Aggregazione cellulare incapsulata della matrice della membrana basale per lo studio della formazione del tessuto milza murino

Summary

Questo articolo descrive un protocollo per l'aggregazione e l'incapsulamento delle cellule della milza all'interno di una matrice di membrana basale semisolida. I costrutti di matrice di membrana basale possono essere utilizzati in coltura tridimensionale per lo studio dello sviluppo di organoidi o per studi di trapianto e rigenerazione tissutale in vivo .

Abstract

La milza è un organo immunitario che svolge un ruolo chiave nelle risposte immunitarie trasmesse per via ematica. La perdita anatomica o funzionale di questo tessuto aumenta la suscettibilità a gravi infezioni del sangue e sepsi. L'autotrapianto di fette di milza è stato utilizzato clinicamente per sostituire il tessuto perso e ripristinare la funzione immunitaria. Tuttavia, il meccanismo che guida la rigenerazione del tessuto della milza robusto e immunologicamente funzionale non è stato completamente chiarito. Qui, miriamo a sviluppare un metodo per aggregare e incapsulare le cellule della milza all'interno di una matrice semi-solida al fine di studiare i requisiti cellulari per la formazione del tessuto della milza. I costrutti cellulari incapsulati con matrice di membrana basale sono suscettibili sia di coltura tissutale in vitro di organoidi tridimensionali che di trapianto sotto la capsula renale per valutare direttamente la formazione di tessuti in vivo . Manipolando le cellule di input per l'aggregazione e l'incapsulamento, dimostriamo che le cellule stromali neonatali PDGFR⁺MAdCAM-1^- derivate da innesto sono necessarie per la rigenerazione del tessuto della milza in modelli di trapianto animale.

Introduction

La rottura traumatica della milza e la comparsa di noduli splenici multipli nel corpo è stata una delle prime indicazioni che il tessuto della milza ospitava capacità rigenerativa ^1,2. Gli autotrapianti di milza sono stati successivamente introdotti in clinica per preservare il tessuto della milza nei pazienti che necessitavano di splenectomia d'urgenza³. Eppure, nonostante faccia parte della pratica clinica da decenni, si sa molto poco su come si rigenera la milza. I modelli di trapianto animale hanno fornito informazioni su molteplici parametri della rigenerazione della milza e della funzione immunitaria ^4,5. In particolare, le modifiche sperimentali al metodo di preparazione dell'innesto hanno permesso di studiare in modo più dettagliato la rigenerazione tissutale a livello cellulare e molecolare.

I trapianti che coinvolgono fette intere di milza subiscono una fase di necrosi di massa prima che venga ricostruita una nuova struttura della milza⁶. La fase iniziale della necrosi del trapianto suggerisce che la maggior parte del tessuto trapiantato è costituito in gran parte da globuli rossi e bianchi e non è necessario per la rigenerazione della milza. Questo è stato studiato sperimentalmente escludendo le cellule ematopoietiche da innesti di milza prima del trapianto sotto la capsula renale di topo. In questo caso, la frazione non leucocitaria/non eritrocitaria della milza, che comprende le cellule stromali ed endoteliali, si è dimostrata sufficiente per indurre la formazione di tessuto de novo ⁷. Il tessuto stromale della milza potrebbe essere ulteriormente trasformato in una sospensione a singola cellula, consentendo l'uso di tecnologie di selezione cellulare per manipolare la composizione dell'innesto cellulare. Rimuovendo selettivamente i tipi di cellule candidate, sono state identificate due popolazioni di cellule stromali CD45-TER-119^- indispensabili per lo sviluppo del trapianto: una popolazione di cellule CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ di tipo endoteliale e una popolazione di cellule mesenchimali PDGFRβ⁺ più ampiamente definita⁸.

La costruzione degli innesti da cellule di milza varia in termini di materiali di supporto e processi di caricamento delle cellule. Le milze ingegnerizzate con tessuti sono state precedentemente preparate caricando unità spleniche su uno scaffold polimerico di acido poliglicolico/acido poli-lattico ^5,9. È interessante notare che le cellule stromali della milza assorbite in una spugna di collagene non sono riuscite ad attecchire, mentre le cellule stromali aggregate e caricate su un foglio di collagene hanno facilitato la rigenerazione della milza⁸. È stato anche dimostrato che la risospensione delle cellule stromali della milza all'interno di una matrice di Matrigel induce l'aggregazione cellulare in condizioni di coltura tridimensionale¹⁰. Tuttavia, questo metodo non è stato testato per l'uso in modelli di trapianto. L'obiettivo generale dell'attuale protocollo è quello di aggregare e incapsulare forzatamente le cellule stromali della milza direttamente all'interno della matrice di membrana basale, che successivamente possono essere trasferite in un sistema di coltura tissutale tridimensionale in vitro o utilizzate come veicolo per trapianti su modelli animali (Figura 1 supplementare).

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo protocolli sperimentali approvati dal Comitato Etico Animale dell'Università del Queensland (UQBR/079/19).

1. Raccolta del tessuto e preparazione delle cellule stromali

1. Sopprimere topi donatori neonatali maschi e/o femmine di 0,5-1,5 giorni di età mediante induzione dell'ipotermia avvolgendo gli animali all'interno della carta velina e mettendoli sotto il ghiaccio tritato per >10 minuti.
   NOTA: Questo protocollo può essere adattato a diversi ceppi di topi, età e numero di animali.
2. Preparare strumenti chirurgici sterili.
3. Appoggiare il mouse in una posizione laterale destra. Tamponare la pelle con etanolo all'80% ed eseguire un'incisione di 1 cm con le forbici chirurgiche Iris per esporre la parete peritoneale.
4. Fai una seconda incisione di 0,5 cm sopra la milza e usa un paio di pinze sottili per sollevare delicatamente il tessuto. Usa un paio di forbici chirurgiche per tagliare i vasi sanguigni e asportare il tessuto. Trasferire il tessuto in una capsula di Petri contenente soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS). Rimuovere il tessuto connettivo residuo attaccato alla milza.
   NOTA: Uno stereomicroscopio può aiutare i movimenti motori fini necessari per manipolare gli strumenti chirurgici.
5. Per dissociare interi tessuti, trasferire la milza neonatale (pool di 10 o meno) nel bordo interno di una provetta conica rovesciata da 14 ml. Distruggi meccanicamente i tessuti con un movimento di pressione utilizzando l'estremità posteriore in plastica di uno stantuffo per siringa da 1 ml.
6. Posizionare e fissare saldamente il tappo su una provetta conica da 14 mL contenente 10 mL di PBS freddo. Capovolgere il tubo 5 volte per lavare tutto il tessuto interrotto dal tappo al tubo.
7. Ripetere il passaggio 1.6 per tutti i tessuti rimanenti.
8. Lasciare la provetta sul ghiaccio per 1 minuto per lasciare che il tessuto si depositi sul fondo della provetta.
9. Scartare con cautela il surnatante (contenente cellule ematopoietiche) facendo passare la soluzione attraverso un colino cellulare reversibile da 70 μm.
10. Recuperare la frazione stromale non solubile invertendo il colino e lavando nuovamente il tessuto stromale nella provetta conica da 14 mL utilizzando 2 mL appena preparati di Dulbecco's Modified Eagle Medium (sDMEM) integrato contenente 1 mg/mL di collagenasi IV, 40 μg/mL di DNasi I e 2% di siero fetale bovino (FBS).
    ATTENZIONE: La collagenasi IV e la collagenasi D sono sostanze pericolose e devono essere maneggiate all'interno di un armadio di biosicurezza con adeguati dispositivi di protezione individuale.
11. Per preparare una sospensione unicellulare, digerire enzimaticamente il tessuto aggregato (fino a 20) per 10 minuti a 37 °C con rotazione costante.
12. Aggiungere 4 mL di sDMEM appena preparato contenente 1 mg/mL di collagenasi D, 40 μg/mL di DNasi I e 2% di FBS direttamente nella provetta contenente il tessuto stromale. Incubare per altri 10 minuti a 37 °C con rotazione costante.
13. Arrestare la digestione aggiungendo 8 ml di PBS ghiacciato. Raccogliere le cellule centrifugando a 200 x g per 5 minuti a 4 °C.
14. Scartare il surnatante e lavare le cellule due volte sospendendo in 1 mL di PBS freddo e centrifugando a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Mantieni le cellule sul ghiaccio.
    NOTA: Le cellule possono essere contate e regolate alla concentrazione desiderata. Ciò può richiedere l'ottimizzazione per diverse popolazioni cellulari. Utilizzando questo protocollo, 0,5 x 10⁶- 1 x 10⁶ cellule stromali/milza vengono in genere recuperate, a seconda dell'età dei topi donatori. Le cellule possono opzionalmente essere colorate e ordinate FACS in questa fase per definire la composizione cellulare.

2. Incapsulamento matriciale di aggregati cellulari

1. Preraffreddare i puntali sterili per pipette P200 all'interno di un congelatore a -20 °C.
2. Tagliare la pellicola flessibile da laboratorio (ad es. Parafilm) in pezzi di 1 cm x 2 cm e sterilizzare immergendola in etanolo all'80% per 10 minuti, seguita da PBS per 10 minuti. La pellicola da laboratorio può essere preparata in anticipo e conservata sterile.
3. Preparare 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ cellule centrifugando a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare con cautela il surnatante, lasciando circa 20 μL del volume di PBS rimanente. Tenere il pellet cellulare sul ghiaccio.
   NOTA: Il PBS rimanente può essere aspirato delicatamente senza disturbare il pellet della cella per confermare il volume.
4. Aspirare 2 μL di matrice di membrana basale ghiacciata in un puntale per pipetta P200 preraffreddato, utilizzando un pipettor P20.
   NOTA: Una matrice di membrana basale altamente concentrata (ad es. Corning Matrigel Matrix High Concentration) aiuta a formare un forte tappo solidificato.
5. Ruotare delicatamente per espellere il puntale della pipetta. Stendere una striscia pre-sterilizzata della pellicola da laboratorio e posizionarla sull'estremità del puntale della pipetta, facendo attenzione a non perforare la pellicola. Continuare ad avvolgere il puntale nella pellicola per sigillare il puntale della pipetta. Posizionare con cautela la punta sigillata direttamente sul ghiaccio, facendo attenzione a non rompere la pellicola.
6. Risospendere il pellet cellulare nel PBS rimanente e stratificare delicatamente la soluzione sulla matrice della membrana basale. Tieni il costrutto sul ghiaccio.
7. Preparare una provetta di centrifugazione inserendo una provetta cluster da 1,2 mL all'interno di una provetta conica da 14 mL.
8. Posizionare il puntale della pipetta all'interno della configurazione della provetta nidificata e centrifugare a 400 x g e 4 °C per 5 minuti.
9. Posizionare la provetta conica da 14 mL con orientamento verticale e incubare a 37 °C per 15 minuti per consentire alla matrice della membrana basale di solidificarsi all'interno del puntale della pipetta.
   NOTA: La provetta conica da 14 mL può essere posizionata sul ghiaccio fino a quando non è necessaria per l'applicazione a valle.

3. Coltura di organoidi tridimensionali

1. Rimuovere con cautela la pellicola di laboratorio dal puntale della pipetta.
2. Inserire uno stantuffo sottile in filo di acciaio inossidabile attraverso l'apertura più grande del puntale della pipetta.
3. Espellere il tappo della matrice fino a quando non viene rilasciato attraverso la punta in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti non trattata contenente 2 mL di sDMEM integrato con il 10% di FBS, 1x Glutamax, 1x Aminoacidi non essenziali (NEAA), 10 μM Rock Inhibitor, 10 U/mL di penicillina/streptomicina e 50 μM di β-mercaptoetanolo.
   NOTA: Il recipiente di coltura tissutale e il volume del terreno corrispondente possono essere regolati secondo necessità.
   ATTENZIONE: NEAA, Penicillina/Streptomicina e β-mercaptoetanolo sono sostanze pericolose e devono essere maneggiate all'interno di un armadio di biosicurezza con adeguati dispositivi di protezione individuale.
4. Coltivare organoidi a 37 °C, 5% di CO₂ e 95% di umidità per 4-12 settimane.
5. Sostituisci metà del mezzo ogni 5 giorni.
   NOTA: Se gli organoidi iniziano ad attaccarsi alla piastra di coltura tissutale, trasferirli in un pozzetto nuovo.

4. Trapianto di capsule renali

1. Preparare strumenti chirurgici sterili.
2. Eseguire un trapianto di rene subcapsulare del tappo della matrice della membrana basale:
   1. Anestetizzare un topo ricevente femmina BALB/c di 8 settimane con isoflurano seguendo le linee guida per l'etica degli animali istituzionali.
      ATTENZIONE: L'isoflurano è una sostanza pericolosa. I gas di scarico devono essere eliminati per impedire l'ingresso nell'ambiente di lavoro.
   2. Appoggiare il mouse in una posizione laterale destra.
   3. Radere i peli dal sito dell'intervento chirurgico e disinfettare la pelle seguendo le linee guida istituzionali.
      NOTA: Si consiglia di disinfettare il sito chirurgico tre volte con movimenti circolari alternando scrub a base di iodio o clorexidina e alcol.
   4. Praticare un'incisione di 2 cm nella pelle perpendicolare alla colonna vertebrale per esporre la parete peritoneale.
      NOTA: Per l'incisione cutanea è possibile utilizzare forbici chirurgiche fini o una lama per bisturi. Gli utenti devono seguire le linee guida per l'etica istituzionale degli animali o le procedure operative standard.
   5. Praticare un'incisione più piccola di 0,5 cm nella parete peritoneale sopra il rene.
      NOTA: L'incisione deve approssimare la larghezza del rene per garantire che il rene rimanga esteriorizzato durante il trapianto.
   6. Esternalizzare il rene attraverso l'apertura peritoneale esercitando una pressione verso il basso utilizzando il pollice e l'indice. Un paio di pinzette ad anello possono essere utilizzate per aiutare l'esteriorizzazione. Assicurarsi che il rene sia umido durante la procedura applicando regolarmente PBS sterile utilizzando un batuffolo di cotone.
   7. Sotto uno stereomicroscopio, pizzicare il grasso perirenale della capsula renale con un paio di pinze ultrafini piegate su un polo del rene. Utilizzare un secondo paio di pinze ultrafini piegate per strappare delicatamente la membrana della capsula renale verso l'alto in direzione opposta, creando una piccola apertura.
   8. Inserire con cautela il polo di una pinza sotto la membrana della capsula. Utilizzare un movimento lento per separare la membrana della capsula dal parenchima renale.
   9. Preparare il tappo della matrice della membrana basale per il trapianto rimuovendo la pellicola di laboratorio dal puntale della pipetta.
   10. Sollevare la capsula renale utilizzando un polo della pinza e inserire la punta della pipetta attraverso l'apertura, spingendola verso il polo opposto del rene.
   11. Inserire uno stantuffo metallico nel puntale della pipetta ed espellere il tappo della matrice estraendo contemporaneamente il puntale della pipetta dal rene.
   12. Inumidire il rene con PBS e reinternalizzare.
   13. Chiudere la parete peritoneale con una sutura 5-0 Vicryl e chiudere la pelle con due autoclip.
   14. Somministrare analgesico (buprenorfina a 0,05-0,1 mg/kg per via sottocutanea o seguendo le linee guida istituzionali per l'etica degli animali).
       ATTENZIONE: La buprenorfina è una sostanza pericolosa e deve essere maneggiata con adeguati dispositivi di protezione individuale.
3. Disattiva il flusso di isoflurano ma mantieni il flusso di ossigeno per consentire al topo di respirare ossigeno puro fino a quando non inizia a prendere coscienza.
4. Riporta il topo nella sua gabbia. Mantieni l'animale al caldo durante il recupero posizionando parzialmente la gabbia sopra un termoforo o sotto una lampada riscaldante e monitora fino a quando il topo non si riprende completamente dall'anestesia.
5. Monitorare il recupero post-chirurgico per le prime due settimane o come richiesto dalle linee guida istituzionali.

Results

L'aggregazione cellulare è importante per promuovere il contatto e la segnalazione cellula-cellula. L'incapsulamento di aggregati cellulari all'interno della matrice di membrana basale ha supportato sia le colture tridimensionali per la formazione di organoidi tissutali in vitro che ha facilitato la consegna meccanica delle cellule nella capsula renale per il trapianto di innesto. Per stabilire questi costrutti, la matrice di membrana basale è stata prima mantenuta in uno stato fluidico in condizioni di freddo glaciale. L'aggregazione cellulare è stata successivamente ottenuta stratificando una sospensione cellulare concentrata sopra e utilizzando la forza centrifuga per spingere le cellule attraverso la matrice ad alta densità. L'ottimizzazione della velocità di centrifugazione (200-2000 x g) è stata necessaria per ottenere un posizionamento della cella dello strato intermedio (Figura 1A), che dipendeva anche dal numero di cellule. Forze centrifughe più elevate (>500 x g) hanno spinto le cellule fino alla punta della pipetta (Figura 1B) ed è necessaria cautela per un numero di cellule più piccolo (ad esempio, <5 x 10⁵) che potrebbero andare persi durante la rimozione del rivestimento flessibile della pellicola di laboratorio. Al contrario, le cellule potrebbero non viaggiare adeguatamente attraverso la matrice della membrana basale se le forze G sono troppo basse (≤200 x g) (Figura 1C). Potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione della velocità di centrifugazione per i numeri di cellule <1 x 10⁵ o >2,5 x 10⁶ . Dopo la centrifugazione, le cellule sono state poste all'interno della matrice di membrana basale riscaldando il costrutto a 37 °C per 15 minuti. Questo processo di solidificazione ha permesso di espellere completamente il "tappo" della matrice (Figura 1D) utilizzando uno stantuffo a filo sottile.

Formazione di organoidi della milza in vitro
I tappi della matrice di membrana basale espulsi in un recipiente di coltura tissutale appropriato hanno formato in modo riproducibile strutture simili a organoidi tridimensionali che potevano essere mantenute seguendo tecniche e condizioni di coltura tissutale standard (37 °C, 5% di CO₂, 95% di umidità)¹¹. In coltura, il substrato della matrice della membrana basale di supporto si è gradualmente dissipato tra i giorni 0 e 14 (Figura 2A, i-iii) e non è stato più possibile osservarlo entro il giorno 21, lasciando intatta una massa cellulare sferica simile a un organoide (Figura 2A, vi) che misura circa 545 μm (s.d. = 120 μm, n = 6)¹¹ di diametro. Queste strutture organoidi sono state supportate in coltura oltre i 30 giorni, ma non sono aumentate di dimensioni nel tempo (Figura 2B). Gli organoidi della milza erano composti da cellule stromale CD45-TER-119^-, eritrocita CD45-TER-119⁺ e linfoidi CD45⁺TER-119^- (Figura 2C), tuttavia, la frequenza di ciascuna popolazione era variabile tra i singoli organoidi (n = 4; Tabella 1). Per valutare la struttura generale degli organoidi della milza, sono state preparate e visualizzate criosezioni tissutali spesse 50 μm. Gli organoidi erano costituiti da una struttura non cava, con cellule presenti su tutto il diametro del tessuto (Figura 2D). La valutazione delle sezioni di organoidi con uno spessore di 7 μm di uno strato di singola cellula ha rivelato che le cellule erano disposte in strutture simili a corde senza un chiaro orientamento spaziale (Figura 2D), con aree prive di nuclei tra le stringhe di cellule. La colorazione degli anticorpi CD45 ha verificato la presenza di cellule ematopoietiche nucleate che circondavano densamente le regioni periferiche dell'organoide (Figura 2E). Inoltre, cellule CD45⁺ di morfologia distinta, a forma di fuso, sono state osservate in regioni organoidi più centrali. Una generale assenza di colorazione degli anticorpi CD90.2 (cellule T) e CD19 (cellule B), ma una colorazione positiva di CD11b, ha dimostrato la presenza specifica di cellule mieloidi (Figura 2F). Anche le cellule endoteliali CD105⁺ e CD31⁺ non ematopoietiche sono state rilevate in più organoidi¹¹.

Trapianto di innesto di milza in vivo
L'incapsulamento di cellule stromali aggregate della milza all'interno di una matrice semisolida facilita gli studi di trapianto su animali. Questa tecnica è stata utilizzata per incorporare preparazioni di cellule stromali della milza neonatale non frazionate o ordinate CD45-TER-119-FACS all'interno di un tappo di matrice di membrana basale, fungendo da veicolo per il trapianto sotto la capsula renale di topo. In linea con protocolli di aggregazione cellulare^{simili 8}, i costrutti cellulari incapsulati (MECC) della matrice di membrana basale hanno rigenerato con successo il tessuto della milza in 4/5 trapianti animali indipendenti, confermando così la fattibilità di questa tecnica di costruzione dell'innesto. Per testare l'utilità dei MECC nella definizione dei tipi cellulari necessari per la rigenerazione della milza, gli innesti MECC sono stati costruiti da cellule neonatali della milza che erano specificamente impoverite di cellule stromali PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ o PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- stromale (CD45^-)¹¹. Gli innesti privi di cellule PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ hanno mantenuto la capacità di rigenerazione dei tessuti grossolani (4/4 innesti; Figura 3A) ¹¹. Tre dei quattro tessuti rigenerati hanno mostrato una composizione e una struttura normali delle cellule della milza, mostrando arteriole centrali, follicoli della polpa bianca, compartimenti segregati delle cellule T e B, cellule dendritiche follicolari, cellule reticolari della zona marginale e macrofagi metallofili marginali, sinusoidi della polpa rossa, cellule mieloidi e macrofagi (Figura 3B)¹¹. Al contrario, gli innesti privi di cellule PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- in gran parte non sono riusciti a rigenerare il tessuto della milza (1/4 degli innesti)¹¹. Questi dati supportano l'importanza delle cellule PDGFRβ⁺ derivate da trapianto nella rigenerazione del tessuto della milza⁸ e individuano un requisito specifico per le cellule stromali PDGFRβ⁺MAdCAM-1^-.

Figura 1. Incapsulamento della matrice della membrana basale di cellule stromali aggregate della milza. Un puntale per pipette da 200 μL viene utilizzato per facilitare l'aggregazione cellulare all'interno di una matrice di membrana basale. Uno strato di matrice fluidica viene innanzitutto stabilito aspirando 2 μL di matrice di membrana basale ghiacciata in un puntale di pipetta pre-raffreddato. Una sospensione cellulare viene depositata sopra lo strato della matrice e viene applicata una forza centrifuga per mobilitare e aggregare le cellule all'interno della matrice della membrana basale. (A) Le impostazioni per la velocità della centrifuga sono ottimizzate per posizionare gli aggregati cellulari a metà strada lungo lo strato della matrice. (B) Un'eccessiva velocità centrifuga provoca l'aggregazione delle cellule all'estremità della pipetta. (C) Una velocità insufficiente impedisce il movimento delle cellule attraverso la matrice. (D) Un tappo a matrice semisolida viene espulso dal puntale della pipetta dopo l'incubazione a 37 °C per 15 minuti. Le punte di freccia indicano la posizione degli aggregati di celle all'interno della matrice. Barra di scala, 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Coltura in vitro di aggregati di milza incapsulati nella matrice di membrana basale e formazione di strutture organoidi tridimensionali. (A) Sviluppo dell'organoide della milza in un decorso temporale di 35 giorni. I pannelli (i-vi) corrispondono ai giorni 0, 7, 14, 21, 28 e 35 della cultura. Le immagini sono state catturate con un microscopio a contrasto di fase invertito Nikon TS2. Barra graduata, 500 μm. (B) Diametro dell'organoide della milza su periodi di coltura estesi. Ogni linea rappresenta un singolo organoide. (C) Caratterizzazione citofluorimetrica di popolazioni cellulari stromali (CD45-TER-119^-), linfoidi (CD45⁺TER-119^-) ed eritroidi (CD45-TER-119⁺) dopo 53 giorni in coltura. Pannello superiore: Tessuto di controllo preparato dallo stroma della milza neonatale. Pannello inferiore: Organoide della milza, giorno 52. (D) Morfologia grossolana del tessuto organoide a spessori di sezione di 50 μm (pannelli superiori) e 7 μm (pannelli inferiori) dopo 22 giorni di coltura. (E) Localizzazione e morfologia delle cellule ematopoietiche CD45⁺ dopo 34 giorni in coltura. L'area ingrandita viene visualizzata nei pannelli di destra. Le sezioni sono di 7 μm. (F) Valutazione delle cellule mieloidi (CD11b), T (CD90.2) e B (CD19) dopo 34 giorni in coltura. L'area ingrandita viene mostrata nel riquadro. Le sezioni sono di 7 μm. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a cellule vive Nikon Eclipse Ti2-E. Barre graduate (D, E, F), 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3. Analisi del tessuto dell'innesto della matrice di membrana basale. Gli innesti sono stati costruiti a partire dallo stroma della milza neonatale impoverito di cellule PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ (n = 4). Ulteriori dati disponibili online¹¹. (A) Aspetto macroscopico di un innesto di milza rigenerato a 4 settimane dopo il trapianto sotto la capsula renale. L'area gialla riquadrata indica il tessuto rigenerato della milza. L'immagine è stata catturata utilizzando uno stereomicroscopio Leica M60 dotato di un adattatore zoom Snap e di un Apple iPhone 6S. Barra graduata, 1000 μm. (B) Immagini composite a immunofluorescenza multicolore di tessuti innesto di 30 μm di spessore criosezionati sul piano coronale. La colorazione degli anticorpi è stata eseguita con marcatori indicati per visualizzare la microarchitettura del tessuto della milza. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a cellule vive Nikon Eclipse Ti2-E. Le aree riquadrate mostrano le regioni con un ingrandimento maggiore. Barra graduata, 1000 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Organoide No.	Cellule stromali	Eritrociti	Linfociti
1	62	7.7	31
2	22	24	55
3	3.6	0.1	96
4	10	76	12

Tabella 1. Percentuale di popolazioni di cellule stromali, eritroidi e linfoidi tra i singoli organoidi della milza.

Figura supplementare 1. Panoramica schematica del protocollo che evidenzia le principali fasi nella generazione di costrutti cellulari incorporati in matrice per studi in vitro e in vivo . Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

L'aggregazione di cellule neonatali della milza all'interno di un mezzo semisolido rappresenta un metodo praticabile per generare costrutti di milza. Protocolli simili basati sulla matrice della membrana basale sono stati utilizzati per avviare colture tridimensionali di milza¹⁰. Qui, dimostriamo che i costrutti di milza sono ugualmente suscettibili di sistemi di coltura di organoidi in vitro e di modelli di trapianto in vivo . Da notare che il trapianto di organoidi di milza coltivati in vitro non è ancora stato testato, ma sarebbe interessante determinare la capacità di rigenerazione completa o parziale del tessuto milza. Questo protocollo eredita anche le tecniche di aggregazione cellulare descritte in precedenti studi sul trapianto di milza⁸. Questi studi hanno comportato il caricamento di aggregati cellulari su un foglio di collagene seguito da un trapianto sotto la capsula renale. L'incapsulamento degli aggregati cellulari all'interno della matrice della membrana basale offre un netto vantaggio in termini di orientamento dell'innesto, in cui viene eliminata la variazione associata al trapianto di collagene con il lato del foglio rivolto verso il basso rispetto al trapianto con il lato dell'aggregato cellulare rivolto verso il basso.

La metodologia per la preparazione dei costrutti di matrici di membrana basale è relativamente semplice. L'uso di una matrice di membrana basale ad alta concentrazione assicura che le cellule siano inizialmente supportate in uno stato aggregato, prima che la matrice si dissolva nell'arco di diversi giorni. In base alla nostra esperienza, la miscelazione e la diluizione della matrice di membrana basale sono minime a seguito di un'attenta stratificazione (fase 2.6) e della centrifugazione (fase 2.8) di una soluzione cellulare sospesa in PBS. La maggior parte delle ottimizzazioni è incentrata sul posizionamento del pellet cellulare all'interno del tappo della matrice (Figura 1). Questo problema può essere affrontato testando diverse variabili come la velocità di centrifugazione, il tempo, la composizione del volume della matrice della membrana basale, il volume della soluzione cellulare sospesa in PBS e le dimensioni del puntale della pipetta. Anche il numero e le caratteristiche delle celle (dimensioni, densità) possono influenzare le impostazioni e ogni preparazione delle celle deve essere ottimizzata individualmente.

È importante evidenziare diverse limitazioni. La matrice a membrana basale può essere un prodotto sensibile alla temperatura e bisogna fare attenzione a lavorare velocemente per mantenere freddi i reagenti. In questo modo si evita la solidificazione prematura della matrice e si garantisce un corretto incapsulamento delle cellule. Mentre tutti i materiali rilevanti vengono conservati, preparati o mantenuti in un ambiente freddo, le fasi di manipolazione manuale (ad esempio, l'espulsione del puntale della pipetta, la sigillatura con pellicola flessibile da laboratorio [Passaggio 2.5]) possono introdurre in modo variabile calore esterno dall'utente, modificando la viscosità della matrice e influenzando le caratteristiche di migrazione cellulare durante la centrifugazione. La riproducibilità all'interno e tra gli esperimenti può, quindi, essere difficile da ottenere in modo coerente.

La seconda limitazione è il requisito dell'esperienza e della competenza dell'utente. Alcune tecniche manuali possono richiedere una formazione prolungata per essere eseguite in modo efficiente e con successo. Ad esempio, sigillare il puntale della pipetta con una pellicola da laboratorio (passaggio 2.5) può inizialmente portare a basse percentuali di successo, ma questo migliorerà inevitabilmente con la pratica. La competenza con le tecniche microchirurgiche animali si ottiene anche attraverso la ripetizione. Per i trapianti, è necessario prestare attenzione, soprattutto quando si inserisce la punta della pipetta sotto la capsula renale (passaggio 4.2.10), si inserisce lo stantuffo del filo per espellere il tappo (passaggio 4.2.11) e si ritira la punta dal rene. È importante che il tappo venga espulso delicatamente e in modo costante mentre il puntale della pipetta viene contemporaneamente estratto. Un movimento eccessivo può provocare la perforazione della capsula renale o il danneggiamento del parenchima, con conseguente sanguinamento eccessivo.

In sintesi, è stato descritto un processo per incapsulare le cellule all'interno di una matrice semi-solida con particolare attenzione alla comprensione della formazione del tessuto della milza. Questo sistema potrebbe essere applicato anche a un'ampia gamma di tipi di cellule con il potenziale per molteplici applicazioni a valle in vitro o in vivo .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette cluster da 1,2 mL in polipropilene a 96 pozzetti	Corning	CLS4401	Da posizionare all'interno di una provetta conica da 14 ml
B-mercaptoetanolo	Gibco	21985023	Stock 55 mM, utilizzare a 50 uM
Collagenasi D	Roche	11088858001
Collagenasi IV	Sigma-Aldrich	C5138	Da Clostridium histolyticum
Deossiribonucleasi I (DNasi I)	Sigma-Aldrich	D4513	Desossiribonucleasi I da pancreas bovino, Tipo II-S, polvere liofilizzata, Proteina ≥ 80 %, ≥ 2.000 unità/mg di proteina
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L di glucosio, L-glutammina e bicarbonato di sodio, senza piruvato di sodio, liquido. Filtrato sterile.
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio, filtrato sterile
Eclipse 200 μ l Puntali per pipette	Labcon	1030-260-000	a punto smussato
(FBS)	Gibco	26140-079	Lotto # 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, utilizzare presso 1X
Matrigel	Corning	354263	Membrana basale a matrice Matrigel Alta concentrazione, Lotto # 7330186
MEM Aminoacidi non essenziali Gibco		11140076	Stock 100X, utilizzare a 1X
Penicillina/Streptomicina	Gibco	15140122	Stock 10.000 unità/ml Penicillina, 10.000 ug/ml
Filtro cellulare reversibile	STEMCELL Technologies	27216	70 μ m
Pinzetta ad anello	NAPOX	A-26	Misura dell'anello: 3 mm
Inibitore di roccia (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuga	Thermofisher		Le velocità di accelerazione e decelerazione sono state impostate su 8
pinzette ultra fini	EMS	78340-51S	Stile 51S. Le pinzette in acciaio austenitico a basso tenore di carbonio SA antimagnetico/antiacido sono resistenti alla corrosione. Finitura satinata antiriflesso.
Vicryl 5/0 Sutura Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Stantuffo a filo lungo	Drummond	5-000-2002-L	Stantuffo in acciaio inossidabile, 25 & 50 & mu; L/WRTL II, Lungo
Clip per ferite MikRon		427630
Clip per ferite	MikRon	427631	9 mm