Isolamento di nuclei dal tessuto adiposo intermuscolare umano e sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo a valle

Summary

La biologia del tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) è in gran parte inesplorata a causa della limitata accessibilità del tessuto umano. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei nuclei e la preparazione della libreria di IMAT umano congelato per il sequenziamento di RNA a singoli nuclei per identificare la composizione cellulare di questo deposito adiposo unico.

Abstract

Il tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) è un deposito adiposo relativamente poco studiato situato tra le fibre muscolari. Il contenuto di IMAT aumenta con l'età e l'IMC ed è associato a malattie metaboliche e muscolo-degenerative; tuttavia, una comprensione delle proprietà biologiche dell'IMAT e della sua interazione con le fibre muscolari circostanti è gravemente carente. Negli ultimi anni, il sequenziamento dell'RNA di singole cellule e nuclei ci ha fornito atlanti specifici per tipo di cellula di diversi tessuti umani. Tuttavia, la composizione cellulare dell'IMAT umano rimane in gran parte inesplorata a causa delle sfide intrinseche della sua accessibilità dalla raccolta della biopsia nell'uomo. Oltre alla quantità limitata di tessuto raccolto, l'elaborazione dell'IMAT umano è complicata a causa della sua vicinanza al tessuto muscolare scheletrico e alla fascia. La natura lipidica degli adipociti lo rende incompatibile con l'isolamento a singola cellula. Pertanto, il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo è ottimale per ottenere trascrittomica ad alta dimensionalità con risoluzione di singola cellula e fornisce il potenziale per scoprire la biologia di questo deposito, inclusa l'esatta composizione cellulare di IMAT. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei nuclei e la preparazione della libreria di IMAT umano congelato per il sequenziamento di RNA a singoli nuclei. Questo protocollo consente la profilazione di migliaia di nuclei utilizzando un approccio basato su goccioline, fornendo così la capacità di rilevare tipi di cellule rare e poco abbondanti.

Introduction

Il tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) è un deposito adiposo ectopico che risiede tra e intorno alle fibre muscolari¹. Come descritto in dettaglio in una recente revisione di Goodpaster et al., l'IMAT può essere rilevato utilizzando la tomografia computerizzata (TC) ad alta risoluzione e la risonanza magnetica (MRI) (Figura 1A, B) e si trova intorno e all'interno delle fibre muscolari in tutto il corpo¹. La quantità di IMAT varia notevolmente da individuo a individuo ed è influenzata da BMI, età, sesso, razza e sedentarietà ^2,3,4. Inoltre, la deposizione di IMAT è comunemente osservata in condizioni patologiche associate alla degenerazione muscolare⁵ e numerosi studi hanno documentato un aumento della massa IMAT in individui con obesità, diabete di tipo 2, sindrome metabolica e insulino-resistenza 6,7,8,9. Ciononostante, le proprietà cellulari e biologiche dell'IMAT stanno solo iniziando a essere svelate. L'accessibilità limitata e la variazione delle posizioni e dei contenuti IMAT in tutto il corpo hanno messo a dura prova la raccolta di campioni da questo deposito adiposo unico nel suo genere². Inoltre, i campioni sono facilmente "contaminati" con il muscolo scheletrico (SM) al momento della raccolta, rendendo difficile decifrare la separazione tra il contributo biologico dei diversi tessuti (Figura 1C). A tal fine, il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq), che ha guadagnato notevole attenzione nell'ultimo decennio, funge da metodologia ideale per consentire la separazione di modelli di espressione genica derivati da IMAT e SM con risoluzione di una singola cellula. Inoltre, l'isolamento dei nuclei è particolarmente utile per il tessuto adiposo a causa dei grandi adipociti carichi di lipidi, che sono impossibili da dissociare in sospensione unicellulare senza compromettere l'integrità delle cellule. Infine, questa tecnologia ha il potenziale per scoprire nuovi marcatori di adipociti specifici per IMAT e scoprire la composizione e la presenza di diverse popolazioni di cellule progenitrici, nonché studiare la variazione della composizione cellulare in condizioni patologiche e normali.

Figura 1: Immagini di IMAT. Immagine rappresentativa della risonanza magnetica (MRI) di IMAT da (A) una femmina magra di mezza età e (B) un maschio di mezza età con obesità. Rosso: tessuto adiposo sottocutaneo, giallo: tessuto adiposo intermuscolare, verde: muscolo scheletrico, blu: osso. Immagine per gentile concessione di Heather Cornnell, AdventHealth Translational Research Institute. (C) Campione di tessuto fresco con IMAT (circondato da una linea nera tratteggiata). Immagine per gentile concessione di Meghan Hopf, AdventHealth Translational Research Institute e Bryan Bergman, Università del Colorado. Questa figura è stata modificata con il permesso di Goodpaster et ^al.1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sono stati pubblicati numerosi studi dell'industria zootecnica che indagano la marezzatura della carne (IMAT in particolare) in suini, polli e bovini utilizzando cellule singole (sc) e snRNA-seq¹⁰. Questi studi hanno identificato diverse sottopopolazioni di adipociti e marcatori di potenziali cellule progenitrici di IMAT 11,12,13; tuttavia, non è noto se queste composizioni cellulari si traducano nell'IMAT umano. Per quanto ne sappiamo, solo uno studio ha esaminato l'eterogeneità cellulare del muscolo umano con infiltrazione adiposa, ottenuta da pazienti maschi con osteoartrite dell'anca, utilizzando snRNA-seq¹⁴. I ricercatori hanno riportato una piccola popolazione di adipociti e diverse sottopopolazioni di progenitori fibro-adipogenici (FAP) all'interno della grande popolazione di mionuclei¹⁴. Il nostro studio è il primo a sviluppare un metodo per interrogare direttamente l'IMAT sezionato manualmente dal muscolo umano per la composizione cellulare utilizzando snRNA-seq.

È importante sottolineare che i protocolli per l'snRNA-seq devono essere personalizzati per il tessuto specifico studiato, poiché la quantità di tessuto disponibile e le proprietà fisiche del tessuto specifico determineranno le fasi di elaborazione ottimali. La resa tissutale per l'IMAT è in genere piccola, spesso non superiore a 50 mg, anche quando si eseguono biopsie ecoguidate. Pertanto, è essenziale una corretta lavorazione di questo tessuto scarso. Riteniamo che questo protocollo servirà come risorsa preziosa per i ricercatori che studiano l'IMAT umano.

Protocol

Il campione utilizzato per questo protocollo faceva parte dello Studio sui muscoli, la mobilità e l'invecchiamento (SOMMA)^15, che è stato approvato dal Western IRB-Copernicus Group (WCG) Institutional Review Board ed è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. I partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto per la loro partecipazione allo studio.

NOTA : Questo protocollo è adattato da un protocollo precedente che utilizza 100 mg di tessuto adiposo sottocutaneo addominale umano su una piattaforma basata su nanopozzetti¹⁶. L'attuale protocollo è ottimizzato per 50 mg di IMAT umano e la preparazione di librerie utilizzando una piattaforma basata su goccioline. Potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione di questo protocollo per l'isolamento di nuclei da IMAT non umano o da altri depositi adiposi.

1. Preparazione di tamponi e reagenti (Tabella 1 e Tabella 2)

NOTA: Preparare i tamponi freschi il giorno dell'esperimento e non riutilizzarli.

1. Preraffreddare una centrifuga a 4 °C.
2. Preparare il tampone di omogeneizzazione e il terreno di isolamento dei nuclei.
   1. Procurarsi due secchi di ghiaccio e preraffreddare 2 provette coniche da 15 mL.
   2. Miscelare tutti i reagenti per il tampone di omogeneizzazione (HB) in una provetta conica da 15 mL secondo l'ordine indicato nella Tabella 1. Mantenere il ghiaccio. Mescolare a vortice.
   3. Miscelare tutti i reagenti per il mezzo di isolamento dei nuclei (NIM) in una provetta conica da 15 mL nell'elenco ordinato nella Tabella 2. Mantenere il ghiaccio. Mescolare a vortice.
   4. Preparare il 10% di Triton-X aggiungendo 100 μL di Triton X-100 a 900 μL di acqua priva di nucleasi. Vortice per garantire una corretta miscelazione. Conservare a temperatura ambiente (RT).

Reagente	Volume (μL)		Concentrazione finale (mM)
	1x	2x
1 M MgCl2	10	20	5
1 M Tris tampone, pH 8,0	20	40	10
2 M KCl	25	50	25
1,5 M Saccarosio (-4oC)	334	668	250
1 mM DTT	2	4	0,001 (~1 μM)
100x inibitore della proteasi	20	40	1x
Superasin 20 U/μL	40	80	0,4 U/μL
Acqua priva di nucleasi	1549	3098	-
Volume totale	2000	4000	-

Tabella 1: Tampone di omogeneizzazione (HB). Mantenere il ghiaccio. Mescolare a vortice.

Reagente	Volume (μL)		Concentrazione finale (mM)
	1x	2x
EDTA	0.4	0.8	0.1
Inibitore dell'RNAsi di Ribolock (40U/μL)	40	80	0,8 U/μL
1% BSA-PBS (-/-)	1959.6	3919.2	-
Volume totale	2000	4000	-

Tabella 2: Mezzo di isolamento dei nuclei (NIM). Mantenere il ghiaccio. Mescolare a vortice.

2. Polverizzazione di tessuto congelato ( Figura 2A)

1. Impostare la workstation per l'omogeneizzazione.
   1. Riempire la bombola con azoto liquido (LN₂).
      ATTENZIONE: quando si lavora con LN_2, indossare sempre occhiali e guanti criogenici.
   2. Ottieni 2 mortai, 1 pestello, 1 spatola a micro-paletta, 1 bocchettone di vetro e 1 pestello in acciaio inossidabile per il douncer automatico.
   3. Impostare il douncer automatico.
   4. Riempi un bicchiere di ghiaccio e pre-raffredda il bicchierino.
2. Riempire i 2 mortai (contenenti il pestello e la spatola) con LN₂ per raffreddare gli strumenti. Lasciare evaporare l'LN₂ e ripetere.
3. Mentre gli strumenti si raffreddano, aggiungere 1 ml di HB alla lancia di vetro.
4. Riempire entrambi i mortai con LN₂ un'ultima volta e versare il campione IMAT da 50 mg in uno dei mortai.
5. Polverizzare l'IMAT usando il pestello premendolo delicatamente sul pezzo di tessuto per romperlo in piccoli pezzi. Assicurati che tutti i pezzi siano polverizzati.
6. L'LN₂ evaporerà lentamente polverizzando il tessuto. Quando il tessuto è adeguatamente polverizzato e sono rimasti ancora 1/4 - 1/2 di un mortaio di LN₂ , inclinare il mortaio verso il bordo del mortaio per raccogliere il tessuto polverizzato dal labbro. Lasciare evaporare completamente l'LN₂ .
7. Immediatamente dopo che l'ultimo LN₂ è evaporato, raccogliere il tessuto polverizzato nella bocchetta di vetro contenente 1 mL di HB.

3. Omogeneizzazione di tessuto polverizzato

1. Omogeneizzare il tessuto polverizzato utilizzando il douncer automatico. Portare il bicchiere su e giù per il pestello in acciaio inossidabile per 10 colpi in avanti, seguiti da 10 colpi in senso inverso.
2. Assicurarsi che la soluzione sia torbida dopo l'omogeneizzazione e non contenga pezzi di tessuto visibili. Spesso ci si aspetta un colore rosa chiaro a causa della contaminazione con il tessuto muscolare.
3. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta pre-raffreddata da 1,7 mL a basso legame su ghiaccio.
4. Utilizzare 400 μl di HB per sciacquare la lancia per assicurarsi che tutto il materiale sia trasferito e aggiungerlo alla provetta.
   NOTA: È possibile elaborare due campioni alla volta. Per fare ciò, raddoppia la quantità di HB e NIM. Polverizzare e omogeneizzare un campione di tessuto e subito dopo polverizzare e omogeneizzare il secondo campione di tessuto per poter eseguire le fasi di isolamento e pulizia in parallelo.

4. Isolamento e bonifica dei nuclei ( Figura 2B)

1. Aggiungere 14 μl di Triton-X (10%) all'omogenato per una concentrazione dello 0,1%.
2. Tenere il tubo sul ghiaccio e al buio per 10-15 minuti mentre si gira vorticosamente ogni 3 minuti.
3. Pre-bagnare un filtro cellulare da 100 μm e uno da 40 μm (per campione) con 100 μL di RT DPBS per ciascuno in una provetta conica da 50 mL.
4. Filtrare l'omogenato attraverso il filtro cellulare da 100 μm.
5. Sciacquare la provetta da 1,7 mL con 400 μL di HB e filtrare attraverso il filtro cellulare da 100 μm.
6. Quindi, filtrare la soluzione attraverso il filtro cellulare da 40 μm.
7. Trasferire una quantità uguale di soluzione in due provette pre-raffreddate da 1,7 mL a basso legame corrispondenti a ~900 μL in ciascuna provetta.
8. Centrifugare le provette per 10 minuti a 2700 x g a 4 °C. Dovrebbe esserci un piccolo pellet visibile dopo la centrifugazione.
9. Rimuovere ed eliminare lo strato lipidico superiore e il surnatante rimanente, lasciando ~50 μL di soluzione dalla prima provetta.
10. Ripetere per il secondo tubo.
11. Risospendere accuratamente il pellet nella prima provetta pipettandolo delicatamente su e giù 20 volte e trasferirlo in una nuova provetta a basso legame da 1,7 mL. Evita di creare bolle.
12. Ripetere questa procedura per la seconda provetta e trasferire la soluzione risoluta nella stessa provetta.
13. Aggiungere 500 μl di NIM e miscelare con il pipettaggio.
14. Centrifugare la provetta con una bilancia a 1000 x g per 10 minuti a 4 °C.
15. Rimuovere il surnatante, lasciando ~50 μL, e pipettare delicatamente su e giù fino a quando il pellet non viene risospeso. Facoltativamente, trasferire il pellet risospeso in un nuovo tubo pulito se rimane del residuo di lipidi sul lato del tubo.
16. Aggiungere 200 μl di NIM e miscelare mediante pipettaggio.

5. Colorazione e conteggio dei nuclei (Figura 2C e Figura 3)

NOTA : Per facilitare il conteggio, impostare un protocollo di "conteggio dei nuclei" su un contatore automatico di cellule, poiché la regolazione del campo luminoso e dei canali DAPI può influire notevolmente sul conteggio. Regolare i canali in modo che vengano catturati solo i nuclei e non i detriti. Assicurarsi che il canale del campo chiaro contrassegni solo gli "oggetti" che presentano anche una macchia DAPI.

1. Aggiungere 1 goccia della soluzione di colorazione per cellule vive e lasciarla al buio, con ghiaccio, per 15 minuti.
2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 30 μm.
3. Miscelare la soluzione di nuclei mediante pipettaggio e aggiungere 10 μl della soluzione a un vetrino della camera di conteggio delle cellule.
4. Conta i nuclei utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
   NOTA: La concentrazione ottimale è di 1000 nuclei/μL corrispondenti a 1,0 x 10⁶/mL.
   1. Assicurarsi che non siano presenti grumi di nuclei, in quanto ciò potrebbe ostruire il chip per la generazione di goccioline di singoli nuclei (Figura 3).
   2. Se la concentrazione dei nuclei non è sufficientemente alta, centrifugare la soluzione a 1000 x g per 10 minuti a 4 °C per ottenere una pelletta, rimuovere il surnatante e risospendere in un volume più piccolo.
   3. Se il grado di detriti nella soluzione è elevato, risospendere la soluzione di nuclei in un volume maggiore di NIM (cioè 1 mL) e filtrare nuovamente attraverso un filtro cellulare da 30 μm. Quindi centrifugare a 1000 x g per 10 minuti a 4 °C e risospendere in volume appropriato in relazione alla concentrazione dei nuclei.
5. Dopo aver ottenuto la concentrazione dei nuclei, procedere direttamente alla prima fase della preparazione della libreria.

Figura 3: Colorazione di nuclei isolati. Immagine dal contatore cellulare dei nuclei colorati con NucBlue/DAPI (immagine a sinistra) e la corrispondente immagine in campo chiaro (immagine a destra). La presenza di piccole quantità di detriti è evidente nell'immagine in campo chiaro. Il contatore automatico di celle utilizzato qui non dispone di un'opzione per includere le barre della scala. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Parametri di preparazione e sequenziamento della libreria

1. Fare riferimento a un protocollo completo per la preparazione della libreria utilizzando l'approccio a nuclei singoli basato su goccioline disponibile sulla pagina web¹⁷ del fornitore.
   1. Puntare a un recupero mirato di 10.000 nuclei. Tuttavia, per i campioni con un alto livello di detriti o nuclei fragili, ci si aspetterebbe un numero inferiore di nuclei recuperati.
   2. Conservare i campioni a 4°C per un massimo di 72 ore dopo il passaggio 2.3. nel protocollo di preparazione della libreria per combinare l'elaborazione di più campioni in parallelo. A tale scopo, elaborare due campioni fino al passaggio 2.3 per due giorni consecutivi e il terzo giorno elaborare i 4 campioni insieme dal passaggio 3 in avanti nel protocollo di preparazione della libreria.
2. Parametri di sequenziamento: Sequenza su una piattaforma di sequenziamento che mira a 50.000 letture paired-end per nucleo.
   NOTA: I dati presentati in questo protocollo sono stati sequenziati sulla piattaforma NovaSeq 6000, con l'obiettivo di 50.000 letture paired-end per nuclei.

Figura 2: flusso di lavoro del protocollo. Illustrazione schematica del flusso di lavoro nei passaggi 2 e 3 (A), 4 (B) e 5 (C) del protocollo. La figura è stata creata con BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Elaborazione e analisi dei dati

NOTA : In questo protocollo, vengono brevemente introdotti alcuni dei software e dei pacchetti R consigliati utilizzati per elaborare i dati di sequenziamento risultanti, concentrandosi sui passaggi successivi alla pre-elaborazione iniziale (Tabella 3). Questo studio fornisce metriche generali di controllo della qualità (QC) e un esempio di approssimazione e proiezione uniforme del manifold (UMAP) nella Figura 4. Tuttavia, una descrizione approfondita dell'analisi bioinformatica esula dall'ambito di questo protocollo. Pertanto, i lettori possono fare riferimento alla recente revisione sulle migliori pratiche per l'analisi di singole cellule di Heumos et ^al.18.

1. Pre-elaborazione dei dati di sequenziamento
   1. Mappare i singoli nuclei letti nel genoma di riferimento umano GRCh38.
   2. Includi le letture dell'introne nel conteggio.
2. Eseguire il controllo qualità e il filtraggio dei dati utilizzando il pacchetto Seurat R ¹⁹.
   1. Calcola un punteggio di complessità cellulare dividendo il numero log(10) di geni rilevati per il numero log(10) di letture rilevate.
   2. Traccia le metriche QC più importanti utilizzando un istogramma o un grafico a violino, incluso il numero di geni rilevati per nucleo, la percentuale di lettura mitocondriale e il punteggio di complessità cellulare.
   3. Filtra i nuclei con meno di 200 o più di 10.000 geni per nucleo, più del 10% di letture mitocondriali e un punteggio di complessità inferiore a 0,8.
3. Normalizza i dati ed esegui la riduzione della dimensionalità.
   1. Utilizzare la funzione SCTransform di Seurat per normalizzare i dati utilizzando 2000 funzioni variabili.
   2. Raggruppare i dati usando le funzioni seguenti del pacchetto Seurat R: RunPCA, FindNeighbors, FindClusters e RunUMAP.
   3. Tracciare un UMAP per visualizzare il clustering dei dati.
4. Filtra i doppietti previsti utilizzando il pacchetto DoubletFinder R ²⁰ e raggruppa nuovamente i dati.
5. Annotare i cluster utilizzando marcatori genici noti dei tipi di cellule che si prevede siano presenti nel tessuto (approccio supervisionato) o in base ai primi 5 geni differenzialmente espressi tra i cluster (approccio non supervisionato).
6. Utilizzare decontX²¹per determinare il grado di contaminazione dell'RNA ambientale e per regolare la matrice di espressione genica per l'RNA ambientale.
   1. Includi la matrice genica grezza come sfondo.
7. Salvare l'oggetto Seurat per l'esplorazione futura dei dati.
   NOTA: Il codice per l'analisi QC e clustering è disponibile nel file supplementare 1.

Pacchetti software/R utilizzati nel flusso di lavoro dei dati	Software/pacchetti alternativi	Fase di lavorazione
CellRanger	STARsolo, kallisto	Ritaglio, allineamento, mappatura
Seurat	SingleCellExperiment, Cellranger	Controllo qualità, analisi ed esplorazione dei dati
DoubletFinder	scds, scdblFinder, Scrublet	Rilevamento doppietto
DecontX	ZuppaX, CellBender	Regolazione dell'RNA ambientale

Tabella 3: Software/strumenti per il flusso di lavoro dei dati.

Results

Questo flusso di lavoro è stato progettato per guidare l'elaborazione di campioni IMAT umani congelati per ottenere profili di espressione genica con risoluzione di singoli nuclei, consentendo l'identificazione del tipo di cellula. Qui viene presentato un campione IMAT rappresentativo di un partecipante allo studio SOMMA.

Il primo passo di qualsiasi analisi dei dati snRNA-seq è valutare la qualità dei dati per identificare i nuclei di scarsa qualità, che dovrebbero potenzialmente essere rimossi dal set di dati. È importante sottolineare che i passaggi e le soglie di filtraggio dovrebbero essere determinati per il tipo specifico di campione e set di dati che hai in mano, poiché le metriche comunemente valutate possono differire tra tessuti e tipi di cellule^22,23. La Figura 4A fornisce immagini di alcune delle metriche chiave utilizzate per valutare la qualità dei dati snRNA-seq generati. Il numero di geni rilevati per nucleo dipende dalla profondità di sequenziamento e dal tipo di cellula, ma ci si aspetterebbe che sia superiore a 200 per nuclei di buona qualità^18,23. È stato riscontrato che i dati generati utilizzando questo protocollo rientrano nell'intervallo previsto con una mediana di 1134 geni per nucleo, su un totale di 4662 nuclei.

La percentuale di letture mitocondriali viene valutata poiché un alto grado di contaminazione mitocondriale può derivare da nuclei danneggiati o da RNA ambientale che si attacca ai nuclei, indicando nuclei di scarsa qualità. Nel set di dati qui presentato, è stata trovata una percentuale mediana di lettura mitocondriale di 2,65, che è ben al di sotto della soglia del 5%-20% comunemente utilizzata in letteratura 24,25,26. La percentuale di reads ribosomiali varia a seconda dei tipi di cellule e dei tessuti. Tuttavia, poiché grandi proporzioni di geni ribosomiali possono influenzare il raggruppamento dei dati, si raccomanda di controllare la percentuale di lettura ribosomiale e potenzialmente rimuovere i geni ribosomiali o i nuclei con alti livelli di geni ribosomiali dal set di dati prima del clustering. I dati generati con questo protocollo hanno mostrato un basso livello di letture ribosomiali con una mediana del 2,46% e un massimo del 16,5% e, pertanto, non abbiamo filtrato in base a questa metrica. Infine, è stato calcolato un punteggio di complessità cellulare in base al numero log(10) di geni rilevati diviso per il numero log(10) di reads rilevate. Si prevede che i nuclei di buona qualità siano superiori a 0,8 e una mediana di 0,92 è stata ottenuta nel campione utilizzato in questo studio. Sulla base di queste metriche di controllo qualità, è possibile decidere quali nuclei filtrare dal set di dati. Per l'analisi, abbiamo scelto di filtrare i nuclei con meno di 200 o più di 10.000 geni per nucleo, più del 10% di letture mitocondriali e un punteggio di complessità inferiore a 0,8.

Dopo la fase iniziale di valutazione della qualità e di filtraggio, è possibile generare un UMAP per visualizzare il clustering dei nuclei. Il clustering è stato eseguito sulla base dei 2000 geni più variabili utilizzando la trasformazione SCT. Le fasi iniziali del clustering possono essere utilizzate per verificare se una qualsiasi delle caratteristiche del controllo qualità si raggruppa, ad esempio nuclei con letture mitocondriali elevate. Inoltre, le informazioni di clustering sono necessarie per alcuni metodi di rilevamento del doppietto, tra cui DoubletFinder²⁰, che è stato utilizzato in questo protocollo. DoubletFinder è stato utilizzato con un tasso di multipletto previsto impostato al 4,8%, come suggerito dai fornitori della piattaforma basata su droplet. Dopo la rimozione del doppietto, è stato stimato il livello di contaminazione dell'RNA ambientale, che è particolarmente comune nelle preparazioni a singolo nucleo, poiché l'RNA viene rilasciato dal citoplasma dopo la lisi cellulare e viene dispensato nelle Gel Beads-in-emulsion (GEM) e amplificato nelle successive fasi di preparazione della libreria. Pertanto, sono stati sviluppati diversi strumenti per correggere il problema intrinseco della contaminazione dell'RNA ambientale (vedi Tabella 3). Abbiamo utilizzato il pacchetto R decontX^21, in cui la matrice di fondo grezza (comprese solo le goccioline vuote) viene utilizzata per regolare la matrice di espressione genica, migliorando la firma di espressione genica reale.

Il raggruppamento e la capacità di rilevare tipi di cellule poco abbondanti dipendono dal numero di nuclei. Questo studio ha rilevato tutti i principali tipi di cellule attesi in IMAT (Figura 4B) da un totale di 3817 nuclei dopo il filtraggio QC, la rimozione del doppietto e l'aggiustamento dell'RNA ambientale. Questi includevano cellule staminali, progenitori fibro-adipogenici (FAP) e adipociti maturi, nonché periciti, cellule muscolari lisce, cellule immunitarie, cellule progenitrici muscolari e mionuclei derivanti dalla contaminazione delle cellule muscolari scheletriche.

Nel complesso, abbiamo dimostrato che questo protocollo produce dati a singolo nucleo ad alta risoluzione che consentono il rilevamento dell'annotazione del tipo di cellula, importante per svelare la biologia e le origini cellulari di IMAT.

Figura 4: Valutazione della qualità, clustering e annotazione del tipo di cellula dei dati di sequenziamento. (A) Diagrammi a violino delle metriche essenziali per la valutazione del campione e delle prestazioni di sequenziamento, tra cui il numero di geni rilevati per nucleo, la percentuale di letture mitocondriali, la percentuale di letture ribosomiali e la complessità cellulare misurata come il numero log(10) di geni rilevati diviso per il numero log(10) di letture rilevate. I valori mediani per ogni metrica sono indicati in caselle chiuse. Numero totale di nuclei: 4662. (B) UMAP che mostra il clustering dei singoli nuclei e il corrispondente DotPlot che mostra l'espressione genica relativa dei geni marcatori del tipo di cellula per ciascun cluster dopo il filtraggio. Numero di nuclei: 3817. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Il codice per l'analisi QC e clustering. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

La collaborazione con IMAT presenta diverse sfide intrinseche. Oltre alla sua limitata accessibilità, la resa del materiale campione è spesso molto scarsa e la "contaminazione" del muscolo scheletrico è quasi impossibile da evitare. Per ottenere il campione della migliore qualità, è necessario penetrare la fascia muscolare quando si inserisce l'ago da biopsia (per assicurarsi di non raccogliere tessuto adiposo sottocutaneo) e rimuovere quanto più tessuto muscolare possibile sezionando il campione al microscopio subito dopo la raccolta, seguito da una successiva elaborazione per istologia, congelamento rapido, ecc. Questo è il primo metodo per utilizzare campioni IMAT raccolti e sezionati in modo prospettico dal muscolo scheletrico. In confronto, i precedenti dati di snRNA-seq nell'IMAT sono stati ottenuti attraverso l'isolamento dei nuclei di una miscela di biopsie del muscolo scheletrico con infiltrazione di grasso nota e non del solo IMAT.

L'IMAT è di natura più densa rispetto ai tessuti adiposi sottocutanei, rendendo la corretta polverizzazione del tessuto durante l'isolamento dei nuclei essenziale per rilasciare i nuclei dalla struttura del tessuto. Una polverizzazione impropria può portare a una minore resa dei nuclei, che è sfavorevole con una quantità limitata di tessuto. Inoltre, il calcolo del numero corretto di nuclei nella soluzione di nuclei preparata è un passaggio fondamentale per garantire un numero sufficiente (ma non eccessivo) di nuclei da caricare sul chip per la generazione di GEM. Troppi nuclei, o la presenza di grandi ammassi di nuclei o detriti, possono provocare un intasamento, influenzando la concentrazione finale di cDNA e, in ultima analisi, l'output del sequenziamento. Eludere l'aggregazione dei nuclei e i detriti nella preparazione dei singoli nuclei è difficile e influisce sulla qualità del campione. L'aggregazione dei nuclei e/o la presenza di detriti possono essere ridotti includendo un ulteriore passaggio di filtraggio con il filtro a celle da 30 μm.

È importante elaborare rapidamente i campioni per ridurre il rischio di degradazione dell'RNA. Mantenere le soluzioni su ghiaccio o raffreddate durante tutte le possibili fasi di isolamento dei nuclei, così come l'aggiunta di una quantità sufficiente di inibitori dell'RNAsi, può ridurre al minimo la degradazione. Data l'importanza del tempo di elaborazione per ogni campione, si consiglia di eseguire un massimo di due campioni alla volta. Inoltre, la soluzione dei nuclei deve essere maneggiata con cura per non rendere i nuclei troppo fragili. I nuclei fragili sono suscettibili di scoppiare durante la generazione di GEM, che può portare a grandi quantità di RNA ambientale nel campione. In questo protocollo, la fase di filtraggio con una siringa (descritta nel protocollo STAR¹⁶) è stata esclusa per preservare l'integrità dei nuclei.

La scelta del metodo di preparazione della biblioteca dipende dalla domanda di ricerca. Abbiamo lavorato sia con un approccio a singolo nucleo basato su goccioline che su nano-pozzi. L'approccio basato su nano-pozzi profila 1200-1600 nuclei e circa 3000-6000 geni rilevati per nuclei¹⁶. Inoltre, questo approccio supporta la trascrittomica a lunghezza intera, che consente lo studio della variazione strutturale, degli pseudo-geni e delle varianti di splicing²⁷. In confronto, più di 10.000 nuclei possono essere profilati utilizzando l'approccio basato su goccioline, ma a scapito di un numero inferiore di geni rilevati per nucleo (2-3 volte inferiore). Per questo protocollo, abbiamo scelto di utilizzare una delle piattaforme basate su droplet poiché il maggior numero di nuclei profilati ci dà una maggiore capacità di rilevare tipi di cellule rare con una bassa abbondanza²⁸.

Il principale limite di snRNA-seq è la perdita di contenuto citosolico, che limita l'analisi dell'espressione ai trascritti nucleari. Il nucleo contiene 10-100 volte meno mRNA rispetto a quello dell'intera cellula²⁹, il che potrebbe essere preoccupante per la scoperta di tutti i tipi di cellule in un tessuto. Tuttavia, un recente studio di Gupta et al. ha scoperto che la trascrittomica nucleare, rispetto alla trascrittomica a cellule intere²⁹, ha rilevato popolazioni cellulari e profili di espressione simili di geni biologicamente rilevanti nei preadipociti in coltura e negli adipociti maturi. Risultati simili sono stati trovati in altri tipi di cellule ^30,31.

L'isolamento di singoli nuclei ha i suoi vantaggi nel fornire modelli di espressione genica di risoluzione di singole cellule (sc) di cellule fragili incompatibili con scRNA-seq. Inoltre, possono essere utilizzati campioni di biobanche congelati e l'isolamento dei nuclei non richiede la digestione enzimatica del tessuto, che può indurre una risposta allo stress nelle cellule, influenzando il trascrittoma³². Utilizzando snRNA-seq, siamo stati in grado di profilare trascrizionalmente gli adipociti e altri tipi di cellule presenti in IMAT, cosa che non sarebbe possibile con scRNA-seq a causa del fatto che gli adipociti sono carichi di lipidi e sono incompatibili con l'approccio basato su goccioline.

Un'importante applicazione dell'snRNA-Seq di IMAT è quella di decifrare la composizione cellulare e le differenze trascrizionali di IMAT in diversi stati metabolici. Inoltre, i set di dati snRNA-seq possono essere utilizzati per deconvoluzione di RNA-seq di massa su IMAT per valutare le differenze di composizione cellulare su scala più ampia³³. Inoltre, l'analisi pseudo-temporale dei dati snRNA-seq può servire a identificare le traiettorie di maturazione cellulare, che è di particolare interesse in tessuti come l'IMAT, in cui le origini cellulari degli adipociti maturi sono ancora dibattute.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 µ m Filtri per siringhe Corning	Millipore Sigma	CLS431229
1,7 mL Provette DNA LoBind	Eppendorf	22431021	provette a basso legame
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100x inibitore della proteasi	Thermo Fisher Scientific	78437
10X Separatore magnetico	10X Genomics	230003
10X Vortex Adapter	10X Genomics
15 mL provette canoniche	Sarstedt	6,25,54,502
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
provette coniche da 50 mL	Sarstedt	6,25,47,254
CellRanger	Genomics	N/A
Kit di accessori Chromium iX	10X Genomics	PN1000323
Chromium iX Controller	10X Genomics	PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Kit a cellula singola	10X Genomics	PN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit di perline in gel v3.1	10X Genomics	PN1000129
Chromium Next GEM Kit GEM a cellula singola v3.1	10X Genomics	PN1000130
Countess 3 Contatore di cellule automatizzato	Thermo Fisher Scientific	AMQAX2000	Contatore di cellule automatizzato
Countess Countess Contatori per camera di conteggio delle cellule	Thermo Fisher Scientific	C10228
DoubletFinder	R	N/A
DPBS (senza calcio, senza magnesio)	Thermo Fisher Scientific	14190144
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
Kit a doppio indice TT Set A, 96 rxns	10X Genomica	PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE	10X Genomics	PN2000048
Falcon 100 µ m Filtro cellulare	Corning Life Science	352360
Falcon 40 µ m Filtro cellulare	Corning Life Science	352340
Glicerina (glicerolo), 50% (v/v) Soluzione acquosa	Ricca Chemical Company	3290-32
KCL	Thermo Fisher Scientific AM9640G
Kit di costruzione della libreria v3.1	10X Genomics	PN1000196
MACS SmartStrainers (30µ m)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler	Eppendorf	6331000017
MgCl2	Ambion	AM9530G
Mortaio e pestello	Logistica sanitaria	14075
NucBlue Live Ready Probes Reagente	Thermo Fisher Scientific	R37605
Acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC)	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Probumin Siero bovino Albumina senza acidi grassi, polvere	Sigma-Aldrich	820024
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Inibitore dell'RNAsi Ribolock	Thermo Fisher Scientific	EO0382
Seurat	R	N/A
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389
SUPERasin 20 U/µ L	Thermo Fisher Scientific	AM2695
ThermoMixer C	Eppendorf
Omogeneizzatore tissutale	Glass-Col	099C K54
Tris tampone pH 8.0	Thermo Fisher Scientific AM9855G
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	AC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0	Gibco	15575020