Descriviamo un protocollo generale che integra l'analisi della spettrometria di massa ad alta risoluzione e il docking molecolare nella ricerca sulla medicina tradizionale cinese.
Articolo metodologico
Spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione per lo studio dei costituenti chimici della ginenura bicolore DC
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La separazione e l'analisi dei componenti chimici desiderati sono argomenti importanti per la ricerca fondamentale della medicina tradizionale cinese (MTC). La cromatografia liquida ad altissime prestazioni con spettrometria di massa tandem a tempo di volo a quadrupolo (UPLC-Q-TOF-MS/MS) è diventata gradualmente una tecnologia leader per l'identificazione degli ingredienti della MTC. Gynura bicolor DC. (BFH), un'erba perenne senza stelo utilizzata per la medicina e il cibo in Cina, ha effetti medicinali come eliminare il calore, inumidire i polmoni, alleviare la tosse, disperdere la stasi e alleviare il gonfiore. I polifenoli e i flavonoidi contengono numerosi isomeri, che ostacolano l'identificazione dei composti complessi nel BFH. Questo articolo presenta un protocollo sistematico per lo studio dei costituenti chimici del BFH basato sull'estrazione con solvente e su dati integrati tramite UPLC-Q-TOF-MS.
Il metodo qui descritto include protocolli sistematici per il pretrattamento dei campioni, la calibrazione MS, l'acquisizione MS, l'elaborazione dei dati e l'analisi dei risultati. Il pretrattamento del campione comprende la raccolta, la pulizia, l'essiccazione, la frantumazione e l'estrazione. La calibrazione MS consiste nella correzione multipunto e a punto singolo. L'elaborazione dei dati include l'importazione dei dati, la definizione del metodo, l'elaborazione dell'analisi e la presentazione dei risultati. In questo articolo vengono presentati i risultati rappresentativi del tipico modello di frammentazione degli acidi fenolici, degli esteri e dei glicosidi nella Gynura bicolor DC. (BFH). Inoltre, vengono discussi in dettaglio la selezione dei solventi organici, l'estrazione, l'integrazione dei dati, la selezione dell'energia di collisione e il miglioramento del metodo. Questo protocollo universale può essere ampiamente utilizzato per identificare composti complessi nella MTC.
Introduzione
La medicina tradizionale cinese (MTC) è stata praticata clinicamente in Cina per migliaia di anni e svolge un ruolo vitale nel mantenimento della salute del popolo cinese1. La composizione della MTC è varia e complessa e la MTC è stata ampiamente riportata in molti studi qualitativi incentrati sulla composizione chimica2. I componenti chimici della MTC possono essere approssimativamente suddivisi nelle seguenti categorie come alcaloidi, acidi organici, fenilpropanoidi, cumarine, lignani, chinoni, flavonoidi, terpenoidi, saponine triterpenoidi, saponine steroidee, glicosidi cardiaci e tannini3. Dato il gran numero di componenti sconosciuti e isomeri indistinguibili nella MTC, la separazione e l'analisi dei componenti chimici desiderati sono argomenti importanti per la ricerca fondamentale della MTC4.
La cromatografia liquida ad altissime prestazioni con spettrometria di massa a tempo di volo a quadrupolo (UPLC-Q-TOF-MS) è stata applicata per analizzare sostanze nella medicina tradizionale cinese (MTC), che possono essere separate mediante cromatografia liquida ad altissima prestazione 5,6. L'alta risoluzione della MS può fornire ampie informazioni sugli ioni, che vengono utilizzate per l'analisi del database con errore inferiore a 5 ppm7. Dopo aver attivato l'energia di collisione, la modalità MS secondaria può ottenere ioni frammento secondario, la cui intensità e numero sono influenzati dalla grandezza dell'energia8.
Gynura bicolor DC. (BFH), un'erba perenne senza stelo ampiamente utilizzata per la medicina e l'alimentazione (Figura 1A), è una pianta rara e in via di estinzione unica in Cina9. BFH ha abbondanti antociani, polifenoli, flavonoidi e una forte capacità antiossidante10. Il BFH ha effetti medicinali tra cui eliminare il calore, raffreddare il sangue, inumidire i polmoni, alleviare la tosse, disperdere la stasi, alleviare il gonfiore, alleviare il caldo estivo ed eliminare il calore. Pochi studi si sono concentrati sulla composizione chimica del BFH11. I polifenoli e i flavonoidi contengono numerosi isomeri, che rendono difficile l'identificazione dei composti complessi nel BFH. È necessario sviluppare un metodo universale per l'identificazione dei componenti chimici, che possa essere applicato a tutti i tipi di MTC. Questo studio mirava a riportare un protocollo sistematico per lo studio dei costituenti chimici del BFH basato sull'estrazione con solvente e dati integrati tramite UPLC-Q-TOF-MS.
Protocollo
1. Pretrattamento del campione
- Lavare l'intera erba di BFH in acqua pura fino a quando non ci sono depositi visibili e impurità. Mettere il BFH pulito in una pirofila e poi metterlo in forno (Figura 1B). Impostare il forno a 50 °C per 24 ore.
NOTA: L'intera pianta di BFH è stata raccolta nella provincia del Sichuan, in Cina. - Frantumare il BFH essiccato in un frantoio multifunzionale ad alta velocità. Trasferire la polvere grossolana in un setaccio da 50 maglie (Figura 1C). Raccogli la polvere fine in un sacchetto ermetico e conservala in una torre di essiccazione.
- Pesare con precisione sei campioni di BFH da 0,25 g ciascuno e metterli in sei matracci conici. Aggiungere 30 ml di solvente organico (50% etanolo-acqua, 70% etanolo-acqua, cloroformio, etere di petrolio, acetato di etile e alcool n-butilico) a ciascun flacone conico (Figura 1D).
- Trasferire la miscela in un sonicatore da bagno ad ultrasuoni per 30 minuti di estrazione a 25 °C. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 5 minuti. Preparare una siringa per iniezione e un filtro a membrana microporosa organica da 0,22 μm. Filtrare tutti i surnatanti in flaconi da 2 mL.
2. Calibrazione MS
- Utilizzando una pipetta da 1.000 μl, trasferire 500 μl di soluzione di idrossido di sodio 0,1 M in un matraccio tarato da 100 mL e quindi trasferire 450 μl di acqua deionizzata o ultrapura nel pallone tarato da 100 mL (Figura 2).
- Utilizzando una pipetta da 200 μl, aggiungere 50 μl di acido formico al matraccio tarato da 100 ml. Produrre un volume totale di 100 ml con 90:10 2-propanolo:acqua e sonicare la soluzione per 5 minuti. Etichettare il matraccio come soluzione di formiato di sodio 0,5 mM in acqua 90:10 2-propanolo e conservarlo in frigorifero.
NOTA: La soluzione di formiato di sodio scade dopo 1 settimana a temperatura ambiente. - Avviare il software di controllo UPLC-Q-TOF-MS e quindi aprire la finestra MS tune . Nel pannello di controllo del flusso del campione , impostare 25 μl/min nell'opzione Portata di infusione e selezionare C nell'opzione Serbatoio . Attendere circa 1 minuto per lo spurgo automatico fino alla fine.
- Fare clic sul pulsante Flusso per iniziare a erogare la soluzione di formiato di sodio. Fare clic sul pulsante Positivo per passare alla modalità ioni positivi e fare clic sul pulsante Sensibilità per passare alla modalità di sensibilità.
NOTA: Procedere al passaggio successivo fino a quando i picchi caratteristici del formiato di sodio non vengono visualizzati nella finestra dello spettro in tempo reale. - Nel software di controllo UPLC-Q-TOF-MS, aprire la finestra MS Console . Nella posizione sinistra, selezionare le opzioni SYNAPT XS e Intellistart in sequenza.
- Spuntare Crea calibrazione e fare clic sul pulsante Start . Fare clic sul pulsante Avanti e selezionare Profilo di calibrazione nel menu a discesa. Fare clic sul pulsante Avanti e selezionare la modalità Sensibilità in Polarità positiva . Fare clic sui pulsanti Avanti, Sintonizza pagina, Avanti e Avvia a turno.
- Passa alla finestra MS tune e fai clic sul pulsante Negativo per passare alla modalità ioni negativi. Torna alla finestra di MS Console .
- Spuntare Crea calibrazione e fare clic sul pulsante Start . Fare clic sul pulsante Avanti e selezionare Profilo di calibrazione nel menu a discesa. Fare clic sul pulsante Avanti e selezionare la modalità Sensibilità in polarità negativa . Fare clic sui pulsanti Avanti, Sintonizza pagina, Avanti e Avvia a turno.
- Nel pannello di controllo del flusso LockSpray , impostare una portata di 50 μl/min e fare clic sul pulsante Flusso per consentire alla soluzione LE di entrare nello spettrometro di massa. Passa alla finestra MS tune , seleziona LockSpray Source Setup e fai clic sul pulsante Avvia per iniziare la calibrazione.
3. Acquisizione di MS
- Passa all'interfaccia principale e fai clic con il pulsante destro del mouse sulla colonna File di ingresso per aprire il metodo di cromatografia liquida.
- Fare clic sul pulsante Ingresso e quindi impostare i parametri tra cui il tempo di esecuzione e il gradiente. Fare clic sul pulsante Autocampionatore e quindi impostare i parametri tra cui Tempo di esecuzione, Colonna e Campione. Fare clic sul pulsante Salva .
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla colonna Metodo MS per aprire il metodo di spettrometria di massa.
- Fare clic sul pulsante Informazioni e quindi impostare i parametri tra cui l'ora di fine, la polarità, la modalità analizzatore, la massa bassa, la massa elevata e l'energia di collisione del trasferimento della rampa. Fare clic sul pulsante OK e quindi sul pulsante Salva .
- Compila la tabella delle sequenze, incluso il nome del file, la fiala e il volume. Fare clic sul pulsante Salva .
- Selezionare la riga nella tabella di sequenza per l'esempio che si desidera eseguire. Fare clic sul pulsante Esegui e fare clic sul pulsante OK nella finestra che si apre.
4. Trattamento dei dati
- Avvia il software di analisi dei dati. Nella colonna Il mio lavoro , fare clic sul pulsante Importa dati MassLynx per aprire una nuova finestra.
- Fare clic sul pulsante con il segno più e controllare tutti e cinque i file raw dalla modalità positiva. Immettere un nome per il gruppo e fare clic sul pulsante Crea set di campioni UNIFI per avviare l'importazione dei dati (Figura 3A).
- Fare doppio clic sul file del metodo di analisi in modalità positiva. Fare clic sull'etichetta Elaborazione e fare clic sul pulsante Target per massa . Immettere il numero di 5 ppm nella casella di input dopo Tolleranza corrispondenza target e Tolleranza corrispondenza frammento.
- Fare clic sul pulsante Home e fare clic sul pulsante Addotti . Seleziona le righe di +H e +Na e fai clic sul pulsante destro a forma di freccia . Fare clic sul pulsante Salva (Figura 3B).
- Fare doppio clic sul file del metodo di analisi in modalità negativa. Fare clic sull'etichetta Elaborazione e fare clic sul pulsante Target per massa . Immettere il numero di 5 ppm nella casella di input dopo Tolleranza corrispondenza target e Tolleranza corrispondenza frammento.
- Fare clic sul pulsante Home e quindi fare clic sul pulsante Addotti . Seleziona le righe -H e +HCOO e fai clic sul pulsante a forma di freccia destra . Fare clic sul pulsante Salva .
- Nella colonna Il mio lavoro, fare clic sul pulsante Analisi per aprire una nuova finestra. Scegli i dati appena importati e il metodo appena creato, quindi fai clic sul pulsante Avanti. Inserisci il nome del file. Selezionare la cartella in cui sono memorizzati i dati dell'analisi e quindi fare clic sul pulsante Fine
- Fare clic sul pulsante Elabora e attendere alcuni minuti fino a quando non vengono visualizzati i risultati (Figura 3C).
- Copiare la tabella dei risultati in un modulo vuoto (Figura 3D).
5. Analisi dei risultati
- Selezionare un composto nella tabella dei risultati. Lo spettro di massa secondario corrispondente verrà visualizzato nell'angolo in basso a destra (Figura 4A).
- Fare clic sul pulsante a forma di tabella e selezionare l'opzione Frammenti ad alta energia per visualizzare la tabella degli ioni frammento secondario (Figura 4B).
- Selezionare uno ione frammento secondario nella tabella. Sposta il mouse sul picco ionico corrispondente allo spettro di massa secondario e la frattura strutturale corrispondente verrà visualizzata sullo schermo (Figura 4C).
NOTA: Valutare manualmente la ragionevolezza della fessurazione fornita dal software e distinguere gli isomeri in base agli ioni del frammento secondario. - Disegna manualmente il modello di frammentazione nel software di disegno.
NOTA: Esempi di modelli di frammentazione sono descritti in dettaglio nella sezione dei risultati rappresentativi.
Risultati
L'identificazione della composizione chimica del BFH è stata utilizzata come modello per visualizzare i risultati rappresentativi. Cromatogrammi di picco di base di Gynura bicolor DC estratta con solvente. sono mostrati nel file supplementare 1-Figura supplementare S1-S6 e il tempo di ritenzione osservato (RT), il nome del componente, la formula, il rapporto massa/carica (m/z) e l'errore di massa sono elencati nelle tabelle S1-S6. Nello ZBTK, tutti i 35 tipi di composti sono stati identificati da picchi separati in UPLC-TOF-MS. Come mostrato nel File Supplementare 1-Tabella Supplementare S1, le principali sostanze chimiche contenevano acido (acido chinico, acido DL-malico, acido citrico, acido o-cumarico e acido 3-O-trans-cumaroilchinico), glicosidi (gentiopicrina, picroside II, suffruticoside J, copollina e borneolo-2-O-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-D-glucoside) ed esteri (bilobalide, trimetilcitrato e trans-O-glucosil-metil-trans-cinnamato). Nella ZBTK-CT sono stati rilevati 25 tipi di composti extra (Supplemental File 1-Supplemental Table S2) e sono stati osservati 45 tipi di composti totali.
Quando il cloroformio è stato utilizzato come estrattore, sono stati trovati tutti i 50 composti. Tra questi, i 28 tipi di composti extra includevano acido coronarico, acido sanleng, agrimolo A e metilartemisato (File supplementare 1-Tabella supplementare S3). Quando l'etere di petrolio è stato utilizzato come estrattore, sono stati osservati 44 tipi di composti totali. Abbiamo trovato 17 tipi di composti extra tra cui notopterolo, onjisaponina e cnideolo B (File supplementare 1-Tabella supplementare S4). Un totale di 65 composti sono stati ottenuti in solvente utilizzando l'acetato di etile come estrattore. Rispetto ai quattro estratti precedenti, sono stati notati 37 composti extra come la dafnetina, l'acetovanillone B e lo stigmasterolo-3-O-β-D-glucoside (Supplemental File 1-Supplemental Table S5). Nell'estratto di alcol butilico, abbiamo trovato 67 tipi di composti totali, che contenevano 26 tipi di composti extra tra cui rengyoside C, cromoni, aturametelina F e deacetilmatricarina-8-O-β-D-glucopiranoside (File supplementare 1-Tabella supplementare S6). In sintesi, abbiamo trovato 168 composti sulla base di tutti i risultati dei composti di sei estrattori.
Per comprendere a fondo la via di scissione dei tipi di composti in UPLC-TOF-MS, abbiamo selezionato tre composti come esempi. Per gli acidi, l'acido 3-O-trans-cumarosilchinico con m/z = 337,09222 potrebbe perdere un gruppo C7H10O5 o C9H8O2 attraverso la reazione di idrolisi per formare intermedi con m/z = 163,04116 o 199,05557, rispettivamente (Figura 4D). Per gli esteri, il trans-O-glucosil-metil-trans-cinnamato con m/z = 385,11308 potrebbe essere convertito in intermedio con m/z = 153,07485 o 135,04679 tramite scissione C-C in siti diversi (Figura 4E). Per i glicosidi, la citricina C con m/z = 385,11308 si è trasformata in intermedio con m/z = 272,09174 attraverso la scissione del legame C-C nella catena alifatica, mentre la perdita del gruppo C7H6O2 ha dato luogo a un intermedio con m/z = 113,02534 (Figura 4F). In un'altra via, la rottura del legame C-O-C sull'anello benzenico ha portato alla formazione di un intermedio con m/z = 163,11245, mentre l'unità esosa è scomparsa.
I risultati rappresentativi del docking molecolare hanno rivelato strutture 2D e 3D rispettivamente nella Figura 4G,H. L'analisi dell'arricchimento dell'ontologia genica ha mostrato i risultati della funzione genica in termini di processo biologico (BP), componente cellulare (CC) e funzione molecolare (MF; Figura 4I). L'analisi dell'annotazione del percorso dell'Enciclopedia di Kyoto dei geni e dei genomi ha mostrato i risultati del percorso dei geni espressi in modo differenziale, che potrebbero essere utilizzati per comprendere ulteriormente la funzione dei geni (Figura 4J). I risultati dettagliati del docking molecolare sono mostrati nel File Supplementare 1-Tabella Supplementare S7 e nel File Supplementare 1-Figura Supplementare S7-S9.
Figura 1: Metodo di pretrattamento della medicina tradizionale cinese. (A) Gynura bicolor DC. (B) Pulizia e asciugatura. (c) Polverizzazione. (D) Aggiunta di solventi organici. (E) Estrazione ad ultrasuoni. (F) Centrifugazione della miscela. (G) Filtrazione del surnatante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Procedura operativa di UPLC-Q-TOF-MS/MS. (A) Preparazione di formiato di sodio. (B) Calibrazione dell'asse di massa. (C) Sintonizzazione MS. (D) Posizionamento del campione. (E) Acquisizione dello spettro di massa. (F) Visualizzazione dello spettro di massa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Elaborazione e integrazione dei dati. (A) Conversione dei dati. (B) Modifica del metodo. (C) Trattamento dei dati. (D) Analisi statistica dei risultati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi approfondita dei risultati. (A) Spettro di massa secondario. (B) Display secondario di ioni frammento. (C) Visualizzazione del sito di frattura. (D) modello di frammentazione 1. (E) Modello di frammentazione 2. (F) Modello di frammentazione 3. (G) Dimostrazione dell'obiettivo d'azione del principio attivo. (H) Struttura 3D del target d'azione del principio attivo. (I) Analisi dell'arricchimento OB. (J) Analisi delle annotazioni del percorso KEGG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Identificazione di composti, risultati del docking molecolare, cromatogrammi di picco di base e analisi di rete. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
Oltre al decotto d'acqua12, l'estrazione con solvente organico è un altro metodo comune di pretrattamento della MTC13. Secondo il principio della dissoluzione di fase simile, numerosi componenti sono stati estratti dalla combinazione di vari solventi organici14. L'estrazione assistita da ultrasuoni è uno dei principali metodi utilizzati per ottenere componenti in TCM15. L'estrazione con anidride carbonica supercritica è utile per estrarre alcuni tipi di sostanze come i lignani16. Inoltre, l'estrazione assistita da microonde in liquidi ionici (IL) è stata studiata come alternativa alle estrazioni convenzionali con solventi organici17. Tuttavia, il controllo preciso dell'energia delle microonde è difficile da ottenere, il che può causare reazioni secondarie come la disidratazione dell'eterificazione e la disidratazione dell'esterificazione.
Le impostazioni ottimali dell'energia di collisione possono produrre ulteriori informazioni sui frammenti MS del secondo ordine. Le informazioni provenienti dalla MS tandem, cioè la modalità MSE , sono state fornite da due scansioni alternate parallele utilizzando sia una bassa energia per ottenere informazioni sugli ioni molecolari sia un'alta energia per ottenere ioni di frammenti di massa accurati a scansione completa18. Durante l'impostazione dei parametri ad alta energia, l'intervallo di 10-35 V viene solitamente utilizzato nell'energia di collisione del trasferimento della rampa per migliorare l'efficienza di frammentazione del precursore19.
La grande quantità di dati grezzi MS è stata generata da MS ad alta risoluzione. I dati grezzi MS, che includevano picchi di ioni molecolari nello spettro MS e picchi di ioni frammento nello spettro MS/MS, devono essere accuratamente elaborati e integrati. Il software di analisi dei dati MS mirava ad analizzare tutti i metaboliti in un campione biologico in modo completo20. Lo screening dei metaboliti solfatati si è basato sull'acquisizione dipendente dai dati di scansioni MS complete e di dati multidimensionali sui metaboliti21. Sulla base dell'evoluzione della tecnologia, la previsione dell'intelligenza artificiale sarà una direzione di sviluppo fattibile per l'analisi dei dati MS.
La maggior parte dei composti può essere identificata con questo metodo. Tuttavia, i frammenti secondari limitati non sono in grado di identificare completamente tutti gli isomeri, compresi i flavonoidi e i tannini. Per ottenere l'identificazione della struttura, i ricercatori possono utilizzare la spettrometria di massa tandem per fornire ulteriori informazioni sugli ioni frammento, che aiutano nell'identificazione delle strutture composte8. Data la limitazione della sorgente di ionizzazione chimica a ioni elettrospray o a pressione atmosferica, la MS ad alta risoluzione non è adatta per l'analisi di macromolecole. La ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice può promuovere la ionizzazione di grandi composti molecolari, come le proteine22. In sintesi, UPLC-Q-TOF-MS/MS è una delle tecniche più ampiamente applicabili per l'identificazione dei composti MTC. Ha il potenziale per essere applicato ad altri campi, tra cui la medicina clinica e la chimica energetica.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (82104881), dal team per l'eredità e l'innovazione del trattamento delle malattie immunitarie MTC, dal progetto di ricerca scientifica medica di Chongqing (progetto congiunto della Commissione sanitaria di Chongqing e dell'Ufficio per la scienza e la tecnologia) (2022DBXM007), da un progetto speciale per l'incentivazione delle prestazioni e l'orientamento dell'Istituto di ricerca scientifica di Chongqing (cstc2022jxjl120005), da un progetto speciale per la Chongqing Postdoctoral Science Foundation (2022CQBSHTB3035), Programma di talenti medici senior di Chongqing per Yong e di mezza età, il programma per le istituzioni scientifiche di Chongqing (progetto di ricerca indipendente n. 2022GDRC015).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| cloroformio | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | CAS 67-66-3 | |
| etanolo | ChuandongChemical | CAS 64-17-5 | |
| acetato di etile | ChuandongChimico | CAS 141-78-6 | |
| cromatografo liquido | Waters | ACQUITY Classe 1 più | |
| software | |||
| di controllo MassLynx Waters V4.2 MSalcool n-butilico | ChuandongChemical | CAS 71-36-3 | |
| etere di petrolio | ChuandongChemical | CAS 8032-32-4 | |
| Spettrometria di massa a tempo di volo a quadrupolo | Waters | SYNAPT XS | |
| UNIFI | Waters | Software di analisi dati |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
