Articolo metodologico

Isolamento di cellule staminali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale con rese elevate e basso danno

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DOI:

10.3791/66835

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5 luglio 2024

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1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

In questo articolo

Sommario

Questo studio presenta un'esclusiva procedura di dissezione smussata per preservare l'integrità della gelatina di Wharton (WJ), con conseguente WJ meno danneggiata e una maggiore quantità e vitalità delle cellule staminali mesenchimali (MSC) raccolte. Il metodo dimostra una resa e una capacità proliferativa superiori rispetto ai metodi convenzionali di dissezione tagliente.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono una popolazione di cellule multipotenti con notevoli proprietà rigenerative e immunomodulatorie. La gelatina di Wharton (WJ) dal cordone ombelicale (UC) ha guadagnato un crescente interesse in campo biomedico come un'eccezionale fonte di MSC. Tuttavia, sono sorte sfide come l'offerta limitata e la mancanza di standardizzazione nei metodi esistenti. Questo articolo presenta un nuovo metodo per aumentare la resa di MSC sezionando WJ intatto dal cordone ombelicale. Il metodo impiega la dissezione smussata per rimuovere lo strato epiteliale, mantenendo l'integrità dell'intero WJ e determinando un aumento della quantità e della vitalità delle MSC raccolte. Questo approccio riduce significativamente gli sprechi di WJ rispetto ai metodi convenzionali di dissezione tagliente. Per garantire la purezza delle WJ-MSC e ridurre al minimo l'influenza cellulare esterna, è stata condotta una procedura che utilizza la tensione interna per staccare l'endotelio dopo aver capovolto la colite ulcerosa. Inoltre, la capsula di Petri è stata capovolta per un breve periodo durante la coltura di espiantazione per migliorare l'attaccamento e la crescita cellulare. L'analisi comparativa ha dimostrato la superiorità del metodo proposto, mostrando una resa più elevata di WJ e WJ-MSC con una migliore vitalità rispetto ai metodi tradizionali. La morfologia e il modello di espressione simili dei marcatori di superficie cellulare in entrambi i metodi confermano la loro caratterizzazione e purezza per varie applicazioni. Questo metodo fornisce un approccio ad alto rendimento e ad alta vitalità per l'isolamento di WJ-MSC, dimostrando un grande potenziale per l'applicazione clinica delle MSC.

Introduzione

Dal primo isolamento di cellule staminali mesenchimali (MSC) dalla gelatina di Wharton (WJ) nel 1991, queste cellule staminali multipotenti hanno guadagnato un'attenzione significativa da parte dei ricercatori grazie alle loro proprietà rigenerativee alla capacità di differenziazione multilineage. Le MSC possono essere isolate da varie fonti, tra cui il midollo osseo, il sangue periferico, la polpa dentale, il tessuto adiposo, il feto (aborto umano) e i tessuti correlati alla nascita2. Il cordone ombelicale (UC) è emerso come un serbatoio promettente grazie alla sua natura non invasiva, all'abbondante resa cellulare e alla capacità di differenziazione, mostrando un alto tasso di proliferazione, potenziale di differenziazione e proprietà di modulazione immunitaria3. Le MSC fetali mostrano una forte staminalità e proprietà immunitarie, che le rendono l'obiettivo principale degli studi clinici e della ricerca di base condotti negli ultimi due decenni 2,4,5. Le MSC derivate dalla CU hanno un potenziale terapeutico superiore rispetto ad altre fonti di MSC, come il midollo osseo o il tessuto adiposo 6,7.

La CU è composta da epitelio amniotico, tre vasi (due arterie e una vena) e la sostanza gelatinosa nota come WJ3. Curiosamente, la CU costituisce una semplice vascolarizzazione, costituita solo dall'endotelio e dal mesotelio, ma non dalla tunica avventizia; il WJ non contiene linfa o nervi8. L'UC presenta una struttura unica ideale per la separazione segmentale. Le UC-MSC si trovano principalmente nel WJ. Le MSC potrebbero essere isolate da diversi compartimenti del WJ, tra cui l'amnio, il subamnio (l'amnio e il subamnio designati anche come regione di rivestimento del cordone) e l'area perivascolare del WJ8. Ogni regione del WJ ha la propria struttura, caratteristiche immunoistochimiche e funzione 3,6.

Le MSC isolate dal WJ della UC sono ampiamente considerate aventi un'utilità clinica superiore rispetto a quelle di altre regioni3. Le WJ-MSC sono state ampiamente studiate in contesti preclinici e clinici per il trattamento di varie malattie grazie al loro potenziale di differenziazione multilinea, alle proprietà immunomodulatorie, agli effetti paracrini, agli effetti antinfiammatori e alle proprietà immuno-privilegiate 2,3. Le WJ-MSC hanno dimostrato di essere promettenti nel trattamento di una serie di malattie, tra cui la malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD), il rigetto del trapianto, il morbo di Crohn, le malattie autoimmuni e le malattie cardiovascolari 9,10,11,12,13,14. Poiché la domanda clinica di WJ-MSC continua ad aumentare, la carenza di offerta di cordoni ombelicali è attualmente un ostacolo alla loro diffusione delle applicazioni.

La resa delle WJ-MSC dipende dal metodo utilizzato per l'estrazione cellulare15. Mentre le WJ-MSC possono essere isolate attraverso la coltura di espianti o la digestione enzimatica, quest'ultimo metodo ha un tempo di propagazione più lungo che può aumentare il rischio di danno cellulare e diminuire la vitalità cellulare16. Tuttavia, numerosi studi hanno dimostrato che il metodo della coltura di espiantazione aumenta la resa e la vitalità delle cellule e che anche i fattori paracrini rilasciati dai tessuti di espiantazione aiutano a promuovere la proliferazione cellulare17,18.

Questo studio ha applicato un approccio di dissezione unico per ottenere WJ interi, producendo MSC con maggiore capacità proliferativa, vitalità e quantità, riducendo al minimo i danni al WJ. Questo metodo innovativo offre una strategia semplificata per l'isolamento delle WJ-MSC, rispondendo alle esigenze critiche nelle applicazioni MSC.

Protocollo

I campioni sono stati ottenuti da donatori sani e consenzienti dell'ospedale per la maternità e l'assistenza sanitaria infantile del distretto di Shenzhen Longgang, Guangdong, Cina. L'uso di campioni umani per lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale di Shenzhen, dall'Università di Medicina Cinese di Pechino (SZLDH2020LSYM-095) e dal Comitato Etico Medico dell'Ospedale per la Maternità e l'Assistenza Sanitaria Infantile del Distretto di Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida approvate. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Raccolta del cordone ombelicale umano

  1. Ottenere campioni di cordone ombelicale umano dall'ospedale cooperativo in condizioni sterili.
    NOTA: Scegli un donatore di età inferiore ai 35 anni, preferibilmente una primipara, senza storia di epatite, malattie sessualmente trasmissibili o disturbi genetici. I risultati dell'esame di ammissione per il virus dell'epatite B, il virus dell'epatite C e il citomegalovirus devono essere negativi. Scegli il taglio cesareo come modalità di parto.
  2. Seleziona un pezzo dritto e intatto di UC di circa 10-15 cm di lunghezza.
  3. Chiudere entrambe le estremità con una pinza emostatica e legare con nodi chirurgici all'estremità interna tra le pinze subito dopo il parto di un neonato a termine con taglio cesareo. (UC raccolto come mostrato nella Figura 1, passaggio 1).
    NOTA: L'operazione del taglio cesareo garantisce che la raccolta sia sterile. Utilizzare nodi chirurgici di sutura di dimensione 0 o 2-0 per una migliore resistenza alla trazione.
  4. Tagliare il cordone ombelicale legato tra la pinza e i nodi usando le forbici chirurgiche (Figura 1, passaggio 1).
  5. Sciacquarlo con una soluzione salina per rimuovere eventuali coaguli di sangue contaminanti sulla superficie e trasferirlo prontamente in una provetta di plastica sterile da 50 ml contenente 20 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
    NOTA: Durante il trasferimento non è stato utilizzato alcun antibiotico.
  6. Sigillare il tubo. Metterlo sul ghiaccio in una scatola di polistirolo e conservarlo a 4 °C prima di trasportarlo in laboratorio.
    NOTA: Sezionare il cavo entro 4 ore dalla raccolta.

2. Isolamento della gelatina di Wharton dal cordone ombelicale

  1. Elaborare il cordone ombelicale seguendo i passaggi seguenti:
    1. Preparare un vassoio sterilizzato con strumenti chirurgici, piastre da 90 mm confezionate in modo asettico, pipette da 1000 μl, PBS sterile, soluzione di etanolo al 75% e terreno di coltura MSC umano privo di xeno.
      NOTA: Le pinze dentate e i morsetti antizanzare consentono di trattare in modo efficiente il cavo strisciante.
    2. Decontaminare la superficie e la zona di lavoro necessari prima di posizionare gli articoli all'interno della cappa di biosicurezza.
      NOTA: Lasciare che l'aria della zona di lavoro sfiati per alcuni minuti prima di iniziare il lavoro.
    3. Disinfettare la superficie della provetta e rimuovere il campione in una capsula di Petri nella cabina di biosicurezza. Immergere il campione con i nodi in etanolo al 75% per 30 s e poi risciacquarlo più volte con PBS sterile in una nuova capsula di Petri.
      NOTA: Il cavo deve essere legato prima di immergerlo in etanolo al 75% e il tempo di immersione deve essere limitato da 30 s a 1 minuto per disinfettare completamente il cavo senza danni.
    4. Tagliare i nodi e tagliare il cordoncino tra due nodi trasversalmente in pezzi corti di circa 2 cm di lunghezza con forbici chirurgiche e pinze.
      NOTA: Le estremità del cavo con nodi devono essere smaltite. La lunghezza dell'UC non dovrebbe essere né troppo lunga né troppo corta; Entrambe le condizioni possono aumentare la difficoltà dell'operazione.
    5. Perfondere la vena (recipiente più grande) con PBS utilizzando pipette da 1000 μl fino a quando il fluido che esce dall'altra estremità del cordone diventa completamente trasparente19.
  2. Sezionare il cordone ombelicale.
    1. Trasferire uno dei pezzi già tagliati in una nuova capsula di Petri.
      NOTA: Due arterie e una vena devono essere esposte visibilmente sulla sezione trasversale8 (Figura 2B).
    2. Aggiungere la quantità appropriata di PBS per mantenere il cavo bagnato durante l'operazione.
    3. Afferrare il cavo con una pinza ed estrarre le arterie lungo il suo asse maggiore con l'aiuto di pinze per zanzare.
      NOTA: Provare a tirare dall'altra estremità del cavo se l'arteria è stata strappata, poiché la parete dell'arteria ha una grande elasticità.
    4. Fissare il cordino orizzontalmente con il lato più spesso rivolto verso l'alto inserendo una lama della pinza nella vena ombelicale e poi serrando saldamente, assicurandosi che la pinza si blocchi sul lato più spesso.
    5. Praticare un'incisione lineare sullo strato di epitelio amniotico da un'estremità all'altra lungo il bordo dell'altra lama della pinza utilizzando un bisturi (Figura 3).
      NOTA: Preserva l'integrità della gelatina di Wharton tagliando il meno WJ possibile.
    6. Inizia da un angolo della fessura di taglio. Sollevare l'angolo dell'epitelio amniotico con pinze dentate e continuare a tagliare orizzontalmente un po' di più con le forbici corneali lungo la superficie interna dell'epitelio.
      1. Separare la gelatina di Wharton e l'epitelio amniotico con le pinze ed espandere gradualmente l'intero cerchio di un'estremità della colite ulcerosa. Staccare lo strato epiteliale nel senso della lunghezza (Figura 3).
        NOTA: La gelatina di Wharton è un tessuto connettivo mucoso racchiuso dall'epitelio amniotico denso8. L'intera operazione dovrebbe essere regolare, ma le pinze per zanzare potrebbero essere utilizzate per la dissezione smussata se si incontrano difficoltà durante il peeling.
    7. Inserire entrambe le lame della pinza all'interno della vena, bloccare una parte di WJ e quindi capovolgerla per esporre l'epitelio della vena ombelicale (Figura 3).
    8. Staccare facilmente l'epitelio della vena, poiché la tensione interna crea una separazione tra l'epitelio della vena e il WJ perivascolare (Figura 3).
  3. Sezionare la UC utilizzando il metodo convenzionale per il confronto20.
    1. Scegli un altro campione già tagliato di quasi lo stesso peso del cordone precedente e trasferiscilo in una nuova capsula di Petri.
    2. Tagliare longitudinalmente lungo la vena ombelicale con le forbici e allargare la UC per esporre i vasi e WJ.
    3. Rimuovere la vena ombelicale e due arterie e rimuovere il WJ dallo strato endoteliale con forbici e bisturi.

3. Isolamento e cultura delle UC-MSC

  1. Metti il WJ raccolto in una piastra di Petri da 90 mm pre-etichettata e taglialo in pezzi di 1-3 mm con forbici e pinze.
  2. Capovolgere la capsula con il tappo sul fondo e metterla in un'incubatrice al 5% di CO2 a 37 °C per 30 minuti per rafforzare l'attaccamento tra i pezzi e la superficie in plastica.
  3. Capovolgere il piatto e aggiungere delicatamente una quantità appropriata di terreno di coltura MSC umano per un'ulteriore coltura.
    NOTA: Utilizzare la velocità più bassa per assicurarsi che i pezzi siano ancora attaccati.
  4. Cambiare il terreno di coltura MSC umano ogni 3 giorni. Scambiare due terzi del terreno e osservare la comparsa di crescita di cellule fibrose ogni 2 giorni nei primi 7 giorni, cambiare l'intero terreno e osservarlo su base giornaliera in seguito.
    NOTA: Evitare di spostare la capsula di Petri per i primi 7 giorni. La distinta crescita di cellule simili a fibroblasti è stata osservata in circa 4 giorni.
  5. La sottocultura fino alla confluenza raggiunge l'80%.
    NOTA: Questo passaggio richiede 7-10 giorni.
    1. Preriscaldare il terreno di coltura di PBS, tripsina allo 0,25% e MSC umano privo di xeno a 37 °C in un bagno d'acqua.
    2. Sciacquare con PBS dopo aver aspirato il surnatante con le pipette e staccare le cellule con tripsina preriscaldata allo 0,25% fino a quando le cellule possono essere rimosse picchiettando la capsula di Petri.
    3. Inattivare la tripsina mescolando il terreno di coltura MSC preriscaldato in un rapporto di 4:1, raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
      NOTA: Queste celle sono considerate passaggio 0 (P0).
    4. Scartare il surnatante con una pipetta, risospendere le cellule nel terreno di coltura di MSC umano e inoculare in nuove piastre di Petri a una densità di semina di 1x104 cellule/cm2 per la propagazione.
  6. Utilizzando un emocitometro, contare il numero totale di cellule dei due metodi dopo l'amplificazione al primo, secondo e terzo passaggio. Determinare la morfologia cellulare al microscopio nel primo, terzo e quinto passaggio.
    NOTA: La morfologia di queste cellule dovrebbe essere simile alle cellule P0.
  7. Utilizzare le cellule al quinto passaggio per la citometria a flusso e altri esperimenti.

4. Espressione di marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso

  1. Staccare 5 celle di passaggio (P5) con tripsina allo 0,25%, lavare le cellule con un tampone di colorazione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere i pellet con il tampone di colorazione delle celle a 100 μl ciascuno.
  2. Etichettare ogni provetta e aggiungere le quantità appropriate di anticorpi, che sono stati coniugati con alloficocianina (APC), isotiocianato di fluoresceina (FITC) o ficoeritrina (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE seguendo le istruzioni del produttore21. Incubare per 15-20 minuti al buio a temperatura ambiente.
  3. Centrifugare le cellule colorate a 300 x g per 5 minuti a 4 °C, aspirare il surnatante con una pipetta e lavare una volta con un tampone di colorazione cellulare.
  4. Ripetere la centrifugazione e la risospensione delle cellule con 300 μl del tampone di colorazione cellulare.
  5. Far passare le cellule attraverso il citometro a flusso e analizzare le cellule colorate con anticorpi secondo le istruzioni del produttore.

5. Determinazione della curva di crescita cellulare con il metodo del conteggio cellulare

  1. Preparare una sospensione unicellulare di cellule P5 utilizzando due metodi, diluendole in un terreno di coltura di MSC umano.
  2. Semina 8.000 cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti, con un totale di 21 pozzetti di ciascun metodo da seminare.
    NOTA: Mescolare delicatamente le cellule soffiando e aspirando con pipette prima della semina.
  3. Raccogliere le cellule da tre pozzetti dopo 24 ore di semina. Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro per calcolare il valore medio.
    NOTA: Agitare la piastra prima del conteggio delle cellule. La durata dell'agitazione può essere prolungata per prevenire la formazione di aggregati cellulari.
  4. Ripetere il conteggio delle celle ogni 24 ore per una durata totale di 7 giorni. Tracciare una curva di crescita utilizzando il tempo (d) sull'asse X e la conta delle cellule (x104/mL) sull'asse Y.

Risultati

Le procedure per la raccolta e la coltura delle UC-MSC, nonché la loro successiva analisi, sono riassunte nella Figura 1. L'UC è stata accuratamente sezionata in diverse sezioni utilizzando il metodo unico; lo schema di funzionamento specifico delle principali procedure è illustrato in Figura 2. La crescita delle cellule dalle colture di espianti è stata monitorata e registrata di routine. Le cellule aderenti a forma di fuso sono state osservate circa 4 giorni dopo la coltura degli espianti e sono state sempre più strisciate a forma di vortice. Queste cellule sono state identificate anche come P0 e hanno continuato a proliferare per il successivo passaggio mantenendo dimensioni e morfologia uniformi durante la proliferazione e il passaggio. I metodi convenzionali e attuali hanno mostrato differenze trascurabili in termini di dimensioni e morfologia delle cellule (Figura 3).

Il metodo di dissezione convenzionale prevede la raschiatura del WJ dai vasi sanguigni e dall'epitelio interno della CU. La resa WJ rappresentava una differenza significativa tra i due metodi per aggiustamento del peso. La resa di WJ può essere calcolata misurando la percentuale di peso del WJ nel cavo da 2 cm (2,4 g ± 0,2 g). Un confronto del rapporto di resa WJ tra i metodi attuali e quelli tradizionali ha mostrato un aumento significativo della resa WJ utilizzando il nuovo approccio (Figura 4A). Un'ulteriore analisi contando la quantità totale di WJ-MSC raccolte con entrambi i metodi dal peso equivalente di UC ha mostrato contemporaneamente un divario pronunciato nella quantità di cellule con l'aumentare del numero di passaggi (Figura 4B). La curva di crescita ha indicato che il tasso di proliferazione delle MSC nel nuovo metodo era significativamente più alto rispetto al metodo convenzionale con la stessa densità di inoculazione dopo 2 giorni (Figura 4C). Questi esperimenti dimostrano i vantaggi del metodo attuale, che consente un modo efficiente per aumentare l'offerta efficiente dello stesso materiale.

Seguendo i criteri minimi delle linee guida dell'International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) per la definizione delle MSC, l'immunofenotipo delle MSC dimostra un'espressione positiva di CD105, CD44, CD90, CD73 (superiore al 95%), mentre è assente di CD45, CD19, CD34, CD11b e HLA-DR (meno del 2%)22. Le MSC derivate da WJ sono state studiate mediante citometria a flusso quantitativa (Figura 5); le cellule isolate con entrambi i metodi erano altamente positive per gli antigeni di superficie CD105, CD44, CD90 e CD73 (tutti superiori al 99%), con l'espressione delle molecole di superficie CD45, CD19, CD34, CD11b e HLA-DR espressa al di sotto dei livelli rilevabili (dati non mostrati). Sulla base dei risultati dei marcatori della superficie cellulare, le cellule aderenti possono essere considerate come MSC e la loro identificazione e purezza possono essere garantite.

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Figura 1: Rappresentazione schematica della dissezione e dell'isolamento delle WJ-MSC dal cordone ombelicale. Fase 1: Il campione di cordone ombelicale umano viene raccolto dal neonato e risciacquato con una soluzione salina, seguito dalla perfusione della vena. Il cordino viene poi tagliato in pezzi di 2 cm. Passaggio 2: la gelatina di Wharton pura (WJ) si ottiene utilizzando il metodo attuale, che prevede la separazione delle arterie, dell'epitelio amniotico e dell'epitelio venoso. Il metodo tradizionale viene utilizzato anche per il confronto. Il cordone ombelicale viene sezionato di conseguenza. Passaggio 3: il WJ sezionato viene tagliato in pezzi di 1-3 mm e il piatto viene posto capovolto nell'incubatrice per 30 minuti per rafforzare l'attacco tra i pezzi e la superficie di plastica. I pezzi di WJ vengono quindi coltivati e fatti passare a una densità di semina di 1 x 104 cellule/cm2 fino a raggiungere l'80% di confluenza. Fase 4: La citometria a flusso viene utilizzata per caratterizzare le cellule P5 analizzando i marcatori di superficie delle cellule staminali mesenchimali (MSC). Fase 5: La capacità proliferativa delle cellule viene determinata tracciando una curva di crescita cellulare utilizzando il metodo del conteggio delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Anatomia del cordone ombelicale e dimostrazione schematica della dissezione. (A) La sezione trasversale della UC, evidenziando le arterie (A), la vena (V), la gelatina di Wharton (WJ) e la successiva dissezione, separa la CU in diversi compartimenti. (B) Dimostrazione schematica della rimozione dello strato epiteliale amniotico. L'incisione viene praticata lungo la linea tratteggiata sull'epitelio amniotico, separando l'epitelio a partire dall'angolo laterale del cordone. (C) Dimostrazione schematica della rimozione della vena epiteliale. Capovolgere il cavo (la direzione della freccia indica la direzione della forza) espone l'epitelio venoso per la rimozione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Caratteristiche morfologiche delle WJ-MSC primarie coltivate e passate. La crescita delle cellule fibroblastoidi distinte dagli espianti può essere osservata intorno al giorno 4 (indicata dalle frecce) e mostra sempre più un modello di crescita simile a un vortice. Gli espianti sono stati rimossi e subcoltivati; Le cellule isolate erano omogenee per quanto riguarda le dimensioni e la morfologia visualizzate. È stata osservata una differenza insignificante nelle dimensioni e nella morfologia delle cellule tra i due metodi. Barra della scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Analisi comparativa grafica della resa WJ e delle caratteristiche di crescita delle MSC in coltura. (A) Confronto della resa WJ utilizzando 2 cm di UC con un peso iniziale di 2,4 g ± 0,2 g con entrambi i metodi. Resa WJ = (peso di WJ) / (peso iniziale del cordone non lavorato. Rapporto tra rendimento WJ (%) = (rendimento WJ) / (rendimento WJ medio del metodo corrente) × 100. (B) Confronto del conteggio delle cellule dopo la coltura e il passaggio nelle stesse condizioni con entrambi i metodi. (C) Curve di crescita delle cellule P5 in entrambi i metodi. Tutti gli esperimenti includevano tre repliche biologiche e le differenze statistiche sono state analizzate con il metodo ANOVA a due vie (***p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Espressione della superficie cellulare delle MSC analizzata mediante citometria a flusso. Le cellule P5 raccolte sia con i metodi convenzionali che con quelli attuali sono sottoposte ad analisi di citometria a flusso. Gli antigeni di superficie CD44, CD105, CD90 e CD73 erano altamente positivi (tutti superiori al 99%), mentre le espressioni di CD45, CD19, CD34, CD11b e le molecole di superficie HLA-DR erano al di sotto del limite di rilevamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Le MSC rappresentano un'area di ricerca dinamica con profonde implicazioni per la medicina rigenerativa22. Le loro proprietà uniche li rendono un punto focale per l'indagine scientifica e hanno il potenziale per rivoluzionare il trattamento di un'ampia gamma di malattie e lesioni7. Le WJ-MSC sono un sottogruppo distinto di MSC, che possono essere ottenute dal tessuto connettivo gelatinoso all'interno della CU situato tra l'epitelio intervascolare e amniotico23. L'applicazione clinica delle MSC risiede nel raggiungimento di un numero sufficiente di cellule24. Tuttavia, all'aumentare del numero di passaggi, le cellule hanno iniziato a mostrare un certo grado di fenomeno di invecchiamento e la capacità proliferativa delle MSC è diminuita gradualmente dopo P524. L'ottimizzazione dei metodi per migliorare la resa delle MSC è, quindi, imperativa.

Il modo più efficiente per isolare le WJ-MSC è quello di sezionare l'intera WJ preservandone l'integrità6. La ricerca mostra che queste cellule di confine provenienti dalle regioni di confine del cordone ombelicale hanno una caratteristica di migrazione più elevata e un tasso di proliferazione più elevato rispetto alle WJ-MSC intervascolari23. Tuttavia, le regioni e i metodi per la dissezione di WJ non sono stati standardizzati e non è chiaro se le popolazioni di cellule staminali all'interno di WJ-MSC condividano le stesse qualità a causa della mancanza di chiari confini istologici tra le partizioni3.

Studi precedenti hanno indicato differenze significative nelle proprietà delle WJ-MSC derivate da vari compartimenti del cordone ombelicale, con cellule situate vicino alla superficie amniotica che mostrano una maggiore capacità proliferativa3. L'attuale metodo unico di dissezione delle UC e di isolamento delle WJ-MSC mira a ridurre sia la perdita del WJ di rivestimento che il danno cellulare, migliorando la resa e la vitalità cellulare. Questo protocollo dimostra un metodo che ha facilitato l'elaborazione della CU in WJ quasi intatta. La fase principale del protocollo prevede la rimozione dello strato epiteliale attraverso il peeling e la dissezione smussata. La fase di innovazione consiste nel rimuovere lo strato epiteliale longitudinalmente con pinze per zanzare. Questo approccio è efficace nel ridurre il danno cellulare adiacente causato dalla dissezione tagliente convenzionale con le forbici25.

L'endotelio della vena è fragile e difficile da eliminare. Dopo aver rimosso l'epitelio amniotico dalla vena ombelicale, il cordone ombelicale viene fatto passare attraverso la vena per esporre l'endotelio. La tensione interna creata dal WJ viene quindi utilizzata per staccare l'endotelio della vena, riducendo così al minimo l'interferenza delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) durante i successivi processi di coltura cellulare.

Viene adottato il metodo di coltura dell'espianto, che ha una resa maggiore rispetto ad altri metodi disponibili18. Le cellule non attaccate saranno gradualmente rimosse attraverso lo scambio del terreno di coltura di MSC umano, con conseguente perdita di cellule26. Gli espianti che non aderiscono alla plastica potrebbero ostacolare la crescita cellulare nell'esperienza precedente. È necessario considerare l'impatto del vapore acqueo emesso dal tessuto a causa delle variazioni tra la temperatura interna ed esterna dell'incubatrice. Per mantenere lo stato asciutto della capsula di Petri, è stata implementata una fase innovativa di capovolgere la capsula per 30 minuti durante l'incubazione con il coperchio sul fondo. Questa inversione di una piastra ha evitato la condensazione del vapore acqueo al contatto tra il tessuto e la superficie della piastra di Petri, che a sua volta consente un migliore attacco degli esosomi alla superficie plastica per migliorare la crescita cellulare.

Il metodo attuale viene confrontato con il metodo di dissezione convenzionale misurando la percentuale in peso del WJ ottenuto e la quantità di MSC coltivate e passate; Il nuovo metodo ha dimostrato una resa significativamente più elevata di WJ e un'ulteriore quantità di MSC raccolte. Sebbene qualsiasi protocollo per isolare le popolazioni di cellule staminali da ciascuno di questi compartimenti comporti il rischio di contaminazione cellulare dagli altri compartimenti, i risultati hanno dimostrato la purezza delle MSC isolate, caratterizzate da un'elevata espressione di marcatori mesenchimali (tutti superiori al 99%) e da una minima rilevazione di marcatori ematopoietici ed endoteliali (dati non mostrati). I risultati hanno dimostrato che le WJ-MSC sono pure e adatte a varie applicazioni, in linea con le linee guida ISCT21. Le MSC coltivate hanno mostrato cellule simili ai fibroblasti in un breve periodo e le cellule si sono formate sempre più in cellule a forma di vortice, mostrando un grande potenziale proliferativo e proprietà migratorie.

Il protocollo delineato in questo studio presenta diverse carenze. In primo luogo, la competenza richiesta all'operatore è elevata, come indicato dalla separazione dell'epitelio amniotico. Ciò potrebbe ostacolarne l'adozione diffusa nella ricerca o nelle applicazioni cliniche. In secondo luogo, il protocollo si basa fortemente sulla manipolazione manuale durante la dissezione, che può introdurre incongruenze tra gli esperimenti o gli operatori. La standardizzazione del processo di dissezione migliorerebbe l'affidabilità e la riproducibilità del protocollo25. Inoltre, la mancanza di altri confronti con il metodo convenzionale lascia domande senza risposta.

In conclusione, il metodo attuale fornisce un modo efficiente per separare il WJ intatto dall'epitelio amniotico e dai vasi, ottenendo un raccolto che include la gelatina di Wharton perivascolare e subamniotica. L'introduzione di una fase di incubazione invertita contribuisce ulteriormente a migliorare l'attaccamento delle MSC. L'analisi comparativa con i metodi tradizionali dimostra i vantaggi significativi del protocollo proposto in termini di ottenimento di una resa WJ più elevata e di raccolta di più MSC con una migliore capacità proliferativa. I risultati evidenziano anche la purezza delle MSC isolate, come indicato da un modello distinto di espressione dei marcatori di superficie cellulare. Questo metodo potrebbe migliorare la resa e la capacità proliferativa delle MSC, offrendo un metodo economico per aumentare la produzione di MSC.

Dichiarazioni

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (82172107), dalla Natural Science Foundation of Guangdong Province, Cina (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), Shenzhen Medical Research Fund (SMRF. D2301015), il Comitato municipale per l'innovazione scientifica e tecnologica di Shenzhen (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) e il Fondo speciale per lo sviluppo economico e tecnologico del distretto di Longgang (LGKCYLWS2022007).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo CD44 anti-umano APC Bioleggenda 
Piastre per colture cellulari a 24 pozzettiThermo Scientific142475
APC anticorpo CD73 (Ecto-5'-nucleotidasi) Bioleggenda 
APC Mouse IgG1, κ Isotipo Ctrl (FC) AnticorpoBiolegend 
AutoclaveHIRAYAMAHVE-50
Contatore di celle automaticoCountstarFL-CD
BAMBANKER Soluzione di crioconservazioneWako302-14681
Tampone per colorazione cellulareBiolegend 
Macchina CentrifugaEppendorf5424R
Banco PulitoShanghai ZhiChengC1112B
CO2 IncubatoreThermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
ElettrotermostaticoShanghai JingHongDHG-9423A
Anticorpo FITC anti-umano CD105 Bioleggenda 
FITC anticorpo CD90 (Thy1) umano Bioleggenda 
FITC IgG1 del topo, κ Isotipo Ctrl (FC) AnticorpoBiolegend 400110
Citometria a flussoBeckmanCitocitometro CytoFLEX
Superior Marienfeld640410
Colorazione intracellulare Permeabilizzazione Wash Buffer (10×) Bioleggenda 
Microscopio Biologico InvertitoZEISSAxio Vert. A1
Serbatoio di Stoccaggio Azoto LiquidoThermo ScientificCY50935-70
Soluzione salina normale (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE anti-umano CD11b AnticorpoBiolegend 
PE anti-umano CD19 Anticorpo Bioleggenda 
PE anti-umano CD34 AntibodyBiolegend 
PE anti-umano CD45 AntibodyBiolegend 368510
PE anticorpo HLA-DR umano Bioleggenda 
PE IgG1 di Topo, κ Isotipo Ctrl (FC) AnticorpoBiolegend 
PE IgG2a di Topo, κ Isotipo Ctrl (FC) AnticorpoBiolegend 
Bilancia elettronica di precisioneSatoriusPRACTUM313-1CN
Macchina per il ghiaccio a fiocco di neveZIEGRAZBE 30-10
tubo di plastica sterilizzato da 50 mLGreniner227270
Bagno d'acqua termostaticoShanghai YiHengHWS12
Tripsina 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-AdvancedHelios 
Sistema di purificazione dell'acqua ultrapura e puraMilli-QMilli-Q Riferimento
Xeno-Free Terreno di coltura MSC umanoFUKOKU 
338806344006 400122 420201323204328108421002393112392506343606307606400114 400214 HPCFDCGL50T2011301

Riferimenti

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