Rivelare il fenotipo ferroptotico del medulloblastoma

La feroptosi è un tipo di morte cellulare reattivo dipendente dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS)^{1 di} recente. Oltre ai ROS, il ferro svolge un ruolo cruciale in questo tipo di morte cellulare, da cui il nome². La fase finale ed esecutiva della ferroptosi è l'accumulo catalizzato dal ferro del danno ossidativo dei lipidi nella membrana plasmatica che alla fine porta alla compromissione dell'integrità della membrana e della permeabilità selettiva e, infine, alla morte cellulare per bolle. L'evento di idroperossidazione lipidica è un fenomeno naturale; Tuttavia, la sua propagazione in tutta la membrana cellulare è impedita dalla difesa antiossidante della cellula. Il principale attore in questo contesto è la proteina Se glutatione perossidasi 4 (GPx4), che può avvicinarsi alla membrana e convertire gli idroperossidi lipidici nei loro derivati alcolici meno tossici³. Il potere riducente della GPx4 è fornito principalmente, ma non esclusivamente, dal glutatione (GSH), un tripeptide composto da aminoacidi non essenziali: glicina, glutammato e cisteina. L'aminoacido limitante per la biosintesi del GSH è la cisteina⁴. Sebbene la cisteina sia classificata come aminoacido non essenziale, il suo fabbisogno può facilmente superare la sua produzione interna nelle cellule altamente proliferative (come le cellule tumorali). Per questo motivo è stato riclassificato nel gruppo degli aminoacidi semi-essenziali. L'importazione necessaria di cisteina avviene principalmente attraverso il sistema Xc-, che consente l'importazione della forma ossidata (dominante) di cisteina (nota anche come cistina) a scapito dell'esportazione di glutammato⁵. Il sistema Xc- è composto da una subunità di trasporto Na+-indipendente, dipendente da Cl, nota come xCT, e da una subunità chaperon, nota come CD98. Fino a poco tempo fa, le proprietà antiferroptotiche dell'asse xCT-GSH-GPx4 sono state viste come uniche e irreplicabili⁶. Tuttavia, nel 2019, è stata descritta una via anti-ferroptotica alternativa, costituita dall'ubichinolo (Coenzima Q10) e dal suo enzima rigenerativo - la proteina soppressore della ferroptosi 1 (FSP1), ^7,8. Poco dopo, è stato riportato un altro sistema disintossicante dell'idroperossido lipidico che coinvolge GTP cicloidrolasi-1/tetraidrobiopterina (GCH1/BH4)⁹. Ciononostante, il ruolo centrale dell'asse xCT-GSH-GPx4 nella prevenzione della ferroptosi non sembra essere messo in discussione.

Nell'ultimo decennio, la ferroptosi è stata ampiamente studiata in una varietà di tipi di tumore, mostrando un grande potenziale come strategia antitumorale (rivisto da Lei et ^al.10). Inoltre, è stato riportato che le cellule tumorali che mostrano un'elevata resistenza ai chemioterapici convenzionali e/o una propensione a metastatizzare sono sorprendentemente sensibili agli induttori della ferroptosi, come gli inibitori della GPx4 11,12,13. Tuttavia, nel contesto dei tumori cerebrali, il potenziale degli induttori ferroptotici rimane ampiamente poco studiato. Mentre questo tipo di morte cellulare è stato strettamente associato al danno da ischemia-riperfusione cerebrale¹⁴e alle malattie neurodegenerative¹⁵, il suo potenziale nel contesto dei tumori cerebrali è stato principalmente limitato al glioblastoma, il tumore craniocerebrale maligno più comune (rivisto da Zhuo et ^al.16). D'altra parte, la sensibilità del medulloblastoma, il più comune tumore maligno pediatrico al cervello e una delle principali cause di mortalità infantile, agli induttori della ferroptosi rimane in gran parte inesplorata. Per quanto ne sappiamo, esiste una scarsa letteratura peer-reviewed che collega ferroptosi e medulloblastoma. Tuttavia, alcuni studi hanno rivelato che il ferro svolge un ruolo cruciale nella sopravvivenza, nella proliferazione e nel potenziale tumorigenico delle cellule staminali tumorali (CSC) sia del medulloblastoma che del glioblastoma17,18, rendendole potenzialmente più vulnerabili all'induzione della ferroptosi. Ciò è particolarmente significativo in quanto il medulloblastoma è noto per la sua sottopopolazione di CSC, o cellule che iniziano/propagano il tumore, che sembrano essere in gran parte responsabili della chemioresistenza, della disseminazione e della recidiva del tumore¹⁹.

La sensibilità all'induzione della ferroptosi è tipicamente studiata misurando il contenuto/accumulo di idroperossido lipidico, che può o meno portare alla morte cellulare. Gli induttori della ferroptosi più comunemente usati sono (1) la erastina, un inibitore del trasportatore xCT²⁰, (2) RSL3, un inibitore dell'enzima GPx4² e/o (3) donatori di ferro, come il citrato ferro-ammonico (FAC)²¹. Il contenuto di idroperossido lipidico viene valutato utilizzando la sonda selettiva BODIPY 581/591 C11²², che ha massimi di eccitazione ed emissione a 581/591 nm nel suo stato ridotto. In seguito all'interazione e all'ossidazione da parte degli idroperossidi lipidici, la sonda sposta i suoi massimi di eccitazione ed emissione a 488/510 nm. Tipicamente, un aumento significativo del contenuto di idroperossido lipidico precede la morte cellulare ferroptotica. Poiché la ferroptosi non è una morte cellulare programmata, non esiste una cascata di segnali molecolari che porti alla sua esecuzione. Pertanto, l'unico modo per confermarlo è monitorare il contenuto di idroperossido lipidico e utilizzare inibitori specifici per questo tipo di morte cellulare, come la ferrostatina 1²³. La ferrostatina 1 è un antiossidante lipofilo in grado di penetrare nel compartimento lipidico della cellula e detossificare gli idroperossidi lipidici, prevenendo così gli eventi ferroptotici.

Il presente studio è stato condotto utilizzando linee cellulari di medulloblastoma DAOY wild-type (WT), che sono state coltivate a 37 °C con il 5% di CO₂ in terreno DMEM integrato con l'8% di FBS. La linea cellulare deleta con xCT è stata mantenuta nelle stesse condizioni, con esperimenti condotti in terreni integrati con 1 mM di N-acetilcisteina (NAC). Le cellule sono state regolarmente sottoposte a screening per micoplasma utilizzando un kit di rilevamento del micoplasma disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) e sono state coltivate fino al 10^° passaggio.

1. Raccolta e semina delle cellule

NOTA: Tutte le fasi vengono eseguite utilizzando tecniche asettiche sterili in una cappa a flusso laminare per colture tissutali. Le cellule di medulloblastoma DAOY sono aderenti, il che significa che tutte le cellule non attaccate possono essere scartate mediante lavaggio con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza Ca²⁺ e Mg²⁺.

1. Prendere la piastra di Petri (piastra di Petri, diametro 100 mm) con le celle e rimuovere le celle galleggianti e il terreno dalla piastra utilizzando un aspiratore.
2. Aggiungere 5-10 ml di PBS alla piastra, lavare il fondo con movimenti circolari della piastra, quindi rimuovere il PBS dalla piastra utilizzando un aspiratore.
3. Aggiungere 1 mL di tripsina (diluizione 10x) al piatto. Incubare la piastra fino a quando un leggero tocco della piastra non rimuove le cellule. Prelevare 10 mL di terreno di coltura DMEM integrato con FBS all'8% e raccogliere meccanicamente le cellule dalla piastra.
4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
5. Prelevare 500 μl della sospensione cellulare e metterla in una cuvetta per il conteggio. Contare il numero di cellule per mL di sospensione cellulare. Per questo studio è stato utilizzato un contatore automatico di celle (vedi Tabella dei materiali).
6. Calcola il volume necessario da prelevare dalla sospensione cellulare per avere 1.00.000 di cellule.
7. Prelevare una piastra a 6 pozzetti e aggiungere il volume calcolato della sospensione cellulare in ciascun pozzetto, quindi aggiungere il terreno di coltura DMEM integrato con l'8% di FBS a 2 mL in ciascun pozzetto.

2. Trattamento delle cellule

NOTA: Il controllo e i trattamenti sono condotti in triplice copia. I gruppi sono i seguenti: Controllo (DMSO), 1 μM di erastina, 0,3 μM di RSL3, 250 μM di FAC, 2 μM di Ferrostatina 1, 1 μM di erastatina + 2 μM di Ferrostatina 1, 0,3 di μM RSL3 + 2 μM di Ferrostatina 1, 250 μM di FAC + 2 μM di Ferrostatina 1. Per l'esperimento sono necessarie quattro piastre a 6 pozzetti, come indicato nella Tabella 1). I dettagli commerciali di tutti i reagenti necessari sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. 24 ore dopo la semina, aggiungere il trattamento corrispondente al pozzetto con le cellule.
2. Lasciare le piastre a 37 °C e 5% di CO₂ nell'incubatrice.

3. Colorazione con idroperossidi lipidici delle cellule trattate con sonda BODIPY 581/591 C11

NOTA: La soluzione madre della sonda specifica per l'idroperossido lipidico viene preparata in DMSO a una concentrazione di 1 mM. Le aliquote della soluzione madre sono conservate a -20 °C in tubi non trasparenti. Per la colorazione, preparare una soluzione di lavoro da 2 μM della sonda in terreno DMEM integrato con FBS all'8%.

1. 6 ore dopo il trattamento, osservare le cellule al microscopio ottico (l'arrotondamento delle cellule dovrebbe essere visibile).
2. Estrarre le piastre dall'incubatore e posizionarle in una cappa a flusso laminare per colture tissutali.
   Utilizzando un aspiratore, rimuovere il terreno e le celle galleggianti (morte).
3. Aggiungere delicatamente 2 mL di PBS a ciascun pozzetto, lavare il fondo con movimenti circolari delle piastre a 6 pozzetti, quindi rimuovere il PBS dai pozzetti utilizzando un aspiratore.
4. Aggiungere 2 mL della soluzione di lavoro della sonda (concentrazione finale di 2 μM in DMEM integrato con FBS).
5. Lasciare la capsula nell'incubatrice a 37 °C e 5% di CO₂ per 30 minuti al buio (le piastre possono essere avvolte in un foglio di alluminio).

4. Analisi in citometria a flusso del contenuto di idroperossido lipidico nelle cellule trattate

NOTA: Tutti i passaggi seguenti vengono eseguiti al buio (nessuna luce nella cappa a flusso laminare).

1. Estrarre le piastre dall'incubatore e posizionarle in una cappa a flusso laminare per colture tissutali.
   Utilizzando un aspiratore, rimuovere la soluzione colorante.
2. Aggiungere delicatamente 2 mL di PBS a ciascun pozzetto, lavare il fondo con movimenti circolari delle piastre a 6 pozzetti, quindi rimuovere il PBS dai pozzetti utilizzando un aspiratore.
3. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio e aspirare l'eventuale PBS rimanente dal pozzetto utilizzando un aspiratore.
4. Aggiungere 150 μl di un reagente di dissociazione cellulare disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) sul fondo di ciascun pozzetto e incubare la piastra fino a quando il tocco delicato della piastra non rimuove le cellule. Prelevare 250 μl di tampone FACS (PBS, 2 mM EDTA, 0,5% BSA) e raccogliere meccanicamente le cellule dai pozzetti.
5. Trasferire le celle nella provetta FACS corrispondente (precedentemente contrassegnata) con il tappo del filtro. Posizionare la provetta con le cellule sul ghiaccio al buio fino a quando non viene eseguita l'analisi (l'analisi deve essere condotta entro un'ora dalla colorazione).
   NOTA: La configurazione e la calibrazione della macchina FACS dipendono dalla macchina utilizzata (vedere la tabella dei materiali).
6. Crea un nuovo esperimento e dagli un nome (Ferroptosi in DAOY - idroperossidi lipidici).
7. Nel disegno dell'esperimento, scegli il laser (488 nm) e il filtro (FITC).
8. Nella visualizzazione dei dati, selezionare la dimensione corretta della cella (>12 μm), impostare le tensioni PMT (la popolazione cellulare dovrebbe apparire nel primo quadrante del dot plot SSC-H/FSC-H) e bloccare il dot plot.
9. Aggiungi un nuovo grafico - istogramma, con FITC-A sull'asse y e scala logaritmica.
10. Vorticare i campioni nel tubo FACS, posizionarli nella macchina FACS e caricare il campione. Registra 10.000 eventi di singoletto FSC e assegna un nome al file (ad esempio, DAOY WT CTL 6h). Esportare il file in formato .fcs.

5. Colorazione con ioduro di propidio (PI) delle cellule morte dopo il trattamento

NOTA: Il disegno dell'esperimento è esattamente lo stesso della misurazione dell'idroperossido lipidico (vedere i passaggi 1 e 2).

1. 24 h dopo la semina, estrarre le piastre dall'incubatrice e posizionarle nella cappa a flusso laminare.
2. Raccogliere il terreno (con le cellule morte) in una provetta da 15 mL.
3. Aggiungere 1 mL di PBS in ogni pozzetto, lavare il fondo con movimenti circolari delle piastre a 6 pozzetti, quindi raccogliere il PBS nella provetta con il rispettivo terreno.
4. Aggiungere 200 μl di tripsina (diluizione 10x) sul fondo di ciascun pozzetto e incubare la piastra fino a quando un leggero tocco della piastra non rimuove le cellule. Utilizzare il rispettivo terreno + PBS per raccogliere le cellule dai pozzetti.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 180 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante utilizzando un aspiratore.
6. Risospendere il pellet di cella in 300 μL di tampone FACS e metterlo su ghiaccio fino all'analisi.
7. Poco prima dell'analisi, aggiungere la soluzione PI (vedere la Tabella dei materiali) a una concentrazione finale di 2 μg/mL.

6. Analisi con citometria a flusso di cellule morte 24h dopo il trattamento

NOTA: Le impostazioni e la calibrazione della macchina FACS vengono eseguite come indicato in precedenza (vedere il passaggio 4).

1. Crea un nuovo esperimento e dagli un nome (Ferroptosi in DAOY - morte cellulare).
2. Nel disegno dell'esperimento, scegli il laser (488 nm) e il filtro (PE).
3. Nella visualizzazione dei dati, selezionare la dimensione corretta della cella (>12 μm), impostare le tensioni PMT (la popolazione cellulare dovrebbe apparire nel primo quadrante del dot plot SSC-H/FSC-H) e bloccare il dot plot.
4. Aggiungi un nuovo grafico: istogramma, con PE-A sull'asse y e scala logaritmica.
5. Vorticare i campioni nel tubo FACS, posizionarli nella macchina FACS e caricare il campione.
6. Registra 10.000 eventi di singoletto FSC e assegna un nome al file (ad esempio, DAOY WT CTL 6h). Esportare il file in formato .fcs.

7. Analisi in citometria a flusso del contenuto di idroperossido lipidico nelle cellule DAOY xCT-/-

NOTA: le celle xCT^-/- sono state generate come descritto in precedenza²⁴.

1. Per questo esperimento, seminare le cellule come indicato nel passaggio 2, ma invece del trattamento, integrare il terreno con 1 mM di NAC durante la notte.
2. Il giorno successivo, mantenere la NAC in un gruppo e rimuoverla dall'altro.
3. Eseguire l'analisi di citometria a flusso del contenuto di idroperossido lipidico esattamente nello stesso modo descritto al passaggio 6.

8. Analisi dei risultati del citometro a flusso

1. Aprire il documento .fcs nel software FlowJo (vedere la tabella dei materiali).
2. Fare doppio clic sul singolo file per aprire tutti gli eventi (non solo i singoletti FCS) registrati nel singolo campione (dot plot SSC-A/FSC-A). Poiché le impostazioni sono tali da non preservare il cancello effettuato sulla macchina, è necessario rifare il cancello e nominare la popolazione (ad esempio, DAOY WT).
3. Fare doppio clic sulla popolazione recintata per aprire un'altra finestra con l'istogramma.
4. Sostituire l'asse Y con il filtro fluorescente utilizzato (Comp-FITC/PE-A).
5. Cambia l'asse X in modale (normalizza ogni picco alla sua modalità, cioè a % del numero massimo di celle trovate in un particolare contenitore).
6. Copia l'istogramma nell'editor di layout. Ripeti l'operazione per tutti i campioni e, ogni volta che un nuovo istogramma viene incollato nell'editor di layout, trascinalo su quello precedente in modo che gli istogrammi vengano sovrapposti (half-offset).

La linea cellulare di medulloblastoma DAOY è stata coltivata in un terreno DMEM standard integrato con FBS all'8% fino a raggiungere circa il 60% di confluenza. Il giorno dell'esperimento, le cellule sono state raccolte e 1.000.000 di cellule per pozzetto sono state piastrate in piastre a 6 pozzetti, secondo la Tabella 1. Il giorno seguente, le cellule (in triplicato) sono state trattate con 1 μM di erastina, 0,3 μM di RSL3 o 250 μM di FAC. Le piastre sono state quindi poste nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2. Dopo 6 ore, le cellule sono state osservate al microscopio per rilevare le cellule gorgoglianti, come indicato dalle frecce nella Figura 1. Questo è servito come indicatore che il farmaco era efficace nell'indurre la ferroptosi prima che le cellule fossero preparate per la colorazione con idroperossido lipidico e la successiva analisi FACS.

Per la rilevazione del contenuto di idroperossido lipidico, il colorante specifico BODIPY 581/591 C11 è stato utilizzato ad una concentrazione finale di 2 μM per 30 min. Poiché questo colorante è sensibile al redox, è stato necessario rimuovere qualsiasi trattamento dalle cellule e lavarle con PBS preriscaldato. Dopo mezz'ora di colorazione, le cellule sono state lavate due volte con PBS, staccate utilizzando la soluzione di distacco cellulare e preparate per l'analisi FACS. I dati ottenuti in questa fase hanno mostrato un aumento della fluorescenza verde del colorante nei campioni trattati con tutti e tre i farmaci (Figura 2). Tuttavia, l'effetto più potente è stato osservato con 0,3 μM di RSL3 (Figura 2B), mentre 1 μM di erastin (Figura 2A) e 250 μM di FAC (Figura 2C) hanno mostrato un effetto leggermente inferiore dopo 6 ore di trattamento.

Per stabilire che l'accumulo di idroperossido lipidico rilevato porta alla morte cellulare, in particolare alla ferroptosi, gli stessi trattamenti descritti nella Tabella 1 sono stati applicati per 24 ore. Per l'analisi delle cellule morte mediante citometria a flusso, sono state raccolte sia le cellule che il surnatante. Le cellule vive e morte sono state pellettate mediante centrifugazione e quindi risospese in tampone FACS per la successiva analisi di citometria a flusso. I dati presentati nella Figura 3 hanno dimostrato che tutti e tre i trattamenti hanno indotto una massiccia morte cellulare, che è stata completamente prevenuta utilizzando l'inibitore specifico della ferroptosi, la ferrostatina-1. Ciò supporta chiaramente l'insorgenza di morte cellulare ferroptotica in seguito all'inibizione di xCT, all'inibizione di GPx4 o al sovraccarico di ferro nelle cellule di medulloblastoma.

Dato che i tre farmaci hanno mostrato effetti leggermente diversi sull'accumulo di idroperossido lipidico, probabilmente a causa di differenze di potenza, è stato impiegato un approccio genetico per studiare la piena potenza degli induttori ferroptotici. Le cellule DAOY xCT-/- ottenute in precedenza (Figura 1A supplementare) sono state coltivate nello stesso terreno delle loro controparti WT ma con integrazione di NAC. Questa selezione positiva ha permesso alle cellule xCT-/- di crescere in coltura. Tuttavia, 6 ore dopo che la NAC è stata rimossa dal terreno di coltura, le cellule hanno iniziato ad accumulare idroperossidi lipidici allo stesso livello delle cellule WT trattate con RSL3 (Figura 4). Analogamente all'inibizione farmacologica, la rimozione della NAC dal terreno ha indotto il caratteristico gorgogliamento delle cellule xCT-/- dopo 6 ore (Figura supplementare 1B).

Figura 1: Fenotipo ferroptotico delle cellule di medulloblastoma. Micrografie rappresentative di cellule DAOY WT trattate (o meno) per 6 ore con 1 μM di erastina (ERA), 0,3 μM di RSL3 o 250 μM di citrato ferroammonico (FAC) in presenza o meno di 2 μM di inibitore della ferroptosi Ferrostatin-1 (Ferro-1). Le frecce bianche indicano cellule rotonde e "gorgoglianti", indicando un fenotipo ferroptotico visibile al microscopio ottico. Ingrandimento: 20x, inserti: 40x. Barre della scala: 50 μm, inserti: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: L'idroperossido lipidico come marcatore chiave della ferroptosi nelle cellule di medulloblastoma. Dati rappresentativi della colorazione con idroperossido lipidico mediante citometria a flusso nelle cellule trattate per 6 ore con (A,B) 1 μM di erastin (ERA), (C,D) 0,3 μM di RSL3 o (E,F) 250 μM di citrato ferroammonico (FAC), in presenza o meno di 2 μM di inibitore della ferroptosi Ferrostatin-1 (Ferro-1). (A,C,E) Dot plot degli eventi registrati; (B,D,F) Rappresentazione istografica del contenuto di idroperossido lipidico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Induzione della morte cellulare ferroptotica mediante approccio farmacologico. Grafici a punti rappresentativi della citometria a flusso di cellule colorate con ioduro di propidio dopo 6 ore di trattamento con 1 μM di erastina (ERA), 0,3 μM di RSL3 o 250 μM di citrato ferroammonico (FAC), in presenza o meno di 2 μM di inibitore della ferroptosi Ferrostatina-1 (Ferro-1). Il gating separa le popolazioni vive (Q4) e morte (Q3) delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Induzione della feroptosi mediante approccio genetico. Dati rappresentativi della colorazione con idroperossido lipidico mediante citometria a flusso nelle cellule DAOY WT e xCT-/- dopo 6 ore in presenza o meno di 2 μM inibitore della ferroptosi Ferrostatin-1 (Ferro-1). A sinistra sono riportati i rappresentanti dell'istogramma del contenuto di idroperossido lipidico. A destra ci sono i dot plot degli eventi registrati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Dettagli sul trattamento delle cellule di controllo e sperimentali.

Figura 1 supplementare: Morte cellulare ferroptotica delle cellule DAOY xCT-/- . (A) Analisi Western blot del livello di xCT in cellule DAOY WT e xCT-/- in terreni DMEM integrati o meno con 2 μM di Ferrostatina-1. (B) Micrografie rappresentative delle cellule DAOY xCT-/- in presenza (a sinistra) e assenza (a destra) di 1mM N-acetilcisteina per 6 ore. Le frecce bianche indicano cellule rotonde e "gorgoglianti", indicando un fenotipo ferroptotico visibile al microscopio ottico. Ingrandimento: 40x. Barre della scala: 10 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Dichiariamo di non avere alcun conflitto di interessi per lo studio qui presentato.