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Articolo metodologico

Preparazione di un modello murino di pancreatite acuta grave tramite una combinazione di iniezione intraperitoneale di ceruleina e lipopolisaccaride

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DOI:

10.3791/66780

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10 maggio 2024

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1The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 2Medical College of Anhui University of Science & Technology, 3Endocrinology Department, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 4Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La somministrazione intraperitoneale di farmaci è un approccio non invasivo sicuro ed efficace per indurre lesioni pancreatiche. Questo studio ha confrontato cinque distinti protocolli di iniezione intraperitoneale sui topi per indurre vari gradi di danno pancreatico e ha stabilito un modello di grave danno pancreatico per studiare i cambiamenti patologici e le strategie di trattamento per la pancreatite acuta grave (SAP).

Abstract

Il trattamento della pancreatite acuta grave (SAP), con alti tassi di mortalità, rappresenta una sfida clinica significativa. Studiare i cambiamenti patologici associati alla SAP utilizzando modelli animali può aiutare a identificare potenziali bersagli terapeutici ed esplorare nuovi approcci terapeutici. Studi precedenti hanno indotto principalmente lesioni pancreatiche attraverso l'iniezione retrograda del dotto biliare di taviaurocolato di sodio, ma l'impatto del danno chirurgico sulla qualità del modello animale rimane poco chiaro. In questo studio, abbiamo impiegato varie frequenze di iniezioni intraperitoneali di Caeruleina combinate con diverse dosi di LPS per indurre lesioni pancreatiche nei topi C57BL/6J e abbiamo confrontato l'entità della lesione attraverso cinque protocolli di iniezione intraperitoneale. Per quanto riguarda l'induzione della pancreatite acuta nei topi, viene proposto un protocollo di iniezione intraperitoneale che si traduce in un tasso di mortalità fino all'80% entro 5 giorni. In particolare, i topi hanno ricevuto dieci iniezioni intraperitoneali giornaliere di Caerulein (50 μg/kg), seguite da un'iniezione di LPS (15 mg/kg) un'ora dopo l'ultima somministrazione di Caerulein. Regolando la frequenza e il dosaggio dei farmaci iniettati, è possibile manipolare efficacemente la gravità del danno pancreatico. Questo modello presenta una forte controllabilità e ha un ciclo di replica breve, che lo rende fattibile per il completamento da parte di un singolo ricercatore senza richiedere attrezzature costose. Simula in modo pratico e accurato le caratteristiche chiave della malattia osservate nella SAP umana, dimostrando al contempo un alto grado di riproducibilità.

Introduzione

La pancreatite acuta grave è caratterizzata da una rapida insorgenza, una rapida progressione e alti tassi di mortalità all'interno del dominio1 della malattia dell'apparato digerente. Il suo alto tasso di mortalità è sempre stato al centro dell'attenzione della ricerca clinica. A causa dei cambiamenti imprevedibili delle condizioni cliniche, dell'eterogeneità delle manifestazioni della malattia e della limitata disponibilità di campioni umani, la creazione di modelli animali è diventata sempre più cruciale per la ricerca sulle malattie.

L'iniezione retrograda di taurocolato di sodio nel dotto biliare comune è comunemente usata per creare un modello di ratto di SAP2. Simulando l'ostruzione pancreatico-biliare e inducendo il reflusso della bile e del liquido pancreatico, questa tecnica di modellazione mostra un alto tasso di successo nella replicazione di modelli animali SAP. Tuttavia, va notato che la chirurgia invasiva ha un impatto sul modello animale stesso. Inoltre, questo metodo è limitato agli animali più grandi, come ratti e cani, che vengono utilizzati principalmente come soggetti sperimentali. Tecniche alternative, tra cui l'intubazione duodenale3, la puntura duodenale diretta4 e la puntura diretta del dotto biliare-dotto pancreatico5, sono spesso utilizzate a scopo di modellazione.

L'iniezione intraperitoneale e i metodi di modellazione dietetica offrono vantaggi non invasivi che possono essere applicati ad animali di qualsiasi taglia. Il modello murino di SAP indotto dall'alimentazione con colina-deficiente-etionina (CDE)6 presenta alcune complicanze, come iperglicemia scarsamente controllabile e ipocalcemia, che lo rendono inadatto per valutare nuovi approcci diagnostici e terapeutici. D'altra parte, l'iniezione intraperitoneale di Caeruleina combinata con L-arginina7 rappresenta il metodo più comunemente impiegato per indurre la pancreatite acuta nei topi. In particolare, la somministrazione ripetuta intraperitoneale di Caeruleina, un analogo della colecistochinina, fornisce un approccio altamente adatto per studiare vari aspetti correlati a questa malattia distruttiva, tra cui la patogenesi, l'infiammazione e i processi di rigenerazione. A causa della sua somiglianza strutturale con la colecistochinina (CCK), la caeruleina stimola efficacemente la contrazione della cistifellea e la secrezione enzimatica pancreatica, portando a uno squilibrio nella secrezione enzimatica seguito da una successiva autodistruzione8. Il lipopolisaccaride (LPS), essendo ubiquitario e ampiamente studiato come molecola di pattern molecolare associato a patogeni, può essere combinato con la caeruleina tramite iniezione intraperitoneale per stabilire un modello efficace di SAP nei topi. Questa combinazione innesca e rilascia rapidamente un numero significativo di citochine infiammatorie, con conseguente eccessiva infiammazione locale e sistemica. Diversi studi hanno riportato l'induzione di modelli SAP nei topi attraverso l'iniezione intraperitoneale di Caeruleina combinata con LPS. Ciò può essere attribuito al fatto che l'iniezione intraperitoneale di ceruleina può causare edema pancreatico ed emorragia nei topi, mentre l'aggiunta di LPS può indurre immediatamente necrosi pancreatica ed esacerbare la risposta infiammatoria sistemica, la sepsi e persino l'insufficienza d'organo. Attualmente, vi è una variazione nel dosaggio e nella frequenza delle iniezioni intraperitoneali di Caeruleina, nonché un'incoerenza nel dosaggio aggiuntivo di LPS. Raggiungere la coerenza nei modelli SAP del topo è impegnativo 9,10,11,12; Pertanto, è necessario stabilire un protocollo standardizzato per ottenere un modello ideale. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'iniezione intraperitoneale nei topi e studiamo la frequenza di iniezione ottimale e il dosaggio aggiuntivo di LPS.

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Protocollo

Questo protocollo è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico presso il Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Scienza e Tecnologia di Anhui (Huainan, Cina) (Codice Etico: 2023-KY-905-001). Lo studio ha seguito le linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso dei roditori da ricerca in tutte le procedure animali. Per il presente studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6J del peso di 20-30 g. I topi sono stati ospitati in un laboratorio animale per una settimana in condizioni controllate (circa 21 °C con un ciclo alternato giorno-notte di 12 ore). I topi avevano accesso ad libitum a cibo e acqua per tutto il tempo. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione degli animali

  1. Assegnare 84 topi C57BL/6J sani a sei gruppi, incluso il gruppo di controllo, Lesione pancreatica (PI) I, PI II, PI III, PI IV e PI V.
  2. Prima di iniziare la procedura di modellazione, etichettare ogni gruppo di topi con tacche per le orecchie e lasciarli digiunare per 12 ore.

2. Preparazione del diluente farmacologico indotto

  1. Sciogliere la ceruleina (1 mg) in 1 mL di PBS e conservare in frigorifero a -20 °C.
  2. Misurare e registrare il peso dei topi sperimentali 1 ora prima dell'iniezione intraperitoneale del farmaco.
  3. Estrarre la massa totale di Caeruleina richiesta in un rapporto di 50 μg/kg, in base al peso totale di tutti i topi.
  4. Diluire nuovamente il farmaco Caerulein ottenuto con PBS.
    NOTA: Il volume totale della diluizione di PBS deve essere equivalente a 5 volte il valore del peso totale di tutti i topi. Lo stesso metodo di diluizione è stato utilizzato per ottenere il diluente LPS.

3. Iniezione intraperitoneale

NOTA: Le iniezioni intraperitoneali sono state somministrate a ciascun gruppo di topi secondo il protocollo delineato nella Tabella supplementare 1 per indurre il modello. Altri 10 topi sono stati raggruppati e trattati con i tassi di sopravvivenza a 7 giorni.

  1. Afferra e tieni i topi in modo che la pancia dei topi sia rivolta verso l'alto e la testa sia posizionata più in basso della coda per evitare danni agli organi durante l'inserimento della siringa.
  2. Disinfetta l'addome dei topi usando batuffoli di cotone al 75% di alcol.
  3. Tenere la siringa con la mano destra (utilizzando un ago di misura ≤0,5/≥0,3) e inserire l'ago nella cute sottocutanea sul lato sinistro della linea bianca addominale.
    NOTA: Passare al lato destro per l'iniezione successiva.
  4. Una volta che l'ago ha raggiunto lo strato sottocutaneo, spostarlo in avanti di circa 3-5 mm, quindi inserire l'ago della siringa nella cavità addominale con un angolo di 45°. A questo punto, si dovrebbe sentire una certa resistenza.
  5. Tenere fermo l'ago e iniettare lentamente la sostanza.
    NOTA: Non superare 5 volte il valore di peso dei topi come il volume di una singola iniezione intraperitoneale.
  6. Dopo l'iniezione, estrarre l'ago e massaggiare delicatamente e premere il sito di iniezione con un batuffolo di cotone sterile per diffondere completamente il farmaco nella cavità addominale dei topi.
  7. Usa una nuova siringa per ripetere con i prossimi topi sperimentali.

4. Test di abilità comportamentali in campo aperto

NOTA: 12 ore dopo l'ultima iniezione intraperitoneale, è stato condotto un test di abilità comportamentale in campo aperto per valutare la distanza totale di attività e il tempo di immobilità dei topi.

  1. Posiziona quattro caselle bianche identiche direttamente sotto la fotocamera.
  2. Collegare la fotocamera al computer utilizzando un cavo video.
  3. Assicurarsi che la scatola sperimentale sia pulita e priva di odori prima di iniziare l'esperimento.
  4. Posiziona l'animale al centro della griglia, rivolto lontano dallo sperimentatore, e lascialo adattare all'ambiente per 10 minuti.
  5. Avvia il software di tracciamento video e fai clic sul menu File per creare un nuovo esperimento.
  6. Impostare il monitoraggio per quattro campi visivi simultanei.
  7. Segna la lunghezza e la larghezza dell'oggetto sperimentale che può muoversi all'interno della scatola nella schermata di monitoraggio in tempo reale (30 cm × 30 cm).
  8. Una volta completata la configurazione, inizia la videosorveglianza e la registrazione.
  9. Registra l'attività dei topi per 15 minuti.
  10. Dopo il test, rimuovere l'animale dalla griglia e rimetterlo nella sua gabbia. Pulire accuratamente la griglia utilizzando uno sterilizzante contenente biossido di cloro.

5. Raccolta e analisi del sangue periferico dei topi

  1. Eutanasia dei topi (seguendo il protocollo approvato istituzionalmente).
    1. Eseguire l'eutanasia sui topi sperimentali 36 ore dopo l'iniezione intraperitoneale. Misurare e registrare il peso corporeo dei topi prima dell'eutanasia.
      NOTA: Somministrare 0,18 ml di idrato di cloralio al 10% per via intraperitoneale, assicurando che non reagisca alla stimolazione della punta o della coda.
    2. Con la mano sinistra, fissa i topi e con la mano destra tieni le forbici per tagliare i baffi su un lato dei topi.
    3. Premere delicatamente la pelle intorno all'occhio per indurre la congestione e la sporgenza del bulbo oculare.
    4. Usa una pinza curva per afferrare il bulbo oculare e rimuoverlo rapidamente, raccogliendo il sangue periferico in una provetta da microcentrifuga.
      NOTA: Sono stati utilizzati due diversi tipi di provette per microcentrifuga, una contenente anticoagulante e l'altra senza.
    5. Contemporaneamente, premere leggermente l'area del cuore dei topi con il dito medio della mano sinistra per aumentare la velocità di pompaggio del cuore.
  2. Lasciare il sangue periferico senza anticoagulante a temperatura ambiente per 30 min.
  3. Misurare le concentrazioni sieriche di amilasi (Amy) e lipasi (Lip) utilizzando un analizzatore biochimico automatizzato attraverso il metodo del tasso enzimatico e il metodo della circolazione enzimatica (seguendo le istruzioni del produttore).
  4. Determinare i livelli di indicatori infiammatori come la Pro Calcitonina (PCT) nel plasma utilizzando il metodo della chemiluminescenza utilizzando un imager a chemiluminescenza commerciale (seguendo le istruzioni del produttore).
  5. Utilizzare i kit ELISA per misurare i livelli di HMGB-1, IL-6 e TNF-α nel siero dei topi (seguendo le istruzioni del produttore).
  6. Analizzare il sangue periferico trattato con anticoagulante utilizzando un analizzatore di cellule del sangue completamente automatico per valutare i parametri rilevanti.

6. Raccolta del tessuto pancreatico e preparazione di una sezione di paraffina

  1. Metti i topi in posizione supina e fissali su un piatto di schiuma.
  2. Radere e disinfettare l'area, quindi praticare un'incisione mediana addominale e capovolgere il tubo dell'intestino tenue verso destra per esporre completamente il pancreas.
  3. Scollegare il duodeno e il dotto pilorico e localizzare l'intestino tenue sotto il pancreas. Liberare completamente il tessuto pancreatico lungo il dotto intestinale.
  4. Usa una pinza senza denti per bloccare la milza e tirare delicatamente verso l'alto.
    NOTA: Non toccare direttamente il tessuto pancreatico ed evitare di usare una forza eccessiva durante l'intero processo di dissociazione.
  5. Sezionare bruscamente il tessuto del legamento pancreatico posteriore fino alla testa del pancreas e scollegare il dotto biliare e i vasi sanguigni.
  6. Rimuovere il tessuto pancreatico, asciugare l'umidità superficiale con carta assorbente, pesare e registrare.
  7. Fissare metà del tessuto pancreatico con il 4% di paraformaldeide e conservare l'altra metà in frigorifero a -80 °C.
  8. Preparare le sezioni di paraffina pancreatica seguendo i passaggi seguenti.
    1. Pulire il tessuto pancreatico fissato con alcol al 75% e tagliarlo a una dimensione di circa 0,5 cm × 0,5 cm.
    2. Immergere il fazzoletto in etanolo al 70% per 20 minuti, etanolo all'80% per altri 20 minuti ed etanolo al 90% per 15 minuti.
    3. Trattare il tessuto due volte con etanolo al 95% per 15 minuti ogni volta e poi due volte con etanolo al 100% per 5 minuti ogni volta.
    4. Sottoporre il tessuto a due cicli di trattamenti di 12 minuti e 5 minuti con una soluzione di xilene per la trasparenza.
    5. Immergere il fazzoletto trasparente in una vasca di cera a 65 °C per 1 ora.
    6. Incorporare il fazzoletto nella paraffina fusa e lasciarlo raffreddare. Ottenere sezioni di paraffina pancreatica con un'affettatrice (spessore: 5 μm).
    7. Appiattire le fette di paraffina ottenute in acqua a 45 °C, montarle e asciugarle (condizioni di cottura: 40 °C per 14-16 h).

7. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)

  1. Posizionare le sezioni di paraffina pancreatica nello xilene I e II per 30 minuti, quindi in alcol anidro, 95%, 85% e 75% per 5 minuti ciascuno e acqua ultrapura per 5 minuti.
  2. Colorare il nucleo cellulare con ematossilina per 160 s, quindi risciacquare lentamente con acqua corrente.
  3. Applicare una soluzione di differenziazione dell'alcol dell'acido cloridrico per 5-10 s, quindi risciacquare rapidamente con acqua corrente.
  4. Trattare le sezioni con alcol anidro per 5 minuti.
  5. Incubare il citoplasma con eosina per 30 s, quindi risciacquare con acqua corrente.
  6. Immergere le sezioni in etanolo al 75%, 85%, 95% e 100% per 10 secondi ciascuna, quindi trattare con xilene per 5 minuti per disidratare.
  7. Infine, sigillare le sezioni con resina neutra e osservare al microscopio.
  8. Eseguire il punteggio patologico e gli standard13.
    NOTA: Determinare la gravità della pancreatite in base a indicatori quali edema, necrosi acina, sanguinamento, emorragia e necrosi adiposa e infiammazione infiammatoria e perivascolare. Utilizzare le linee guida per l'implementazione pubblicate in precedenza per il punteggio13.

8. Colorazione immunoistochimica

  1. Decerare le sezioni di tessuto pancreatico incluse in paraffina in xilene e successivamente reidratarle in un gradiente di soluzioni di etanolo.
  2. Eseguire il blocco enzimatico endogeno utilizzando il 3% di H2O2 per 20 minuti dopo una rottura della membrana di 30 minuti.
  3. Bloccare l'anticorpo con siero bovino al 5% a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi incubare per una notte a 4 °C con una diluizione 1:1500 di coniglio anti-HMGB1.
  4. Sciacquare le sezioni con PBS, quindi incubarle negli anticorpi secondari corrispondenti per 30 minuti a 37 °C. Successivamente, eseguire lo sviluppo del colore DAB, la controcolorazione dell'ematossilina e sigillare con gomma neutra.

9. Metodo TUNEL per rilevare l'apoptosi nelle sezioni pancreatiche

  1. Decerare le sezioni di paraffina pancreatica in xilene per 5 minuti, ripetere due volte e lavare con etanolo a gradiente (100% per 5 minuti, 90% per 2 minuti, 70% per 2 minuti e acqua distillata per 2 minuti).
  2. Lavare via il liquido in eccesso che circonda le sezioni di paraffina usando il PBS. Trattare ogni campione con 100 μL di proteinasi K, garantendo una copertura completa del tessuto. Incubare i campioni a 37 °C per 20 minuti. Successivamente, immergere i campioni in PBS 3 volte, ogni volta per 5 minuti.
    NOTA: La soluzione di proteinasi K è stata preparata diluendo la soluzione originale di proteinasi K (200 μg/mL) con PBS in un rapporto di 1:9 (volume), ottenendo una concentrazione finale di 20 μg/mL, esclusa la DNasi. Un lavaggio accurato della proteinasi K è essenziale per evitare interferenze con le successive reazioni di marcatura.
  3. Aggiungere una quantità adeguata di 3% H2O2 (diluito da PBS) sul tessuto per infiltrarlo completamente e incubare per 20 minuti. Risciacquare il fazzoletto con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuna.
    NOTA: Le sezioni di paraffina devono essere mantenute umide. Per inattivare le perossidasi endogene nel tessuto, il tempo di incubazione non deve essere troppo lungo per evitare falsi positivi dovuti alla rottura del DNA causata dal 3% di H2O2.
  4. Coprire l'intera area del campione da testare con 50 μL di tampone di equilibratura e incubare per 10 minuti.
  5. Rimuovere il più possibile il buffer di equilibratura. Quindi, aggiungere 56 μl di tampone di incubazione TdT a ciascun campione di tessuto e incubare per 1 ora (a temperatura ambiente).
    NOTA: Il vetrino non deve essere lasciato asciugare e l'esposizione alla luce deve essere evitata. Il tampone di incubazione TdT è stato preparato secondo le istruzioni del produttore (Enzima TdT ricombinante: Biotina-dUTP Miscela di marcatura: Tampone di equilibrio = 1 μL: 5 μL: 50 μL).
  6. Lavare immediatamente i campioni di tessuto con PBS. Sciacquateli 4 volte per 5 minuti ciascuno. Rimuovere delicatamente l'eventuale soluzione di PBS in eccesso attorno ai campioni con carta da filtro.
  7. Aggiungere 100 μL di soluzione di reazione Streptavidina-HRP precedentemente diluita (Streptavidina-HRP: TBST = 1: 300) a ciascun campione di tessuto per la reazione Streptavidina-HRP. Incubare per 30 min. Quindi, lavare i campioni con PBS e sciacquarli 3 volte per 5 minuti ciascuno.
  8. Eseguire la colorazione DAB aggiungendo 50 μL di DAB a ciascuna sezione di paraffina. Osserva la colorazione al microscopio in tempo reale. Dopo la comparsa di una colorazione positiva, posizionare immediatamente i vetrini in una scatola umida. Ferma la reazione lavandolo con acqua pura.
  9. Immergere i vetrini in una soluzione colorante di ematossilina per 3-5 minuti, quindi risciacquare con acqua pura.
  10. Differenziare in soluzione di differenziazione dell'ematossilina per circa 2 s, seguito da risciacquo immediato con acqua pura.
  11. Ottenere la colorazione blu utilizzando la soluzione rebluante di ematossilina per alcuni secondi e risciacquare i vetrini con acqua pura.
    NOTA: Condurre un esame microscopico dopo la colorazione nucleare. Se la colorazione è troppo scura, riportare i vetrini nella soluzione di differenziazione. Se la colorazione è troppo chiara, riavviare il processo di colorazione dalla fase di colorazione nucleare.
  12. Disidratare i campioni con 4 cicli di etanolo anidro fresco per 5 minuti ciascuno. Quindi, immergili nel butanolo per 5 minuti e nello xilene per 5 minuti. Infine, usa lo xilene fresco per altri 5 minuti.
  13. Montare i vetrini utilizzando una gomma neutra. Lasciarli asciugare naturalmente all'aria o in forno a 60 °C.
  14. Eseguire l'esame istologico utilizzando un microscopio a luce bianca. I nuclei apoptotici appariranno marroni.
  15. Calcola l'indice apoptotico (AI) corrispondente.
    NOTA: Osservare le diapositive in doppio cieco. Nei vetrini positivi a TUNEL, selezionare in modo casuale 5 aree positive ad alto ingrandimento (400x) e contare almeno 100 cellule acinose in ciascuna area per determinare la percentuale di cellule positive. AI = (numero totale di cellule apoptotiche/numero totale di cellule) × 100%.

10. Citometria a flusso

  1. Procurare tessuti pancreatici freschi e lavarli accuratamente dopo averli perfusi con PBS.
  2. Preparare una soluzione digestiva per via endovenosa di collagenasi allo 0,5% e utilizzare forbici per tessuti sterili per digerire adeguatamente i tessuti pancreatici.
  3. Aggiungere una soluzione di terminazione della digestione BSA al 5% a seconda delle condizioni dei frammenti pancreatici e della torbidità del liquido, e centrifugare la miscela a bassa temperatura per 5 minuti (~300 x g, 4 °C).
  4. Scartare il surnatante per terminare la digestione.
  5. Preparare un terreno di coltura cellulare contenente fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF) e il 2,5% di sospensione di cellule di siero fetale bovino per risospendere le cellule pancreatiche.
  6. Filtrare le sospensioni di cellule acinose pancreatiche attraverso una rete di nylon da 200 maglie per ottenere sospensioni cellulari attraverso il filtraggio cellulare.
  7. Centrifugare la sospensione di cellule acinose pancreatiche a bassa temperatura (seguire le condizioni indicate al punto 10.3).
  8. Scartare il surnatante.
  9. Lavare le celle con PBS pre-raffreddato.
  10. Risospendere delicatamente le cellule in un tampone legante 1x pre-raffreddato mediante risospensione centrifuga.
  11. Etichettare le cellule acinose pancreatiche con l'annessina V-FITC/PI secondo le istruzioni del produttore dopo aver regolato la concentrazione cellulare.
  12. Utilizzare la citometria a flusso entro 1 ora per rilevare l'apoptosi nelle cellule acinose pancreatiche.

11. Rilevamento Western blot di Caspasi-3 e HMGB-1

  1. Estrarre la proteina pancreatica.
    1. Estrarre 50 mg di tessuto pancreatico e tagliarlo in piccoli frammenti.
    2. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi RIPA (contenente PMSF e inibitore della proteasi fosforilata).
    3. Omogeneizzare il tessuto pancreatico su ghiaccio per 5 minuti utilizzando un tritatutto elettrico.
    4. Incubare il tessuto omogeneizzato su ghiaccio agitando delicatamente per 2 ore.
    5. Centrifugare l'omogeneizzato a 4 °C per 10 minuti a 4.500 x g.
    6. Raccogliere la soluzione surnatante e conservarla a -80 °C.
  2. Eseguire la quantificazione delle proteine.
    1. Diluire un certo volume di campione standard BSA (25 mg/mL) a una concentrazione di 0,5 mg/mL.
    2. Preparare una quantità specifica di soluzione di lavoro BCA mescolando 50 volumi di soluzione BCA A con 1 volume di soluzione BCA B, assicurando una miscelazione accurata e uniforme.
    3. Posizionare il campione standard BSA nei fori standard su una piastra a 96 pozzetti nell'ordine di 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 e 20 μl. Bilanciare il volume di ciascun foro con acqua distillata, ottenendo un volume totale di 20 μl.
    4. Aggiungere 2 μL di campioni nei fori del campione, quindi aggiungere in sequenza 18 μL di acqua distillata per la diluizione (1:9).
    5. Riempire ogni pozzetto con 200 μL di soluzione di lavoro BCA e lasciarlo riposare a 37 °C per circa 20-30 minuti.
    6. Misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 562 nm. Calcolare la concentrazione proteica dei campioni in base alla curva standard.
    7. Aggiungere un volume specifico di soluzione di cracking RIPA e tampone di diluizione per diluire i campioni fino a raggiungere la concentrazione di 5-10 μg/μL, che è considerata appropriata.
    8. Conservare i campioni a -20 °C dopo la denaturazione delle proteine (100 °C; 10 min).
  3. Eseguire il Western blotting.
    1. Preparatevi per SDS-PAGE.
      1. Installa gli stampi per la produzione di colla e controlla le loro prestazioni di tenuta.
      2. Aggiungere TEMED all'adesivo di separazione al 10% e mescolare uniformemente.
      3. Iniettare il composto nello stampo, che rappresenta circa i due terzi del volume, evitando la formazione di bolle.
      4. Aggiungere l'isopropanolo allo stampo e premere l'adesivo per circa 40 minuti.
      5. Utilizzare lo stesso programma per configurare l'adesivo concentrato al 5%.
      6. Versare l'isopropanolo e aggiungere immediatamente l'adesivo.
      7. Posizionare il pettine verticalmente fino a quando la colla non polimerizza completamente.
    2. Eseguire l'operazione di elettroforesi.
      1. Aggiungere il campione da testare nell'ordine di controllo sperimentale previsto, in ordine inverso, nei fori di campionamento dell'adesivo SDS-PAGE.
      2. Aggiungere contemporaneamente il Protein Mark per determinare la posizione della proteina target e della proteina di riferimento interna.
      3. Posizionare il campione nella vasca per elettroforesi al termine dell'aggiunta del campione.
      4. Inizialmente, eseguire a 80 V per 30 minuti, quindi eseguire il gel per separare la proteina a 100 V per 60 minuti.
        NOTA: Prestare attenzione alla posizione del blu di bromofenolo per evitare un'eccessiva elettroforesi.
    3. Eseguire il trasferimento delle proteine.
      1. Taglia la pellicola in PVDF nell'angolo in alto a destra per fungere da segno.
      2. Mettere il film PVDF in una soluzione di metanolo per 5-10 s per attivarlo.
      3. Immergere la pellicola di PVDF in un tampone per elettroforesi per circa 15 minuti.
      4. Rimuovere con cura il gel dopo l'elettroforesi e tagliare il gel in eccesso, assicurandosi che il gel rimanga umido durante tutto il processo.
      5. Assemblare la stecca nel seguente ordine: piastra negativa → spugna → tre strati di carta da filtro → gel → pellicola PVDF → tre strati di carta da filtro → spugna → piastra positiva.
        NOTA: Assicurarsi che non vi siano bolle tra il gel e la pellicola in PVDF.
      6. Posizionare il morsetto assemblato nella scanalatura rotante bagnata (da nero a nero) con i cubetti di ghiaccio posizionati attorno ad esso.
      7. Accendere l'alimentazione e avviare il trasferimento della pellicola a 400 mA per 100 min.
    4. Eseguire la sigillatura del film PVDF e l'incubazione di anticorpi primari e secondari.
      1. Rimuovere delicatamente la pellicola di PVDF dopo il trasferimento e risciacquare con TBST per 10 minuti, ripetendo il processo 3-5 volte.
      2. Sigillare il film PVDF in latte scremato al 5% per 2 ore.
      3. Rimuovere la pellicola di PVDF e risciacquare con TBST per 10 minuti, ripetendo il processo 4 volte.
      4. Mettere insieme la pellicola di PVDF e l'anticorpo primario diluito in frigorifero a 4 °C agitando delicatamente e incubare per una notte.
      5. Rimuovere la pellicola in PVDF il giorno successivo e risciacquare con TBST per 10 minuti, ripetendo il processo 4 volte.
      6. Incubare il film PVDF in un diluente per anticorpi secondari marcato con HRP per circa 2 ore.
      7. Sciacquare la pellicola in PVDF con TBST per 10 minuti, ripetendo il processo 4 volte.
    5. Esponi il film e analizzalo.
      1. Applicare uniformemente la soluzione ECL preparata sulla pellicola.
      2. Esporre la pellicola in una stanza buia con un esposimetro per circa 2-3 minuti e poi conservarla.
      3. Condurre l'analisi utilizzando il software di immagine J.

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Risultati

Il processo di modellazione sperimentale dei topi è illustrato nella Figura 1. Dopo 12 ore dal completamento dell'iniezione, è stato utilizzato un videoregistratore in campo aperto per monitorare la distanza di movimento e la durata dell'immobilità di diversi gruppi sperimentali di topi per 5 cicli (Figura 2A). Durante i 5 cicli, i topi del gruppo PI V hanno mantenuto un basso livello di distanza di movimento entro 3 minuti, mentre il rapporto d...

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Discussione

Attualmente, mancano mezzi efficaci per migliorare l'alto tasso di mortalità nei pazienti con pancreatite acuta grave. È fondamentale studiare l'efficacia dei farmaci nel migliorare i meccanismi di stabilità immunitaria. Esiste un urgente bisogno di un modello animale ideale per la pancreatite acuta grave. I topi con un background genetico C57BL/6J sono ampiamente utilizzati nella ricerca biomedica, compresi gli studi sulla fisiopatologia SAP. Oltre 70 anni di differenziazione genetica nei topi B6J hanno portato alla del...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto da Progetti di ricerca in salute e scienze mediche nella città di Huainan (n. HNWJ2023005); Programma di guida municipale per la scienza e la tecnologia nella città di Huainan (n. 2023151); Programma di formazione per l'innovazione e l'imprenditorialità degli studenti dell'Anhui Provincial College (n. S202310361254); Il nono lotto del "50· Stars of Science and Technology" team di innovazione nella città di Huainan e nel progetto di costruzione di specialità cliniche chiave provinciali di Anhui. Vorremmo esprimere la nostra gratitudine al Dipartimento di Laboratorio del Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Scienza e Tecnologia di Anhui per aver fornito i dati dei test pertinenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
20&volte; Soluzione di riparazione dell'antigene dell'acido citrico (pH 6,0)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG1202-250 ml
AmilasiMindray, Cina
Annexin V-FITC/PIWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Cina  G1511  diluito a 1:20
Anti-HMGB1 Rabbit pABWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, CinaGB11103  diluito a 1:1800
Kit di rilevamento quantitativo delle proteine BCAWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, CinaG2026-200T
BD FACSCantometro a flusso IIBD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USABD FACSCanto II
BSAWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaGC305010-100g
C57BL/6JCavion Experimental Animal Co., Changzhou, Cinanumero di licenza SCXY (Su) 2011... 0003
Ceruletide  MCE, New Jersey, Stati Uniti17650-98-5 50 µ g/kg
Imager a chemiluminescenzaCytiva CO.,LTD.; Soluzione di
(polvere secca pH 6.0)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG1201-5 L
Collagenasi IVWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Cina... GC3050140,5 mg/mL
DAB (SA-HRP) Kit di rilevamento dell'apoptosi delle cellule TunelWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG1507-100 T
Dimension EXL con LM Integrated Chemistry SystemSiemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield, USAYZB/USA 8311-2014
ECL developerWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Cina
Colorante eosina (solubile in alcol)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG1001-100 ml
EthoVision XT Noldus, Paesi Bassi
capra marcata FITC-label anti-coniglio IgGWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaGB22303  diluito a 1:50
Analizzatore di cellule del sangue completamente automaticoZybio Inc. Cina  Zybio-Z3 CRP
GapDHWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaGB11103  diluito a 1:1500
Soluzione di ritorno blu di ematossilinaWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG1040-500 ml
Soluzione di differenziazione dell'ematossilinaWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG1039-500 ml
Colorante ematossilinaWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG1004-100 ml
HMGB-1 ELISA kitnjjcbio Co., Ltd, Cina
OMOGENEIZZATOREWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaKZ-III-F;
capra marcata HRP anti-coniglio IgGWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaGB23303  diluito a 1:1500
IL-6 ELISA kitWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Cina
Lipasi Mindray, Cina
lipopolisaccaride Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaGC20500915 mg/kg
Centrifuga ad alta velocità a bassa temperaturaChangsha Pingfan Apparatus& Instrument Co., Ltd., CinaTGL-20M
Liquido di rottura della membranaWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG1204
microtomoJinhua Craftek Instrument Co., Ltd.; CinaCR-601ST
Rete di nylonWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Cina200 mesh
(metodo di colorazione DAB)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG1507-100T
Macchina per l'inclusione di tessuti in paraffinaPRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Changzhou, CinaPBM-A
Apparecchio patologico per l'essiccazione dei tessutiPRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Changzhou, CinaPHY-III
Soluzione salina tamponata con fosfatoWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG4202-100ML
PMSFWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG2008-1 ml
Microscopio a fluorescenza positivoOlympus Corporation, Tokyo, GiapponeBX53
Pro CalcitoninMindray, Cina
membrana PVDFMillipore, USA0.22 µ m
RIPAWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaG2002-100 ml
SDS-PAGEBeyotime Biotechnology, CinaP0012A
TNF-α Kit ELISAWuhan servicebio Technology Co., Ltd, CinaGEM0004
Bagno d'acqua ad ultrasuoniDONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO., LTD.; CinaKQ-200KDE
Western BlotBio-Rad Laboratories, Inc., Stati Uniti
Western Blot Imaging SystemGlobal Life Sciences IP Holdco LLC, GIAPPONEAmersham ImageQuant 800 
Miscelatore a vorticeSCILOGEX; USA
riparazione dell'antigene dell'acido citrico USA IC111150 100222 GEM0001 Kit di rilevamento dell'apoptosi cellulare TUNEL in un solo passaggio da

Riferimenti

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