Esplorazione di soluzioni alternative di perfusione utilizzando vettori di ossigeno polimerizzati a base di emoglobina di nuova generazione in un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto

Summary

Qui, descriviamo l'applicazione di un vettore di ossigeno polimerizzato a base di emoglobina umana (PolyhHb) come perfusato e il protocollo in cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto.

Abstract

Il trapianto di polmone è ostacolato dalla mancanza di donatori idonei. In precedenza, i donatori ritenuti marginali o inadeguati venivano scartati. Tuttavia, nuove ed entusiasmanti tecnologie, come la perfusione polmonare ex vivo (EVLP), offrono ai fornitori di trapianti di polmone una valutazione estesa per gli allotrapianti di donatori marginali. Questa piattaforma di valutazione dinamica ha portato a un aumento dei trapianti di polmone e ha permesso ai fornitori di utilizzare donatori precedentemente scartati, ampliando così il pool di donatori. Le attuali tecniche di perfusione utilizzano perfusi cellulari o acellulari ed entrambi presentano vantaggi e svantaggi distinti. La composizione della perfusione è fondamentale per mantenere un ambiente omeostatico, fornire un adeguato supporto metabolico, ridurre l'infiammazione e la morte cellulare e, in ultima analisi, migliorare la funzione degli organi. Le soluzioni di perfusione devono contenere una concentrazione proteica sufficiente a mantenere un'adeguata pressione oncotica. Tuttavia, le attuali soluzioni di perfusione spesso portano a stravaso di liquidi attraverso l'endotelio polmonare, con conseguente edema polmonare involontario e danno. Pertanto, è necessario sviluppare nuove soluzioni di perfusione che prevengano danni eccessivi mantenendo una corretta omeostasi cellulare. Qui, descriviamo l'applicazione di un vettore di ossigeno a base di emoglobina umana polimerizzata (PolyhHb) come perfusato e il protocollo in cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di EVLP di ratto. L'obiettivo di questo studio è fornire alla comunità dei trapianti di polmone informazioni chiave nella progettazione e nello sviluppo di nuove soluzioni di perfusione, nonché i protocolli appropriati per testarle in modelli di trapianto traslazionale clinicamente rilevanti.

Introduction

Come ogni campo del trapianto di organi solidi, il trapianto di polmone soffre di una carenza di organi da donatori. Al fine di aumentare il pool di donatori, è stata dedicata una ricerca significativa allo studio del potenziale degli allotrapianti che una volta si pensava non fossero adatti al trapianto, ovvero i donatori con criteri estesi (ECD). Questi allotrapianti possono essere considerati ECD per una serie di motivi, tra cui qualità discutibile, scarsa funzionalità, infezione, traumi, periodi ischemici caldi o freddi prolungati ed età avanzata^{di 1,2} anni. In alcuni casi, in cui questi polmoni sono adatti per il trapianto immediato³, è spesso vantaggioso sia per i fornitori che per i riceventi valutare questi polmoni per un ulteriore periodo di tempo per determinare la loro idoneità al trapianto. La perfusione polmonare ex vivo (EVLP) è una tecnologia che consente una valutazione estesa dei potenziali allotrapianti polmonari in un circuito chiuso al di fuori del donatore 2,4,5,6,7, offrendo al fornitore del trapianto la possibilità di determinare l'idoneità al trapianto. L'EVLP ha dimostrato la capacità di valutare adeguatamente gli organi dei donatori 8,9,10,11, di ridurre gli effetti del danno da riperfusione ischemica (IRI)^12,13 e di aumentare il pool di donatori^14,15, rendendo così il trapianto di polmone un trattamento più accessibile per tutti.

In generale, un sistema EVLP è un sistema chiuso con un circuito ventilatorio (ottenuto collegando un ventilatore alla trachea per introdurre aria nel sistema) e un circuito vascolare (ottenuto collegando l'atrio sinistro (LA) all'arteria polmonare (PA) con un tubo)⁷. Il circuito vascolare ha il perfusato che scorre attraverso il tubo per fornire al polmone nutrienti vitali e ossigeno, limitando al contempo il tempo ischemico freddo (CIT)5,8,16,17. Questa soluzione è a base ematica (cioè tramite l'aggiunta di globuli rossi concentrati (PRBC))^16,17 o acellulare (cioè senza PRBC)^4,5. Tuttavia, ci sono diversi svantaggi notevoli nell'utilizzo dei PRBC. Se si utilizzano PRBC da donatori deceduti a causa di traumi o donatori cerebralmente morti (BDD), questi fluidi contengono spesso grandi quantità di citochine infiammatorie, che possono aumentare il danno cellulare durante l'EVLP e aumentare i livelli di emoglobina libera da cellule (Hb), eme, ferro e frammenti cellulari che infliggono ulteriori danni alle cellule^18,19. Inoltre, poiché questi donatori sono spesso multiorgano, la raccolta di PRBC prima dell'approvvigionamento potrebbe portare a una diminuzione del volume di sangue nel donatore e successivamente ad un aumento dell'ischemia in tutti gli organi. Se si utilizzano PRBC da un'altra fonte, i fornitori potrebbero affrontare carenze di sangue poiché questo è un materiale scarso in sé e per sé^20,21. Infine, i PRBC sono inclini alla lisi meccanica sul circuito EVLP indipendentemente dalla loro fonte, rilasciando Hb e altri componenti che contribuiscono al danno cellulare.

Pertanto, per molte ragioni, potrebbe essere vantaggioso utilizzare un sostituto artificiale dei globuli rossi, cioè i trasportatori di ossigeno a base di emoglobina (HBOC), come integratore di perfusato. Un HBOC particolarmente promettente è l'emoglobina umana polimerizzata (PolyhHb). Il polihHb è sintetizzato a partire da Hb purificato da PRBC scaduti che sono stati ritenuti non idonei alla trasfusione immediata²². Hanno dimostrato di essere validi sostituti del sangue nello shock emorragico²³ e nel trapianto²⁴ e possono essere prodotti in grandi quantitಲ. Tuttavia, l'adozione su larga scala di PolyhHb non ha avuto successo a causa di complicazioni impreviste come la vasocostrizione, l'aumento della pressione sanguigna e l'arresto cardiaco^23,25. Le ragioni alla base di questi risultati erano probabilmente dovute alla presenza di Hb libero da cellule o polimeri di Hb a basso peso molecolare (< 500 kDa) nella soluzione di PolyhHb, poiché hanno una propensione a stravasare nello spazio tissutale, con conseguente diminuzione della disponibilità di ossido nitrico, conseguente vasocostrizione, ipertensione sistemica e, infine, danno ossidativo del tessuto^26,27. Per migliorare questi problemi, il Palmer Laboratory ha lavorato allo sviluppo di una nuova generazione di PolyhHb che contiene specie minime a basso MW e Hb priva di cellule, che ha dimostrato caratteristiche biofisiche migliorate e risposte in vivo 22,28,29,30. Diversi studi trasfusionali sugli animali hanno dimostrato che se i polimeri di Hb a basso peso molecolare vengono eliminati dall'HBOC, la vasocostrizione, l'ipertensione sistemica e il danno ossidativo possono essere mitigati 28,29,31,32,33,34,35. Pertanto, questo PolyhHb di nuova generazione è un promettente candidato perfusato.

Qui, descriviamo l'applicazione di un PolyhHb di nuova generazione da utilizzare in un perfusato e il protocollo con cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di EVLP di ratto. L'obiettivo di questo studio è fornire alla comunità dei trapianti di polmone informazioni chiave nella progettazione e nello sviluppo di nuove soluzioni di perfusione, nonché fornire protocolli per testarle in modelli di trapianto traslazionale clinicamente rilevanti.

Protocol

I ratti Sprague-Dawley (300 g di peso corporeo) sono stati ottenuti commercialmente e ospitati in condizioni prive di agenti patogeni presso l'Ohio State University Wexner Medical Center Animal Facility. Tutte le procedure sono state eseguite umanamente secondo il NIH e la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l'uso umano degli animali da laboratorio e con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Ohio State University (Protocollo IACUC 2023A00000071).

1. Sintesi e purificazione del polihHb

NOTA: La produzione e la sintesi del materiale PolyhHb utilizzato per i seguenti esperimenti EVLP sono state inizialmente pubblicate da Cuddington et al. nel 2020²². Si prega di fare riferimento a questo lavoro per schemi approfonditi e analisi della sintesi di PolyhHb. Quello che segue è un riassunto della sintesi e purificazione del PolyhHb su scala pilota e della sua successiva preparazione come perfusato.

1. Lavaggio, lisi e purificazione dell'Hb con globuli rossi
   1. Procurarsi 18 unità di PRBC umani scaduti e versarle in un recipiente di filtrazione da 20 L, diluire con soluzione fisiologica allo 0,9% in peso fino a un ematocrito finale del 22% (Figura 1B, C).
   2. Esecuzione di sei scambi di volume del sistema (diacicli) su un modulo di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) in polietilene solfone modificato (mPES) da 0,65 μm con soluzione salina allo 0,9% in peso sulla soluzione di globuli rossi. NOTA: Lo scopo di questa fase di lavaggio è quello di rimuovere i globuli rossi danneggiati, i frammenti di membrana e altri materiali extracellulari prima dell'emolisi (Figura 1B, C).
   3. Lisi la soluzione di globuli rossi con 10 L di tampone fosfato (PB, 3,75 mM, pH 7,4) per 1 ora a 4 °C agitando costantemente.
   4. Rimuovere i frammenti di membrana lisata e altri aggregati filtrando la soluzione su un modulo TFF da 500 kDa e raccogliendo il permeato nel recipiente del reattore batch da 30 L (Figura 1A-C).
   5. Una volta che 480 g di Hb sono nel reattore, aggiungere una carica di sale per convertire il PB in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   6. Ricircolare l'Hb attraverso un contattore di gas alimentato con azoto, oltre a mantenere uno spazio di testa dell'azoto nel reattore, per deossigenare la proteina durante la notte. Raffreddare a 14 °C per limitare la formazione di metaemoglobina (metHb).
2. Polimerizzazione Hb
   1. Riscaldare la soluzione di Hb alla temperatura fisiologica (37 °C) mentre si fa ricircolare la soluzione su un circuito di contattore del gas.
      NOTA: L'obiettivo è quello di deossigenare la proteina a un pO₂ tra 0-10 mmHg per garantire che la maggior parte dell'Hb sia nello stato quaternario teso (Figura 1A).
   2. Aggiungere 1 g di carica di ditionito di sodio, se necessario, per garantire un'efficace deossigenazione.
   3. Mantenendo il circuito di ricircolo e degassando la soluzione di Hb, aggiungere un rapporto molare 30:1 di glutaraldeide (GA) a Hb diluito in 3 L di PBS deossigenato (pH 7,4).
   4. Aggiungere la soluzione al recipiente del reattore nell'arco di 3 ore con un'ora aggiuntiva di tempo di reazione.
   5. Estinguere la reazione di reticolazione con un rapporto molare 7:1 di cianoboroidruro di sodio a GA, diluito in 3 L di PBS (pH 7,4). Aggiungere al reattore per oltre 10 min.
   6. Raffreddare il reattore a 14 °C durante la notte.
3. Purificazione di PolyhHb
   1. Pompare il contenuto del reattore in un recipiente di filtrazione da 10 L e iniziare la circolazione attraverso un modulo TFF in polietilene solfone (PES) da 0,2 μm (Stage 1). Questa fase rimuoverà gli aggregati di grandi dimensioni e i contaminanti indesiderati.
   2. Alimentare il permeato in un recipiente di filtrazione secondario da 10 L che, una volta pieno, farà circolare su un modulo TFF in polisulfone (PS) da 500 kDa (Fase 2). Continuare fino a svuotare il reattore (Figura 1B, D).
   3. Una volta che il reattore è stato svuotato nel circuito di purificazione, iniziare lo scambio dell'eccipiente allo stadio 1 con una soluzione di Ringer lattato modificata (pH 7,4). Dopo ogni scambio di volume completo, misurare la concentrazione di proteine nel permeato dello Stadio 1 utilizzando la spettroscopia UV-visibile.
   4. Quando il permeato di stadio 1 ha una concentrazione inferiore a 1 mg di Hb/mL, trasferire la soluzione di Ringer modificata allo stadio 2. Qualsiasi rapina nella fase 1 è un rifiuto e deve essere smaltita in modo appropriato. In totale, assicurarsi che vengano eseguiti 12 scambi di volumi completi della soluzione di Ringer modificata in entrambe le fasi.
   5. Dopo il completamento dei diacicli, concentrare il contenuto della Fase 2 ad almeno 10 g/dL sul modulo TFF da 500 kDa.
   6. Confezionare la soluzione concentrata in provette coniche da 50 mL e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.

2. Formulazione in perfusato

1. Preparare il perfusato fino a un volume finale di 165 ml. Diluire PolyhHb a una concentrazione finale di 3,7 g/dL con William's E Medium.
2. Aggiungere albumina sierica umana (HSA) a una concentrazione finale del 3% di HSA in peso. Aggiungere 1 mL di eparina alla soluzione finale.

3. Configurazione del circuito di perfusione polmonare Ex Vivo

1. Posizionare PolyhHb perfusato nel serbatoio del circuito EVLP e aprire il bagno di acqua calda a 37 °C. Assicurarsi che il perfusato circoli all'interno del circuito accendendo le pompe a rulli.
2. Collegare il gas di deossigenazione (cioè 6% O₂, 8% CO₂, 84% N₂) all'ossigenatore a fibra cava per deossigenare il perfusato. Questo viene fatto per valutare la capacità del polmone di ossigenare il perfusato.
3. Aprire il software di acquisizione dati su un computer nelle vicinanze. Assicurarsi che la pressione dell'arteria polmonare, la pressione differenziale tracheale, la pressione differenziale del flusso respiratorio, il peso polmonare e i trasduttori di velocità della pompa siano collegati sia al circuito che alla scatola del convertitore dati.
4. Assicurarsi che non siano presenti perdite in tutto il sistema esaminando attentamente tutti i collegamenti dei tubi e che l'acqua calda circoli ovunque (Figura 2). Premere Esegui sul software di acquisizione dati per assicurarsi che tutti i trasduttori di pressione funzionino. Una volta che il sistema funziona correttamente, spegnere le pompe a rulli.

4. Approvvigionamento di blocco polmonare di ratto da donatore

1. Impostare il tavolo operatorio e disporre gli strumenti (Figura 3). Autoclavare tutti gli strumenti a 121 °C per 30 min.
2. Preparare 1200 U/kg di eparina, una miscela di ketamina/xilazina per anestetico (60 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg), nonché suture di seta lunghe 5-10 cm (3-0 o 4-0).
3. Iniettare la soluzione di ketamina/xilazina per via intraperitoneale nel ratto. Attendere 5-10 minuti affinché il piano anestetico si sviluppi. Per garantire un livello adeguato di anestesia, pizzicare il ratto per provocare una reazione. Se non c'è reazione, è stato raggiunto il livello corretto di anestesia.
4. Radere l'addome del ratto e posizionare il ratto in posizione supina sulla tavola chirurgica. Pulire l'addome con iodio povidone ed etanolo al 70%. Metti un unguento oftalmico sotto gli occhi del ratto per prevenire la secchezza.
5. Spostare il ratto sulla tavola chirurgica e fissarlo in posizione (Figura 4A). Attiva il software di acquisizione dati e inizia la registrazione. Accendere il ventilatore a 4 ml/kg e assicurarsi che la pressione positiva di fine espirazione (PEEP) sia di circa 2 cm/H₂O.
   NOTA: Queste impostazioni iniziali sono specifiche dell'esperimento. Spetta a tutti i ricercatori determinare le migliori strategie ventilatorie per i singoli esperimenti.
6. Una volta raggiunta la corretta profondità dell'anestesia, eseguire una laparotomia della linea mediana dal processo xifoideo alla sinfisi pubica utilizzando un paio di forbici. Successivamente, eseguire una rotazione viscerale mediale-laterale e visualizzare la vena cava inferiore infra-epatica utilizzando uno strumento smussato (IVC)36,37,38 (Figura 4B). Iniettare l'eparina nell'IVC con un ago da 20G (Figura 4C).
7. Sposta l'attenzione sul collo e taglia la pelle dalla tacca sternale fino a poco sotto l'angolo della mandibola con un paio di forbici. Quindi, inizia a sezionare verso la trachea (Figura 5A).
8. Nel collo, sezionare senza mezzi termini i muscoli della cinghia necessari per esporre la trachea (Figura 5B). Praticare un'incisione trasversale con un paio di forbici sulla trachea anteriore tra gli anelli cartilaginei abbastanza grandi per il tubo endotracheale (ET) (diversi millimetri), ma non tagliare la parte posteriore della trachea. Posizionare una sutura di seta 5-0 attorno alla trachea (Figura 5C).
9. Inserire il tubo endotracheale e fissarlo in posizione con la suddetta sutura di seta 5-0 (Figura 5D). Collegare il tubo ET al ventilatore e assicurarsi che il torace si alzi correttamente.
10. Eseguire una sternotomia mediana ed entrare nuovamente nella cavità toracica usando le forbici. Posizionare i divaricatori della parete toracica per esporre il cuore e i polmoni (Figura 6A). Evita qualsiasi manipolazione involontaria dei polmoni, poiché sono incredibilmente friabili.
11. Rimuovere il timo dal mediastino anteriore con una combinazione di dissezione affilata (forbice) e smussata. Fare attenzione a non danneggiare i grandi vasi o i polmoni.
12. Identificare l'arteria polmonare (PA; Figura 6B) e posizionare una sutura di seta 5-0 attorno ad essa per prepararsi all'incannulamento (Figura 6C). A causa dell'anatomia microscopica dei grandi vasi del ratto, è spesso più facile posizionare la sutura attorno all'AP e all'aorta allo stesso tempo.
13. Praticare un'incisione di 2-3 mm nel percorso di efflusso ventricolare destro (RVOT) utilizzando un paio di forbici (Figura 6D-E) per posizionare la cannula arteriosa all'interno del PA e fissarla in posizione con la sutura 5-0 descritta un passaggio prima (Figura 6F).
14. Praticare un'incisione di 5 mm nel ventricolo sinistro (LV) e nell'IVC infraepatica utilizzando un paio di forbici per sopprimere il ratto. Collegare rapidamente il liquido di conservazione polmonare alla cannula arteriosa per gravità, lavare i polmoni con circa 20 ml (Figura 7A-B). Assicurarsi che il liquido di conservazione polmonare sia disaerato prima di collegarlo alla cannula arteriosa poiché gli emboli d'aria sono molto dannosi per i polmoni.
15. Collegare la cannula arteriosa al circuito EVLP. Accendere la pompa a rulli e lasciare che una piccola quantità di perfusato fluisca attraverso il polmone e fuori dal ventricolo sinistro nella cavità toracica. Una volta che il perfusato inizia a fuoriuscire dall'atrio sinistro, spegnere la pompa a rulli (Figura 7C). Pur consentendo il flusso del perfusato, assicurarsi che la pressione PA non aumenti, il che indicherebbe un blocco o un posizionamento errato.
16. Posizionare una piccola pinza nel ventricolo sinistro e allungare delicatamente l'anulus della valvola mitrale, che consentirà l'introduzione della cannula dell'atrio sinistro (LA) (Figura 8A). Metti una cravatta di seta 5-0 intorno al cuore e legala senza stringere (Figura 8B).
17. Inserire la cannula LA nel ventricolo sinistro e far avanzare la cannula LA fino a quando non può essere vista all'interno dell'atrio. Terminare il fissaggio del LA con la sutura 5-0 pre-legata (Figura 8C).
18. Identificare l'esofago e bloccarlo con un emostatico il più vicino possibile al diaframma. Tagliare l'esofago sotto l'emostatico per assicurarsi che non vi siano fuoriuscite nella cavità toracica (Figura 9A).
19. Utilizzando la colonna vertebrale come guida, tagliare con un paio di forbici tutti gli attacchi legamentosi che collegano il blocco cuore-polmone alle strutture circostanti (Figura 9B). Una volta che il blocco cuore-polmone è liberamente mobile, sezionare la trachea dal collo e infine tagliare la trachea sopra il tubo ET usando un paio di forbici per liberare il blocco cuore-polmone (Figura 9C).
20. Spostare il blocco cuore-polmone sulla camicia toracica all'interno del circuito EVLP e collegare la cannula LA al circuito EVLP (Figura 9D). Accendere la pompa a rulli e collegare il monitor del ventilatore.
21. Controllare la trappola per bolle per assicurarsi che non vengano introdotti emboli d'aria nel sistema.
22. Modificare lentamente le impostazioni di ventilazione e perfusione ai livelli sperimentali desiderati durante i primi 15 minuti 36,37,38. Inoltre, durante questa fase iniziale di ramp-up, aumentare la portata di perfusione alla velocità e/o alla pressione desiderate.
23. Nei punti temporali designati dall'esperimento, controllare i livelli di gas perfusato e i test di funzionalità polmonare.

Results

La validazione del nostro perfusato a base di PolyhHb e, inoltre, la stabilità di questo perfusato per diverse ore, è dimostrata nella Figura 10. Durante la prima 1 ora, tutti i perfusi testati (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), a base di globuli rossi) hanno mostrato una leggera diminuzione di LA pO₂ (Post pO₂). Tuttavia, il perfusato a base di globuli rossi ha mostrato una diminuzione significativa a 1 ora rispetto al PolyhHb (p < 0,05). Quando sono stati testati nelle ore successive, sia il PolyhHb che il perfusates di controllo avevano un pO 2 stabile di LA_, mentre il PolyhHb aveva una tendenza non significativa (p > 0,05) di pO₂ più elevato (Figura 10A). Delta pO₂, cioè la variazione del pO₂ di LA da pO₂ di PA, è nuovamente diminuita significativamente a 1 h nel gruppo perfusato di globuli rossi (p < 0,05), mentre è rimasta stabile nel gruppo PolyhHb e Control perfusates con un trend non significativo (p > 0,05) di pO₂ più elevato nel gruppo PolyhHb (Figura 10B). Il pCO₂ di LA era significativamente più basso nel perfusato di globuli rossi e nel perfusato di controllo rispetto al perfusato di PolyhHb dopo la prima ora (p < 0,05), e questo si è mantenuto vero nelle ore successive quando si confrontavano il perfusato di polihHb e il perfusato di controllo (Figura 10C). Infine, il delta pCO₂ (cioè la variazione della pCO2 LA da pCO2 PA) era significativamente aumentato nel perfusato RBC dopo 1 ora (p < 0,05), e dopo diverse ore rimaneva stabile sia nel perfusato Polyhb che in quello di controllo (Figura 10D).

I dati fisiologici polmonari in tempo reale raccolti attraverso il software di acquisizione forniscono informazioni complementari ai livelli di gas perfusato (Figura 11). La resistenza vascolare polmonare (PVR) ha mostrato ancora una volta che il perfusato dei globuli rossi è aumentato significativamente nella prima ora (p < 0,05). Nelle diverse ore rimanenti, sia il perfusatore PolyhHb che quello di controllo hanno avuto un PVR stabile e basso (Figura 11A). La variazione del peso polmonare è aumentata significativamente anche nel perfusato dei globuli rossi nella prima ora (p < 0,05) ed è aumentata sia nel perfusato PolyhB che in quello di controllo nelle ore rimanenti con un peso leggermente superiore nel perfusato PolyhHb (Figura 11B). Infine, la compliance è diminuita significativamente nel gruppo RBC perfusato entro la prima ora (p < 0,05), mentre c'è stata una diminuzione non significativa nel PolyhHb e nel Control perfusato (p > 0,05), con PolyhHb che ha avuto la più alta compliance dopo 4 ore (Figura 11C).

In termini di successo e/o fallimento tecnico (Figura 12), è importante attirare l'attenzione su diversi aspetti. Nella Figura 12A, possiamo vedere il fallimento dell'allotrapianto dovuto a necrosi del lobo superiore destro dovuta a un possibile coagulo all'interno del sistema vascolare polmonare. Nella Figura 12B, notiamo anche un grave edema tissutale all'interno del lobo destro, che porta al fallimento sperimentale. Le figure 12C-E mostrano la corretta conservazione e l'aspetto dei tessuti nelle rispettive condizioni sperimentali. Infine, nella Figura 12F, possiamo vedere la conservazione ideale dei tessuti dopo il lavaggio con una soluzione di conservazione polmonare.

Figura 1: Sintesi e purificazione di PolyhHb su scala pilota. (A) Bioreattore per polimerizzazione. (B) I processi di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) sono impostati in un frigorifero a 4 °C. (C) Primo piano del set-up parallelo di TFF per il lavaggio dei globuli rossi (RBC) e la purificazione dell'emoglobina (Hb). (D) Primo piano del sistema TFF in serie a due stadi per la purificazione di PolyhHb. I recipienti per gli stadi uno e due si trovano rispettivamente a sinistra e a destra dei filtri. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica del circuito di perfusione polmonare ex vivo (EVLP). (A) Disegno schematico del circuito EVLP. (B) Posizionamento in vivo della cannula dell'arteria polmonare e della cannula atriale sinistra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Strumenti chirurgici utilizzati per la perfusione polmonare ex vivo . (A) Sutura di seta. (B) Pinze a punta fine (di media lunghezza). (C) Pinze a punta fine (lunghezza lunga). (D) Pinze curve a punta fine. (E) Forbici alla maionese. (F) Cannula tracheale. (G) Cannula dell'arteria polmonare (PA). (H) Cannula atriale sinistra (LA). (I) Divaricatori per gabbie toraciche. (J) Forbici a molla. (K) Pinze DeBakey. (L) Emostato. (M) Piccole forbici. (N) Piccola pinza curva a punta fine. (O) Ritiri Adson. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Posizionamento chirurgico ed esposizione della vena cava inferiore (IVC). (A) Posizionamento del ratto per l'approvvigionamento polmonare. (B) Esposizione dell'IVC infraepatico. (C) Incannulare l'IVC e iniettare eparina con un ago da 27G. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Incannulare la trachea con il tubo endotracheale (ET). (A) Iniziare tagliando la pelle della zona del collo. (B) Sezionare i muscoli della cinghia e il tessuto connettivo per esporre la trachea. (C) Praticare un'incisione trasversale sulla trachea anteriore tra gli anelli cartilaginei abbastanza grandi per il tubo ET. (D) Inserire il tubo ET nella trachea e fissarlo in posizione con una sutura di seta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Posizionamento della cannula dell'arteria polmonare. (A) Esposizione della cavità toracica per visualizzare il cuore e i polmoni. (B) Identificare l'AP e isolarlo. (C) Posizionamento di suture intorno al PA. (D) Taglio di un piccolo foro nel tratto di efflusso del ventricolo destro (RVOT) per la cannula PA. (E) Posizionamento corretto della cannula PA all'interno del PA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Lavaggio dei polmoni con soluzione di conservazione. (A) Collegamento della cannula di lavaggio alla cannula dell'arteria polmonare (PA). (B) Il liquido limpido dovrebbe fuoriuscire dall'atrio sinistro (LA). (C) Collegamento della cannula PA al circuito di perfusione polmonare ex vivo per garantire il flusso e il posizionamento corretti della cannula PA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Posizionamento della cannula atriale sinistra (LA). (A). Dilatare delicatamente l'anulus della valvola mitrale con un paio di pinze. (B) Posizionare liberamente una sutura di seta attorno al ventricolo sinistro (LV). Posizionare la cannula LA all'interno dell'atrio sinistro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Estrazione del blocco cuore-polmone. (A) Legatura dell'esofago sotto l'emostato. (B) La dissezione libera il blocco cuore-polmone dalla colonna vertebrale. (C) Sezionare liberare la trachea. (D) Collegamenti e posizionamento corretti della cannula per perfusione polmonare ex vivo (EVLP). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10. Livelli di gas perfusato nel tempo. (A) Post pO₂, cioè pO₂ atriale sinistro (LA), in una perfusione di 4 ore. (B) Delta pO₂, cioè la variazione del LA pO₂ dall'arteria polmonare (PA) pO₂ in una perfusione di 4 ore. (C) Post pCO₂, cioè LA pO₂, in una perfusione di 4 ore. (D) Delta pCO₂, cioè la variazione del pO₂ LA da pO₂ PA in una perfusione di 4 ore. Il blu rappresenta il perfuso di PolyhHb, il nero rappresenta il perfusato di controllo (media standard di William) e il rosso rappresenta il perfuso a base di globuli rossi. N=6 per gruppo. Le barre di errore indicano la deviazione standard. La significatività è stata testata utilizzando un test T di Student ed è indicata con un *, p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11. Dati fisiologici polmonari in tempo reale. (A) Resistenza vascolare polmonare (PVR) oltre 4 ore di riperfusione. (B) Variazione (indicata con Δ) del peso polmonare nel tempo. (C) Conformità oltre 4 ore di riperfusione. Il blu rappresenta il perfuso di PolyhHb, il nero rappresenta il perfusato di controllo (media standard di William) e il rosso rappresenta il perfuso a base di globuli rossi. N=6 per gruppo. Le barre di errore indicano la deviazione standard. La significatività è stata testata utilizzando un test T di Student ed è indicata con un *, p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12: Risultati tecnici rappresentativi. (A) Fallimento dell'innesto a causa di infarto del lobo superiore destro. (B) Fallimento dell'innesto a causa di grave edema del lobo destro. (C) Canulazione e perfusione riuscite dell'allotrapianto polmonare con perfusato di globuli rossi. (D) Canulazione e perfusione riuscite dell'allotrapianto polmonare con perfusato di PolyhHb. (E) Canulazione e perfusione riuscite dell'allotrapianto polmonare con perfusato standard. (F) Conservazione ideale dei tessuti dopo il lavaggio con soluzione di conservazione dei polmoni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Lo sviluppo e la sperimentazione di soluzioni di perfusione è un'impresa innovativa che molti in tutto il mondo stanno intraprendendo. Tradizionalmente, i perfusi standard offrono la capacità di sospendere il tempo ischemico e mitigare le lesioni associate all'ischemia, nonché alla riperfusione¹⁸. Tuttavia, la prossima evoluzione dell'EVLP è quella di migliorare l'attuale tecnologia del perfusato e di incorporare terapie di riparazione e ricondizionamento 39,40,41,42,43.

Il PolyhHb descritto in questo lavoro è compreso tra 500 kDa e 0,2 μm per evitare che il materiale fuoriesca dal circuito nel polmone, il che impedirà la vasocostrizione e l'aumento della pressione PA³⁰. È fondamentale che durante le fasi di polimerizzazione di questa sintesi, la pressione parziale dell'ossigeno (pO₂) sia mantenuta al valore appropriato per il prodotto PolyhHb di affinità all'ossigeno desiderato. Ciò include tutte le soluzioni aggiunte durante la reazione (ad esempio, reticolante, soluzione di tempra, ecc.) aventi una pO2 corrispondente al bioreattore (ad esempio, degassata con azoto, ossigenata, ecc.). Uno dei principali vantaggi di questa procedura di sintesi è che il prodotto finale ha equilibri di ossigeno modificabili per consentire diverse applicazioni con diverse richieste di ossigeno (ad esempio, bassa affinità per l'ossigeno PolyhHb per la medicina trasfusionale, moderata affinità per l'ossigeno per la perfusione polmonare o alta affinità per l'erogazione mirata di ossigeno). È anche importante assicurarsi che sul bioreattore sia presente un meccanismo di riscaldamento che non provochi un riscaldamento eccessivo dei punti di contatto, con conseguente formazione di proteine danneggiate. Abbiamo scoperto che una bobina di rame in tutto il recipiente forniva un riscaldamento/raffreddamento più uniforme e meno dannoso rispetto a una camicia di riscaldamento isolata all'esterno del recipiente (Figura 1A).

Sebbene lo sviluppo di un modello di ratto EVLP non sia una novità^37,38, abbiamo notato diverse aree che possono portare a risultati migliori. In primo luogo, è necessario praticare piccole incisioni nell'IVC al momento del sacrificio per assicurarsi che non ci sia aria aggiuntiva che potrebbe entrare nei polmoni attraverso la circolazione. Quando si lava l'allotrapianto polmonare con la soluzione di conservazione del polmone, un colore bianco pallido uniforme dei polmoni fa sapere al microchirurgo che c'è un successo tecnico per il processo di approvvigionamento. Se c'è ancora un polmone di colore rosa all'interno del parenchima, a volte è consigliabile regolare la cannula PA in modo che l'intero polmone sia uniformemente perfuso. Mentre la cannula PA è spesso la parte più facile da completare della procedura, l'introduzione della cannula LA è leggermente più difficile. È sempre necessario dilatare l'anulus della valvola mitrale in modo che la cannula LA raggiunga l'LA. Tuttavia, questo deve essere fatto con estrema cautela in quanto è facile perforare il ventricolo o gli atri. Una volta che la punta della cannula si trova all'interno degli atri, può spesso smarrirsi mentre fissa la sutura attorno al ventricolo. Spesso è necessario regolare l'angolo del tavolo (più orizzontale) o posizionare un pezzo di garza nella parte inferiore della cannula in modo che rimanga in posizione.

Limitazioni
Ci sono alcune limitazioni a questo modello. Sebbene sia utile valutare l'efficacia dei perfusati e la loro capacità di migliorare i potenziali allotrapianti, questo non è un modello di trapianto che sarebbe in grado di dirci i risultati in vivo di diversi perfusati e tecnologie. Inoltre, sebbene PolyhHb sia una nuova entusiasmante tecnologia di perfusato, il suo uso, l'efficacia e le potenziali limitazioni dovranno essere ulteriormente comprovati in ulteriori esperimenti di perfusione preclinica e clinica prima di poter prendere in considerazione l'adozione diffusa di questa tecnologia.

Conclusioni
Qui, abbiamo dimostrato l'applicazione di un perfusato PolyhHb di nuova generazione e il protocollo con cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di EVLP di ratto. Con l'avanzare della tecnologia del perfusato, sarà vantaggioso esplorare le possibilità di utilizzare il PolyhHb come potenziale sostituto dei perfusi tradizionali³⁰. Le precedenti generazioni di PolyhHb hanno portato a effetti collaterali dannosi in base alla loro composizione; Tuttavia, i miglioramenti alla sintesi hanno creato un polimero che ha meno probabilità di stravasare, portare a edema e quindi causare danni cellulari³⁰. Con PolyhHb, è possibile eseguire EVLP senza la necessità di globuli rossi, pur soddisfacendo la domanda metabolica degli allotrapianti polmonari. Ciò consentirà senza dubbio una migliore funzione dell'allotrapianto ex vivo. Tuttavia, è necessaria un'ulteriore convalida della PolyhHb sia in ambito preclinico che clinico. Ci auguriamo che questo protocollo fornisca alla comunità dei trapianti di polmone informazioni chiave nella progettazione e nello sviluppo di nuove soluzioni di perfusione, nonché i protocolli appropriati per testarle in modelli di trapianto traslazionali clinicamente rilevanti.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siringa da insulina da 10 cc Ago da 29 G x 1/2"	BD	309301
Bioreattore in batch di vetro da 30 L	Ace Glass
Ago da 30 g Aghi	medici	BD-305106
Baytril (enrofloxacina) Compresse antibatteriche	Elanco	NA
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2.2H2O)	Sigma Aldrich	10035-04-8	lattato di Ringer
modificato tipo 672	Harvard Apparatus	731747
Connect kit D150	Cole-Parmer	VK 73-3763
Dumont #5 Pinze	Strumenti per le scienze	11252-50
Dumont Medical #5/45 Pinze - Angolate 45 gradi	Strumenti per le scienze fini	11253-25
Ecoline Star Edition 003, scaldabagno E100	Lauda	LCK 1879
Leucoriduzione umana scaduta, unità globuli rossi impaccate	Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150	Hugo Sachs Elektronik	PY2 73-3762
Pinze	Strumenti	per le scienze fini11027-12
Glutaraldeide (C5H8O2 70 wt%)	Sigma Aldrich	111-30-8 (G7776)
Emostatico Halsted-Mosquito	Roboz Surgical	RS-7112
Eparina 30.000 unità per 30 ml	APP Pharmaceuticals Albumina
sierica umana (HSA)	OctaPharma Plasma		Additivo per perfusato
Set di tubi IL2 per perfusato	Apparecchio Harvard	733842
IPL-2 Sistema di perfusione polmonare di base	Apparato
Harvard Ketamina 500 mg per 5 ml	JHP Pharmaceuticals
Cannula dell'atrio sinistro	Apparecchio Harvard	730712
Contattore a membrana Liqui-Cel serie EXF G420	3M	G420	contattore per gas
Soluzione di glucosio a basso contenuto di destrano di potassio (perfadex)	Soluzione XVIVO		per il lavaggio del polmone
Tubo rivestito in platino Masterflex (Dimensioni: 73,17,16,24)	Cole-Palmer
N-acetil-L-cisteina (NALC, C5H9NO3S)	Sigma Aldrich	616-91-1 (A7250)	lattato di Ringer modificato
( 10L, 20L)	Nalgene		Recipienti di filtrazione
Pompa peristaltica	Ismatec	ISM 827B
PES, 0,65 &; micro; m Modulo TFF	Repligen	N02-E65U-07-N
PhysioSuite	Kent Scientific Corporation	PS-MSTAT-RT
polietersulfone (PES), 0,2 µ m Modulo TFF	Repligen	N02-S20U-05-N
Polisulfone (PS), 500 kDa Modulo TFF	Repligen	N02-P500-05-N
Cloruro di potassio (KCl)	Fisher Scientific	7447-40-7	Per PBS
PowerLab 8/35	ADInstruments	730045
Cannula dell'arteria polmonare	Harvard Apparatus	730710
Tubo della testa della pompa (Dimensioni: 73,17,16,24)	PharMed BPT
Puralube  Unguento oftalmico	Dechra	NA
Forbici	Strumenti per le scienze	14090-11
SCP Servocontrollore per perfusione tipo 704	Apparecchio Harvard	732806
Ventilatore per piccoli animali modello 683	Apparecchio Harvard	55-000
Cloruro di sodio (NaCl)	Fisher Scientific	7647-14-5 (S271-10)	Per PBS e soluzione salina
Cianoboroidruro di sodio (NaCNBH3)	Sigma Aldrich	25895-60-7
Ditionito di sodio (Na2S2O4)	Sigma Aldrich	7775-14-6
Idrossido di sodio (NaOH)	Fisher Scientific	1310-73-2	Per lattato
di Ringer modificatoLattato di sodio (NaC3H5O3)	Sigma Aldrich	867-56-1	Per lattato di Ringer modificato
Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)	Fisher Scientific	7558-79-4	Per PBS
Fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4)	Fisher Scientific	7558-80-7	per PBS
SomnoSuite Sistema di anestesia per piccoli animali	Kent Scientific Corporation	Modulo SS-MVG
Ratti Sprague-Dawley	Envigo
TAM-A tipo 705/1	Apparecchio Harvard	73-0065
Amplificatore trasduttore TAM-D tipo 705/2	Apparecchio Harvard	73-1793
Modulo di controllo del tempo TCM tipo 686	Apparecchio Harvard	731750
Cannula tracheale	Apparecchio Harvard 733557
Set di tubi per camera umida	Apparato Harvard	73V83157
Cassetta per tubi	Cole-Parmer	IS 0649
Pinzetta #5 Dumostar	Kent Scientific Corporation	INS500085-A
Pinzetta #5 in acciaio inossidabile, curva	Kent Scientific Corporation	IND500232
Pinzetta #7 Titanium	Kent Scientific Corporation
Tygon E-3603 Tubo 2,4 mm ID	Harvard Apparecchio	721017	linea perfusata che entra nel polmone
Tygon E-3603 Tubo 3,2 mm ID	Apparato Harvard 721019		linea perfusata che esce dal polmone
Vannas-Tubingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15008-08
VCM modulo di controllo del ventilatore tipo 681	Harvard Apparatus	731741
William's E Media	Gibco, ThermoFisher Scientific	A12176-01	Additivo perfusato
Xilazina 100 mg per 1 ml	di Akorn