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Articolo metodologico

Esplorazione di soluzioni alternative di perfusione utilizzando vettori di ossigeno polimerizzati a base di emoglobina di nuova generazione in un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto

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DOI:

10.3791/66702

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14 giugno 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1COPPER Laboratory, Department of Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 3William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, College of Engineering, The Ohio State University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo l'applicazione di un vettore di ossigeno polimerizzato a base di emoglobina umana (PolyhHb) come perfusato e il protocollo in cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto.

Abstract

Il trapianto di polmone è ostacolato dalla mancanza di donatori idonei. In precedenza, i donatori ritenuti marginali o inadeguati venivano scartati. Tuttavia, nuove ed entusiasmanti tecnologie, come la perfusione polmonare ex vivo (EVLP), offrono ai fornitori di trapianti di polmone una valutazione estesa per gli allotrapianti di donatori marginali. Questa piattaforma di valutazione dinamica ha portato a un aumento dei trapianti di polmone e ha permesso ai fornitori di utilizzare donatori precedentemente scartati, ampliando così il pool di donatori. Le attuali tecniche di perfusione utilizzano perfusi cellulari o acellulari ed entrambi presentano vantaggi e svantaggi distinti. La composizione della perfusione è fondamentale per mantenere un ambiente omeostatico, fornire un adeguato supporto metabolico, ridurre l'infiammazione e la morte cellulare e, in ultima analisi, migliorare la funzione degli organi. Le soluzioni di perfusione devono contenere una concentrazione proteica sufficiente a mantenere un'adeguata pressione oncotica. Tuttavia, le attuali soluzioni di perfusione spesso portano a stravaso di liquidi attraverso l'endotelio polmonare, con conseguente edema polmonare involontario e danno. Pertanto, è necessario sviluppare nuove soluzioni di perfusione che prevengano danni eccessivi mantenendo una corretta omeostasi cellulare. Qui, descriviamo l'applicazione di un vettore di ossigeno a base di emoglobina umana polimerizzata (PolyhHb) come perfusato e il protocollo in cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di EVLP di ratto. L'obiettivo di questo studio è fornire alla comunità dei trapianti di polmone informazioni chiave nella progettazione e nello sviluppo di nuove soluzioni di perfusione, nonché i protocolli appropriati per testarle in modelli di trapianto traslazionale clinicamente rilevanti.

Introduzione

Come ogni campo del trapianto di organi solidi, il trapianto di polmone soffre di una carenza di organi da donatori. Al fine di aumentare il pool di donatori, è stata dedicata una ricerca significativa allo studio del potenziale degli allotrapianti che una volta si pensava non fossero adatti al trapianto, ovvero i donatori con criteri estesi (ECD). Questi allotrapianti possono essere considerati ECD per una serie di motivi, tra cui qualità discutibile, scarsa funzionalità, infezione, traumi, periodi ischemici caldi o freddi prolungati ed età avanzatadi 1,2 anni. In alcuni casi, in cui questi polmoni sono adatti per il trapianto immediato3, è spesso vantaggioso sia per i fornitori che per i riceventi valutare questi polmoni per un ulteriore periodo di tempo per determinare la loro idoneità al trapianto. La perfusione polmonare ex vivo (EVLP) è una tecnologia che consente una valutazione estesa dei potenziali allotrapianti polmonari in un circuito chiuso al di fuori del donatore 2,4,5,6,7, offrendo al fornitore del trapianto la possibilità di determinare l'idoneità al trapianto. L'EVLP ha dimostrato la capacità di valutare adeguatamente gli organi dei donatori 8,9,10,11, di ridurre gli effetti del danno da riperfusione ischemica (IRI)12,13 e di aumentare il pool di donatori14,15, rendendo così il trapianto di polmone un trattamento più accessibile per tutti.

In generale, un sistema EVLP è un sistema chiuso con un circuito ventilatorio (ottenuto collegando un ventilatore alla trachea per introdurre aria nel sistema) e un circuito vascolare (ottenuto collegando l'atrio sinistro (LA) all'arteria polmonare (PA) con un tubo)7. Il circuito vascolare ha il perfusato che scorre attraverso il tubo per fornire al polmone nutrienti vitali e ossigeno, limitando al contempo il tempo ischemico freddo (CIT)5,8,16,17. Questa soluzione è a base ematica (cioè tramite l'aggiunta di globuli rossi concentrati (PRBC))16,17 o acellulare (cioè senza PRBC)4,5. Tuttavia, ci sono diversi svantaggi notevoli nell'utilizzo dei PRBC. Se si utilizzano PRBC da donatori deceduti a causa di traumi o donatori cerebralmente morti (BDD), questi fluidi contengono spesso grandi quantità di citochine infiammatorie, che possono aumentare il danno cellulare durante l'EVLP e aumentare i livelli di emoglobina libera da cellule (Hb), eme, ferro e frammenti cellulari che infliggono ulteriori danni alle cellule18,19. Inoltre, poiché questi donatori sono spesso multiorgano, la raccolta di PRBC prima dell'approvvigionamento potrebbe portare a una diminuzione del volume di sangue nel donatore e successivamente ad un aumento dell'ischemia in tutti gli organi. Se si utilizzano PRBC da un'altra fonte, i fornitori potrebbero affrontare carenze di sangue poiché questo è un materiale scarso in sé e per sé20,21. Infine, i PRBC sono inclini alla lisi meccanica sul circuito EVLP indipendentemente dalla loro fonte, rilasciando Hb e altri componenti che contribuiscono al danno cellulare.

Pertanto, per molte ragioni, potrebbe essere vantaggioso utilizzare un sostituto artificiale dei globuli rossi, cioè i trasportatori di ossigeno a base di emoglobina (HBOC), come integratore di perfusato. Un HBOC particolarmente promettente è l'emoglobina umana polimerizzata (PolyhHb). Il polihHb è sintetizzato a partire da Hb purificato da PRBC scaduti che sono stati ritenuti non idonei alla trasfusione immediata22. Hanno dimostrato di essere validi sostituti del sangue nello shock emorragico23 e nel trapianto24 e possono essere prodotti in grandi quantità22. Tuttavia, l'adozione su larga scala di PolyhHb non ha avuto successo a causa di complicazioni impreviste come la vasocostrizione, l'aumento della pressione sanguigna e l'arresto cardiaco23,25. Le ragioni alla base di questi risultati erano probabilmente dovute alla presenza di Hb libero da cellule o polimeri di Hb a basso peso molecolare (< 500 kDa) nella soluzione di PolyhHb, poiché hanno una propensione a stravasare nello spazio tissutale, con conseguente diminuzione della disponibilità di ossido nitrico, conseguente vasocostrizione, ipertensione sistemica e, infine, danno ossidativo del tessuto26,27. Per migliorare questi problemi, il Palmer Laboratory ha lavorato allo sviluppo di una nuova generazione di PolyhHb che contiene specie minime a basso MW e Hb priva di cellule, che ha dimostrato caratteristiche biofisiche migliorate e risposte in vivo 22,28,29,30. Diversi studi trasfusionali sugli animali hanno dimostrato che se i polimeri di Hb a basso peso molecolare vengono eliminati dall'HBOC, la vasocostrizione, l'ipertensione sistemica e il danno ossidativo possono essere mitigati 28,29,31,32,33,34,35. Pertanto, questo PolyhHb di nuova generazione è un promettente candidato perfusato.

Qui, descriviamo l'applicazione di un PolyhHb di nuova generazione da utilizzare in un perfusato e il protocollo con cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di EVLP di ratto. L'obiettivo di questo studio è fornire alla comunità dei trapianti di polmone informazioni chiave nella progettazione e nello sviluppo di nuove soluzioni di perfusione, nonché fornire protocolli per testarle in modelli di trapianto traslazionale clinicamente rilevanti.

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Protocollo

I ratti Sprague-Dawley (300 g di peso corporeo) sono stati ottenuti commercialmente e ospitati in condizioni prive di agenti patogeni presso l'Ohio State University Wexner Medical Center Animal Facility. Tutte le procedure sono state eseguite umanamente secondo il NIH e la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l'uso umano degli animali da laboratorio e con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Ohio State University (Protocollo IACUC 2023A00000071).

1. Sintesi e purificazione del polihHb

NOTA: La produzione e la sintesi del materiale PolyhHb utilizzato per i seguenti esperimenti EVLP sono state inizialmente pubblicate da Cuddington et al. nel 202022. Si prega di fare riferimento a questo lavoro per schemi approfonditi e analisi della sintesi di PolyhHb. Quello che segue è un riassunto della sintesi e purificazione del PolyhHb su scala pilota e della sua successiva preparazione come perfusato.

  1. Lavaggio, lisi e purificazione dell'Hb con globuli rossi
    1. Procurarsi 18 unità di PRBC umani scaduti e versarle in un recipiente di filtrazione da 20 L, diluire con soluzione fisiologica allo 0,9% in peso fino a un ematocrito finale del 22% (Figura 1B, C).
    2. Esecuzione di sei scambi di volume del sistema (diacicli) su un modulo di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) in polietilene solfone modificato (mPES) da 0,65 μm con soluzione salina allo 0,9% in peso sulla soluzione di globuli rossi. NOTA: Lo scopo di questa fase di lavaggio è quello di rimuovere i globuli rossi danneggiati, i frammenti di membrana e altri materiali extracellulari prima dell'emolisi (Figura 1B, C).
    3. Lisi la soluzione di globuli rossi con 10 L di tampone fosfato (PB, 3,75 mM, pH 7,4) per 1 ora a 4 °C agitando costantemente.
    4. Rimuovere i frammenti di membrana lisata e altri aggregati filtrando la soluzione su un modulo TFF da 500 kDa e raccogliendo il permeato nel recipiente del reattore batch da 30 L (Figura 1A-C).
    5. Una volta che 480 g di Hb sono nel reattore, aggiungere una carica di sale per convertire il PB in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    6. Ricircolare l'Hb attraverso un contattore di gas alimentato con azoto, oltre a mantenere uno spazio di testa dell'azoto nel reattore, per deossigenare la proteina durante la notte. Raffreddare a 14 °C per limitare la formazione di metaemoglobina (metHb).
  2. Polimerizzazione Hb
    1. Riscaldare la soluzione di Hb alla temperatura fisiologica (37 °C) mentre si fa ricircolare la soluzione su un circuito di contattore del gas.
      NOTA: L'obiettivo è quello di deossigenare la proteina a un pO2 tra 0-10 mmHg per garantire che la maggior parte dell'Hb sia nello stato quaternario teso (Figura 1A).
    2. Aggiungere 1 g di carica di ditionito di sodio, se necessario, per garantire un'efficace deossigenazione.
    3. Mantenendo il circuito di ricircolo e degassando la soluzione di Hb, aggiungere un rapporto molare 30:1 di glutaraldeide (GA) a Hb diluito in 3 L di PBS deossigenato (pH 7,4).
    4. Aggiungere la soluzione al recipiente del reattore nell'arco di 3 ore con un'ora aggiuntiva di tempo di reazione.
    5. Estinguere la reazione di reticolazione con un rapporto molare 7:1 di cianoboroidruro di sodio a GA, diluito in 3 L di PBS (pH 7,4). Aggiungere al reattore per oltre 10 min.
    6. Raffreddare il reattore a 14 °C durante la notte.
  3. Purificazione di PolyhHb
    1. Pompare il contenuto del reattore in un recipiente di filtrazione da 10 L e iniziare la circolazione attraverso un modulo TFF in polietilene solfone (PES) da 0,2 μm (Stage 1). Questa fase rimuoverà gli aggregati di grandi dimensioni e i contaminanti indesiderati.
    2. Alimentare il permeato in un recipiente di filtrazione secondario da 10 L che, una volta pieno, farà circolare su un modulo TFF in polisulfone (PS) da 500 kDa (Fase 2). Continuare fino a svuotare il reattore (Figura 1B, D).
    3. Una volta che il reattore è stato svuotato nel circuito di purificazione, iniziare lo scambio dell'eccipiente allo stadio 1 con una soluzione di Ringer lattato modificata (pH 7,4). Dopo ogni scambio di volume completo, misurare la concentrazione di proteine nel permeato dello Stadio 1 utilizzando la spettroscopia UV-visibile.
    4. Quando il permeato di stadio 1 ha una concentrazione inferiore a 1 mg di Hb/mL, trasferire la soluzione di Ringer modificata allo stadio 2. Qualsiasi rapina nella fase 1 è un rifiuto e deve essere smaltita in modo appropriato. In totale, assicurarsi che vengano eseguiti 12 scambi di volumi completi della soluzione di Ringer modificata in entrambe le fasi.
    5. Dopo il completamento dei diacicli, concentrare il contenuto della Fase 2 ad almeno 10 g/dL sul modulo TFF da 500 kDa.
    6. Confezionare la soluzione concentrata in provette coniche da 50 mL e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.

2. Formulazione in perfusato

  1. Preparare il perfusato fino a un volume finale di 165 ml. Diluire PolyhHb a una concentrazione finale di 3,7 g/dL con William's E Medium.
  2. Aggiungere albumina sierica umana (HSA) a una concentrazione finale del 3% di HSA in peso. Aggiungere 1 mL di eparina alla soluzione finale.

3. Configurazione del circuito di perfusione polmonare Ex Vivo

  1. Posizionare PolyhHb perfusato nel serbatoio del circuito EVLP e aprire il bagno di acqua calda a 37 °C. Assicurarsi che il perfusato circoli all'interno del circuito accendendo le pompe a rulli.
  2. Collegare il gas di deossigenazione (cioè 6% O2, 8% CO2, 84% N2) all'ossigenatore a fibra cava per deossigenare il perfusato. Questo viene fatto per valutare la capacità del polmone di ossigenare il perfusato.
  3. Aprire il software di acquisizione dati su un computer nelle vicinanze. Assicurarsi che la pressione dell'arteria polmonare, la pressione differenziale tracheale, la pressione differenziale del flusso respiratorio, il peso polmonare e i trasduttori di velocità della pompa siano collegati sia al circuito che alla scatola del convertitore dati.
  4. Assicurarsi che non siano presenti perdite in tutto il sistema esaminando attentamente tutti i collegamenti dei tubi e che l'acqua calda circoli ovunque (Figura 2). Premere Esegui sul software di acquisizione dati per assicurarsi che tutti i trasduttori di pressione funzionino. Una volta che il sistema funziona correttamente, spegnere le pompe a rulli.

4. Approvvigionamento di blocco polmonare di ratto da donatore

  1. Impostare il tavolo operatorio e disporre gli strumenti (Figura 3). Autoclavare tutti gli strumenti a 121 °C per 30 min.
  2. Preparare 1200 U/kg di eparina, una miscela di ketamina/xilazina per anestetico (60 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg), nonché suture di seta lunghe 5-10 cm (3-0 o 4-0).
  3. Iniettare la soluzione di ketamina/xilazina per via intraperitoneale nel ratto. Attendere 5-10 minuti affinché il piano anestetico si sviluppi. Per garantire un livello adeguato di anestesia, pizzicare il ratto per provocare una reazione. Se non c'è reazione, è stato raggiunto il livello corretto di anestesia.
  4. Radere l'addome del ratto e posizionare il ratto in posizione supina sulla tavola chirurgica. Pulire l'addome con iodio povidone ed etanolo al 70%. Metti un unguento oftalmico sotto gli occhi del ratto per prevenire la secchezza.
  5. Spostare il ratto sulla tavola chirurgica e fissarlo in posizione (Figura 4A). Attiva il software di acquisizione dati e inizia la registrazione. Accendere il ventilatore a 4 ml/kg e assicurarsi che la pressione positiva di fine espirazione (PEEP) sia di circa 2 cm/H2O.
    NOTA: Queste impostazioni iniziali sono specifiche dell'esperimento. Spetta a tutti i ricercatori determinare le migliori strategie ventilatorie per i singoli esperimenti.
  6. Una volta raggiunta la corretta profondità dell'anestesia, eseguire una laparotomia della linea mediana dal processo xifoideo alla sinfisi pubica utilizzando un paio di forbici. Successivamente, eseguire una rotazione viscerale mediale-laterale e visualizzare la vena cava inferiore infra-epatica utilizzando uno strumento smussato (IVC)36,37,38 (Figura 4B). Iniettare l'eparina nell'IVC con un ago da 20G (Figura 4C).
  7. Sposta l'attenzione sul collo e taglia la pelle dalla tacca sternale fino a poco sotto l'angolo della mandibola con un paio di forbici. Quindi, inizia a sezionare verso la trachea (Figura 5A).
  8. Nel collo, sezionare senza mezzi termini i muscoli della cinghia necessari per esporre la trachea (Figura 5B). Praticare un'incisione trasversale con un paio di forbici sulla trachea anteriore tra gli anelli cartilaginei abbastanza grandi per il tubo endotracheale (ET) (diversi millimetri), ma non tagliare la parte posteriore della trachea. Posizionare una sutura di seta 5-0 attorno alla trachea (Figura 5C).
  9. Inserire il tubo endotracheale e fissarlo in posizione con la suddetta sutura di seta 5-0 (Figura 5D). Collegare il tubo ET al ventilatore e assicurarsi che il torace si alzi correttamente.
  10. Eseguire una sternotomia mediana ed entrare nuovamente nella cavità toracica usando le forbici. Posizionare i divaricatori della parete toracica per esporre il cuore e i polmoni (Figura 6A). Evita qualsiasi manipolazione involontaria dei polmoni, poiché sono incredibilmente friabili.
  11. Rimuovere il timo dal mediastino anteriore con una combinazione di dissezione affilata (forbice) e smussata. Fare attenzione a non danneggiare i grandi vasi o i polmoni.
  12. Identificare l'arteria polmonare (PA; Figura 6B) e posizionare una sutura di seta 5-0 attorno ad essa per prepararsi all'incannulamento (Figura 6C). A causa dell'anatomia microscopica dei grandi vasi del ratto, è spesso più facile posizionare la sutura attorno all'AP e all'aorta allo stesso tempo.
  13. Praticare un'incisione di 2-3 mm nel percorso di efflusso ventricolare destro (RVOT) utilizzando un paio di forbici (Figura 6D-E) per posizionare la cannula arteriosa all'interno del PA e fissarla in posizione con la sutura 5-0 descritta un passaggio prima (Figura 6F).
  14. Praticare un'incisione di 5 mm nel ventricolo sinistro (LV) e nell'IVC infraepatica utilizzando un paio di forbici per sopprimere il ratto. Collegare rapidamente il liquido di conservazione polmonare alla cannula arteriosa per gravità, lavare i polmoni con circa 20 ml (Figura 7A-B). Assicurarsi che il liquido di conservazione polmonare sia disaerato prima di collegarlo alla cannula arteriosa poiché gli emboli d'aria sono molto dannosi per i polmoni.
  15. Collegare la cannula arteriosa al circuito EVLP. Accendere la pompa a rulli e lasciare che una piccola quantità di perfusato fluisca attraverso il polmone e fuori dal ventricolo sinistro nella cavità toracica. Una volta che il perfusato inizia a fuoriuscire dall'atrio sinistro, spegnere la pompa a rulli (Figura 7C). Pur consentendo il flusso del perfusato, assicurarsi che la pressione PA non aumenti, il che indicherebbe un blocco o un posizionamento errato.
  16. Posizionare una piccola pinza nel ventricolo sinistro e allungare delicatamente l'anulus della valvola mitrale, che consentirà l'introduzione della cannula dell'atrio sinistro (LA) (Figura 8A). Metti una cravatta di seta 5-0 intorno al cuore e legala senza stringere (Figura 8B).
  17. Inserire la cannula LA nel ventricolo sinistro e far avanzare la cannula LA fino a quando non può essere vista all'interno dell'atrio. Terminare il fissaggio del LA con la sutura 5-0 pre-legata (Figura 8C).
  18. Identificare l'esofago e bloccarlo con un emostatico il più vicino possibile al diaframma. Tagliare l'esofago sotto l'emostatico per assicurarsi che non vi siano fuoriuscite nella cavità toracica (Figura 9A).
  19. Utilizzando la colonna vertebrale come guida, tagliare con un paio di forbici tutti gli attacchi legamentosi che collegano il blocco cuore-polmone alle strutture circostanti (Figura 9B). Una volta che il blocco cuore-polmone è liberamente mobile, sezionare la trachea dal collo e infine tagliare la trachea sopra il tubo ET usando un paio di forbici per liberare il blocco cuore-polmone (Figura 9C).
  20. Spostare il blocco cuore-polmone sulla camicia toracica all'interno del circuito EVLP e collegare la cannula LA al circuito EVLP (Figura 9D). Accendere la pompa a rulli e collegare il monitor del ventilatore.
  21. Controllare la trappola per bolle per assicurarsi che non vengano introdotti emboli d'aria nel sistema.
  22. Modificare lentamente le impostazioni di ventilazione e perfusione ai livelli sperimentali desiderati durante i primi 15 minuti 36,37,38. Inoltre, durante questa fase iniziale di ramp-up, aumentare la portata di perfusione alla velocità e/o alla pressione desiderate.
  23. Nei punti temporali designati dall'esperimento, controllare i livelli di gas perfusato e i test di funzionalità polmonare.

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Risultati

La validazione del nostro perfusato a base di PolyhHb e, inoltre, la stabilità di questo perfusato per diverse ore, è dimostrata nella Figura 10. Durante la prima 1 ora, tutti i perfusi testati (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), a base di globuli rossi) hanno mostrato una leggera diminuzione di LA pO2 (Post pO2). Tuttavia, il perfusato a base di globuli rossi ha mostrato una diminuzione significativa a 1 ora rispetto al PolyhHb (p < 0,05). Quando sono stati...

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Discussione

Lo sviluppo e la sperimentazione di soluzioni di perfusione è un'impresa innovativa che molti in tutto il mondo stanno intraprendendo. Tradizionalmente, i perfusi standard offrono la capacità di sospendere il tempo ischemico e mitigare le lesioni associate all'ischemia, nonché alla riperfusione18. Tuttavia, la prossima evoluzione dell'EVLP è quella di migliorare l'attuale tecnologia del perfusato e di incorporare terapie di riparazione e ricondizionamento 39,40,41...

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Dichiarazioni

Per il materiale presentato in questo lavoro, A.F.P., A.G. e C.C. sono inventori della domanda di brevetto statunitense PCT/US2022/041743. A.F.P., C.C., B.A.W. e S.M.B. sono inventori della domanda di brevetto statunitense PCT/US2023/017765.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata generosamente sostenuta dalla Jewel and Frank Benson Family Endowment e dalla Jewel and Frank Benson Research Professorship. B.A.W. è parzialmente supportato dalla sovvenzione del National Institutes of Health (NIH) R01HL143000. L'AFP è supportato dalle sovvenzioni NIH R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 e R01HL138116 e dalla sovvenzione del Comando per la ricerca medica e il materiale dell'esercito degli Stati Uniti W81XWH1810059. S.M.B. è supportato dal NIH R01 DK123475.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da insulina da 10 cc Ago da 29 G x 1/2"BD309301
Bioreattore in batch di vetro da 30 LAce Glass
Ago da 30 g AghimediciBD-305106
Baytril (enrofloxacina) Compresse antibattericheElancoNA
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2.2H2O)Sigma Aldrich10035-04-8lattato di Ringer
modificato tipo 672Harvard Apparatus731747
Connect kit D150Cole-Parmer VK 73-3763
Dumont #5 PinzeStrumenti per le scienze11252-50
Dumont Medical #5/45 Pinze - Angolate 45 gradiStrumenti per le scienze fini11253-25
Ecoline Star Edition 003, scaldabagno E100LaudaLCK 1879
Leucoriduzione umana scaduta, unità globuli rossi impaccateWexner Medical Center
Canadian Blood Services
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
PinzeStrumentiper le scienze fini11027-12
Glutaraldeide (C5H8O2 70 wt%)Sigma Aldrich111-30-8 (G7776)
Emostatico Halsted-MosquitoRoboz SurgicalRS-7112
Eparina 30.000 unità per 30 mlAPP Pharmaceuticals Albumina
sierica umana (HSA)OctaPharma PlasmaAdditivo per perfusato
Set di tubi IL2 per perfusatoApparecchio Harvard733842
IPL-2 Sistema di perfusione polmonare di baseApparato
Harvard Ketamina 500 mg per 5 mlJHP Pharmaceuticals
Cannula dell'atrio sinistroApparecchio Harvard730712
Contattore a membrana Liqui-Cel serie EXF G4203MG420contattore per gas
Soluzione di glucosio a basso contenuto di destrano di potassio (perfadex)Soluzione XVIVOper il lavaggio del polmone
Tubo rivestito in platino Masterflex (Dimensioni: 73,17,16,24)Cole-Palmer
N-acetil-L-cisteina (NALC, C5H9NO3S)Sigma Aldrich616-91-1 (A7250)lattato di Ringer modificato
( 10L, 20L)NalgeneRecipienti di filtrazione
Pompa peristaltica  Ismatec ISM 827B
PES, 0,65 &; micro; m Modulo TFFRepligenN02-E65U-07-N
PhysioSuiteKent Scientific CorporationPS-MSTAT-RT
polietersulfone (PES), 0,2 µ m Modulo TFFRepligenN02-S20U-05-N
Polisulfone (PS), 500 kDa Modulo TFFRepligenN02-P500-05-N
Cloruro di potassio (KCl)Fisher Scientific7447-40-7Per PBS
PowerLab 8/35  ADInstruments730045
Cannula dell'arteria polmonareHarvard Apparatus730710
Tubo della testa della pompa (Dimensioni: 73,17,16,24)PharMed BPT
Puralube  Unguento oftalmicoDechraNA
ForbiciStrumenti per le scienze14090-11
SCP Servocontrollore per perfusione tipo 704Apparecchio Harvard732806
Ventilatore per piccoli animali modello 683Apparecchio Harvard55-000
Cloruro di sodio (NaCl)Fisher Scientific7647-14-5 (S271-10)Per PBS e soluzione salina
Cianoboroidruro di sodio (NaCNBH3)Sigma Aldrich25895-60-7
Ditionito di sodio (Na2S2O4)Sigma Aldrich7775-14-6
Idrossido di sodio (NaOH)Fisher Scientific1310-73-2Per lattato
di Ringer modificatoLattato di sodio (NaC3H5O3)Sigma Aldrich867-56-1Per lattato di Ringer modificato
Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)Fisher Scientific7558-79-4Per PBS
Fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4)Fisher Scientific7558-80-7per PBS
SomnoSuite Sistema di anestesia per piccoli animaliKent Scientific CorporationModulo SS-MVG
Ratti Sprague-DawleyEnvigo
TAM-A tipo 705/1Apparecchio Harvard73-0065
Amplificatore trasduttore TAM-D tipo 705/2Apparecchio Harvard  73-1793
Modulo di controllo del tempo TCM tipo 686Apparecchio Harvard731750
Cannula trachealeApparecchio Harvard 733557
Set di tubi per camera umidaApparato Harvard  73V83157
Cassetta per tubiCole-ParmerIS 0649
Pinzetta #5 DumostarKent Scientific Corporation  INS500085-A
Pinzetta #5 in acciaio inossidabile, curvaKent Scientific CorporationIND500232
Pinzetta #7 TitaniumKent Scientific Corporation
Tygon E-3603 Tubo 2,4 mm IDHarvard Apparecchio721017linea perfusata che entra nel polmone
Tygon E-3603 Tubo 3,2 mm IDApparato Harvard 721019linea perfusata che esce dal polmone
Vannas-Tubingen Spring ScissorsFine Science Tools15008-08
VCM modulo di controllo del ventilatore tipo 681Harvard Apparatus731741
William's E MediaGibco, ThermoFisher ScientificA12176-01Additivo perfusato
Xilazina 100 mg per 1 mldi Akorn
Per amplificatore a ponte di frequenza portante CFBA Per vasi Nalgene per Modulo amplificatore trasduttore INS600187

Riferimenti

  1. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung. Am J Transplant. 23, 2 Suppl 1 S379-S442 (2023).
  2. Gouchoe, D. A., et al. Ex vivo lung perfusion in donation after circulatory death: A post hoc analysis of the normothermic Ex Vivo lung perfusion as an assessment of extended/marginal donors lungs trial. J Thorac Cardiovasc Surg. , 10.1016/j.jtcvs.2024.03.011 (2024).
  3. Bobba, C. M., et al. Trends in donation after circulatory death in lung transplantation in the United States: Impact of era. Transpl Int. 35, 10172(2022).
  4. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
  5. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. N Engl J Med. 364 (15), 1431-1440 (2011).
  6. Cypel, M., Neyrinck, A., Machuca, T. N. Ex vivo perfusion techniques: state of the art and potential applications. Intens Care Med. 45 (3), 354-356 (2019).
  7. Gouchoe, D. A., et al. XPS™ Jensen lung as a low-cost, high-fidelity training adjunct to ex-vivo lung perfusion. Artif Organs. , 10.1111/aor.14623 (2023).
  8. Van Raemdonck, D., Rega, F., Rex, S., Neyrinck, A. Machine perfusion of thoracic organs. J Thorac Dis. 10, Suppl 8 S910-S923 (2018).
  9. Andreasson, A. S., Dark, J. H., Fisher, A. J. Ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation--state of the art. Eur J Cardiothorac Surg. 46 (5), 779-788 (2014).
  10. Ahmad, K., Pluhacek, J. L., Brown, A. W. Ex vivo lung perfusion: A review of current and future application in lung transplantation. Pulm Ther. 8 (2), 149-165 (2022).
  11. Kim, J. L., et al. Biometric profiling to quantify lung injury through ex vivo lung perfusion following warm ischemia. Asaio j. 69 (8), e368-e375 (2023).
  12. Jeon, J. E., et al. Acellular ex vivo lung perfusate silences pro-inflammatory signaling in human lung endothelial and epithelial cells. J Transl Med. 21 (1), 729(2023).
  13. Baciu, C., et al. Altered purine metabolism at reperfusion affects clinical outcome in lung transplantation. Thorax. 78 (3), 249-257 (2023).
  14. Peel, J. K., et al. Evaluating the impact of ex vivo lung perfusion on organ transplantation: A retrospective cohort study. Ann Surg. 278 (2), 288-296 (2023).
  15. Peel, J. K., et al. Determining the impact of ex vivo lung perfusion on hospital costs for lung transplantation: A retrospective cohort study. J Heart Lung Transpl. 42 (3), 356-367 (2023).
  16. Warnecke, G., et al. Normothermic ex vivo preservation with the portable Organ Care System Lung device for bilateral lung transplantation (INSPIRE): a randomised, open-label, non-inferiority, phase 3 study. Lancet Respir Med. 6 (5), 357-367 (2018).
  17. Loor, G., et al. Portable normothermic ex vivo lung perfusion, ventilation, and functional assessment with the Organ Care System on donor lung use for transplantation from extended-criteria donors (EXPAND): a single-arm, pivotal trial. Lancet Resp Med. 7 (11), 975-984 (2019).
  18. Loor, G., et al. Prolonged EVLP using OCS lung: Cellular and acellular perfusates. Transplantation. 101 (10), 2303-2311 (2017).
  19. Bansal, S., Biswas, G., Avadhani, N. G. Mitochondria-targeted heme oxygenase-1 induces oxidative stress and mitochondrial dysfunction in macrophages, kidney fibroblasts and in chronic alcohol hepatotoxicity. Redox Biol. 2, 273-283 (2014).
  20. Park, S., et al. Initial investigation on the feasibility of porcine red blood cells from genetically modified pigs as an alternative to human red blood cells for transfusion. Front Immunol. 14, 1298035(2023).
  21. Ellingson, K. D., et al. Continued decline in blood collection and transfusion in the United States-2015. Transfusion. 57, Suppl 2 1588-1598 (2017).
  22. Cuddington, C. T., et al. Pilot scale production and characterization of next generation high molecular weight and tense quaternary state polymerized human hemoglobin. Biotechnol Bioeng. 119 (12), 3447-3461 (2022).
  23. Moore, E. E., et al. Human polymerized hemoglobin for the treatment of hemorrhagic shock when blood is unavailable: the USA multicenter trial. J Am Coll Surg. 208 (1), 1-13 (2009).
  24. Shonaka, T., et al. Impact of human-derived hemoglobin based oxygen vesicles as a machine perfusion solution for liver donation after cardiac death in a pig model. PLoS One. 14 (12), e0226183(2019).
  25. Chen, G., Palmer, A. F. Hemoglobin-based oxygen carrier and convection enhanced oxygen transport in a hollow fiber bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102 (6), 1603-1612 (2009).
  26. Bucci, E., Kwansa, H., Koehler, R. C., Matheson, B. Development of zero-link polymers of hemoglobin, which do not extravasate and do not induce pressure increases upon infusion. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 35 (1), 11-18 (2007).
  27. Schaer, C. A., et al. Haptoglobin preserves vascular nitric oxide signaling during hemolysis. Am J Respir Crit Care Med. 193 (10), 1111-1122 (2016).
  28. Muller, C. R., et al. Safety and efficacy of human polymerized hemoglobin on guinea pig resuscitation from hemorrhagic shock. Sci Rep. 12 (1), 20480(2022).
  29. Greenfield, A., et al. Biophysical analysis and preclinical pharmacokinetics-pharmacodynamics of tangential flow filtration fractionated polymerized human hemoglobin as a red blood cell substitute. Biomacromolecules. 24 (4), 1855-1870 (2023).
  30. Cuddington, C., et al. Polymerized human hemoglobin-based oxygen carrier preserves lung allograft function during normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. , 10.1097/mat.0000000000002118 (2024).
  31. Cabrales, P., et al. Effects of the molecular mass of tense-state polymerized bovine hemoglobin on blood pressure and vasoconstriction. J Appl Physiol. 107 (5), 1548-1558 (2009).
  32. Baek, J. H., et al. Down selection of polymerized bovine hemoglobins for use as oxygen releasing therapeutics in a guinea pig model. Toxicol Sci. 127 (2), 567-581 (2012).
  33. Williams, A. T., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock with fresh and stored blood and polymerized hemoglobin. Shock. 54 (4), 464-473 (2020).
  34. Muller, C. R., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock after traumatic brain injury with polymerized hemoglobin. Sci Rep. 11 (1), 2509(2021).
  35. Lamb, D. R., et al. The molecular size of bioengineered oxygen carriers determines tissue oxygenation in a hypercholesterolemia guinea pig model of hemorrhagic shock and resuscitation. Mol Pharm. 20 (11), 5739-5752 (2023).
  36. Bobba, C. M., et al. A novel negative pressure-flow waveform to ventilate lungs for normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. 67 (1), 96-103 (2021).
  37. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. J Vis Exp. (96), e52309(2015).
  38. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), 7-15 (2014).
  39. Wong, A., et al. Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion. Eur Respir J. 55 (4), 1902222(2020).
  40. Machuca, T. N., et al. The role of the endothelin-1 pathway as a biomarker for donor lung assessment in clinical ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transpl. 34 (6), 849-857 (2015).
  41. Gouchoe, D. A., et al. Mitsugumin 53 Mitigation of ischemia reperfusion injury in a mouse model. J Thorac Cardiovasc Surg. 10, 10.1016/j.jtcvs.2023.08.005 (2023).
  42. Gouchoe, D. A., Whitson, B. A., Zhu, H. The next frontier in lung transplantation: Protecting the endothelium and repairing organs for transplant utilizing MG53. Clin Transl Dis. 3 (6), e255(2023).
  43. Gouchoe, D. A., et al. MG53 mitigates warm ischemic lung injury in a murine model of transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. , 10.1016/j.jtcvs.2023.10.056 (2023).

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