Articolo metodologico

Paradigmi per la valutazione comportamentale nel modello di Drosophila del disturbo dello spettro autistico

DOI:

10.3791/66649

⸱

6 settembre 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioscience and Biotechnology, Indian Institute of Technology Kharagpur

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Il disturbo dello spettro autistico (ASD) è associato a un comportamento sociale e comunicativo alterato e all'emergere di comportamenti ripetitivi. Per studiare l'interrelazione tra i geni ASD e i deficit comportamentali nel modello di Drosophila , in questo articolo vengono descritti cinque paradigmi comportamentali per valutare il distanziamento sociale, l'aggressività, il corteggiamento, l'adescamento e il comportamento di assuefazione.

Abstract

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Il Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) comprende un gruppo eterogeneo di disturbi dello sviluppo neurologico con sintomi comportamentali comuni, tra cui deficit nell'interazione sociale e nella capacità di comunicazione, comportamenti limitati o ripetitivi migliorati e, in alcuni casi, difficoltà di apprendimento e deficit motorio. La Drosophila è servita come organismo modello senza pari per la modellazione di un gran numero di malattie umane. Poiché molti geni sono stati implicati nell'ASD, i moscerini della frutta sono emersi come un modo potente ed efficiente per testare i geni presumibilmente coinvolti nel disturbo. Poiché centinaia di geni, con vari ruoli funzionali, sono implicati nell'ASD, un singolo modello genetico di ASD è irrealizzabile; invece, singoli mutanti genetici, knockdown genici o studi basati sulla sovraespressione degli omologhi dei geni associati all'ASD sono i mezzi comuni per ottenere informazioni sui percorsi molecolari alla base di questi prodotti genici. In Drosophila sono disponibili una serie di tecniche comportamentali che forniscono una facile lettura dei deficit in specifiche componenti comportamentali. Il saggio dello spazio sociale e i saggi di aggressività e corteggiamento nelle mosche si sono dimostrati utili nella valutazione dei difetti nell'interazione sociale o nella comunicazione. Il comportamento di toelettatura nelle mosche è un'eccellente lettura del comportamento ripetitivo. Il test di assuefazione viene utilizzato nei moscerini per stimare la capacità di apprendimento dell'assuefazione, che risulta essere influenzata in alcuni pazienti con ASD. Una combinazione di questi paradigmi comportamentali può essere utilizzata per effettuare una valutazione approfondita dello stato di malattia umana simile all'ASD nei moscerini. Utilizzando le mosche mutanti Fmr1 , la ricapitolazione della sindrome dell'X fragile negli esseri umani e il knockdown delle file omologhe POGZ nei neuroni dei moscerini, abbiamo mostrato deficit quantificabili nel distanziamento sociale, nell'aggressività, nel comportamento di corteggiamento, nel comportamento di toelettatura e nell'assuefazione. Questi paradigmi comportamentali sono qui dimostrati nelle loro forme più semplici e dirette con l'ipotesi che ne faciliterebbero l'uso diffuso per la ricerca sull'ASD e altri disturbi dello sviluppo neurologico nei modelli di mosca.

Introduzione

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Il Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) comprende un gruppo eterogeneo di disturbi neurologici. Comprende una serie di disturbi complessi del neurosviluppo caratterizzati da deficit multicontestuali e persistenti nella comunicazione e nell'interazione sociale e dalla presenza di modelli comportamentali e di attività ristretti e ripetitivi e interessi1. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), a 1 bambino su 100 viene diagnosticato l'ASD in tutto il mondo con un rapporto maschi/femmine di 4,22. La malattia si manifesta nel secondo o terzo anno di vita. I bambini con ASD mostrano una mancanza di interesse per la reciprocità socio-emotiva, la comunicazione non verbale e le capacità relazionali. Esibiscono comportamenti ripetitivi come il movimento motorio stereotipato, il seguire la routine inflessibile e ritualizzata e un'intensa attenzione agli interessi ristretti. I bambini con ASD mostrano un alto grado di risposta al tatto, all'olfatto, al suono e al gusto, mentre la risposta al dolore e alla temperatura èrelativamente bassa. Anche la penetranza di questo disturbo è diversa tra i diversi pazienti affetti da ASD e quindi la variabilità aumenta.

L'attuale diagnosi clinica di ASD si basa sulla valutazione comportamentale degli individui in quanto non esiste un test genetico comune basato su biomarcatori di conferma che copra tutte le forme di ASD3. Decifrare le basi genetiche e neurofisiologiche sarebbe utile per indirizzare le strategie di trattamento. Nell'ultimo decennio, un ampio corpus di ricerche ha portato all'identificazione di centinaia di geni che sono stati eliminati o mutati o i cui livelli di espressione sono alterati nei pazienti con ASD. La ricerca in corso enfatizza la convalida del contributo di questi geni candidati utilizzando organismi modello come il topo o il moscerino della frutta, in cui questi geni vengono eliminati o abbattuti, seguiti da test per deficit comportamentali simili all'ASD e chiarimenti dei percorsi genetici e molecolari sottostanti che causano le anomalie. Un modello murino che ricapitola le variazioni del numero di copie (CNV) nei loci cromosomici umani 16p11.2 mostra alcuni dei difetti comportamentali dell'ASD 4,5,6. L'esposizione prenatale a un farmaco teratogeno, l'acido valproico (VPA) è un altro modello murino che raffigura tratti simili all'ASD 7,8 umano. Inoltre, esiste una serie di modelli murini che mostrano autismo associato alla sindrome genetica, ad esempio, modelli sindromici a singolo gene causati da mutazioni in Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c e modelli non sindromici a singolo gene causati da mutazioni in geni come Cntnap2, Shank, Neurexin o Neuroligin 5.

Il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) è un altro importante organismo modello per lo studio delle basi cellulari, molecolari e genetiche di una pletora di malattie umane9, tra cui l'ASD. La Drosophila e l'uomo condividono processi biologici altamente conservati a livello molecolare, cellulare e sinaptico. I moscerini della frutta sono stati utilizzati con successo negli studi sull'ASD 10,11,12 per caratterizzare i geni legati agli ASD e decifrare il loro ruolo esatto nella sinaptogenesi, nella funzione sinaptica e nella plasticità, nell'assemblaggio dei circuiti neurali e nella maturazione; Si è scoperto che gli omologhi dei geni associati all'ASD hanno un ruolo nella regolazione del comportamento sociale e/o ripetitivo 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Il moscerino della frutta ha anche funzionato come modello per lo screening dei geni ASD e delle loro varianti 15,22,23. La sfida più grande nella ricerca sull'ASD nei moscerini è che, a differenza di altri modelli di malattia, non esiste un unico modello di mosca ASD. Per comprendere l'impatto delle mutazioni o dell'abbattimento di uno specifico gene ASD, un ricercatore deve convalidare se i fenotipi comportamentali imitano sufficientemente i sintomi dei pazienti con ASD e quindi procedere verso la comprensione delle basi molecolari o fisiologiche dei fenotipi.

Pertanto, il rilevamento di fenotipi ASD-like è vitale per la ricerca sull'ASD nel modello di mosca. Nel corso degli anni sono emerse una manciata di tecniche comportamentali che ci consentono di rilevare anomalie come deficit nel comportamento/interazione sociale, comunicazione, comportamenti ripetitivi e reattività agli stimoli. Inoltre, diverse modifiche e aggiornamenti di queste tecniche comportamentali sono stati apportati in diversi laboratori per soddisfare requisiti specifici come l'upscaling, l'automazione dei saggi, le letture, la quantificazione e i metodi di confronto. In questo articolo video, vengono dimostrate le versioni più basilari di cinque paradigmi comportamentali che, in combinazione, possono essere utilizzati per rilevare gli esiti comportamentali simili all'ASD nel modo più semplice.

L'aggressività è un comportamento innato conservato evolutivamente che influenza la sopravvivenza e la riproduzione24. Il comportamento aggressivo nei confronti dei conspecifici è influenzato dalla "motivazione alla socializzazione"25,26 e dalla "comunicazione"27, entrambi compromessi negli individui affetti da ASD. Il comportamento aggressivo è ben descritto in Drosophila e la sua quantificabilità attraverso il robusto saggio di aggressività 28,29,30 e una base genetica e neurobiologica ben compresa31 lo rende un paradigma comportamentale adatto 32 per valutare il fenotipo ASD in un modello di mosca. L'aggressività è influenzata dall'isolamento sociale lontano da un ambiente sociale, che porta a una maggiore aggressività; Lo stesso è stato osservato quando i moscerini maschi sono alloggiati in isolamento per alcuni giorni33,34. Un altro test comportamentale che quantifica la socievolezza nei moscerini è il Social Space Assay35, che misura le distanze tra i vicini più prossimi e le distanze tra i moscerini in un piccolo gruppo di mosche, rendendolo perfettamente adatto per testare i ruoli degli ortologhi del gene ASD nei moscerini 12,21,36,37 e nei modelli di mosche ASD indotti dall'ambiente 38. 39.

Il test di corteggiamento della Drosophila è un altro paradigma comportamentale frequentemente utilizzato per analizzare l'alterazione delle abilità sociali e comunicative su circuito o manipolazione genetica, compresi i geni correlati all'autismo 18,19,21,40. I modelli di comportamento ripetitivi sono prevalenti nei pazienti con ASD, che si ricapitola nelle mosche con il comportamento di toelettatura, una serie di azioni distinte e stereotipate eseguite per la pulizia e altri scopi. È stato utilizzato con successo per valutare l'impatto delle mutazioni del gene ASD nei moscerini21,41 e l'esposizione a sostanze chimiche 38,39. Molteplici avanzamenti e automazione nel saggio sono stati descritti prima del 16,41,42,43; In questo articolo, stiamo dimostrando il modello di analisi più semplice, che è facile da adottare e quantificare.

È noto che l'ASD influisce sulla capacità di assuefazione, apprendimento e memoria in alcuni pazienti 44,45,46,47,48,49,50, organismi modello ASD 51,52 e causa anche deficit in diversi comportamenti olfattivi50. L'abitudine al salto a luci spente di Drosophila è stata utilizzata in precedenza per lo screening dei geni ASD23. L'assuefazione può essere valutata con un semplice metodo di saggio di assuefazione olfattiva 53,54,55. Descriviamo il metodo per indurre l'assuefazione olfattiva e saggiamo il risultato utilizzando un classico saggio binario di scelta dell'odore basato sul labirinto a Y56 che può essere utilizzato per rilevare difetti nell'assuefazione in condizioni di mutazione del gene ASD o knockdown genico. Per valutare se l'impatto di una mutazione (o di un gene knock-down) o di un trattamento farmacologico sul comportamento di una mosca equivalga a un fenotipo ASD-like, si può utilizzare una combinazione di questi 5 saggi descritti qui.

Protocollo

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Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Saggio di aggressività

  1. Preparazione dell'arena del saggio di aggressione
    1. Prendi una piastra standard a 24 pozzetti (Figura 1A) e usa ogni pozzetto della piastra come un'unica "arena" (Figura 1B) per l'aggressione delle mosche. Riempi metà di ogni pozzetto con normale cibo per mosche e lascialo asciugare per una notte.
      NOTA: Opzionalmente, un punto focale per l'aggressione può essere incluso nell'arena, come un punto di pasta di lievito o una femmina decapitata per garantire l'aggressione maschile.
    2. Prendi qualsiasi foglio di plastica/acrilico trasparente, sufficiente a coprire la superficie di circa tre o quattro pozzetti. Forare il foglio per creare una piccola apertura di ~2,5 mm di diametro per inserire le singole mosche nei pozzetti attraverso di esso.
  2. Preparazione dell'aspiratore di mosche
    1. Prendi un tubo di gomma/silicone lungo 30-50 cm (Figura 1C1).
    2. Prendi un puntale per pipetta da 200 μl (o 1.000 μl) e taglialo a ~1 cm dal puntale stretto. Inserire l'estremità tagliata a un'estremità del tubo di gomma; Questa punta sarà l'"estremità della bocca", utilizzata per l'aspirazione basata sulla bocca.
    3. Prendi un altro puntale per pipetta e taglia l'estremità stretta di questo puntale per creare un'apertura sufficiente per consentire l'ingresso di una mosca attraverso di esso. Inserire la base di questo puntale per pipetta nell'estremità della coda del tubo; questa sarà l'"estremità di volo" dell'aspiratore, da cui la mosca verrà aspirata (Figura 1C2).
    4. Inserire un pezzo di stoffa a rete o un sottile strato di cotone sull'estremità "fly" del tubo, all'incrocio tra il tubo e la punta. Assicurarsi che una mosca aspirata nel puntale della pipetta rimanga intrappolata nel puntale, davanti alla rete.
    5. Sigillare le giunzioni tra il tubo e i puntali della pipetta utilizzando il parafilm.
  3. Preparazione di provette a corpo singolo e fiale con alloggiamento di gruppo
    1. Preparazione di tubi a corpo singolo
      1. Aggiungere quasi 500 μl di cibo per mosche appena preparato in una provetta per microfuge da 2 mL (Figura 1D). Usa una mini centrifuga per tirare giù il cibo fino alla parte inferiore del tubo.
      2. Impostare il cibo in modo che si solidifichi a temperatura ambiente tenendo il coperchio aperto per una notte. Coprire le provette con un panno sottile per evitare che le mosche vaganti entrino nelle provette.
      3. Forare i coperchi dei tubi di microfuga con aghi per la circolazione dell'aria e chiudere i coperchi dopo che il cibo si è solidificato.
    2. Preparazione di fiale per gruppi di stabulazione
      1. Prendi fiale di mosche normali e riempi almeno una parte delle fiale con cibo appena preparato (Figura 1D).
  4. Preparare le mosche prima dell'esperimento
    1. Mantenere le linee di mosca dei genotipi desiderati in normali bottiglie di vetro/plastica contenenti cibo standard per mosche in un'incubatrice a 25 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore.
    2. Raccogliere le mosche appena chiuse (da 0 a 24 ore) del genotipo desiderato e separarle per sesso in anestesia con anidride carbonica utilizzando uno stereomicroscopio.
    3. Inserire metà delle mosche maschi singolarmente in "tubi a alloggiamento singolo". Tenete l'altra metà dei moscerini maschi in un gruppo di 10 con le mosche femmine in regolari "fiale di alloggio di gruppo" creando una condizione sociale. Conservare tutte le provette e i flaconcini a 25 °C per 5 giorni.
      NOTA: Mantenere una temperatura di 24-25 °C e ~50% di umidità nella stanza del comportamento. I ceppi di mosca utilizzati sono stati: w1118 e mosche mutanti trans-eterozigoti FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Le mosche Fmr1 , che sono state tenute in isolamento per 5 giorni, mostrano attacchi di aggressività significativamente diminuiti nei confronti di un altro maschio (Figura 1E).
  5. Esecuzione dell'esperimento del comportamento aggressivo
    1. Esegui l'esperimento di aggressività durante la finestra temporale ZT0-ZT3 poiché le mosche mostrano il picco di attività durante questo momento della giornata.
      NOTA: ZT=Tempo Zeitgeber in un ciclo standard di luce/buio di 12 ore; ZT0= si accende, cioè l'inizio della fase di luce, ZT3= 3 h dopo l'inizio della fase di luce, e così via. ZT12= luci spente.
    2. Trasferire due moscerini maschi dalle camere di stabulazione singole o di gruppo con il metodo dell'aspirazione della bocca all'arena di aggressione attraverso il foro del coperchio; Allontanare immediatamente il foro per assicurarsi che le mosche non possano scappare.
    3. Lascia che le mosche si acclimatino all'interno dell'arena per 1-2 minuti. Avvia un timer per 20 minuti. Registra le mosche per tutti i 20 minuti posizionando una fotocamera o un telefono cellulare esattamente verticalmente sopra l'arena utilizzando un supporto. Assicurati che i tipi di attacchi aggressivi siano visibili nel video.
      NOTA: Garantire una chiara illuminazione dell'arena ed evitare qualsiasi abbagliamento/riflesso dal coperchio che cade direttamente sull'obiettivo della fotocamera.
    4. Ripetere l'esperimento per 15-20 coppie di mosche per ogni genotipo e ogni tipo di condizione abitativa.
      NOTA: Il pregiudizio inconscio può essere annullato con il doppio accecamento delle mosche di controllo e di prova, nonché dei file video appartenenti a più genotipi.
  6. Analisi dei dati del test di aggressione
    1. Trasferisci i file video su un computer con uno schermo sufficientemente grande in modo che gli attacchi aggressivi siano visibili.
    2. Riproduci il video e conta il numero totale di attacchi aggressivi in un arco di tempo di 20 minuti58,59.
    3. Compila e organizza i dati di ogni genotipo e di ogni modello di alloggiamento in un foglio di calcolo ed esegui l'analisi dei dati utilizzando qualsiasi software statistico. Esegui un test t a due code e traccia i dati come scatola e baffi.

2. Saggio dello spazio sociale

NOTA: Il protocollo del saggio, l'arena e l'analisi qui descritti sono stati descritti in precedenza60,61.

  1. Preparazione dell'arena del saggio dello spazio sociale (SSA)
    1. Posizionare entrambi i distanziatori triangolari in acrilico (altezza = 8,9 cm, base = 6,7 cm e spessore = 0,3 cm) in piano sopra una lastra di vetro rettangolare (13,5 cm x 10,4 cm, spessore 0,3 cm) in modo che gli angoli retti dei distanziatori in acrilico siano allineati con gli angoli della lastra di vetro (Figura 2A).
    2. Posizionare due distanziatori rettangolari in acrilico (6,7 cm x 1,5 cm, spessore = 0,3 cm) in piano sulla lastra di vetro, allineati con le basi dei due distanziatori triangolari. Dopo questa disposizione, verificare che i quattro distanziatori acrilici circondano un'arena triangolare (~2,16 cm²61) sulla lastra di vetro rettangolare che non è coperta da distanziatori (Figura 2A,B). Posiziona l'adesivo di un righello (Figura 2C) su uno dei distanziatori triangolari e assicurati che sia visibile dall'alto.
    3. Posizionare ora una seconda lastra di vetro rettangolare (13,5 cm x 10,4 cm, spessore 0,3 cm) sopra i distanziatori acrilici in modo che si allinei con la lastra di vetro nella parte inferiore; I distanziatori acrilici finirebbero inseriti tra lo spazio di vetro, lasciando uno spazio triangolare nel mezzo tra due lastre di vetro. Utilizzare quattro piccole clip per legare per tenere i vetri e i distanziatori.
  2. Preparazione delle mosche per SSA
    1. Raccogliere le mosche appena chiuse (da 0 a 24 ore) del genotipo desiderato e separarle per sesso in anestesia fredda utilizzando uno stereomicroscopio.
      NOTA: Raffreddare l'apparecchio per anestesia fredda (può essere utilizzata una piastra di Petri) in un'incubatrice a -20 °C. Metti le mosche in fiale vuote, immergi queste fiale nel ghiaccio (in un secchiello per il ghiaccio) fino a quando le mosche non diventano immobili, posizionale sulla capsula di Petri fredda e inizia a selezionarle.
    2. Conservare i moscerini maschio e femmina separatamente per 24 ore in fiale di cibo in un'incubatrice a 25 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore.
      NOTA: Per gli esperimenti qui dimostrati, i ceppi di mosche utilizzati erano w1118 e mosche mutanti trans-eterozigoti FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Esecuzione dell'esperimento SSA
    1. Mantenere le stesse condizioni sperimentali del saggio di aggressione (temperatura: 24-25°C, umidità ~ 50%) ed eseguire l'esperimento durante la finestra temporale ZT0-ZT3.
    2. Rimuovere la clip del raccoglitore in basso a destra e spostare leggermente il distanziatore rettangolare verso l'esterno in modo da creare uno spazio (~0,5 cm) tra i due distanziatori rettangolari.
    3. Trasferire le mosche (raccolte il giorno precedente) dalla fiala di cibo in una fiala vuota. Trasferiscili nell'arena dello spazio sociale (l'area triangolare) con un'aspirazione delicata attraverso lo spazio creato tra i distanziatori rettangolari. Chiudere immediatamente lo spazio facendo scorrere il distanziatore rettangolare e la clip del raccoglitore nelle loro posizioni e assicurarsi che non rimanga spazio per la fuga delle mosche.
    4. Tenendo la camera in posizione verticale, battere delicatamente la camera 3 volte su un cuscinetto morbido per assicurarsi che tutte le mosche siano alla base della camera all'inizio dell'esperimento.
    5. Clamp la camera SSA in posizione verticale e avviare il timer. Scatta una foto nitida dell'arena dopo 20 minuti, quando le mosche si posano nelle loro posizioni nell'arena e mostrano un movimento minimo. Evitare l'abbagliamento e l'illuminazione irregolare.
    6. Ripetere l'esperimento 3 volte per la stessa popolazione di mosche martellando le mosche e ripetendo i passaggi dai passaggi 2.3.5 a 2.3.7 (repliche interne). Ripetere 3 volte con una diversa popolazione di mosche dello stesso genotipo/condizione (ripetizioni indipendenti).
      NOTA: Congelare la camera di analisi per scartare le mosche dalla camera. Pulisci le superfici di vetro e plastica con etanolo per rimuovere tutti gli odori dopo che un ciclo di esperimenti è stato fatto con un gruppo di mosche.
  4. Analisi dei dati del saggio dello spazio sociale
    1. Analizzare le immagini nel software ImageJ62 ed elencare le distanze tra le mosche più vicine come descritto in precedenza61.
    2. Esegui analisi statistiche e grafici grafici utilizzando software statistici.
      NOTA: I ceppi di mosca utilizzati per il test SSA qui descritto erano le mosche mutanti trans-eterozigoti w1118 e Fmr1 (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Le mosche Fmr1 mostrano una distanza significativamente maggiore dai vicini più vicini (Figura 2D).

3. Saggio di corteggiamento

  1. La camera del corteggiamento
    1. Assemblare tutti e quattro i pezzi della camera di corteggiamento (Figura 3A) insieme nell'ordine mostrato nella Figura 3B. Ogni perforazione del disco centrale, inserita tra il coperchio e i pezzi di base, funzionerà come "camera di corteggiamento" (Figura 3C).
  2. Ottenere femmine preaccoppiate
    1. Avviare e mantenere più bottiglie di coltura di mosche CS (Canton S, wild type) con ~60-100 mosche maschi e femmine in ogni bottiglia di cibo.
    2. Quando emergono gli adulti, scartare tutte le mosche adulte e trasferire le mosche che emergono da queste bottiglie ogni 2-3 ore in nuove fiale di cibo integrate con una piccola quantità di pasta di lievito.
      NOTA: Evitare il sovraffollamento delle fiale. Fare attenzione a non trasferire vecchie mosche, larve o pupe nella fiala di accoppiamento.
    3. Incubare queste "fiale di accoppiamento" per 4 giorni per assicurarsi che tutte le femmine si siano accoppiate.
  3. Preparazione di tubi a corpo singolo per maschi
    1. Aggiungere quasi 500 μL di cibo per mosche a ciascuna provetta per microfuge da 2 mL. Utilizzare una minicentrifuga per tirare verso il basso il cibo nella parte inferiore del tubo.
    2. Lasciare che il cibo si solidifichi durante la notte, tagliare il coperchio del tubo di microfuge, coprirlo con parafilm e perforare il parafilm con un ago per la circolazione dell'aria.
  4. Raccolta e isolamento dei maschi vergini
    1. Impostare incroci con 10-15 maschi e 20-30 femmine vergini dei genotipi desiderati in fiale di cibo separate.
    2. Raccogliere maschi vergini dei genotipi desiderati dalla progenie e conservarli individualmente in "tubi a corpo singolo" utilizzando l'aspiratore. Continuate a raccogliere i maschi appena chiusi ogni 5-6 ore (fino a 40-50 maschi per ogni genotipo) e isolateli in provette individuali a stabulazione singola.
    3. Richiudere il coperchio del tubo con il parafilm.
  5. Esecuzione dell'esperimento del saggio di corteggiamento
    1. Dopo 5 giorni di isolamento dei maschi del test, eseguire il test di corteggiamento durante la finestra temporale ZT0-ZT3.
    2. Configura i dispositivi di registrazione video con largo anticipo, concentrandoti sull'area di lavoro del saggio.
    3. Con l'aiuto di un aspiratore, raccogli una femmina preaccoppiata (6-10 giorni) dalle fiale di accoppiamento e inseriscila in una camera di corteggiamento.
    4. Utilizzando l'aspiratore, trasferire delicatamente una mosca maschile (controllo/test) dal tubo a alloggiamento singolo alla camera di corteggiamento contenente la singola femmina preaccoppiata attraverso il foro di trasferimento. Ruotare rapidamente il coperchio per chiudere la camera.
    5. Registrare video il comportamento delle mosche per 15 minuti.
  6. Analisi dei dati video e statistiche
    1. Trasferisci i file video su un computer; Nota la durata del tempo trascorso dal maschio in corteggiamento durante 15 minuti esaminando manualmente il video.
    2. Calcola l'indice di corteggiamento (CI) per ogni mosca maschio, che è la frazione (o percentuale) del tempo trascorso dal maschio nel corteggiare la femmina durante 15 minuti.
    3. Conta il numero totale di tentativi di copulazione in 15 minuti.
    4. Si noti la durata del ritardo mostrato dal maschio prima del suo primo tentativo di corteggiamento come latenza di corteggiamento (CL).
      NOTA: Si raccomanda di analizzare 40-60 maschi per condizione/genotipo per ottenere la potenza statistica e determinare la coerenza dei risultati dell'IC.

4. Saggio del comportamento di toelettatura

  1. Arena del saggio del comportamento di toelettatura
    1. Utilizzare una piccola camera circolare con un volume di ~0,4 cm3 come arena per registrare il comportamento di toelettatura.
      NOTA: La stessa arena di corteggiamento descritta nella sezione 3 può essere utilizzata per il test del comportamento di toelettatura.
    2. Poiché il comportamento di toelettatura comporta la registrazione del movimento di organi più fini come le gambe, utilizzare la registrazione video ad alta risoluzione o ad alto contrasto. Per seguire questo protocollo, utilizzare un pannello LED rivestito in vetro diffuso come superficie illuminata in modo uniforme di dimensioni 20 cm x 20 cm. Posiziona la camera di corteggiamento sopra il pannello per garantire che la luce passi dal basso attraverso la camera.
  2. Preparare le mosche prima dell'esperimento
    1. Mantenere il genotipo sperimentale delle mosche in bottiglie per alimenti a 25 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore.
    2. Raccogliere le mosche appena chiuse (da 0 a 24 ore) del genotipo desiderato e separarle per sesso in anestesia fredda utilizzando uno stereomicroscopio come descritto nel saggio dello spazio sociale.
    3. Isolare i moscerini maschi in provette a corpo singolo (come quelle utilizzate nel saggio di aggressione) per 24 ore.
      NOTA: Per l'esperimento qui dimostrato, i ceppi di mosche utilizzati sono stati: W1118 e mosche mutanti trans-eterozigoti FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Esecuzione del test del comportamento di toelettatura
    1. Mantenere una temperatura di 24-25 °C e umidità ~ 50%; eseguire l'esperimento durante la finestra temporale ZT0-ZT316.
    2. Trasferisci una mosca maschio a stabulazione singola da un tubo a stabulazione singola nell'arena di toelettatura utilizzando un aspiratore. Far scorrere immediatamente il foro nel coperchio per assicurarsi che le mosche non possano fuoriuscire.
    3. Posiziona l'arena di toelettatura su un pannello LED diffuso e lascia che la mosca si acclimati all'interno dell'arena per 1 minuto. Registra video la mosca per 10 minuti posizionando la telecamera esattamente verticalmente sopra l'arena montata su un supporto. Assicurati che i tipi di attacchi di toelettatura siano visibili e quantificabili nel video.
      NOTA: Il comportamento di toelettatura include lo sfregamento della testa, degli occhi, delle antenne, della proboscide, del torace, dell'addome, dei genitali e delle ali con le zampe (primo paio: T1, secondo paio: T2 o terzo paio di zampe: T3). I parametri comportamentali di toelettatura che sono stati presi in considerazione in questo studio sono quelli descritti in Andrew et al. 41 e dimostrati nella Figura 4.
    4. Ripeti l'esperimento per ogni genotipo.
    5. Analisi dei dati comportamentali di toelettatura
      1. Analizza i video e calcola i seguenti quattro parametri: Indice di toelettatura (percentuale di tempo trascorso in toelettatura); latenza di toelettatura (tempo fino al primo incontro di toelettatura); numero dell'incontro di toelettatura; e durata media dell'incontro di toelettatura (durata totale dell'incontro/numero di attacchi).
      2. Contrassegna un singolo incontro di toelettatura come terminato quando una mosca smette di mostrare uno qualsiasi dei parametri e rimane immobile per 2 s o interrompe l'incontro e cammina per almeno 4 passi.

5. Dosaggio dell'assuefazione olfattiva

NOTA: Come mostrato nella Figura 5, l'assemblaggio finale deve essere effettuato il giorno del saggio del labirinto a Y54,56.

  1. Preparare le mosche per l'assuefazione
    1. Allevare mosche dei genotipi desiderati per tutti gli esperimenti in un'incubatrice con una temperatura ambiente di 25 oC e 70% di umidità in condizioni standard di 12 ore di luce: 12 ore di ciclo di buio (LD).
    2. Raccogli le mosche vecchie da 0 a 12 ore, appena chiuse e trasferisci ~30-40 mosche in una bottiglia media fresca con un tappo di cotone stretto.
    3. Assegna codici a ogni bottiglia per mantenere lo sperimentatore cieco sui genotipi in fase di sperimentazione.
  2. Induzione dell'assuefazione olfattiva
    1. Mettere 1 mL dell'odorizzante preferito diluito con liquido di paraffina (leggero) in una provetta per microfughe da 1,5 mL. Per il controllo, è sufficiente utilizzare 1 mL di luce liquida di paraffina in una provetta microfuge da 1,5 mL. Agitare il contenuto nel tubo per 10 minuti per garantire una miscelazione uniforme e poi coprirlo con pellicola trasparente uniformemente perforata.
      NOTA: Nel video verrà utilizzato il butirrato di etile al 20%.
    2. Utilizzare il filo per sospendere i tubi contenenti l'odorizzante diluito o solo il liquido diluente in flaconi di terreno separati contenenti mosche.
    3. Coprite bene le bottiglie con del cotone e poi avvolgetele con carta kraft per evitare la diffusione del vapore odorizzante. Etichettare le bottiglie di controllo e quelle contenenti odori come naive e esposte agli odori (abituate), rispettivamente. Conservare questi biberon a induzione per 3 giorni in un'incubatrice con le condizioni sopra menzionate.
  3. Preparazione delle mosche e l'apparato del labirinto a Y
    1. Trasferire le mosche dalle bottiglie di induzione in fiale contenenti solo carta da filtro imbevuta d'acqua.
    2. Lasciarli morire di fame per circa 16-18 ore a temperatura ambiente prima dell'esperimento per aumentare la motivazione.
    3. Assicurarsi che i componenti dell'apparato del labirinto a Y siano puliti e inodori; Assemblare le quattro parti in modo verticale. Fissare le camere di arrampicata al labirinto a Y, che viene poi collegato alla parte superiore dell'adattatore. Fissare saldamente la parte inferiore del labirinto a Y alla fiala d'ingresso che funge da stelo centrale nella parte inferiore, come mostrato nella Figura 5.
    4. Collegare l'estremità conica di ciascuna camera di risalita con i flaconi di reagenti contenenti odorizzante (10-3 diluizioni con acqua distillata) utilizzando tubi di silicone inodori.
    5. Pompare l'odorizzante a una portata uguale (~120 mL/min) dalle bombole del gas ai due bracci della Y con l'aiuto di una pompa a vuoto e lasciarlo saturare per 15 minuti per ottenere consistenza.
  4. Esecuzione del classico saggio del labirinto a Y
    1. Introduci delicatamente le mosche affamate di ogni fiala nella fiala d'ingresso della configurazione del labirinto a Y.
    2. Lasciali acclimatare per un breve periodo; collegare la fiala di ingresso con l'adattatore Y-maze per iniziare il test; e lascia che le mosche si arrampichino sui bracci del labirinto a Y e rimangano intrappolate nelle due camere di raccolta. Impostare la durata di ogni test su 1 minuto.
    3. Al termine, tocca le mosche sul fondo della fiala d'ingresso e cambia la posizione delle braccia del labirinto a Y per evitare la polarizzazione laterale. Effettua quattro letture per la stessa serie di mosche.
    4. Registra il numero di mosche che si arrampicano su ciascuno dei due bracci del labirinto a Y entro il tempo stabilito.
    5. Ripetere il test per almeno 8 lotti per ottenere un set di dati rappresentativo.
  5. Analisi e interpretazione dei dati raccolti
    1. Quantificare i risultati calcolando l'indice di prestazione (PI), che può essere rappresentato come la differenza tra il numero di mosche che scelgono il braccio dell'aria (A) e il numero di mosche che scelgono il braccio dell'odore (O) come frazione del numero totale di mosche partecipanti.
    2. Utilizzare test statistici ( test t di Student non accoppiato) per verificare se il PI delle mosche naïve rispetto a quelle esposte agli odori è significativo.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Saggio di aggressione
Come modello ASD a mosca, sono state utilizzate mosche mutanti Fmr1 63,64. w1118 maschi sono stati utilizzati come mosche di controllo e Fmr1 trans-eterozigote Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 mosche maschi come mosche sperimentali; I maschi adulti sono stati alloggiati in tubi di isolamento per 5 giorni. I maschi omotipici (stesso genotipo, stesse condizioni di stabulazione) sono stati introdotti nell'arena dell'aggressività e il loro comportamento è stato registrato per 20 minuti. Per ogni genotipo è stato contato il numero totale di attacchi aggressivi in 20 minuti. Il numero di attacchi aggressivi durante i 20 minuti è risultato significativamente ridotto nel caso dei maschi mutanti rispetto ai maschi di controllo (Figura 1E). Questa ridotta aggressività nelle mosche Fmr1 potrebbe essere dovuta a un ridotto interesse per l'interazione sociale con un'altra mosca. Al contrario, i moscerini maschi mutanti Fmr1 di gruppo/socialmente ospitati mostrano un numero di attacchi di aggressività paragonabile a quello dei moscerini w1118 socialmente ospitati (dati non mostrati), indicando probabilmente un ruolo positivo dell'ambiente sociale nell'induzione del comportamento sociale.

Saggio dello spazio sociale
Il saggio dello spazio sociale è stato eseguito in w1118 e mosche modello ASD (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M ). Per ogni mosca è stata calcolata la distanza dal vicino più prossimo e sono state eseguite 10 repliche biologiche per ogni genotipo. I moscerini mutanti mostrano distanze significativamente più elevate rispetto alle controparti di controllo (Figura 2D), indicando una preferenza per una maggiore distanza dalle altre mosche.

Saggio di corteggiamento
Il test di corteggiamento di mosche maschi alloggiate singolarmente è stato eseguito per quantificare il comportamento di corteggiamento innato di due mosche modello ASD separate. In primo luogo, il comportamento di corteggiamento delle mosche transeterozigoti Fmr1 è stato confrontato con quello di w1118; Le mosche Fmr1 hanno mostrato un indice di corteggiamento significativamente più basso e un numero ridotto di tentativi di copulazione (Figura 3E1). In un secondo esperimento, row, un ortologo di Drosophila del gene POGZ umano (un gene di rischio ASD20 altamente prevalente), è stato abbattuto esprimendo un microRNA a forcina corta contro row nei neuroni del corpo a fungo utilizzando la linea driver MB247-GAL4. Queste mosche modello ASD sono state testate per qualsiasi difetto nel modello di corteggiamento innato; L'indice di corteggiamento e il numero di tentati copulatori sono stati calcolati da video di 15 minuti. Le mosche knockdown hanno mostrato un indice di corteggiamento significativamente ridotto e un numero di tentativi di copulazione (Figura 3E2), indicando la loro comunicazione difettosa nei confronti delle femmine.

Comportamento di toelettatura
Il comportamento di toelettatura viene utilizzato come lettura per il comportamento ripetitivo in Drosophila 16,42,43. Il comportamento di toelettatura è stato quantificato nelle mosche transeterozigoti Fmr1 e confrontato con quello di w1118. La latenza alla prima toelettatura è significativamente ridotta nei moscerini Fmr1, mentre la durata media dell'incontro di toelettatura e l'indice di toelettatura sono significativamente aumentati nei moscerini Fmr1 (Figura 4C), indicando un comportamento di toelettatura (o ripetitivo) migliorato nei moscerini modello ASD. Al contrario, il numero totale di attacchi di toelettatura nei moscerini mutanti non è risultato alterato in modo significativo rispetto a quello dei moscerini di controllo.

Saggio di assuefazione olfattiva
L'assuefazione è difettosa in un gran numero di individui autistici e può essere utilizzata come test per lo stesso in Drosophila23. Qui, l'assuefazione olfattiva è stata testata nel modello ASD abbattendo la fila negli interneuroni locali olfattivi guidati da LN1-GAL4. Un odorante avversivo, il 20% di butirrato di etile, è stato utilizzato in questi esperimenti per indurre l'assuefazione in queste mosche. I risultati mostrano che le mosche knockdown non si sono abituate dopo un'esposizione di 3 giorni agli odori (le ultime due barre nel grafico nella Figura 5E non mostrano una differenza significativa tra mosche naive e abituate) rispetto alle mosche di tipo selvatico che mostrano un'assuefazione tipica dopo l'esposizione al butirrato di etile per 3 giorni (le mosche esposte mostrano un calo significativo dell'indice di prestazione rispetto alle mosche naïve). Ciò indica che le mosche knockdown non si abituano dopo l'esposizione al butirrato di etile per 3 giorni e sono respinte dall'odore ripugnante, dimostrando che queste mosche ASD sono carenti di assuefazione.

figure-results-1
Figura 1: Arena dell'aggressività e modelli comportamentali rappresentativi. (A) L'arena dell'aggressività allestita in una piastra a 24 pozzetti con un coperchio perforato per l'ingresso al volo. Riquadro: Dimensioni di una singola arena con cibo per mosche. (B) Fotografia di un tubo di stabulazione singola contenente una singola mosca maschio isolata e una fiala di gruppo contenente mosche maschili e femmine, ricapitolando un ambiente sociale. (C) Un aspiratore per il trasferimento di mosche basato sull'aspirazione orale. Elementi necessari per il montaggio di un aspiratore a mosca che indichi i lati del tubo per l'ingresso della mosca (estremità della mosca) e il lato che verrebbe inserito nella bocca (estremità della bocca) (C1) e un aspiratore a mosca assemblato (C2). (D) Modelli comportamentali aggressivi maschili rappresentativi: avvicinamento, minaccia alare, scherma, tenuta, affondo, boxe e zuffa. (E) I moscerini maschi mutanti Fmr1 mostrano un comportamento aggressivo ridotto nei confronti di altri maschi rispetto ai controlli. Box plot che mostra il numero di attacchi aggressivi per maschi socialmente isolati di w1118 (controllo) rispetto a mosche trans-eterozigoti Fmr1 (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Allestimento dell'arena per saggi di spazi sociali. (A) Diagramma che mostra le dimensioni e la disposizione delle lastre di vetro e dei distanziatori acrilici. (B) La disposizione finale dei componenti dell'arena in cui i distanziatori acrilici sono inseriti tra i pezzi di vetro, lasciando un piccolo spazio per l'ingresso della mosca nella parte inferiore. Lo spazio triangolare creato tra pezzi di vetro e distanziatori è l'arena SSA per le mosche, qui le mosche sono in grado di muoversi solo in due dimensioni. (C) Fotografia dell'allestimento finale dell'arena SSA con le mosche all'interno della camera. Abbreviazione: SSA = array di spazio sociale. (D) I moscerini modello ASD (Fmr1 transeterozigote) mostrano una maggiore distanza l'una dall'altra nel test dello spazio sociale rispetto a w1118. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Arena del corteggiamento e modelli comportamentali rappresentativi. Diagrammi che mostrano (A) il design e (B) la disposizione dei dischi in un'arena di saggio di corteggiamento. (C) Foto dell'arena di corteggiamento dopo l'arrangiamento finale. (D) Immagini rappresentative che mostrano i modelli comportamentali di corteggiamento di un maschio ingenuo nei confronti di una femmina accoppiata: inseguimento, orientamento, sfarfallio delle ali, leccamento, tentativo di copulazione e copulazione. (E) Grafici che mostrano l'indice di corteggiamento e il numero di tentate copulazioni in due modelli ASD: (E1) Le mosche mutanti Fmr1 mostrano una riduzione significativa dell'indice di corteggiamento e del tentativo di copulazione rispetto al controllo w1118 . (E2) le mosche knockdown di fila sono state utilizzate come un altro modello ASD in cui l'shRNA di fila era espresso nei neuroni del corpo del fungoy (MB247-GAL4); Una significativa riduzione del comportamento di corteggiamento è stata osservata dopo l'abbattimento della fila. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Configurazione dell'arena e modelli comportamentali rappresentativi del comportamento di toelettatura. (A) L'arena a forma di disco o ruota (la stessa arena di corteggiamento mostrata nella Figura 3) è allestita su un pannello LED con un diffusore per un'illuminazione uniforme dal basso e il video è stato catturato dall'alto. Ciò garantisce un contrasto più elevato necessario per identificare il movimento fine delle appendici durante la toelettatura. (B) Fotografie dei modelli di comportamento di toelettatura osservati nei moscerini maschi adulti. T1 = 1° paio di gambe, T2 = 2° paio di gambe, T3 = terzo paio di gambe. La nomenclatura abbreviata intuitiva viene utilizzata per i modelli di toelettatura in B: T1-testa = testa strofinata con le prime zampe; T1-T1 = primo paio di zampe strofinate insieme, e così via. Abbreviazione: LED = diodo a emissione luminosa. (C) Grafici che mostrano i risultati del test di toelettatura eseguiti in mosche trans-eterozigoti Fmr1 e confrontati con w1118. I moscerini mutanti Fmr1 hanno mostrato una latenza significativamente ridotta per il primo incontro di toelettatura, indicando l'inizio precoce della toelettatura rispetto al controllo. Inoltre, la durata media dell'incontro di toelettatura e l'indice di toelettatura erano significativamente aumentati nei mutanti Fmr1 , indicativo di un comportamento ripetitivo migliorato nei moscerini modello ASD. Al contrario, il numero totale di attacchi di toelettatura non è stato alterato in modo significativo nei moscerini mutanti rispetto al controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Induzione e configurazione del saggio per l'assuefazione olfattiva e l'esito rappresentativo dopo il saggio. (A) Componenti della configurazione del saggio binario per la scelta dell'odore: (A1) il labirinto a Y, (A2) l'adattatore, (A3) la disposizione di questi due, (A4) una coppia di provette di raccolta da attaccare alla sommità dei bracci del labirinto a Y, (A5) la bottiglia di vetro e i tubi di vetro per mantenere la soluzione odorizzante o l'acqua attraverso la quale l'aria bolle prima di passare al labirinto a Y. (B) Installazione di bottiglie di cibo per mosche per l'induzione dell'assuefazione olfattiva; il diagramma dei cartoni animati (B1) mostra come il tubo di microfuge contenente odorante sia appeso a un filo di rame a metà all'interno della bottiglia; (B2) infine, l'apertura della bottiglia viene coperta da cotone e sigillata da buste di carta marrone. (C) Foto della disposizione totale dell'allestimento del labirinto a Y. (D) Fotografie che mostrano la distribuzione delle mosche nelle camere di raccolta dopo la fine di un esperimento. (D1) Le mosche ingenue (esposte solo alla paraffina inodore, controllo) mostrano repulsione verso l'odorante avversivo (20% di butirrato di etile utilizzato per l'induzione dell'assuefazione in questo studio) e scelgono nel braccio del labirinto a Y riempito con aria normale mentre le mosche esposte (D2) (abituate) si distribuiscono uniformemente in entrambe le braccia. Abbreviazione: ID = diametro interno. (E) I risultati del test di assuefazione olfattiva delle mosche a fila hanno mostrato un difetto di assuefazione. Le mosche wild type (Canton S), dopo 3 giorni di esposizione al butirrato di etile, hanno mostrato una significativa riduzione dell'indice di prestazione rispetto alle mosche naïve, indicativa di assuefazione. Quando le progenie di mosche LN1-GAL4 x row-shRNA sono state esposte per 3 giorni, l'indice di prestazione non è risultato significativamente diverso da quello delle mosche naïve; ciò dimostra che queste mosche non si sono abituate dopo 3 giorni di esposizione all'odore, ricapitolando un sintomo umano simile all'ASD. Abbreviazioni: ASD = disturbo dello spettro autistico; shRNA = RNA a forcina corta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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La Drosophila è utilizzata come organismo modello per la ricerca sui disturbi neurologici umani a causa di un alto grado di conservazione delle sequenze geniche tra la mosca e i geni della malattia umana9. Numerosi e robusti paradigmi comportamentali lo rendono un modello attraente per lo studio dei fenotipi manifestati nei mutanti che ricapitolano le malattie umane. Poiché centinaia di geni sono implicati nel disturbo dello spettro autistico (ASD), non esiste un modello comune di ASD in nessun organismo modello. Quindi, per ogni mutante, i ricercatori devono prima stabilire fenotipi simili all'ASD nel moscerino. In questo articolo, abbiamo cercato di semplificare il processo proponendo l'uso di cinque paradigmi comportamentali di mosca in concerto per tale valutazione. Questi paradigmi sono impiegati nei moscerini per valutare i principali e comuni deficit comportamentali dei pazienti umani con ASD: deficit sociali e di comunicazione, miglioramento dei comportamenti ripetitivi e un difetto di assuefazione. Se una mutazione del gene del moscerino mostra difetti in tutti o nella maggior parte di questi cinque paradigmi, potrebbe essere una forte indicazione di uno scenario simile all'ASD.

La maggior parte dei paradigmi comportamentali qui descritti sono stati utilizzati più volte nella letteratura precedente per risolvere diverse domande di ricerca. Non è raro trovare variazioni nelle tecniche tra i diversi studi. Le modifiche alle tecniche sono state apportate per soddisfare le esigenze di ricerca e per soddisfare la domanda specifica da risolvere. Ad esempio, nel test di corteggiamento, il comportamento di corteggiamento innato e appreso può essere quantificato nei confronti di una mosca tester che può essere un maschio immaturodi 65 anni, una femmina verginedi 66,67, una femmina preaccoppiatadi 68,69,70, una femmina vergine congelata di65 o anche una femmina decapitatadi 19 anni . Nel metodo descritto in questo articolo, le femmine pre-accoppiate di tipo selvatico sono state utilizzate come tester per verificare il modello di corteggiamento di una mosca modello ASD maschio. La ricettività essutale diuna femmina preaccoppiata è relativamente inferiore a quella di una mosca vergine71. Di conseguenza, il numero di incontri di corteggiamento maschile e la loro durata sono più verso una femmina accoppiata che verso una vergine; Allo stesso modo, la latenza alla copulazione è anche più lunga di quella delle femmine tester vergini, nel qual caso la copulazione precoce porta a una riduzione dell'indice di corteggiamento, riducendo la possibilità di un confronto efficace tra i genotipi. Quindi, l'uso di una femmina preaccoppiata come tester fornisce una migliore analisi comparativa del comportamento di corteggiamento di una mosca ASD rispetto a una mosca di tipo selvatico. D'altra parte, l'uso di femmine vergini può fornire ulteriori informazioni che possono essere mascherate quando vengono utilizzate femmine accoppiate. L'uso di femmine accoppiate può anche influenzare e alterare il comportamento di corteggiamento maschile. In sintesi, si suggerisce che i ricercatori scelgano la loro strategia sperimentale e i dettagli a seconda della necessità dell'esperimento specifico.

È necessario essere cauti qui prima di applicare la tecnica in uno o tutti gli omologhi di mosche dei geni ASD. Tutti questi paradigmi comportamentali sono regolati da un numero specifico e piccolo di neuroni. L'espressione di un certo gene deve essere stabilita prima di procedere a uno specifico paradigma comportamentale. Ad esempio, se l'omologo del moscerino di un gene associato all'ASD non è espresso nei neuroni del corpo dei funghi o nei neuroni glutammatergici, allora il comportamento di corteggiamento e toelettatura potrebbe non essere influenzato nel suo mutante.

Un altro punto a cui i ricercatori devono prestare attenzione è che la mancanza di un difetto non significa sempre che la mutazione non abbia alcun ruolo. Ad esempio, negli esperimenti sul comportamento di toelettatura con mutanti Fmr1 , il conteggio totale degli attacchi di toelettatura non è significativamente inferiore nei mutanti rispetto ai controlli, mentre altri parametri come l'indice di toelettatura, ecc. dimostrano un difetto nel comportamento di toelettatura. Ciò può essere spiegato dal prolungamento di ogni incontro di toelettatura nei mutanti Fmr1 , con conseguente conteggio basso del numero totale di attacchi nonostante la durata totale dell'incontro sia molto più alta. Ciò sottolinea la necessità di quantificare più parametri per ciascun modello comportamentale. Inoltre, va ricordato che il termine ASD copre un'ampia gamma di malattie causate da variazioni in uno qualsiasi delle centinaia di geni, che si traducono in fenotipi eterogenei con vari gradi di penetranza tra gli individui colpiti. Ad esempio, il deficit di assuefazione si osserva in alcuni pazienti ma non in tutti. Lo stesso ci si aspetterebbe nei modelli di mosca della malattia.

Per l'analisi del comportamento aggressivo, in questo studio sono stati presi in considerazione diversi tipi di parametri aggressivi: affondo, minaccia alare, zuffa, ecc. (Figura 1)30. Ogni incontro deve essere identificato e conteggiato come tipo di incontro individuale o come conteggio totale degli attacchi. È importante prima familiarizzare con i modelli di aggressività dei moscerini maschi, che sono descritti in59,72 e mostrati nella Figura 1. Durante il conteggio dei numeri di incontri aggressivi, i punti di inizio e fine di un singolo evento di aggressione devono essere chiaramente identificati; Più tipi di schemi di aggressività potrebbero essere mostrati all'interno di un singolo incontro, seguito dalla fine dell'incontro. Un attacco di aggressione è considerato finito quando una mosca smette di mostrare uno qualsiasi dei comportamenti aggressivi o del movimento per 2 secondi o interrompe l'attacco e inizia ad allontanarsi.

La maggior parte di questi paradigmi comportamentali ha molteplici variazioni e avanzamenti descritti da più laboratori. Ciascuna delle modifiche specifiche era stata creata per soddisfare le esigenze di uno scopo specifico. Allo stesso modo, le tecniche di quantificazione o analisi automatizzate e basate su algoritmi hanno liberato queste tecniche dalle possibilità di errori manuali. In questo articolo, sono state dimostrate le tecniche più basilari con il minor numero di requisiti materiali, nella speranza che queste tecniche possano essere facilmente adottate e utilizzate dal maggior numero di ricercatori.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo immensamente grati a Mani Ramaswami (NCBS, Bangalore) e Baskar Bakthavachalu (IIT Mandi) per la configurazione del saggio di assuefazione e scelta dell'odore, Pavan Agrawal (MAHE) per i suoi preziosi suggerimenti sul test di aggressione, Amitava Majumdar (NCCS, Pune) per aver condiviso il suo prototipo di camera di corteggiamento e le linee di mosca mutanti Fmr1 e Gaurav Das (NCCS, Pune) per aver condiviso la linea MB247-GAL4. Ringraziamo il Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, USA), il National Institute of Genetics (NIG, Kyoto, Giappone), la Banaras Hindu University (BHU, Varanasi, India) e il National Center for Biological Science (NCBS, Bangalore, India) per le linee di Drosophila . Il lavoro nel laboratorio è stato sostenuto da sovvenzioni da SERB-DST (ECR/2017/002963) ad AD, borsa di studio DBT Ramalingaswami assegnata ad AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016) e supporto istituzionale da IIT Kharagpur, India. SD e SM ricevono borse di dottorato da CSIR-Senior Research Fellowship; PM riceve un dottorato di ricerca da MHRD, India.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Arena di aggressione:
Piastra standard a 24 pozzetti in polistirene12 cm x 8 cm x 2 cm. Diametro di un singolo pozzetto = 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; profondità = 1 cm
FoglioAlternativa: un coperchio perforato di una piastra per colture cellulari
Social Space Saggio:
Clip19 mm
Lastre di vetro e lastre acriliche di dimensioniSpessore = 5 mm
Saggio di corteggiamento:
Dado e bullone con filettatura
Fogli di perspex di forme personalizzatei) Coperchio: un disco rotondo in perspex trasparente su misura (2-3 mm di spessore, 70 mm di diametro) con un foro di caricamento nella regione periferica e un altro foro per la vite al centro (diametro ~ 3 mm per ciascuno); ii) Un secondo disco di Perspex trasparente di spessore più spesso (3-4 mm di spessore, 70 mm di diametro), con 6-8 perforazioni di diametro 15 mm, equidistanti dal centro; iii) Base: Come il coperchio tranne che senza il foro di caricamento
Saggio di toelettatura:
Pannello10... Pannello LED montabile a soffitto da 15 Watt
Assuefazione e saggio del labirinto a Y
Camere rampicantix2, vetro borosilicato
Adattatore per il collegamento del labirinto a Y con fialain Perspex, su misura, misurazioni in Figura 5A
FlaconiBorosil #1500017
di lavaggio a gasBorosil #1761021
FialaOD= 25 mm x Altezza= 85 mm; Vetro borosilicato
Odorante (Butirrato di etile)Merck #E15701
Cera di paraffina (liquida) lightSRL #18211
Morsetti aPolymed #14098
TubiOD = 0,6 cm, ID = 0,3 cm; morsetti a rullo per il controllo del flusso
Pompaa vuoto Hana #HN-648 (Qualsiasi pompa per acquario con direzione del flusso invertito manualmente)
LabirintoVetro borosilicato
Tubo di vetro a forma di Y (vetro borosilicato)Su misura, misure in Figura 5A
Elementi comuni:
Qualsiasi software per la riproduzione video (es.- Lettore multimediale VLC)https://www.videolan.org/vlc/
Computer per l'analisi video
BottiglieOD= 60 mm x Altezza= 140 mm; vetro/polipropilene
FialeOD= 25 mm x Altezza= 85 mm; Vetro borosilicato
Graph-pad Prisma softwarehttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ softwarehttps://imagej.net/downloads
Timer Videocamera
con registrazione video impostataLa videocamera o la fotocamera di un telefono cellulare funzioneranno
Per aspiratore di mosche:
CottonAbsorbent, autoclavato
ParafilmSigma-aldrich #P7793
Puntali200 &; L o 1000 µ L, scegliere in base al diametro esterno del tubo in silicone
Lunghezza del tubo= 30-50 cm. Il tubo deve essere inodore
Composizione del cibo per mosche:
Ingredienti (quantità per 1 L di cibo)
Agar (8 g)SRL # 19661 (CAS: 9002-18-0)
Farina di mais (80 g)D-glucosio biologico, procurato localmente
(20 g)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Acido propionico (4 g)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Saccarosio (40 g)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Metil para idrossibenzoato) (1.25 g)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Lievito in polvere (10 g)HIMEDIA # RM027
Fly lines utilizzato negli esperimenti in questo studio:
Tipo selvatico (Cantone S o CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; fmr1[δ 50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; fmr1[δ 113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, consorzio NP, Japan
row-shRNABDSC # 25971
trasparente di plastica/acrilico trasparente per legante personalizzate LED rivestito in vetro diffuso d'ingresso di reagenti trasparenti Tappo in vetro rullo in silicone a Y dei dati Fly Fly per pipette in silicone/gomma

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Psychiatric Association. American Psychiatric Association DSM-5 Task Force Diagnostic and statistical manual of mental disorders: DSM-5TM, 5th ed. , Am. Psychiatr. Publ. Inc. (2013).
  2. Zeidan, J., et al. Global prevalence of autism: A systematic review update. Autism Res. 15 (5), 778(2022).
  3. Lordan, R., Storni, C., De Benedictis, C. A. Autism spectrum disorders: diagnosis and treatment. Autism Spectr Disord. , Exon Publications. (2021).
  4. Horev, G., et al. Dosage-dependent phenotypes in models of 16p11.2 lesions found in autism. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 17076-17081 (2011).
  5. Bey, A. L., Jiang, Y. Overview of mouse models of autism spectrum disorders. Curr Protoc Pharmacol. 66 (1), 1(2014).
  6. Fetit, R., Price, D. J., Lawrie, S. M., Johnstone, M. Understanding the clinical manifestations of 16p11.2 deletion syndrome: a series of developmental case reports in children. Psychiatr Genet. 30 (5), 136-140 (2020).
  7. Nicolini, C., Fahnestock, M. The valproic acid-induced rodent model of autism. Exp Neurol. 299, 217-227 (2018).
  8. Tartaglione, A. M., Schiavi, S., Calamandrei, G., Trezza, V. Prenatal valproate in rodents as a tool to understand the neural underpinnings of social dysfunctions in autism spectrum disorder. Neuropharmacology. 159, 107477(2019).
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