Valutazione del recupero funzionale dell'attività del diaframma eupneico dopo emisezione unilaterale del midollo spinale cervicale nei ratti

Sommario

Le complicanze respiratorie sono la principale causa di morte nei soggetti con lesione del midollo spinale cervicale (cSCI). I modelli animali di cSCI sono essenziali per le valutazioni meccanicistiche e gli studi preclinici. Qui, introduciamo un metodo riproducibile per valutare il recupero funzionale dell'attività del muscolo diaframma (DIAm) dopo emisezione spinale C₂ unilaterale (C₂SH) nei ratti.

Abstract

Dopo la cSCI, l'attivazione del DIAm può essere influenzata a seconda dell'entità della lesione. Il presente manoscritto descrive un modello unilaterale di emisezione C₂ (C₂SH) di cSCI che interrompe l'attività elettromiografica (EMG) del diaframma omolaterale eupnico (iDIAm) durante la respirazione nei ratti. Per valutare il recupero del controllo motorio della DIAm, è necessario innanzitutto stabilire chiaramente l'entità del deficit dovuto al C₂SH. Verificando una perdita iniziale completa di iDIAm EMG durante la respirazione, il recupero successivo può essere classificato come assente o presente e l'entità del recupero può essere stimata utilizzando l'ampiezza dell'EMG. Inoltre, misurando la continua assenza di attività EMG iDIAm durante la respirazione dopo il periodo di shock spinale acuto successivo a C₂SH, il successo del C₂SH iniziale può essere convalidato. La misurazione dell'attività EMG del diaframma controlaterale (cDIAm) può fornire informazioni sugli effetti compensatori del C₂SH, che riflette anche la neuroplasticità. Inoltre, le registrazioni EMG DIAm di animali svegli possono fornire informazioni fisiologiche vitali sul controllo motorio del DIAm dopo C₂SH. Questo articolo descrive un metodo per un modello C₂SH rigoroso, riproducibile e affidabile di cSCI nei ratti, che è un'eccellente piattaforma per lo studio della neuroplasticità respiratoria, dell'attività compensatoria del cDIAm e delle strategie terapeutiche e farmaceutiche.

Introduzione

Ci sono più di 300.000 individui con lesione del midollo spinale (SCI) negli Stati Uniti, circa la metà dei quali ha lesioni cervicali¹. Queste lesioni provocano una significativa perdita di benessere e mettono a dura prova gli individui, le loro famiglie e il sistema sanitario. Fortunatamente, la maggior parte delle lesioni del midollo spinale sono incomplete, fornendo il potenziale per il rafforzamento dei percorsi risparmiati¹. Questa neuroplasticità può consentire il recupero di almeno alcune funzioni, inclusa l'attività DIAm, che è importante per i comportamenti ventilatori e non ventilatori. Pertanto, la promozione della neuroplasticità è una strada promettente di ricerca per aiutare le persone con lesione^{midollare 2}.

I modelli di roditori di lesione midollare hanno il potenziale per contribuire in modo sostanziale alla scoperta di trattamenti per migliorare la salute umana. Uno dei modelli classici di LM utilizzati per studiare la neuroplasticità è una transezione unilaterale (emisezione) del midollo spinale a C₂ (C₂SH), che lascia intatto il lato controlaterale ^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}. L'effetto del C₂SH sulla produzione frenica e l'importanza di risparmiare le vie controlaterali sono state rivelate per la prima volta oltre cento anni fa da Porter¹², il cui articolo seminale ha gettato le basi per gli studi moderni sulla neuroplasticità respiratoria. Il modello C₂SH interrompe gli input discendenti dal gruppo respiratorio ventrale rostrale (rVRG) nel midollo, che contiene i neuroni premotori responsabili della trasmissione dell'output della generazione del ritmo respiratorio¹⁴. Questi neuroni premotori rVRG trasmettono anche l'impulso neurale eccitatorio ai motoneuroni frenici (Figura 1). Diversi ricercatori hanno adottato approcci diversi al modello C₂SH 10,11,15,16, il che può in parte spiegare parte della variabilità nel recupero tra gli studi. In breve, gli approcci variano in termini di risparmio dei funicoli dorsali, esecuzione di un'emisezione completa o esecuzione di una transezione parziale laterale che non interrompa completamente gli input discendenti dall'rVRG omolaterale. In generale, i modelli C₂SH sono particolarmente utili per lo studio della neuroplasticità respiratoria a causa dei tassi di recupero spontaneo dell'attività elettromiografica (EMG) dell'iDIAm eupneica nel tempo, che può essere migliorata da diversi fattori, tra cui la segnalazione neurotrofica 17,18,19,20,21. Tuttavia, una perdita iniziale di funzione, definita come il silenziamento dell'attività eupneica iDIAm EMG, deve essere stabilita prima che il recupero possa essere chiaramente classificato. Questa convalida dell'inattività al momento del C₂SH non viene effettuata in diversi studi 3,4,6,7,11,22,23.

Le valutazioni istologiche del midollo spinale asportato forniscono solo l'evidenza di un danno alla posizione appropriata delle vie bulbospinali eccitatorie omolaterali che innervano i motoneuroni frenici nel midollo spinale, ma l'istologia non sostituisce l'evidenza fisiologica (ad esempio, DIAm EMG). Inoltre, le valutazioni istologiche vengono eseguite in ex vivo in momenti terminali (spesso da diverse settimane a mesi dopo l'infortunio) e non forniscono informazioni "in tempo reale". Alcuni ricercatori hanno notato che l'entità della lesione è correlata alla quantità di deficit funzionale o alla sua mancanza 5,24,25,26. È importante notare che la validità di tali affermazioni dipende probabilmente fortemente da come viene classificata la "funzione" (cioè, quali sono i compiti funzionali e come vengono quantificati), e la variabilità tra gli studi evidenzia la difficoltà di produrre lesioni funzionalmente identiche tra gli animali. In effetti, i ricercatori hanno sottolineato che la relazione tra l'entità della lesione e la funzione locomotoria dei muscoli degli arti (quantificata dal punteggio di Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)²⁴) non è lineare^27,28. In studi precedenti, non abbiamo trovato alcuna relazione tra l'entità del C₂SH e l'entità del recupero dell'attività EMG eupneica iDIAm post-lesione 10,29,30,31, sebbene altri ricercatori abbiano riportato una relazione tra la funzione ventilatoria e l'entità della sostanza bianca che risparmia ⁵. Pertanto, nel caso del modello C₂SH, un approccio per la convalida funzionale dell'inattività di iDIAm al momento dell'intervento chirurgico e preferibilmente all'inizio del decorso temporale degli esperimenti di lesione cronica del midollo spinale è sia vantaggioso che necessario.

Il presente articolo sottolinea l'uso di DIAm EMG per la conferma in tempo reale della perdita iniziale di DIAm EMG durante la respirazione dopo il C₂SH, nonché per successive valutazioni di conferma a 3 giorni (Giorno 3) dopo l'infortunio 18,21,31,32,33. In precedenti lavori con il modello C₂SH, sono state eseguite laparotomie ripetute per registrare DIAm EMG 10,13,30,34. Tuttavia, lavori più recenti hanno utilizzato elettrodi EMG cronici, che consentono la registrazione dell'EMG in ratti anestetizzati e svegli. Inoltre, gli elettrodi cronici riducono il rischio di pneumotorace e non richiedono laparotomie ripetute, che possono causare l'inibizione del DIAm ^35,36. Sebbene le versioni del modello C₂SH siano state utilizzate da molti ricercatori, la conferma del silenziamento dell'attività di iDIAm non è stata fatta al momento dell'intervento^chirurgico 3,4,6,7,11,22,23. Senza una tale conferma di inattività, è difficile sapere quale parte del successivo recupero attribuire alla neuroplasticità delle vie omolaterali rispetto a quelle controlaterali, che possono avere impatti differenziali. Questa è una considerazione importante perché l'unità neurale inspiratoria dall'rVRG ai motoneuroni frenici è principalmente omolaterale, con una perdita di circa il 50% degli input glutammatergici eccitatori ai motoneuroni frenici dopo C₂SH³³. Tuttavia, ci sono rimanenti input eccitatori inspiratori dall'rVRG controlaterale che decussano al di sotto del sito della lesione per innervare i motoneuroni frenici omolaterali e possono essere rafforzati attraverso la neuroplasticità per promuovere il recupero funzionale. Rimuovendo l'input eccitatorio omolaterale predominante ai motoneuroni frenici, l'attività eupneica dell'iDIAm EMG viene persa (almeno sotto anestesia), mentre l'attività del cDIAm continua e viene persino migliorata. La perdita di attività dell'iDIAm EMG durante la respirazione è quindi una misura del successo di un C₂SH (Figura 2).

Un certo livello di attività EMG iDIAm è presente già 1-4 giorni dopo C₂SH negli animali svegli^23,37. Inoltre, negli animali decerebrati, l'attività di iDIAm è presente da pochi minuti a ore dopo l'emisezione cervicale superiore ed è soppressa dall'anestesia³⁸. Inoltre, il successo del C₂SH è convalidato dalla conferma dell'assenza di attività EMG iDIAm durante la respirazione (eupnea) nei ratti anestetizzati il giorno 3 dopo l'infortunio. Studi di imaging confocale hanno confermato la perdita di input sinaptici glutammatergici sui motoneuroni frenici durante questa fase iniziale della lesione³⁷. Al 3° giorno dopo l'infortunio, se c'è una qualsiasi attività EMG eupneica residua, questa viene interpretata come prova di rimozione incompleta dell'unità inspiratoria discendente omolaterale dall'rVRG. Il presente articolo è diviso in tre sezioni: (1) registrazioni croniche di DIAm EMG, (2) C₂SH e (3) acquisizione di dati EMG in animali svegli e anestetizzati. Questo protocollo descrive un modello C₂SH rigoroso, riproducibile e affidabile di cSCI nei ratti, che è un'eccellente piattaforma per lo studio della neuroplasticità respiratoria, dell'attività compensatoria del cDIAm e delle strategie terapeutiche e farmaceutiche.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic (numero di protocollo: A00003105-17-R23). Gli animali nel presente studio erano un mix di ratti Sprague-Dawley maschi e femmine di circa 3 mesi di età e di peso compreso tra 200 g e 350 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Impianto di elettrodi

1. Preparazione degli elettrodi
   1. Assicurarsi che l'attrezzatura menzionata sia disponibile: (1) filo di acciaio inossidabile multifilare, (2) bisturi con lama #11, (3) forbici, 4) microscopio da dissezione, (5) righello, (6) pinze, (7) aghi da 25 g, (8) 2 pinze (almeno una con una zona di crimpatura).
   2. I dettagli del processo di produzione degli elettrodi sono mostrati nella Figura 3. Ripetere questa procedura almeno due volte per gli elettrodi di registrazione differenziale accoppiati.
   3. Per prima cosa, misura e taglia 18 cm di filo di acciaio inossidabile.
   4. Fare un nodo base a rovescio a 4 cm da un'estremità del filo, come mostrato nella Figura 3; questo servirà come ancoraggio quando il lato corto del filo viene impiantato e suturato nel DIAm.
   5. Utilizzando un bisturi e un cannocchiale da dissezione chirurgica, rimuovere accuratamente 2 mm di isolamento immediatamente adiacenti al nodo sul lato più corto del filo. Prestare molta attenzione a non tagliare i fili del filo multifilare.
      NOTA: Questa parte non isolata funge da superficie conduttiva dell'elettrodo. In genere, la qualità del segnale inizia a degradarsi se tre o più fili vengono tagliati inavvertitamente e, in tal caso, l'elettrodo viene sostituito.
   6. Successivamente, spellare ~5 mm dall'estremità del lato corto del filo, che viene poi inserito nel lume di un ago da 25 G per creare uno strumento simile a un filo di sutura che verrà utilizzato per impiantare l'elettrodo nel DIAm.
      NOTA: A seconda delle preferenze personali, possono essere utilizzati anche aghi di calibro superiore (ad es. fino a 28 G). A causa del diametro più sottile degli aghi di calibro superiore, il rischio di pneumotorace può potenzialmente essere ridotto. Tuttavia, potrebbe anche essere più difficile inserire i fili multifilari nel lume più piccolo dell'ago.
   7. Per fare ciò, rimuovi un ago da 25 G dalla sua confezione e, usando entrambe le pinze, piega con cura l'ago a ~1 cm dall'estremità affilata smussata da un lato all'altro fino a quando non si rompe.
      NOTA: Questo processo non deve essere affrettato; In caso contrario, le forze di taglio possono causare la chiusura del lume dell'ago, richiedendo la ripetizione del processo.
   8. Inserire l'estremità spelata del filo nel lume dell'ago rotto da 1 cm, assicurandosi che l'ago poggi immediatamente adiacente alla parte isolata rimanente del filo.
   9. Assicurandosi che non vi sia alcuna parte non isolata tra l'ago e il lato più corto rimanente del filo, crimpare l'ago per collegarlo al filo.
   10. Quindi, usa le due pinze per piegare con cura l'ago attaccato per dargli una curvatura simile a quella di un ago da sutura chirurgico standard.
   11. Infine, spelare ~5 mm dall'estremità del lato lungo del filo (Figura 3). Dopo che gli elettrodi sono stati suturati nel DIAm, il lato lungo del filo verrà tunnellizzato per l'accesso esterno per consentire le registrazioni EMG DIAm.
   12. Ripetere il processo per creare un secondo elettrodo per le registrazioni differenziali.
2. Posizionamento dell'elettrodo EMG a membrana
   1. Prima dell'intervento chirurgico, sterilizzare o sterilizzare in autoclave tutte le apparecchiature chirurgiche, tra cui (1) tagliacapelli per piccoli animali, (2) bisturi con lama #11, (3) forbici chirurgiche, (4) pinze e (5) porta micro-aghi.
   2. Acquisisci una gabbia pulita e fornisci cibo, acqua, lettiera e arricchimento ambientale. Mettere da parte su un termoforo. Questa gabbia servirà per alloggiare l'animale dopo l'intervento chirurgico.
   3. Sterilizzare il campo operatorio con disinfettante idoneo e indossare dispositivi di protezione individuale (camici, cuffie, mascherina e guanti chirurgici). Mettere gli elettrodi precedentemente preparati in una pozza di alcol isopropilico al 70%.
   4. Posizionare un termoforo nell'area chirurgica per mantenere la temperatura corporea del ratto durante l'anestesia e l'intervento chirurgico. Coprire il termoforo con un asciugamano chirurgico sterilizzato.
   5. Pesare il ratto e calcolare il dosaggio appropriato dell'anestetico in base alle linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
   6. Anestetizzare il ratto con un'iniezione intramuscolare degli arti posteriori di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) o altro anestetico appropriato (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Iniettare buprenorfina a rilascio prolungato (1 mg/kg) e carprofene (5 mg/kg) prima dell'intervento. Procedi quando l'animale non risponde più al pizzicamento delle dita.
   7. Usa le tosatrici per radere il ratto dal processo xifoideo a circa metà strada fino agli arti posteriori. Inoltre, radere la parte posteriore del ratto dove gli elettrodi saranno esternalizzati oltre la portata dell'animale (di solito intorno alle scapole). Pulisci i peli in eccesso con un pezzo di garza.
   8. Preparare la pelle per l'incisione pulendola con una garza sterile imbevuta di clorexidina gluconato (4% peso/volume).
   9. Posizionare l'animale in posizione supina sul termoforo sterilizzato. Partendo dal processo xifoideo, utilizzare il bisturi e una lama #11 pulita per praticare un'incisione rostrocaudale di 4-5 cm. Questo dovrebbe esporre gli strati muscolari addominali sottostanti.
   10. Praticare un'altra incisione (3-4 cm) lungo la linea mediana negli strati muscolari per esporre il contenuto addominale. Fare attenzione a non tagliare gli organi addominali.
   11. Assicurarsi che la superficie addominale (cioè inferiore) del DIAm sia visibile, anche se il lato destro dell'animale sarà oscurato dal fegato.
   12. Usando il manico di un bisturi o un altro strumento contundente, spingere verso il basso il fegato e altri organi per esporre il lato addominale del DIAm.
   13. Preparare l'elettrodo per l'uso rimuovendolo dalla pozza di alcol isopropilico e lavandolo con soluzione fisiologica sterile. Quindi, utilizzando un supporto per micro-aghi, orientare uno degli elettrodi precedentemente preparati perpendicolarmente alle fibre muscolari nella regione medio-costale del DIAm. Le fibre muscolari si diffondono radialmente attraverso il DIAm.
       NOTA: Il diametro è sottile (~2 mm) e non deve essere forato. Piuttosto, l'obiettivo è quello di incorporare la parte non isolata del filo dell'elettrodo (Figura 3) all'interno del DIAm.
   14. Utilizzare il microscopio operatorio per inserire con cautela il filo di sutura dell'elettrodo (estremità dell'ago) nel DIAm. Lasciare che la curvatura dell'ago guidi l'elettrodo all'interno e poi all'esterno della superficie addominale del DIAm, assicurandosi che l'intera parte non isolata del filo sia completamente incorporata nel muscolo.
   15. Tirare con cautela l'ago fino a quando il nodo del filo si ancora nel DIAm. Assicurarsi che la parte non isolata (2 mm) del filo dell'elettrodo sia completamente all'interno del DIAm, con un nodo nel punto in cui l'ago è entrato per la prima volta nel DIAm.
   16. Quindi, tagliare l'ago dal filo dell'elettrodo e smaltirlo in un contenitore per oggetti taglienti.
   17. Usando due pinze, fare un nodo nel punto in cui l'ago di sutura (3-0) è uscito dal DIAm. Per fare ciò, legare un anello nel lato corto del filo, far scorrere l'anello verso il basso sulla superficie addominale del DIAm e stringere accuratamente l'anello in un nodo. L'elettrodo (parte non isolata) dovrebbe ora essere ancorato sia al punto di ingresso che a quello di uscita.
   18. Tagliare la parte in eccesso del lato più corto del filo.
   19. Seguire i passaggi 1.2.14-1.2.18 per suturare un altro elettrodo sullo stesso lato del DIAm, a ~3 mm di distanza dal primo.
   20. Eseguire l'impianto di coppie di elettrodi nell'emidiaframma opposto nello stesso modo.
   21. Quindi, assicurati che il lato più lungo dei fili degli elettrodi sia tutto al di fuori della cavità addominale e inizia a suturare (3-0) gli strati muscolari per chiudere l'addome. Per ogni coppia di elettrodi, fare un anello e ancorarlo.
       NOTA: Assicurarsi che rimangano 2-3 cm di filo all'interno della cavità addominale per consentire al ratto di allungarsi senza causare tensione sul DIAm.
   22. Pulire il sangue in eccesso con soluzione fisiologica e quindi suturare (3-0) lo strato muscolare in uno schema continuo per chiudere il peritoneo.
   23. Scavare un catetere da 16 G dalla pelle dorsale mediale del ratto fino alla pelle addominale aperta e tirare un paio di fili di elettrodi attraverso la parte posteriore del ratto.
   24. Ripetere il processo con un secondo catetere sull'altro lato e far passare la seconda coppia di fili dell'elettrodo.
   25. Sutura la pelle addominale con una sutura 3-0 in uno schema di sutura interrotto.
   26. Quindi, per ogni coppia, legare i fili degli elettrodi in un nodo e suturarli in posizione.
   27. Somministrare all'animale un'iniezione di soluzione salina sottocutanea (~1 ml per 50 g di massa animale). Metti l'animale in una gabbia pulita sopra un termoforo per riprenderlo.
       NOTA: La laparotomia può causare l'inibizione dell'attività DIAm^35,36. Attendere almeno 72 ore prima dell'analisi quantitativa di qualsiasi misurazione EMG.

2. Emisezione spinale cervicale

1. Preparare l'area chirurgica sterile come prima.
2. Prima dell'intervento chirurgico, sterilizzare in autoclave o tutte le apparecchiature chirurgiche. Attrezzatura richiesta: (1) tagliacapelli per piccoli animali, (2) bisturi con lama #11, (3) forbici chirurgiche, (4) pinze, (5) rongeur, (6) divaricatori, (7) coltello da dissezione angolato.
3. Circa 72 ore dopo l'impianto dell'elettrodo DIAm EMG, pesare il ratto e calcolare il dosaggio appropriato dell'anestetico in base alle linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
4. Prima di anestetizzare il ratto, posizionare il ratto in una gabbia in stile Bowman e registrare l'EMG DIAm bilaterale come descritto nel passaggio 3.2.
5. Anestetizzare il ratto con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) o altro anestetico appropriato secondo il protocollo del comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali. Prima dell'intervento, iniettare buprenorfina a rilascio prolungato (1 mg/kg) per via sottocutanea e carprofene (5 mg/kg) per via intraperitoneale.
6. Procedi quando l'animale non risponde più al pizzicamento delle dita. Controllare la profondità dell'anestesia con un pizzico di dita dei piedi ogni 15 minuti circa.
7. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, posizionare il ratto in posizione prona e registrare l'EMG nel ratto anestetizzato come descritto al punto 3.3.
   NOTA: Assicurarsi che tutte le registrazioni vengano eseguite con il ratto nella stessa posizione.
8. Radere i peli dal collo all'incirca all'altezza delle orecchie e scendere fino alle scapole e rimuoverli con una garza bagnata.
9. Pulire la pelle con clorexidina gluconato (4% peso/volume) e coprire l'animale con coperture chirurgiche sterili (ad eccezione della parte superiore del dorso).
10. Con l'aiuto di un bisturi praticare un'incisione rostro-caudale di 4 cm. Ritrarre la pelle e tagliare il muscolo acromiotrapezio. Quindi sezionare il muscolo romboidale per esporre i muscoli spinali.
    NOTA: L'acromiotrapezio è il muscolo trapezio medio e le sue fibre muscolari corrono approssimativamente parallele alla colonna vertebrale. Il muscolo romboidale è esposto nel piano sotto l'acromiotrapezio e le sue fibre muscolari corrono in diagonale.
11. Ritrarre i muscoli spinali da C₁ a C₃.
    NOTA: I muscoli spinali corrono immediatamente adiacenti alla colonna vertebrale.
12. Eseguire con cura una laminectomia a C₂ utilizzando un rongeur mentre si guarda attraverso un microscopio operatorio per assicurarsi che non vengano danneggiate le arterie o i nervi principali.
13. Tagliare e ritrarre la dura madre a C_2.
14. Collegare i fili degli elettrodi esposti dalla schiena del ratto all'amplificatore durante l'esecuzione dell'emisezione spinale. Fare riferimento al passaggio 3 per maggiori dettagli.
15. Durante il monitoraggio della DIAm EMG, inserire il coltello da dissezione angolato appena sotto il punto in cui la radice dorsale entra nel midollo spinale e si seziona fino al punto medio della superficie ventrale nel modo mostrato nella Figura 2A.
    NOTA: Se si utilizza un termoforo elettronico, potrebbe essere necessario spegnerlo durante il monitoraggio dell'EMG per evitare rumore.
16. Entro pochi secondi da questa sezione, assicurarsi che l'attività eupnica DIAm EMG omolaterale alla lesione cessi e che sia evidente un aumento compensatorio dell'attività cDIAm EMG (Figura 2C).
17. Se l'attività eupneica dell'EMG iDIAm persiste, eseguire un altro taglio con la lama da dissezione, come evidenziato nella Figura 2C. Tuttavia, non tagliare la linea mediana; Il taglio sul lato controlaterale molto probabilmente porterà alla morte dell'animale.
18. Sutura i muscoli e poi la pelle con suture sterili (3-0).
19. Per mantenere l'idratazione, iniettare per via sottocutanea 1 ml di soluzione salina per 50 g di massa animale e porre l'animale in una gabbia pulita con un termoforo per il recupero. Monitorare l'animale mentre si riprende dall'intervento chirurgico.
20. Circa 72 ore dopo (Giorno 3 Post-C₂SH), registrare l'attività EMG nei ratti svegli secondo il passaggio 3.2 del protocollo. Fare attenzione a non danneggiare i punti sul dorso del ratto.
21. Successivamente, anestetizzare nuovamente il ratto (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati), utilizzando una dose di anestetico più leggera di quella che sarebbe necessaria per un piano chirurgico (tra 1/3 e 1/2 di una dose normale). Dosi aggiuntive possono essere somministrate a condizione che i ratti mostrino un riflesso corneale intatto e rispondano al pizzicamento delle dita.
22. Monitorare l'attività DIAm EMG seguendo il passaggio 3 del protocollo.
    NOTA: Posizionare il ratto nella stessa posizione utilizzata per la valutazione iniziale dell'attività EMG di iDIAm.
23. Se l'attività eupneica dell'iDIAm EMG (cioè l'attività in fase con l'attività inspiratoria del cDIAm EMG) è assente il giorno 3, concludere che il C₂SH iniziale ha avuto successo e includere lo stesso animale per ulteriori analisi.

3. Acquisizione e analisi dei dati

1. Impostazioni generali ed estrazione dei dati
   1. Impostare i filtri passa-banda del preamplificatore a 100 Hz (passa-alto) e 1000 Hz (passa-basso).
      NOTA: Queste impostazioni del filtro eliminano gli artefatti di movimento e riducono notevolmente il rumore a 60 Hz e la contaminazione ECG (che ha una potenza di picco a ~75 Hz) pur mantenendo la stragrande maggioranza del contenuto di frequenza del segnale DIAm EMG intramuscolare. Basato sulla teoria di Nyquist, digitalizzare con una frequenza di campionamento di 2000 Hz per evitare l'aliasing e consentire una risoluzione adeguata per notare l'attività dell'unità motoria nell'EMG composto. Se si eseguono analisi specializzate del contenuto di frequenza della gamma di frequenza inferiore a 100 Hz, è importante impostare le impostazioni del filtro del preamplificatore per garantire che le frequenze di interesse non vengano filtrate.
   2. Monitora due canali (EMG dell'emidiaframma sinistro e destro) nel software di visualizzazione su un computer e salva i dati in un formato appropriato per ulteriori analisi.
   3. Raccogli almeno 1-2 minuti di registrazioni euneiche per avere dati sufficienti per le analisi.
   4. Assicurarsi che i dati vengano raccolti in tre o più punti temporali:
      1. Prima di C₂SH, stabilire una registrazione eupnica di base in condizioni di veglia e anestetizzate.
      2. Durante l'intervento chirurgico C₂SH per stabilire il silenziamento dell'attività EMG eupneica iDIAm in condizioni anestetizzate.
      3. Al giorno 3 post-C₂SH per confermare che l'assenza di attività EMG eupneica iDIAm persiste e stabilire un punto iniziale dell'entità del deficit negli animali svegli che non è influenzato dallo shock spinale ^2,39 o dalla somministrazione di depressivi respiratori come la buprenorfina.
   5. Analizza le registrazioni DIAm EMG utilizzando qualsiasi software che consenta di eseguire calcoli su segnali digitalizzati (ad esempio, Matlab, Python, R). Il processo di base è il seguente:
      1. Carica i file EMG grezzi. A seconda delle impostazioni di filtraggio, potrebbe essere necessario tenere conto di un offset CC nel segnale.
         NOTA: Una soluzione semplice consiste nel sottrarre la media del segnale EMG grezzo da se stesso.
      2. Calcola la radice quadrata media del segnale EMG con una finestra mobile di 50 ms. Questo può essere fatto spostando una finestra di calcolo di 50 ms in avanti di un punto di campionamento alla volta fino a raggiungere la fine del segnale.
         NOTA: Le analisi dei singoli eventi DIAm EMG forniscono la massima potenza statistica e consentono il clustering dell'attività eupneica e non eupneaica. Pertanto, il rilevamento dell'insorgenza e dell'offset dei singoli respiri nell'EMG DIAm è fondamentale, come evidenziato in un precedente rapporto⁴⁰.
   6. Eseguire il filtraggio dell'attività eupneica visualizzando gli istogrammi della frequenza respiratoria istantanea e della durata del burst, come mostrato in un precedente report⁴¹.
2. Registrazioni da sveglio.
   1. Esegui registrazioni da sveglio mettendo i ratti in una gabbia per roditori in stile Bowman. Una gabbia cilindrica in stile Bowman può ospitare ratti adulti fino a 750 g.
   2. Svita le aste di metallo su un lato della gabbia in stile Bowman e convinci delicatamente il topo a entrare. Riavvitare le aste di metallo, intrappolando il topo nella gabbia cilindrica.
      NOTA: Acclimatare i ratti alla gabbia per almeno 30 minuti prima di procedere con la registrazione. Se possibile, è meglio acclimatare i ratti alla gabbia in stile Bowman per più giorni prima di qualsiasi misurazione. È buona norma fornire bocconcini mentre i ratti sono nella gabbia durante questa fase di acclimatazione.
   3. Per ridurre al minimo gli stimoli visivi esterni, usa un tovagliolo di carta o un oggetto simile per creare una tenda attorno alla parte anteriore della gabbia dove si trova la testa del topo. Inoltre, riduci al minimo i rumori forti e garantisci il comfort fisico del ratto in tutti i punti.
      NOTA: I segni evidenti di disagio includono irrequietezza, respirazione rapida e lotta contro la gabbia. Se si osserva uno di questi segni, potrebbe essere necessario riportare il ratto nella gabbia domestica e tentare di registrare quando il ratto è più calmo.
   4. Per i ratti più piccoli (<300 g), inserire materiali di riempimento (ad es. tovagliolo di carta, batuffoli di cotone) negli spazi extra della gabbia per scoraggiare il ratto dal girare di 180 gradi.
   5. Dopo che il ratto si è acclimatato, collegare con cura i fili che escono dal dorso del ratto a un preamplificatore, che alimenta i segnali analogici in un convertitore analogico-digitale, e seguire le procedure descritte al punto 3.1.
3. Registrazioni anestetizzate
   1. Metti i ratti nella stessa posizione ogni volta, preferibilmente incline a imitare più da vicino la postura del ratto sveglio.
   2. Collegare i fili che escono dal dorso di ratto a un preamplificatore, che alimenta i segnali analogici in un convertitore analogico-digitale, e seguire le procedure descritte al punto 3.1.
4. Recupero degli animali
   1. Metti i ratti all'interno di una gabbia per topi vuota e pulita, senza lettiera per il recupero.
   2. Posiziona la gabbia su un termoforo.
   3. Monitorare il ratto a intervalli regolari (<15 minuti) per le prime 3 ore o fino a quando il ratto inizia a muoversi. Monitorare a intervalli meno regolari (30 minuti) fino a quando l'animale non si sveglia di nuovo.
   4. Dopo che il ratto è deambulante, mettilo in una gabbia pulita con lettiera, accesso a cibo e acqua e arricchimento ambientale.
   5. Continuare a monitorare il ratto almeno una volta al giorno per tutto il tempo dell'esperimento. Prestare particolare attenzione alle variazioni di peso/capacità di alimentazione, nonché all'integrità dei siti di incisione e delle suture.

Risultati

L'approccio presentato in questo articolo riduce al minimo la variabilità interoperatore stabilendo criteri chiari per la valutazione dell'EMG DIAm in un modello di ratto di C₂SH. In primo luogo, deve essere osservata la cessazione dell'attività EMG eupneica iDIAm immediatamente dopo C₂SH, come mostrato nella Figura 2. In caso contrario, è possibile eseguire una transezione secondaria fino alla scomparsa dell'attività eupneica dell'iDIAm. In secondo luogo, il giorno 3 dopo C₂SH, la continua assenza di EMG eupneico iDIAm deve essere verificata mentre gli animali sono anestetizzati. La Figura 4A mostra un esempio di C₂SH di successo, determinato dalla continua assenza di attività EMG eupneica iDIAm in anestesia il giorno 3 dopo l'infortunio. La Figura 4B mostra l'attività DIAm EMG nello stesso animale in condizioni di veglia non anestetizzate, evidenziando la riduzione, ma non l'assenza, dell'attività di iDIAm rispetto al basale pre-infortunio. In particolare, l'attività EMG cDIAm è aumentata sia in condizioni di veglia che in condizioni di anestetismo. Le registrazioni anestetizzate del giorno 3 forniscono la convalida che il C₂SH iniziale ha avuto successo, ma le analisi quantitative dovrebbero essere eseguite negli animali svegli. Negli animali svegli, l'attività DIAm EMG al Giorno 3 dopo C₂SH rappresenta il punto di partenza per il recupero. La Figura 4B mostra che l'attività EMG di iDIAm è ridotta, ma non assente, il giorno 3 nei ratti svegli.

In alcuni casi, il C₂SH non è accompagnato dalla cessazione totale dell'attività EMG eupneica (Figura 5A). Un C₂SH inadeguato si verifica in meno del 5% di tutti i casi utilizzando l'approccio delineato nel presente manoscritto; tuttavia, è essenziale che su ciascun ratto venga eseguita una valutazione dell'attività DIAm EMG al giorno 3 dopo il C₂SH per convalidare il successo del C₂SH. La Figura 5A mostra un esempio di attività DIAm EMG da un ratto il giorno 3 dopo l'infortunio, in cui il C₂SH era inadeguato nell'eliminare l'attività eupneica iDIAm EMG entro il giorno 3. È importante notare che la convalida dell'efficacia del C₂SH è stata eseguita mentre l'animale era anestetizzato. La continua attività eupneica dell'EMG suggerisce che almeno una parte della via bulbospinale omolaterale discendente è stata risparmiata, il che può complicare l'interpretazione dei risultati. La Figura 5B mostra che l'attività EMG di iDIAm è ridotta, ma non assente, al giorno 3 nei ratti svegli. Tuttavia, il risparmio di input discendenti omolaterali può ridurre il deficit iniziale.

Figura 1: Quadro concettuale. Il gruppo respiratorio ventrale rostrale (rVRG) invia input discendenti ai motoneuroni frenici nel midollo spinale cervicale (C_{3-C 5}). La maggior parte di questi assoni discendenti innerva il pool di motoneuroni frenici omolaterali, ma una piccola frazione attraversa la linea mediana per attivare il pool di motoneuroni controlaterali. Immediatamente dopo un C₂SH, gli input discendenti dall'rVRG al pool di motoneuroni frenici omolaterali vengono interrotti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Attività rappresentativa C₂SH e DIAm EMG. (A) Viene mostrata la vista trasversale del midollo spinale di ratto e del sito tran (ombreggiato in rosso) con le strutture importanti etichettate. La lesione spinale viene eseguita inserendo un coltello da dissezione proprio sotto il punto in cui entra la radice dorsale e tagliando fino a circa la linea mediana (area rossa traslucida ombreggiata). Si noti la recisione dei principali tratti motori nei funicoli laterali e ventrali, ma il parsimo dei funicoli dorsali. (B) La vista longitudinale, che raffigura il silenziamento dell'attività del motoneurone omolaterale, integra le tracce EMG grezze utilizzate per la conferma in tempo reale di una lesione soddisfacente (C). Quando il midollo spinale è lesionato, l'attività eupneica dell'iDIAm EMG cessa, suggerendo che gli input omolaterali ai motoneuroni frenici sono stati interrotti; nel frattempo, l'EMG cDIAm aumenta immediatamente la sua attività come mostrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Produzione di elettrodi. Viene mostrato il processo di produzione degli elettrodi DIAm EMG. Il processo di base prevedeva la misurazione e il taglio di una lunghezza appropriata di filo (Passaggio 1), la legatura di un nodo di ancoraggio e la rimozione dell'isolamento per esporre l'elettrodo (Passaggio 2), il collegamento di un ago calibro 25 al filo (Passaggi 3 e 4), la piegatura dell'ago per dargli una curvatura simile a un ago da sutura chirurgico (Passaggio 5), e rimuovendo l'isolamento per esporre una parte del filo che verrà collegato all'amplificatore per la registrazione EMG (Passaggio 6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Emisezione spinale riuscita. (A) L'attività EMG del DIAm è mostrata in un ratto anestetizzato prima del C₂SH e al giorno 3 dopo l'infortunio. Non ci sono prove di attività eupneica iDIAm EMG in questo ratto al giorno 3 dopo l'infortunio, indicando che il C₂SH iniziale ha avuto successo. Si noti l'aumento compensatorio dell'attività EMG cDIAm e l'aumento della frequenza respiratoria rispetto alla condizione pre-infortunio. (B) L'attività EMG del DIAm è mostrata nello stesso ratto in condizioni di veglia non anestetizzate il giorno 3 dopo C₂SH. C'è una chiara evidenza di una ridotta, anche se non completamente silenziata, attività EMG di iDIAm. Si noti l'aumento compensatorio dell'attività EMG cDIAm e l'aumento della frequenza respiratoria rispetto alla condizione pre-infortunio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Emisezione spinale non riuscita. (A) L'attività EMG del DIAm è mostrata in un ratto anestetizzato prima del C₂SH e al giorno 3 dopo l'infortunio. In questo ratto, l'attività eupneica dell'iDIAm EMG persisteva al giorno 3 dopo l'infortunio, indicando che l'iniziale C₂SH era inadeguato. Di conseguenza, questo ratto è stato escluso da ulteriori analisi del recupero funzionale. Si noti l'aumento compensatorio dell'attività EMG del cDIAm nonostante un C₂SH non riuscito, ma un aumento minimo della frequenza respiratoria. (B) L'attività DIAm EMG è mostrata nella stessa corsa in condizioni di veglia non anestetizzata il Giorno 3 dopo C₂SH. Ci sono prove di una riduzione dell'iDIAm EMG, di un aumento dell'attività cDIAm EMG e di un leggero aumento della frequenza respiratoria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

C₂ emisezione spinale
La procedura descritta in questo articolo enfatizza le valutazioni dell'attività DIAm EMG che fungono da convalida di una lesione spinale C₂ che seziona i funicoli laterali e ventrali risparmiando i funicoli dorsali (Figura 2A). L'approccio chirurgico proposto ha due vantaggi principali. In primo luogo, risparmia i funiculi dorsali, che preservano la funzione deambulatoria nei ratti, pur continuando a recidere gli input omolaterali ai motoneuroni frenici. In secondo luogo, monitorando la DIAm EMG, possiamo convalidare l'efficacia della lesione C₂ nell'eliminare l'attività eupneica dell'iDIAm EMG inizialmente durante l'intervento chirurgico mentre gli animali sono anestetizzati. Al giorno 3 dopo l'infortunio, mentre gli animali sono anestetizzati, verifichiamo che vi sia effettivamente un silenziamento continuo dell'attività eupneica iDIAm EMG. In precedenza è stato dimostrato che gli input eccitatori di rVRG sui motoneuroni frenici e l'espressione del recettore NMDA nei motoneuroni frenici sono ridotti da 3 a 7 giorni dopo l'infortunio e che sia l'input sinaptico glutammatergico che l'espressione del recettore NMDA aumentano nel tempo dopo 7 giorni dall'infortunio^33,42. Questi dati, combinati con la conferma istologica della lesione C₂ 10,13,29,30,33, suggeriscono che l'inattività continua in anestesia il giorno 3 dopo l'infortunio fornisce informazioni sull'efficacia del C₂SH iniziale. Attraverso studi condotti in più anni, tassi relativamente stabili di recupero spontaneo in anestesia tra il 30% e il 40% sono stati osservati a 14 giorni dopo C ₂SH 18,19,20,29,31,43, suggerendo che questo metodo di verifica del successo del C₂SH è riproducibile e affidabile.

La procedura C₂SH prevede diversi passaggi critici. È importante sottolineare che il modello C₂SH qui proposto risparmia i funicoli dorsali e quindi non porta a deficit motori degli arti. Nei modelli di emisezione spinale C₂ completi che coinvolgono i funicoli dorsali, i deficit motori degli arti sono considerevolmente maggiori 3,4,5,6,7,37. Pertanto, un ulteriore vantaggio del modello C₂SH (Figura 2A) è che, oltre al silenziamento dell'attività EMG eupneica iDIAm nei ratti anestetizzati con lesione C₂, i ratti sono funzionalmente simili ai ratti con laminectomia fittizia in termini di deambulazione e altre funzioni. Di conseguenza, sono generalmente in grado di nutrirsi e pulirsi da soli, il che riduce il carico di cura pur consentendo studi sul controllo neuromotorio DIAm e sulla neuroplasticità respiratoria. Per garantire che il modello C₂ sia implementato in modo appropriato, è necessario prestare molta attenzione per evitare lesioni eccessive. Inserire il coltello da dissezione proprio sotto il punto in cui la radice dorsale entra nel midollo spinale e tagliare la porzione ventrale con parsimonia sono entrambe regole empiriche utili. L'obiettivo è garantire che l'attività eupneica di iDIAm EMG cessi; Questo può essere fatto con più piccoli tagli, se necessario. Infatti, nella settimana successiva al C₂SH, diventerà chiaro se c'è stato un danno eccessivo al midollo spinale se gli animali hanno difficoltà a deambulare e a raggiungere i pellet di cibo.

Posizionamento degli elettrodi e registrazioni EMG
Gli elettrodi EMG DIAm cronici presentano diversi vantaggi evidenti rispetto ad altri approcci. Gli elettrodi possono (e dovrebbero) essere impiantati diversi giorni prima della procedura di C₂SH, lasciando un tempo sufficiente per il recupero e non richiedendo una laparotomia e un C₂SH durante la stessa sessione chirurgica. Questo è importante perché è ben noto che la laparotomia provoca l'inibizione del DIAm^35,36. Impiantando elettrodi DIAm cronici, non sono necessarie laparotomie ripetute, che sono state eseguite in lavori precedenti^10,13; c'è anche un rischio ridotto di pneumotorace poiché gli elettrodi non vengono inseriti nel DIAm durante ogni sessione. Tuttavia, a seguito del posizionamento degli elettrodi possono verificarsi diversi eventi avversi potenzialmente gravi. Sebbene il rischio di pneumotorace sia ridotto evitando l'inserimento ripetuto di elettrodi, non è completamente annullato e, anzi, può verificarsi uno pneumotorace, causando la morte immediata o problemi prolungati. Al fine di ridurre questo rischio, è buona norma assicurarsi che l'ago che viene infilato attraverso il DIAm non fori la superficie superiore del DIAm. Inoltre, evitare l'uso di pinze affilate che potrebbero infliggere danni al DIAm durante la manipolazione dei fili degli elettrodi. Occasionalmente, i ratti possono masticare i punti all'addome, potenzialmente sventrandosi se lasciati a se stessi. I ratti devono essere osservati a intervalli regolari dopo il posizionamento degli elettrodi per rilevare precocemente questi tipi di comportamenti. In alcuni casi, potrebbe essere possibile anestetizzare i ratti per riparare i danni ai punti di sutura. Tuttavia, è meglio se tale comportamento viene mitigato fornendo un adeguato sollievo dal dolore durante e dopo l'intervento chirurgico e assicurandosi che il campo sterile non venga rotto durante l'intervento chirurgico. In casi estremi, potrebbe essere necessario sopprimere i ratti che rimuovono ripetutamente i punti.

La registrazione e l'analisi dei segnali EMG non è l'obiettivo principale del presente studio e dipende fortemente dalle particolari apparecchiature e software disponibili in ciascun laboratorio. Sebbene le informazioni sulle apparecchiature siano fornite nella Tabella dei materiali, esiste un'ampia varietà di opzioni hardware per amplificare e registrare l'attività EMG e le specifiche dipenderanno da una combinazione di funzionalità, disponibilità e convenienza per ciascun laboratorio. Tuttavia, ci sono alcuni principi generali della registrazione dell'EMG che è importante menzionare. Un potenziale problema è il movimento o la distruzione degli elettrodi impiantati, che può limitare le valutazioni quantitative della DIAm EMG. Se gli elettrodi si sono staccati dal DIAm, o se i ratti sono riusciti a consumare o danneggiare in altro modo i fili esternalizzati, potrebbe non essere possibile registrare l'attività EMG o il livello di rumore potrebbe cambiare. Questo può essere evitato confermando che gli elettrodi sono saldamente fissati nel DIAm e che un segnale con un elevato rapporto segnale/rumore (SNR) può essere registrato da essi durante l'intervento chirurgico di posizionamento degli elettrodi DIAm. Inoltre, esternalizzare i fili degli elettrodi in alto sul dorso e tagliare il filo in eccesso in modo che i ratti non siano in grado di accedere ai fili degli elettrodi sono entrambi favorevoli al successo degli elettrodi cronici. In alternativa ai fili esternalizzati, i cappucci della testa³⁷ o la telemetria^44,45 possono essere opzioni ragionevoli. Entrambi gli approcci possono ottenere registrazioni negli animali svegli più facilmente, ma possono essere leggermente più difficili da implementare rispetto alla semplice esternalizzazione dei fili multifilamento. Tutte le fonti elettroniche vicine possono potenzialmente essere fonti di rumore. È fondamentale che tutte le apparecchiature siano messe a terra in modo appropriato, che vengano utilizzati cavi schermati e che i ratti non vengano toccati durante le registrazioni attive. Oltre a spegnere i cuscinetti termici elettronici durante la registrazione, potrebbe essere necessario spegnere temporaneamente le luci, le apparecchiature vicine, i tavoli chirurgici azionati elettricamente e altri dispositivi simili per ottenere registrazioni a basso rumore. Per ridurre al minimo le influenze ambientali, è necessario spegnere le apparecchiature elettroniche che non devono essere accese per le registrazioni DIAm EMG. Quando possibile, le registrazioni dovrebbero essere effettuate in una stanza schermata elettricamente. Nel tempo, le cicatrici tissutali e la fibrosi attorno agli elettrodi DIAm EMG possono ridurre la conduttività dell'elettrodo, riducendo l'SNR. Inoltre, anche lievi cambiamenti nella postura possono avere un grande impatto sul segnale DIAm EMG; pertanto, per ridurre al minimo questi problemi potenzialmente complicati, l'EMG DIAm dovrebbe essere registrato con i ratti nella stessa postura durante le sessioni di registrazione.

Un'altra considerazione importante sono le impostazioni di filtraggio e campionamento. Il tipo di elettrodo (ad esempio, intramuscolare o esofageo/di superficie) è estremamente rilevante quando si tratta di determinare il contenuto di frequenza di un segnale e, di conseguenza, i filtri passa-alto e passa-basso appropriati. È stato profuso un notevole sforzo per determinare i filtri ottimali per il diametro superficiale/esofageo EMG⁴⁶. Studi simili nel DIAm di ratto non sono stati eseguiti, ma in precedenza abbiamo dimostrato che in effetti, l'intero contenuto di frequenza dell'EMG DIAm registrato utilizzando elettrodi intramuscolari cronici nei ratti era inferiore a 1000 Hz, con la frequenza del baricentro intorno a 300 Hz⁴⁷. In un confronto diretto delle frequenze medie e mediane dello spettro di potenza dell'EMG del bicipite brachiale nell'uomo ottenute tramite elettrodi di superficie e intramuscolari, Christensen et ^al.48 hanno scoperto che sia la frequenza media che quella mediana erano circa 3 volte superiori per gli elettrodi intramuscolari rispetto agli elettrodi di superficie. Nel DIAm, i ricercatori hanno riportato frequenze del centroide di circa 100 Hz quando si utilizzano elettrodi esofagei bipolari 49,50,51,52,53,54, il che suggerirebbe che i 300 Hz, precedentemente determinati per gli elettrodi intramuscolari, corrispondono approssimativamente alla stessa tendenza mostrata da Christensen et ^al.48. Nonostante ciò, diversi studi pubblicati che utilizzano l'EMG DIAm intramuscolare in modelli di roditori hanno posizionato i loro filtri passa-alto a 300 Hz 4,37,55,56 e alcuni sono persino arrivati fino a 500 Hz ⁵⁷. È indiscutibile che un tale approccio di filtraggio ridurrebbe sostanzialmente l'ampiezza del segnale DIAm EMG di almeno la metà. Proponiamo un approccio molto meno distruttivo: (1) filtraggio passa-alto a 100 Hz perché la maggior parte dello spettro di potenza dell'ECG è inferiore a 100 Hz mentre relativamente poco dello spettro di potenza DIAm EMG è inferiore a 100 Hz^51,52, e (2) successiva rimozione dell'ECG residuo mediante la corrispondenza della forma d'onda⁵⁸. Pertanto, i filtri appropriati per DIAm EMG per la maggior parte degli studi possono essere impostati tra 100 Hz e 1000 Hz, con una frequenza di campionamento di almeno 2000 Hz per catturare tutte le caratteristiche rilevanti all'interno dei dati. Analisi dettagliate dell'EMG DIAm possono quindi essere eseguite utilizzando le tecniche pubblicate nei precedenti rapporti 40,41,47,58.

Animali svegli e anestetizzati
In particolare, alcuni studi hanno evidenziato che i modelli C₂SH di cSCI non portano alla completa inattività di iDIAm EMG^23,37 eupneico. In un certo senso, questo non è sorprendente, poiché è stato notato in precedenza che l'attività "breakthrough" si verifica durante comportamenti che richiedono una spinta più elevata (ad esempio, respiri profondi e la risposta all'occlusione delle vie aeree)4,7,29,42. Questi dati suggeriscono che probabilmente non è appropriato pensare al modello C₂SH come a un vero modello di inattività continua. Infatti, sembra che l'impulso sia sufficientemente alto negli animali svegli perché l'attività eupneica dell'iDIAm EMG sia presente già quattro giorni dopo un completo C₂SH³⁷, sebbene non sia presente in modo coerente un giorno dopo l'infortunio²³. In tutti i casi, l'anestesia sopprime l'attività di iDIAm dopo l'emisezione spinale cervicale superiore, come evidenziato nei precedenti rapporti^23,38 e mostrato nella Figura 4 e nella Figura 5. Non ci sono dati pubblicati disponibili sull'attività di DIAm EMG in ratti svegli con il C₂SH con funicoli dorsali risparmiati proposti nel presente manoscritto (Figura 2A). Il lavoro futuro dovrebbe fornire una caratterizzazione dettagliata dell'andamento temporale dell'attività DIAm EMG in animali svegli con questo modello C₂SH. Detto questo, è ancora prudente eseguire la convalida della continua assenza di inattività eupneica iDIAm il giorno 3 dopo l'infortunio in anestesia per imitare le condizioni sperimentali durante le quali il midollo spinale è stato inizialmente lesionato/sezionato. Quando può essere presente l'attività eupneica dell'iDIAm EMG negli animali svegli al 3° giorno dopo l'infortunio, si nota che anche mezze dosi di anestetici di solito portano a una completa cessazione dell'attività eupneica dell'iDIAm EMG. Con queste dosi, gli animali sono calmi e calmi. Oltre a verificare il silenziamento dell'attività EMG eupneica iDIAm durante il C₂SH e al Giorno 3 dopo l'infortunio, si raccomanda di estrarre il midollo spinale dopo l'esperimento terminale per eseguire la conferma istologica della sede e dell'estensione del C₂SH ^9,29,59. La conferma istologica della lesione, se combinata con la conferma funzionale dell'attività EMG eupneica iDIAm silenziata, fornisce una forte evidenza di un successo di C₂SH.

Il presente articolo presenta un C₂SH di cSCI nei ratti che porta al silenziamento immediato dell'attività EMG dell'iDIAm eupneica con silenziamento continuato in anestesia al giorno 3 dopo l'infortunio. A causa del risparmio del funicolo dorsale nel modello C₂SH proposto nel presente manoscritto, la funzione motoria degli arti è preservata, evitando così effetti fuori bersaglio. Ciò consente di eseguire studi longitudinali sugli effetti di una lesione cervicale alta sul controllo neuromotorio DIAm in ratti altrimenti relativamente sani, aggiungendo così un carico minimo di assistenza per gli investigatori. La convalida dell'inattività in anestesia al giorno 3 dopo l'infortunio garantisce che venga stabilita una chiara linea di base per valutare il successivo grado di recupero dell'EMG eupneico iDIAm. Questo approccio fornisce un metodo rigoroso, affidabile e riproducibile per eseguire un C₂SH nei ratti. Questo modello ha il potenziale per migliorare notevolmente la comprensione del decorso temporale della neuroplasticità respiratoria e la sua intersezione con potenziali strategie terapeutiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ago da 25 G	Health	1188825100	Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1" (0,508 mm x 2,5 cm) A
3-0 Vicryl Violet Braided	Ethicon	J774D	3-0 Suture
Adson-Brown Pincipe	Fine Science Tools	11627-12	Forma della punta: Dritta, Punte: Denti di squalo, Larghezza della punta: 1,4 mm, Dimensioni della punta: 2 x 1,4 m, Lega / Materiale: Acciaio inossidabile, Lunghezza: Gabbia
Bowman Style	Braintree Scientific	POR-530	Gamma di peso: da 250 a 750 g; Lunghezza massima: 9" (228 mm); L'unità di base è costruita in acrilico gioiello da 5" (123 mm).
Castroviejo Portaaghi	Fine Science Tools	12565-14	Forma della punta: Dritta, Larghezza della punta: 1,5 mm, Lunghezza di serraggio: 10 mm, Blocco: Sì, Forbici: No, Lega / Materiale: Acciaio inossidabile, Lunghezza: 14 cm, Seghettato: Sì, Caratteristica: Cavo a clip in carburo di tungsteno
1m TP Shielded	Biopac Systems, Inc	LEAD110S	Fili conduttori schermati per
software di acquisizione dati	LabChart	LabChart 7.3.8	Software di registrazione, visualizzazione e analisi dei dati per registrazioni multicanale e valutazioni in tempo reale Software di
analisi dei dati - Matlab 2023b	Mathworks, Inc.	Versione 23.2	Linguaggio di programmazione generico per analisi post hoc
Coltello da dissezione	Fine Science Tools	10056-12	Tagliente: 4 mm, Spessore: 0,5 mm, Lega / Materiale: Acciaio inossidabile, Lunghezza: 12,5 cm, Forma lama: Angolata di 30 gradi;
Dumont #3 Pinze	Fine Science Tools	11293-00	Stile: #3, Forma della punta: Dritta, Punte: Standard, Dimensioni della punta: 0,17 x 0,1 mm, Lunghezza: 12 cm, Lega / Materiale: Dumostar
Amplificatore per elettromiogramma	Biopac Systems, Inc	EMG100C	Amplificatore EMG
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	Forma della punta: Curvo, Dimensione della coppa: 2,5 mm, Lega / Materiale: Acciaio inossidabile, Lunghezza: 13 cm, Azione articolare:
Singolo Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16021-14	Lega / Materiale: Acciaio inossidabile, Lunghezza: 14cm, Azione articolare: Singolo, Dimensione della coppa: 1mm, Forma della punta:
Modulo di alimentazione isolato	Biopac Systems, Inc	IPS100C	Gestisce moduli di amplificazione della serie 100 indipendenti dal sistema di acquisizione dati della serie MP di Biopac Systems, Inc.
Kelly Hemostats	Fine Science Tools	13019-14	Punte: seghettate, larghezza della punta: 1,5 mm, lunghezza di serraggio: 22 mm, lega / materiale: acciaio inossidabile, lunghezza: 14 cm, forma della punta:
curette a coltello	V. Mueller	VM101-4414	punta: affilata, diametro della punta: 2 mm
Forbici per microdissezione	Strumenti di ricerca biomedica, Inc.	11-2420	Lunghezza: 4", Angolo: Dritto, Lunghezza lama: 23 mm
Filo multifilare in acciaio inossidabile	Cooner Wire, Inc.	AS 631	AWG 40; Diametro totale: 0,011 mm (con isolamento), 0,008 mm (senza isolamento).
PowerLab 8/35	ADInstruments	PL3508	Sistema di acquisizione dati
Lama per bisturi #11	Fine Science Tools	10011-00	Forma della lama: Angolata, Tagliente: 20 mm, Spessore: 0,4 mm, Lega / Materiale: Acciaio al carbonio
Manico per bisturi #3	Fine Science Tools	10003-12	Lega / Materiale: Acciaio inossidabile, Lunghezza: 12 cm
Sprague Dawley Rat	Inotiv	Codice d'ordine: 002	Sprague Dawley ratti di razza (femmina e maschio)
Microscopio chirurgico	Olympus	SZ61	Microscopio operatorio
Forbici da taglio per sutura	George Tiemann & Co.	110-1250SB	Lega / Materiale: Acciaio inossidabile, Forma della punta: Dritto, Punte: Affilato/Smussato, Lunghezza: 4,5
Forbici a molla Vannas	Strumenti per la scienza fine	15000-08	Punte: Affilato, Tagliente: 2,5 mm, Diametro della punta: 0,05 mm, Lunghezza: 8 cm, Lega / Materiale: Acciaio inossidabile, Seghettato: No, Forma della punta:
Divaricatore Weitlaner	Codman	50-5647	Rebbi: 2 x 3 smussati, Lunghezza: 4,5"