siero per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti alla provetta da 15 mL e risospendere gli aggregati affettati utilizzando un P1000 con punta a foro largo.
  3. Trasferire le cellule in criotubi preetichettati. Chiudere le provette e trasferire le provette in un contenitore di crioconservazione prerefrigerato a 4 °C. Conservare le cellule a -80 °C per 24-48 ore.
  4. Trasferisci crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
    NOTA: Un riepilogo schematico del processo di differenziazione OC è illustrato nella Figura 1.

4. Induzione del corpo embrioide

  1. Coltivare ed espandere un numero sufficiente di iPSC come descritto sopra per l'induzione dell'EB.
    NOTA: La produzione di OC può essere aumentata aumentando il numero di corpi embrioidi, che a loro volta producono una resa complessiva più elevata di cellule ematopoietiche. Un pozzetto di iPSC confluenti al 70-80% produce circa 8,4 x 105 cellule per pozzetto di un pozzetto a piastra a 6 pozzetti. Sono necessarie 12.500 iPSC unicellulari per formare un corpo embrioide.
  2. Aspirare il terreno esausto dalle colture di iPSC e risciacquare le colonie di iPSC con D-PBS.
  3. Aggiungere 0,5 mL di reagente di dissociazione a singola cellula preriscaldato a temperatura ambiente a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e agitare il recipiente di coltura per rivestire l'intera superficie del pozzetto. Incubare il recipiente di coltura a 37 °C per 5-8 minuti.
  4. Rimuovere il recipiente dall'incubatore, aspirare il reagente di dissociazione a singola cellula e aggiungere 1 mL del terreno di differenziazione di fase 1 ai pozzetti, costituito da terreno privo di siero hiPSC con 50 ng/mL di proteina morfogenetica ossea umana 4 (hBMP4), 50 ng/mL di fattore di crescita endoteliale vascolare umano-165 (hVEGF), 20 ng/mL di fattore di cellule staminali umane (hSCF), e 10 μM Y-27632.
  5. Staccare delicatamente le cellule risciacquando il pozzetto con il terreno Stage 1. Raggruppare le iPSC dissociate in una provetta conica da 15 mL.
  6. Aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione di fase 1 ai pozzetti e lavare via le cellule rimanenti o utilizzare un raschietto per cellule per le colonie che non si lavano via facilmente.
  7. Dopo aver trasferito tutte le cellule nella provetta, centrifugare a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per formare un pellet cellulare. Aspirare e risospendere le cellule in un totale di 2 mL di terreno di differenziazione prebilanciato Stage 1 utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL o una P1000 con punta a foro largo.
  8. Conta le cellule utilizzando un emocitometro o un dispositivo automatico per il conteggio delle cellule. Aggiungere il terreno alla provetta da 15 mL contenente la sospensione a cellula singola per ottenere una piastra di 12.500 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti a bassissimo attacco a fondo tondo in 100 μL del terreno di differenziazione di fase 1.
    NOTA: Al microscopio, le cellule appariranno come una sospensione unicellulare con cellule disperse in tutto il pozzetto.
  9. Centrifugare le piastre a 96 pozzetti per 3 minuti a 100 x g. Dopo la centrifugazione, le cellule dovrebbero iniziare ad assomigliare agli sferoidi se osservate al microscopio. Mettere la piastra in un incubatore a 37 °C per 24 ore.
  10. Cambiare metà del terreno il giorno 1 e il giorno 2 con il mezzo di differenziazione della fase 1. Per migliorare l'efficienza, utilizzare una pipetta multicanale per smaltire 50 μL del terreno di differenziazione esausto dello Stadio 1 in una capsula di Petri.
  11. Dopo aver smaltito il terreno dalla piastra a 96 pozzetti, verificare la presenza di EB sotto lo stereomicroscopio che potrebbero essere stati rimossi accidentalmente. Trasferire gli EB rimossi accidentalmente sulla piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta P1000 con puntali a foro largo.
  12. Aggiungere 50 μL di terreno di differenziazione fresco di fase 1 a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con attacco ultrabasso a fondo tondo utilizzando una pipetta multicanale.

5. Differenziamento ematopoietico

  1. Un giorno prima di iniziare la differenziazione ematopoietica, rivestire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di un estratto di membrana basale a una concentrazione di 200-300 μg/mL. Posizionare la piastra a pozzetto a 4 °C per una notte.
    NOTA: Ogni pozzetto riceverà 8 EB in un secondo momento di questo protocollo. A seconda del numero di EB preparati, rivestire i pozzetti in modo corrispondente.
  2. Aspirare l'estratto di membrana basale in eccesso e preriempire i pozzetti della piastra a 6 pozzetti con 3 mL del terreno di differenziazione di Stadio 2, costituito da un terreno basale ematopoietico a cui vengono aggiunti 2 mM di ultraglutammina, 55 μM di 2-mercaptoetanolo, 25 ng/mL di interleuchina umana 3 (hIL-3) e 100 ng/mL di fattore stimolante le colonie di macrofagi umani (hM-CSF).
  3. Utilizzando un P1000 con punte a foro largo, trasferire 8 EB in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Dopo il trasferimento, confermare a occhio o sotto lo stereomicroscopio che in ogni pozzetto sono presenti 8 EB.
    NOTA: Dopo 1 giorno, gli EB galleggianti aderiranno al fondo del pozzo. Nei 5-7 giorni successivi, dovrebbe diventare visibile una popolazione cellulare fluttuante comprendente cellule ematopoietiche. Il periodo di differenziazione ematopoietica può essere variato, a partire da 7 giorni. La differenziazione per 10 giorni ha mostrato una popolazione ematopoietica composta da grandi sottopopolazioni CD45+, CD14+ e CD11b+ .
  4. Dopo 5 giorni di trattamento con il terreno di differenziazione di fase 2, eseguire un cambio di terreno rimuovendo il terreno esausto e distribuendolo in una provetta conica da 50 ml. Pipettare lentamente per cercare di rimuovere il minor numero possibile di cellule flottanti e mantenere lo sforzo di taglio il più basso possibile. Il pipettaggio al microscopio stereoscopico può aiutare a evitare la rimozione accidentale delle cellule.
  5. Aggiungere immediatamente 1 mL di terreno di differenziazione fresco Stage 2 ai pozzetti. Al fine di recuperare eventuali cellule ematopoietiche galleggianti che potrebbero essere già presenti a questo punto del processo di differenziazione, non scartare il mezzo erogato. Piuttosto, centrifugare la provetta con il mezzo esausto a 300 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante.
  6. Aggiungere il terreno di differenziazione fresco di fase 2 alla provetta e risospendere per staccare le cellule che potrebbero essere state trasferite con il terreno esausto.
  7. Aggiungere 2 mL del terreno di differenziazione fresco di fase 2 con le cellule recuperate in ciascun pozzetto, che è stato precedentemente riempito con 1 mL di terreno di differenziazione di fase 2.
  8. Il giorno 10 della differenziazione ematopoietica, verificare la presenza di un gran numero di cellule ematopoietiche fluttuanti. Raccoglieteli raccogliendoli in una provetta da 50 ml. Possono essere congelati al 10% di DMSO, al 50% di FBS e al 40% di terreno o utilizzati immediatamente per differenziare le cellule in OC.

6. Maturazione M-CSF e differenziamento OC

  1. Cellule di seme ad una concentrazione di 200.000 cellule/cm2 su piastre di coltura tissutale trattate bene e trattate con alfa-MEM, integrate con FBS al 10% e 50 ng/mL hM-CSF.
  2. Per eseguire saggi funzionali o imaging, staccare le cellule mature M-CSF 3 giorni dopo la semina lavandole con PBS preriscaldato a 37 °C utilizzando un P1000 con punta a foro largo. Potrebbero essere necessarie ripetute fasi di lavaggio per staccare completamente le celle.
  3. Trasferire le cellule staccate in una provetta da 15 mL utilizzando una P1000 con punta a foro largo e centrifugare a 300 x g per 5 min. Scartare il surnatante.
  4. Risospendere e sciogliere il pellet cellulare con il mezzo di differenziazione OC, costituito da alfa-MEM integrato con FBS al 10%, 50 ng/mL hM-CSF e 80 ng/mL hRANKL. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un dispositivo automatico di conteggio delle cellule e riseminare le cellule mature M-CSF a una densità di 200,00-250,000 cellule/cm2 in un materiale di coltura appropriato per saggi funzionali o imaging (ad esempio, saggi di riassorbimento osseo, vetrini coprioggetti per l'imaging, ecc.).
  5. Differenziare con il mezzo di differenziazione OC per 7-9 giorni. Eseguire un cambio completo del terreno di coltura con il terreno di differenziazione OC fresco ogni 2-3 giorni.
    NOTA: Gli OC multinucleati compaiono in genere dopo 5-7 giorni.

Results

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Monitoraggio della morfologia cellulare durante tutto il processo di differenziamento
Tutti i risultati descritti di seguito sono stati generati utilizzando la linea MCND-TENS2 iPSC per il differenziamento OC. Questa linea di iPSC è stata precedentemente utilizzata in diversi studi32,33. Tuttavia, anche altre linee di iPSC sono state utilizzate con successo con questo protocollo di differenziazione.

Una valutazione visiva regolare rivela caratteristiche morfologiche diverse e distinte delle iPSC durante il processo di differenziazione in OC (Figura 2). Le colonie di iPSC (Figura 2A) sono state dissociate in una sospensione a singola cellula, che appare come singole cellule in tutta la piastra del pozzetto a fondo rotondo prima della centrifugazione (Figura 2B). Dopo la centrifugazione (fase 4.9 del protocollo), le cellule si raccoglieranno al centro della piastra a pozzetti a bassissimo attacco a fondo tondo e successivamente formeranno sfere (corpi embrioidi, EB, Figura 2C). Gli EB aumenteranno di due o tre volte di dimensioni durante il processo di differenziazione mesodermica (Figura 2D) e diventeranno facilmente visibili all'occhio alla fine del periodo di differenziazione di 4 giorni (Figura 2E). Gli EB possono essere visti aderire e fondersi con il fondo della piastra del pozzetto dopo il trasferimento nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti per la differenziazione ematopoietica (passaggio 5.3 del protocollo, Figura 2F). Dopo 7-8 giorni, grandi quantità di cellule ematopoietiche fluttuanti diventano visibili nel terreno di coltura (Figura 2G). Dopo la raccolta e la riplaccatura delle cellule ematopoietiche, segue una fase di maturazione M-CSF e viene avviata la differenziazione OC (fase 6.4 del protocollo). Entro 5-6 giorni, le cellule multinucleate con un grande corpo cellulare trasparente diventano visibili per la prima volta (Figura 2H). Un gran numero di cellule mononucleate è ancora visibile in questa fase. Dopo altri 2-3 giorni di differenziamento degli OC, gli OC si fonderanno ulteriormente con le cellule adiacenti per formare grandi policarioni con ancora più nuclei (Figura 2I).

Valutazione della popolazione ematopoietica derivata da EB
Il differenziamento ematopoietico può essere eseguito per un periodo di tempo variabile. In letteratura sono stati descritti periodi di tempo che vanno da 7 giorni fino a 9 settimane. In questo protocollo, la differenziazione ematopoietica viene eseguita per un periodo di 10 giorni. Abbiamo scoperto che 10 giorni di differenziazione ematopoietica hanno prodotto un basso numero di progenitori ematopoietici CD34+ precoci (0,53%, Figura 3A) e un numero maggiore di progenitori ematopoietici CD43+ in stadio intermedio (48,5%, Figura 3B). Più criticamente, quantità sufficienti di HPC CD45+ (96,2%, Figura 3C), CD14+ (33%, Figura 3D) e CD11b+ (35,9%, Figura 3E) sono state generate dopo un periodo di trattamento di 10 giorni per differenziarle ulteriormente in OC. Tuttavia, potrebbe essere necessario regolare e ottimizzare il periodo di trattamento con citochine per la differenziazione ematopoietica (fase 5.4 del protocollo) in base alla linea iPSC per generare quantità adeguate di cellule CD45+, CD14+ e CD11b+ .

In media, 6 milioni di cellule ematopoietiche sono state raccolte dopo 10 giorni di differenziazione da ciascun pozzetto con 8 EB.

Valutazione della morfologia e dell'attività del OC
A seguito del differenziamento degli OC, gli OC possono essere valutati morfologicamente e funzionalmente. I precursori OC vengono riseminati su vetrini da camera o vetrini coprioggetti dopo la fase di maturazione M-CSF per migliorare la qualità dell'immagine durante la colorazione per TRAP o Cathepsina K. La colorazione enzimatica TRAP dopo la differenziazione OC mostra OC grandi, multinucleati e positivi per TRAP (Figura 4A). Inoltre, si possono vedere cellule mononucleate leggermente positive alla TRAP intervallate tra OC multinucleari. I controlli negativi senza l'aggiunta di RANKL non mostrano OC multinucleare fuso. Ciononostante, è possibile rappresentare un piccolo numero di cellule mononucleate leggermente positive alla TRAP (Figura 4B).

Le immagini al microscopio laser a scansione confocale (CLSM) mostrano OC colorati per la catepsina K (turchese) e la F-actina (rosso) in combinazione con la colorazione nucleare DAPI (blu) (Figura 4C, 4D). Grandi OC multinucleari sono visibili quando trattati con RANKL secondo il protocollo, che descrive un'estesa struttura citoscheletrica di F-actina e una colorazione positiva per la catepsina K (Figura 4C). I controlli negativi senza l'aggiunta di RANKL, d'altra parte, non mostrano cellule multinucleari fuse.

Gli OC possono essere ulteriormente valutati funzionalmente misurando l'attività di riassorbimento. Per determinare l'attività di riassorbimento possono essere utilizzati saggi di riassorbimento osseo o minerale. Qui, i precursori OC sono stati seminati su pozzi rivestiti di fosfato di calcio e differenziati terminalmente. Ampie aree in cui il rivestimento minerale è stato riassorbito sono visibili in un colore grigio-bluastro (Figura 4E). Si possono identificare pozzi di riassorbimento di diverse dimensioni. Non riassorbito, il restante rivestimento di fosfato di calcio è visibile in marrone. La presenza di pozzi di riassorbimento conferma l'identità delle cellule multinucleate differenziate come OC. Inoltre, i pozzi di riassorbimento possono essere ulteriormente quantificati al fine di valutare e confrontare l'attività di riassorbimento. L'area totale del minerale riassorbito sulla superficie totale del pozzo può essere quantificata come misura percentuale. Inoltre, è possibile quantificare ulteriormente le dimensioni e il numero di pozzi di riassorbimento. I controlli negativi non trattati non hanno mostrato pozzi di riassorbimento (Figura 4F).

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Figura 1: Illustrazione schematica del processo di differenziazione degli osteoclasti dalle iPSC umane. Illustrazione disegnata da Hannah Blümke utilizzando Affinity Designer 2.1.1. L'illustrazione utilizza disegni utilizzati in precedenza33. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Immagini al microscopio durante il processo di differenziazione delle iPSC umane verso gli osteoclasti. (A) Colonie di iPSC indifferenziate durante la propagazione. (B) iPSC in pozzetti a fondo tondo dopo la dissociazione in una sospensione a singola cellula prima della centrifugazione. (C) IPSC a singola cellula raccolte centralmente dopo centrifugazione. (D) Gli EB crescono di dimensioni durante il periodo di differenziazione mesodermica di 4 giorni. (E) Corpi embrioidi visibili a seguito di differenziamento mesodermico. (F) A seguito del trasferimento dei corpi embrioidi su piastre a 6 pozzetti rivestite di estratto di membrana basale, i corpi embrioidi possono essere visti aderire e fondersi con il fondo del pozzetto. (G) Dopo 5-7 giorni di differenziazione ematopoietica, si può osservare un gran numero di cellule ematopoietiche fluttuanti nel terreno. (H) A seguito della maturazione di M-CSF, i primi osteoclasti con 3-4 nuclei compaiono dopo 5-7 giorni di differenziazione con RANKL. (I) Al termine del differenziamento degli osteoclasti, si possono osservare grandi cellule multinucleate. Barre della scala: A, D, F, G = 200 μm, B, C, H, I = 50 μm, E = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Analisi dei marcatori di superficie di cellule ematopoietiche derivate da corpi embrioidi mediante citometria a flusso. L'espressione dei marcatori consente l'analisi delle cellule ematopoietiche e l'identificazione di sottopopolazioni dopo il gating per singoletti singoletti e cellule vive. (A) Ontogeneticamente la popolazione di cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ precoci è molto piccola o assente in combinazione con questo protocollo. (B) Le cellule CD43+ costituiscono circa il 50% dell'intera popolazione. (C) Le cellule progenitrici ematopoietiche CD45+ in stadio avanzato costituiscono la maggior parte della popolazione ematopoietica con il 96,2%. (D, E) I precursori OC CD14+ e CD11b+ più diretti costituiscono rispettivamente il 33% e il 36%. In rosso: controllo negativo non colorato, in blu: controlli isotipici, in giallo: cellule colorate con il rispettivo anticorpo marcatore. I grafici utilizzano dati pubblicati in precedenza33. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Valutazione morfologica e funzionale di osteoclasti umani differenziati con iPSC. (A) La colorazione TRAP dopo il differenziamento degli osteoclasti mostra osteoclasti di grandi dimensioni, multinucleati e positivi a TRAP. Cellule mononucleate leggermente positive alla TRAP possono essere viste intervallate tra osteoclasti multinucleari. (B) I controlli negativi senza l'aggiunta di RANKL colorato per TRAP non mostrano osteoclasti multinucleari fusi. Ciononostante, è possibile raffigurare un piccolo numero di cellule mononucleate leggermente positive alla TRAP. (C) Le immagini al microscopio a scansione laser confocale di cellule ematopoietiche differenziate con osteoclasti su un vetrino coprioggetti colorato per F-actina (rosso) e catepsina K (turchese) in combinazione con colorante nucleare DAPI (blu) mostrano grandi osteoclasti positivi alla catepsina K multinucleata. (D) I controlli negativi senza l'aggiunta di RANKL mostrano simili a (B) cellule mononucleate con una densità cellulare inferiore. (E) La valutazione funzionale può essere effettuata valutando l'attività di riassorbimento degli osteoclasti. Per questo, la differenziazione degli osteoclasti viene eseguita su un test di riassorbimento osseo o minerale. Le immagini a pozzetto piastrellate acquisite con un microscopio a campo largo invertito in modalità di contrasto di fase raffigurano ampie aree di riassorbimento dello strato minerale di fosfato di calcio. L'attività di riassorbimento può essere ulteriormente quantificata misurando l'area di riassorbimento sull'area totale. (F) I controlli negativi senza l'aggiunta di RANKL non mostrano aree di riassorbimento. Barre graduate: A, B = 100 μm, C, D = 50 μm, E, F = 1 mm. Le immagini sono state modificate a partire da dati pubblicati in precedenza33. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

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Questo protocollo offre un metodo affidabile e robusto per differenziare le iPSC in OC. Tuttavia, ci sono diverse insidie che si possono incontrare durante il processo di differenziazione. Le linee di iPSC umane generate da cellule di diversa origine tissutale sono state differenziate con successo utilizzando questo protocollo33. Quando si congelano le iPSC (vedere il passaggio del protocollo "3. Congelamento delle iPSC"), un pozzetto nel punto di passaggio è stato congelato in un crioviale. Durante lo scongelamento (vedere il passaggio del protocollo "1. Scongelamento e propagazione di iPSC umane"), una crioviale è stata scongelata in un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Le diverse linee di iPSC si comporteranno in modo leggermente diverso e i tassi di proliferazione variano. Il tasso di suddivisione dovrà essere regolato di conseguenza.

Quando si fanno passare le iPSC o le si dissociano in una sospensione unicellulare per l'induzione dell'EB, è importante rimuovere eventuali colonie o aggregati spontaneamente differenziati di cellule morte per migliorare l'efficacia e l'efficienza della differenziazione mesodermica ed ematopoietica. Questo può essere fatto con uno stereomicroscopio utilizzando un raschietto per cellule, puntali per pipette da una pipetta P10 o P20 o uno strumento di raschiatura costruito da una pipetta Pasteur35.

Come accennato in precedenza, questo protocollo prevede la dissociazione delle colonie di iPSC in una sospensione unicellulare per l'induzione di EB, mentre con altri protocolli, le iPSC vengono lasciate come aggregati da centrifugare per l'induzione di EB36. È stato riportato che le dimensioni, il numero di cellule, la forma e la morfologia dell'EB influenzano la differenziazione 37,38,39. Pertanto, ipotizziamo che la dissociazione in una sospensione unicellulare consenta una migliore uniformità da EB a EB in termini di dimensioni e forma dopo la centrifugazione e, quindi, risultati più coerenti nella produzione di cellule ematopoietiche31.

Sono stati descritti altri metodi per l'induzione dell'EB. Tali metodi che utilizzano una sospensione a singola cellula in combinazione con l'inibitore ROCK per migliorare la sopravvivenza cellulare sono stati segnalati per essere vantaggiosi nel controllo delle dimensioni dell'EB e dell'esito della differenziazione31.

Il metodo di induzione EB con piastra a fondo tondo a 96 pozzetti descritto in questo protocollo è adatto per la produzione su larga scala di EB e consente l'aumento della produzione di OC. Recentemente sono stati descritti metodi più innovativi per il differenziamento ematopoietico senza una fase di induzione del corpo embrioide con il potenziale di facilitare il processo di differenziazione32. Ciononostante, questi protocolli non sono ancora stati stabiliti per la differenziazione dell'OC33.

Nel protocollo sopra menzionato, descriviamo il cambiamento del mezzo il giorno 5 del differenziamento ematopoietico. Un piccolo numero di cellule fluttuanti può già apparire intorno al 4-5° giorno di differenziazione. Per evitare di scartare le cellule galleggianti, il terreno deve essere raccolto in una provetta e centrifugato prima di essere scartato. Il pellet cellulare sul fondo della provetta deve quindi essere rimosso con il mezzo fresco e deve essere trasferito nuovamente nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Tuttavia, il significato della popolazione di cellule fluttuanti precoci nel differenziamento OC deve ancora essere determinato.

La produzione di cellule ematopoietiche può essere valutata utilizzando la citometria a flusso. Alte rese di cellule CD45+, CD14+ e CD11b+ sono auspicabili per la differenziazione degli osteoclasti33. È stato riportato che la crioconservazione delle cellule ematopoietiche galleggianti raccolte è impegnativa, con tassi di recupero generalmente limitati e bassa vitalità cellulare40,41. Mediante crioconservazione delle cellule ematopoietiche in un terreno di crioconservazione costituito per il 50% da un terreno di espansione cellulare ematopoietico privo di siero (vedi Tabella dei materiali), 40% FBS e 10% DMSO, siamo stati in grado di recuperare cellule con una vitalità cellulare di circa il 90,3% ± 2,62 SD (n = 7) dopo lo scongelamento.

L'osteoclastogenesi richiede la fusione di più precursori OC mononucleati per formare osteoclasti multinucleati in grado di riassorbimento minerale e osseo. Mentre le linee cellulari murine di precursori dell'OC richiedono semplicemente l'aggiunta di RANKL per indurre la formazione di OC42, i precursori umani richiedono M-CSF aggiuntivo per la sopravvivenza e la proliferazione cellulare43. OSCAR è stato recentemente scoperto come un recettore aggiuntivo coinvolto nella differenziazione OC, anche se solo il collagene di tipo I è stato finora identificato come ligando. Mentre la ricerca di OSCAR con OC derivati da iPSC è ancora limitata, le concentrazioni suprafisiologiche in vitro di RANKL e M-CSF in una linea cellulare murina sembrano bypassare la necessità di attivazione di OSCAR44, l'attivazione di OSCAR in vivo sembra essere un segnale costimolatorio necessario per l'osteoclastogenesi45. Un ulteriore fattore da considerare è la superficie della piastra del pozzetto. È noto che le proprietà superficiali chimiche46 e fisiche47 influenzano la differenziazione degli osteoclasti e possono promuovere o ostacolare il successo della differenziazione. Una certa eterogeneità all'interno della popolazione dei precursori appare anche fondamentale per il successo della fusione degli OC, poiché diversi fattori correlati alla fusione come CD47 e DC-STAMP agiscono in diversi stadi della fusione degli osteoclasti48.

In conclusione, questo protocollo consente di differenziare l'OC umano dalle iPSC per facilitare e accelerare la ricerca sull'OC.

Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

Acknowledgements

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Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Giachelli per il loro aiuto tecnico e supporto. Ringraziamo il Centro di Microscopia W. M. Keck e il direttore del Centro Keck, Dr. Nathanial Peters, per l'assistenza nell'ottenere le immagini di microscopia confocale e microscopia a campo largo. Si ringraziano inoltre la UW Flow Core Facility e il Flow Core Facility manager, Aurelio Silvestroni, per il supporto tecnico e l'assistenza. Infine, ringraziamo Hannah Blümke per il supporto con l'illustrazione e il graphic design.

Il finanziamento è stato fornito attraverso la sovvenzione R35 HL139602-01 del National Institutes of Health. Riconosciamo anche la sovvenzione NIH S10, la OD016240 S10 per il finanziamento dello strumento presso il W. M. Keck Center e la sovvenzione NIH 1S10OD024979-01A1 per il finanziamento dello strumento presso la UW Flow Core Facility.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoetanoloSigma AldrichM6250-10ML
Anticorpo - Anti-Catepsina K Abcamab19027
Anticorpo - Anticorpo CD45BD555485
APC - IgG1 di topo coniugato con APC, κ Controllo isotipoBD555751
Anticorpo - BV711-coniugato Anti-umano CD14BD563372
Anticorpo - BV711-coniugato IgG2b di topo, κ Controllo isotipoBD563125
Anticorpo - Capra Anti-coniglio IgG H& L Alexa Fluor® 647Abcamab150079
Anticorpo - PE-coniugato Anti-umano CD14R& D SystemsFAB3832P-025
Anticorpo - Integrina umana alfa M/CD11b coniugata PER& D SystemsFAB16991P-025
Anticorpo - PE-Cy7-coniugato Anti-umano CD34BD560710
Anticorpo - PE-Cy7-coniugato IgG1 di topo κ Controllo isotipo:BD557872
Anticorpo - PE/Cianina5-coniugato Anti-umano CD11bBiolegend301308
Anticorpo - PE/Cianina5-coniugato IgG1 di topo, κ Isotipo CtrlBiolegend400118
Anticorpo - PerCP-Cy5.5-coniugato IgG1 di topo κ AnticorpoBD550795
563521anti-umano CD43 BD coniugato PerCpCy5.5
CosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Contatore di cellule automatizzato Countess 3ThermoFisher16812556
Estratto di membrana basale con fattore di crescita ridotto qualificato per cellule staminali CultrexR& D Sytems3434-010-02Estratto di membrana basale
DAPIR& D Systems5748/10
Dispase (5 U/mL)STEMCELL Technologies7913
DMEM/F-12 con 15 mMHEPES Stem Cell36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)STEMCELL Technologies78211
Tecnologie IL-3STEMCELL umane78146.1
Fattore stimolante le colonie di macrofagi umani (hM-CSF)STEMCELL Technologies78150.1
Attivatore del recettore solubile umano del fattore nucleare-κ Ligando B (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
Fattore delle cellule staminali umane (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Human TruStain FcX (Soluzione di blocco del recettore Fc)Biolegend422301 Fattore di
crescita dell'endotelio vascolare umano-165 (hVEGF165)STEMCELL Technologies78073
Invitrogen Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
MEM &alfa;, nucleosidi, senza rosso fenoloThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855Terreno di crioconservazione senza siero
mTeSR Plus mediumSTEMCELL Technologies100-0276Terreno umano privo di siero iPSC (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera a 96 pozzetti, Nunclon trattato con sfera, fondo a forma di U MicropiastraThermo Scientific174925Fondo rotondo attacco ultra-basso piastra a 96 pozzetti
P1000 Punte a foro largoThermoFisher2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650Terreno di coltura cellulare ematopoietica
TrypLE Select Enzyme (1X), senza rosso fenoloThermo Fisher12563011Reagente di dissociazione a singola cellula
UltraglutamminaBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 Terreno cellulare ematopoietico senza sieroBioscience Lonza04-418QTerreno basale ematopoietico
micro;-Slide 8 pozzetti AltoIbidi80806
umano coniugato con , per il controllo dell'isotipo - Kit per il test di riassorbimento osseo &

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