Method Article

Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica

DOI:

10.3791/66922

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July 12th, 2024

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1Department of Ophthalmology, University of California, Los Angeles, 2Doheny Eye Institute, 3Molecular, Cellular, and Integrative Physiology Interdepartmental PhD Program, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recentemente abbiamo identificato l'irrigidimento capillare retinico come un nuovo paradigma per la disfunzione retinica associata al diabete. Questo protocollo elabora le fasi per l'isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale da colture endoteliali retiniche, seguite da una descrizione della tecnica di misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La degenerazione capillare retinica è un segno clinico distintivo delle prime fasi della retinopatia diabetica (DR). I nostri studi recenti hanno rivelato che l'irrigidimento capillare retinico indotto dal diabete svolge un ruolo causale cruciale e precedentemente non riconosciuto nella degenerazione dei capillari retinici mediata dall'infiammazione. L'aumento della rigidità capillare retinica deriva dalla sovraespressione della lisil ossidasi, un enzima che lega e irrigidisce la matrice subendoteliale. Poiché si prevede che affrontare la DR nella fase iniziale prevenga o rallenti la progressione della DR e la perdita della vista associata, la matrice subendoteliale e la rigidità capillare rappresentano bersagli terapeutici rilevanti e nuovi per la gestione precoce della DR. Inoltre, la misurazione diretta della rigidità capillare retinica può fungere da fase cruciale per la convalida preclinica per lo sviluppo di nuove tecniche di imaging per la valutazione non invasiva della rigidità capillare retinica in soggetti animali e umani. Con questa visione in mente, forniamo qui un protocollo dettagliato per l'isolamento e la misurazione della rigidità dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale utilizzando la microscopia a forza atomica.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I capillari retinici sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi retinica e della funzione visiva. Infatti, la loro degenerazione nel diabete precoce è fortemente implicata nello sviluppo di complicanze potenzialmente visibili della retinopatia diabetica (DR), una condizione microvascolare che colpisce quasi il 40% di tutti gli individui con diabete1. L'infiammazione vascolare contribuisce in modo significativo alla degenerazione capillare retinica nella DR. Studi precedenti hanno dimostrato un ruolo importante per segnali molecolari e biochimici aberranti nell'infiammazione vascolare retinica indotta dal diabete 2,3. Tuttavia, lavori recenti hanno introdotto un nuovo paradigma per la patogenesi della DR che identifica l'irrigidimento capillare retinico come un determinante cruciale, ma precedentemente non riconosciuto, dell'infiammazione e della degenerazione vascolare retinica 4,5,6.

In particolare, l'aumento della rigidità capillare retinica indotto dal diabete è causato dalla sovraregolazione dell'enzima reticolante del collagene lisil ossidasi (LOX) nelle cellule endoteliali retiniche (EC), che irrigidisce la matrice subendoteliale (membrana basale)4,5,6. L'irrigidimento della matrice, a sua volta, irrigidisce le EC retiniche sovrastanti (a causa della reciprocità meccanica), portando così all'aumento complessivo della rigidità capillare retinica4. Fondamentalmente, questo irrigidimento capillare retinico indotto dal diabete da solo può promuovere l'attivazione della EC retinica e la morte EC mediata dall'infiammazione. Questa regolazione meccanica dei difetti dell'EC retinica può essere attribuita all'alterata meccanotrasduzione endoteliale, il processo mediante il quale i segnali meccanici vengono convertiti in segnali biochimici per produrre una risposta biologica 7,8,9. È importante sottolineare che i segnali meccanici EC alterati e la struttura della matrice subendoteliale sono stati anche implicati nella degenerazione vascolare coroideale associata alla degenerazione maculare precoce legata all'età (AMD)10,11,12, il che attesta le implicazioni più ampie della meccanobiologia vascolare nelle malattie degenerative della retina.

In particolare, l'irrigidimento dei capillari retinici si verifica all'inizio del diabete, che coincide con l'insorgenza dell'infiammazione retinica. Pertanto, l'aumento della rigidità capillare retinica può fungere sia da bersaglio terapeutico che da marcatore diagnostico precoce per la DR. A tal fine, è importante ottenere misurazioni affidabili e dirette della rigidità dei capillari retinici e della matrice subendoteliale. Ciò può essere ottenuto utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM), che offre una tecnica unica, sensibile, accurata e affidabile per misurare direttamente la rigidità delle cellule, della matrice extracellulare e dei tessuti13. Un AFM applica una forza di indentazione minuta (livello di nanoNewton) sul campione la cui rigidità determina la misura in cui il cantilever AFM di indentazione si piega: più rigido è il campione, più il cantilever si piega e viceversa. Abbiamo utilizzato ampiamente l'AFM per misurare la rigidità delle cellule endoteliali in coltura, delle matrici subendoteliali e dei capillari retinici isolati di topo 4,5,6,11,12. Queste misurazioni della rigidità dell'AFM hanno contribuito a identificare la meccanobiologia endoteliale come un determinante chiave della patogenesi di DR e AMD. Per aiutare ad ampliare l'ambito della meccanobiologia nella ricerca sulla vista, qui forniamo una guida passo passo sull'uso dell'AFM per le misurazioni della rigidità dei capillari retinici isolati di topo e della matrice subendoteliale.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con la dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e approvate dai comitati istituzionali per l'uso degli animali e della cura (IACUC; numero di protocollo ARC-2020-030) presso l'Università della California, Los Angeles (numero di garanzia per il benessere degli animali dell'istituto OLAW A3196-01). Il seguente protocollo è stato eseguito utilizzando capillari retinici isolati da topi maschi adulti (20 settimane) C57BL/6J del peso di ~25 g (topi diabetici) e ~32 g (topi non diabetici; Jackson Laboratory).

1. Isolamento dei capillari retinici di topo per la misura della rigidità AFM (Giorni 1-4)

NOTA: Questo protocollo, riportato in un recente studio4, descrive in dettaglio l'enucleazione e la fissazione lieve dell'occhio del topo, l'isolamento della retina e la digestione della tripsina e il successivo montaggio della vascolarizzazione retinica risultante su vetrini per microscopia per la misurazione della rigidità AFM.

  1. Enucleazione e fissazione lieve (Giorno 1)
    1. Dopo l'eutanasia del topo con esposizione all'anidride carbonica seguita da lussazione cervicale, inserire una micro pinza dietro il bulbo oculare, tenere l'attacco muscolare ed estrarre con cautela l'occhio senza pizzicare troppo strettamente le micro pinze, che potrebbero recidere il nervo ottico.
    2. Posizionare l'occhio enucleato in formalina al 5% (v/v) in PBS per 24 ore a 4 °C per una fissazione lieve.
      NOTA: Sulla base dell'esperienza4, gli occhi non fissati o più lievemente fissati producono capillari fragili che si frammentano durante la preparazione del campione AFM e la misurazione della rigidità.
  2. Isolamento retinico (Giorno 2)
    1. Posizionare l'occhio fisso su un pezzo di carta oleata sotto un microscopio da dissezione. Successivamente, utilizzando una micro pinza, tenere i resti del muscolo e del nervo ottico attaccati all'esterno dell'occhio posteriore e orientare l'occhio in modo che la cornea sia rivolta su un lato (Figura 1).
    2. Utilizzando una lama chirurgica, praticare un'incisione 1-2 mm dietro e parallela al limbus (giunzione cornea-sclera). Quindi, tenendo l'occhio in posizione con la micro pinza, applicare una forza verso il basso con la lama e continuare a premere fino a quando il segmento anteriore dell'occhio non è completamente separato dall'estremità posteriore (Figura 1). Scartare il segmento anteriore e la lente. Non segare avanti e indietro in quanto ciò potrebbe causare danni alla retina.
    3. Trasferire il segmento posteriore (sclera, coroide e retina) in un piatto di 6 cm riempito con PBS (pH 7,4).
    4. Usando una micro spatola e contemporaneamente tenendo delicatamente il nervo ottico con una micro pinza, estrai la retina. Conservare la retina in una provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente PBS a 4 °C fino all'isolamento capillare.
       
  3. Risciacqui retinici
    1. Per risciacquare una retina, riempire sei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti con 1 mL di H2O (ddH2O) a doppia distillazione. Successivamente, utilizzando una pipetta Pasteur rovesciata, trasferire la retina dalla provetta da microcentrifuga da 2 ml nel primo pozzetto.
    2. Sciacquare la retina sull'agitatore orbitale a 120 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
    3. Utilizzando una pipetta P1000, pipettare con cura l'acqua su e giù adiacente alla retina, soffiando acqua sulla retina per provocare una leggera agitazione.
    4. Utilizzando la pipetta di vetro rovesciata, trasferire la retina nel secondo pozzetto e ripetere i passaggi 1.3.2 e 1.3.3 4 volte, con ogni risciacquo effettuato in un pozzetto fresco (contenente ddH2O).
    5. Infine, trasferire la retina al sesto pozzetto e sciacquarla durante la notte (O/N) a RT sull'agitatore orbitale impostato a 100 giri/min per facilitare la separazione della neuroglia retinica dai vasi sanguigni durante la digestione della tripsina.
  4. Digestione retinica della tripsina (Giorno 3)
    1. Preparare una soluzione di tripsina al 10% (p/v) sciogliendo la polvere di tripsina 1:250 in tampone Tris (pH 8; 0,1 M). Mescolare delicatamente capovolgendo più volte il tubo conico per ridurre al minimo la formazione di bolle, il che rende più difficile confermare la solubilità della tripsina.
    2. Equilibrare la soluzione di tripsina al 10% in un bagnomaria a 37 °C per 10-15 minuti. Una volta che la polvere di tripsina si è completamente sciolta, filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,2 μm.
    3. In una piastra a 12 pozzetti, aggiungere 2 mL/pozzetto/retina della soluzione filtrata di tripsina al 10%. Aggiungere un po' di soluzione di tripsina in più nel pozzetto vicino (per equilibrare le pareti della pipetta di vetro per i passaggi successivi).
    4. Aggiungere 3 mL di ddH2O in tre pozzetti di una piastra a 6 pozzetti (dedicare questi tre pozzetti per una retina).
    5. In una provetta conica da 15 mL, inserire un puntale P200 prima di aggiungere 4 mL della soluzione filtrata di tripsina al 10%. Trasferire questo tubo conico nel bagno a 37 °C per consentire alla punta di essere immersa nella tripsina per 2-3 minuti, in quanto ciò aiuta a prevenire che la retina si attacchi alle pareti della punta nelle ultime fasi.
    6. Dopo il risciacquo O/N della retina (dal punto 1.3.5), utilizzare una pipetta P1000 per pipettare accuratamente l'acqua su e giù adiacente alla retina, spruzzando acqua sulla retina per provocare una leggera agitazione.
    7. Utilizzando una pipetta di vetro rovesciata, trasferire la retina risciacquata nel pozzetto contenente tripsina della piastra a 12 pozzetti (dal punto 1.4.3). Assicurarsi che la retina venga trasferita con una quantità minima di ddH2O residuo in modo da non diluire significativamente la soluzione di tripsina. Incubare per 3 ore a 37 °C.
    8. Centrando la punta P200 imbevuta di tripsina (dal passaggio 1.4.5) sull'area del nervo ottico, pipettare delicatamente l'intera rete vascolare su e giù per dissociare il tessuto non vascolare14.
    9. Utilizzando una pipetta di vetro rovesciata pre-risciacquata con tripsina (pipettando la tripsina su e giù 5 volte), trasferire il sistema vascolare retinico nel primo pozzetto contenente ddH2O della piastra a 6 pozzetti (dal passaggio 1.4.4).
    10. Agitare la piastra e pipettare il sistema vascolare su e giù utilizzando una pipetta di vetro con tripsina invertita per rimuovere qualsiasi residuo di tessuto non vascolare.
    11. Utilizzando la pipetta di vetro, trasferire il sistema vascolare retinico nel secondo pozzetto contenente ddH2O della piastra a 6 pozzetti e conservare a 4 °C fino al montaggio sul vetrino per la misurazione della rigidità AFM.
      NOTA: Il sistema vascolare retinico idratato (in PBS) è strutturalmente intatto a 4 °C per un massimo di 2 settimane. Tuttavia, le misurazioni di routine della rigidità devono essere effettuate da capillari appena isolati.
  5. Montaggio della vascolarizzazione retinica per la misurazione della rigidità AFM (Giorno 4)
    1. Utilizzando una pipetta di vetro con tripsina invertita, trasferire il sistema vascolare retinico nel terzo pozzetto contenente ddH2O della piastra a 6 pozzetti per rimuovere eventuali residui di soluzione di tripsina.
    2. Pulire accuratamente (utilizzando ddH2O e tessuto raschiante) un vetrino per microscopia a superficie carica che verrà utilizzato per il montaggio della rete vascolare per la misurazione della rigidità AFM.
      NOTA: La superficie caricata del vetrino fornisce un forte legame per la rete vascolare durante la misurazione AFM.
    3. Etichettare il vetrino e disegnare una regione circolare di 4-5 cm attorno al centro con una penna idrofobica per evitare fuoriuscite d'acqua durante i passaggi successivi.
    4. Utilizzando una pipetta di vetro scissa con tripsina invertita, trasferire con cura il sistema vascolare retinico al centro della regione contrassegnata.
    5. Utilizzando una pipetta P200, rimuovere con cura quanta più acqua in eccesso possibile da un bordo senza aspirare accidentalmente il sistema vascolare nel puntale.
    6. Posizionare il vetrino in una cabina di biosicurezza (cappa BSL-2) vicino al lato anteriore (rete filtrata) e lasciare evaporare l'acqua residua.
    7. Una volta che il sistema vascolare è quasi asciutto, al microscopio a contrasto di fase (ingrandimento 4x), reidratare accuratamente il sistema vascolare aggiungendo lentamente ddH2O con una pipetta P200 su un lato della regione contrassegnata. L'aggiunta di ddH2O direttamente sul sistema vascolare ne provoca il distacco.
    8. Acquisisci immagini a contrasto di fase del sistema vascolare reidratato con ingrandimenti 4x e 20x per assicurarti che abbia una buona integrità strutturale e sia correttamente distribuito (non piegato su se stesso) e attaccato al vetrino, che sono criteri essenziali per una misurazione affidabile della rigidità AFM.

2. Ottenimento di matrice subendoteliale da colture di cellule endoteliali microvascolari retiniche (REC) (giorni 1-17)

NOTA: Questo protocollo, adattato da Beacham et al.15 e riportato in recenti studi 4,5,6, descrive la coltura di REC su vetrini di vetro modificati, seguita da decellularizzazione per ottenere una matrice subendoteliale per la successiva misurazione della rigidità AFM.

  1. Preparazione dei vetrini coprioggetti rivestiti di gelatina e della placcatura delle celle (Giorno 1)
    NOTA: Eseguire il rivestimento in gelatina e le successive fasi di risciacquo PBS++ in una cappa di coltura tissutale prima di passare a una cappa chimica per le successive fasi di trattamento con glutaraldeide ed etanolammina.
    1. Posizionare un vetrino coprioggetti circolare autoclavato da 12 mm di diametro per pozzetto di una piastra sterile a 24 pozzetti e aggiungere 500 μL di gelatina sterile preriscaldata allo 0,2% (p/v) (diluita in PBS contenente calcio e magnesio; PBS++) a ciascun pozzetto contenente vetrino coprioggetti. Incubare per 1 ora a 37 °C.
    2. Aspirare la soluzione di gelatina, sciacquare una volta i vetrini coprioggetti con PBS++ sterile e reticolare la gelatina rivestita aggiungendo 500 μL di glutaraldeide all'1% (v/v) per 30 minuti a RT.
    3. Raccogliere e smaltire correttamente (secondo le linee guida istituzionali) la soluzione di glutaraldeide prima di risciacquare i vetrini coprioggetti con PBS++ per 5 minuti su un agitatore orbitale a 100 RPM in RT. Ripetere questa fase di risciacquo 5 volte. Durante i primi tre risciacqui, sollevare i vetrini coprioggetti utilizzando una pinzetta sterile per consentire un risciacquo accurato della glutaraldeide. Qualsiasi quantità residua può ridurre la vitalità cellulare.
    4. Aggiungere 800 μl di etanolammina 1 M al vetrino coprioggetto reticolato con gelatina per 30 minuti a RT per spegnere eventuali tracce residue di glutaraldeide nel pozzetto.
    5. Raccogliere e smaltire correttamente (come da linee guida istituzionali) la soluzione di etanolammina e sciacquare i vetrini coprioggetti 5 volte con PBS++ per 5 minuti su un agitatore orbitale a 100 giri/min in RT. Durante i primi tre risciacqui, sollevare i vetrini coprioggetti utilizzando una pinzetta sterile per consentire un risciacquo accurato dell'etanolammina. Qualsiasi quantità residua può ridurre la vitalità cellulare.
    6. I vetrini coprioggetti reticolati sono ora pronti per la placcatura cellulare.
      NOTA: Sebbene le cellule vengano regolarmente piastrate subito dopo la preparazione del vetrino coprioggetti, può essere utile confrontare la placcatura delle cellule su vetrini coprioggetti in gelatina reticolata conservati in PBS++ a 4 °C per 1-2 giorni.
    7. In condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale, le cellule endoteliali microvascolari retiniche (REC) vengono piatte in un terreno/pozzetto da 500 μL a una densità che raggiunge il 100% di confluenza entro 24 ore, come confermato dalla microscopia a contrasto di fase.
      NOTA: Raggiungere la confluenza entro 24 ore è importante in quanto la quiescenza REC risultante aumenterà la capacità delle cellule di secernere matrice (fare riferimento al passaggio seguente). Nella nostra esperienza con i REC umani, una densità di placcatura di 4 x 104 cellule/cm2 è sufficiente per raggiungere la confluenza entro 24 ore. Tuttavia, poiché la dimensione dei REC varia a seconda delle specie (ad esempio, i REC dei topi sono significativamente più piccoli), potrebbe essere necessario ottimizzare la densità iniziale della placcatura.
  2. Produzione di matrice subendoteliale mediante coltura REC (Giorno 2-16)
    1. Dopo che le cellule hanno raggiunto la confluenza (~24 h), sostituire il terreno di coltura con un terreno fresco integrato con acido ascorbico filtrato sterile (concentrazione finale di 200 μg/mL).
      NOTA: Qualsiasi trattamento REC con fattori di rischio di malattia (ad esempio, glicemia alta, prodotti finali della glicazione avanzata, ecc.) o agenti farmacologici può iniziare ora, insieme al trattamento con acido ascorbico.
    2. Cambiare il terreno di coltura integrato con acido ascorbico a giorni alterni per 15 giorni.
      NOTA: L'acido ascorbico è instabile in soluzione. Preparare una soluzione madre fresca 100X a giorni alterni per un'integrazione media.
  3. Decellularizzazione delle colture REC per ottenere la matrice subendoteliale (Giorno 16)
    1. Dopo 15 giorni di trattamento con acido ascorbico, rimuovere il terreno e sciacquare le cellule con PBS privo di calcio/magnesio.
    2. Decellularizzare le colture REC aggiungendo 250 μL/per pozzetto di tampone di decellularizzazione caldo (20 mM di idrossido di ammonio e 0,5% di Triton X-100 in PBS) per ~2-3 minuti. Confermare la rimozione delle cellule al microscopio a contrasto di fase (ingrandimento 10x).
    3. Rimuovere delicatamente il tampone di decellularizzazione senza disturbare la matrice subendoteliale secreta da REC e aggiungere 0,5 mL di PBS a ciascun pozzetto.
      NOTA: Per garantire che la matrice sottoendoteliale non si stacchi durante questa e le successive fasi di risciacquo, eseguire un risciacquo delicato solo con una pipetta P1000. Non eseguire l'aspirazione a vuoto.
    4. Conservare le piastre a 4 °C per una notte per stabilizzare la matrice secreta da REC.
  4. Trattamento con DNasi della matrice subendoteliale per rimuovere i detriti cellulari (Giorno 17)
    1. Sciacquare la matrice subendoteliale del passaggio 2.3.4 con 800 μL di PBS/pozzetto.
    2. Rimuovere delicatamente il PBS e incubare la matrice con 200 μL di DNasi I priva di RNasi (30 K unità) a 37 °C per 30 minuti per rimuovere tutte le tracce di detriti cellulari. Verificare l'efficienza del trattamento con DNasi cercando attentamente i detriti cellulari al microscopio a contrasto di fase.
    3. Rimuovere delicatamente la soluzione di DNasi I e sciacquare due volte la matrice subendoteliale con 800 μL di PBS/pozzetto.
    4. Verificare che la matrice sottoendoteliale fibrosa su macroscala sia visibile al microscopio a contrasto di fase (ingrandimento 10x). La visualizzazione delle fibre di matrice nanometrica più fini richiede la scansione topografica AFM o l'imaging confocale ad alta risoluzione di proteine della matrice immunomarcate con ingrandimento 100x.
    5. Utilizzare immediatamente la matrice subendoteliale fresca (non fissata) per la misurazione della rigidità AFM.
    6. Dopo la misurazione dell'AFM, fissare i campioni della matrice con paraformaldeide all'1% (v/v) (15 minuti a temperatura ambiente) e conservati a 4 °C per l'immunomarcatura con anticorpi contro le proteine della matrice subendoteliale e/o gli enzimi reticolanti.

3. Misurazione della rigidità AFM

NOTA: Questo protocollo, adattato da un manuale utente AFM standard e riportato in recenti studi 4,5, descrive in dettaglio l'acquisizione e l'analisi dei dati di rigidità dai capillari retinici e dalla matrice subendoteliale utilizzando un software AFM e di analisi dei dati. Sebbene i passaggi descritti di seguito siano basati su un modello specifico di AFM (vedi Tabella dei materiali), i principi di base sono generalmente applicabili a tutti i modelli AFM.

  1. Selezione della sonda a sbalzo
    NOTA: I campioni biologici morbidi richiedono cantilever morbidi che possono piegarsi all'indentazione del campione mentre le dimensioni della sonda sono selezionate per corrispondere alle dimensioni del campione.
    1. Per la misurazione della rigidità di vasi retinici di topo di 5-8 μm di diametro, utilizzare una sonda a sbalzo con raggio di 1 μm con una costante elastica (k) di 0,2-0,3 N/m. Per la misurazione della rigidità di una matrice subendoteliale composta da fibre su scala nanometrica, utilizzare una sonda a sbalzo con raggio di 70 nm con una costante elastica (k) di 0,06-0,1 N/m.
  2. Montaggio a sbalzo
    1. Sul computer AFM, aprire il software che controlla l'unità AFM e la fotocamera collegata a un microscopio a contrasto di fase che viene utilizzato per visualizzare il cantilever e il campione.
    2. Fissare il supporto a sbalzo sul supporto di cambio a sbalzo e montare il cantilever selezionato sul supporto utilizzando una pinza da orologiaio sotto uno stereoscopio senza danneggiare fisicamente il cantilever. Serrare la vite sul supporto per fissare il cantilever.
    3. Posizionare e bloccare il supporto a sbalzo sulla testa AFM che poggia sul supporto.
    4. Utilizzando la funzione del motore passo-passo nel software AFM, ritirare la testa AFM nel punto più alto e impostare quella posizione come punto zero nel software. Questo passaggio impedisce al cantilever AFM di colpire accidentalmente lo stadio del campione durante il montaggio della testa AFM (passaggio successivo).
    5. Sollevare con cautela la testa AFM dal suo supporto e montarla sul palco campione AFM posizionando le gambe nelle rispettive fessure.
  3. Allineamento laser
    NOTA: L'allineamento iniziale del laser viene eseguito senza alcun campione (cioè in modalità Aria) in quanto garantisce un allineamento più preciso del raggio laser sulla punta a sbalzo (impedendo la rifrazione del laser nel liquido). Tuttavia, poiché i campioni biologici sono immersi in un mezzo che ha un indice di rifrazione diverso da quello dell'aria, è importante riallineare il laser nel mezzo prima della misurazione della rigidità.
    1. Per l'allineamento laser in aria, posizionare la testa AFM sul tavolino del campione e utilizzare l'obiettivo 10x e la fotocamera collegata per visualizzare il cantilever sul monitor in modalità live. Il laser a infrarossi è nascosto alla vista dell'utente ma è visibile con una telecamera CCD.
    2. Selezionare la funzione Modalità di contatto Spettroscopia di forza sul software e aprire la finestra intitolata Allineamento laser.
    3. Utilizzando le due viti contrassegnate lateralmente con il laser sulla testa AFM, focalizzare il raggio laser sul cantilever in modo tale che il valore SUM nella finestra di allineamento laser sia il più alto. Per ottenere ciò, focalizzare il laser verso o intorno al centro del cantilever.
    4. Utilizzando le viti di regolazione del rivelatore, regolare il fotorilevatore in modo che il punto laser si trovi al centro della finestra di allineamento laser.
    5. Utilizzando la vite di regolazione dello specchio, regolare lo specchio per assicurarsi che il valore SUM sia al valore più alto possibile.
      NOTA: Un valore SUM elevato garantisce una valutazione sensibile e accurata della rigidità del campione. Pertanto, è necessario eseguire sia l'allineamento laser che la regolazione dello specchio per ottenere il valore SUM più alto.
    6. Successivamente, per l'allineamento laser nel liquido, aggiungere il terreno di coltura desiderato in un piatto e montarlo saldamente sul tavolino per evitare vibrazioni o derive, che creano artefatti di misurazione durante l'indentazione del campione.
    7. Mentre guardi il feed della telecamera in tempo reale focalizzato sul cantilever, abbassalo nel liquido utilizzando la funzione del motore passo-passo.
    8. Ripetere i passaggi 3.3.4 e 3.3.5 per assicurarsi che il valore SUM rimanga il più alto e che il punto laser si trovi al centro della finestra di allineamento laser.
  4. Taratura della costante della molla a sbalzo
    NOTA: Sebbene le sonde a sbalzo siano dotate di una costante elastica calibrata dal produttore (k), è buona norma verificarne in modo indipendente il valore (in liquido) prima dell'inizio di una misurazione. Utilizzare una superficie di vetro pulita che riduca al minimo le interazioni tra la sonda a sbalzo e la superficie di vetro.
    1. La forza di setpoint applicata dal cantilever imposta la deflessione massima del laser dal cantilever consentita per una rientranza della forza. Impostarlo inizialmente a 1,5 V. Se il cantilever non riesce ad avvicinarsi a questa data forza di setpoint, aumentarla in modo incrementale fino a far rientrare il campione e generare una curva di indentazione della forza.
    2. La lunghezza Z indica la distanza massima di cui il piezo z si ritira dopo che il cantilever ha raggiunto il setpoint durante l'indentazione del campione. La lunghezza Z dovrebbe essere almeno sufficiente per garantire che la sonda a sbalzo si separi in modo pulito dal campione. Per la calibrazione della costante elastica su una superficie di vetro, impostare la lunghezza Z a 1 μm.
    3. La velocità Z si riferisce alla velocità con cui il piezo z sposta il cantilever verticalmente verso il basso verso il campione durante l'indentazione della forza. Dovrebbe essere ottimizzato perché una velocità molto bassa catturerà principalmente il comportamento viscoso del campione, mentre una velocità molto alta catturerà principalmente il comportamento elastico. Ci si aspetta che la velocità ottimale catturi la vera natura viscoelastica dei campioni biologici. Impostare la velocità Z su 2 μm/s per i campioni biologici viscoelastici.
    4. L'altezza target nell'intervallo Z indica la distanza approssimativa dal campione alla quale si trova lo z-piezo dopo aver misurato una curva di forza e prima di spostarsi in una posizione diversa sul campione. L'altezza del target dell'intervallo Z deve essere maggiore dell'altezza delle feature di esempio. Impostare l'altezza del bersaglio sulla gamma Z a 7,5 μm.
    5. Utilizzando la funzione Step Motor , avvicinare il cantilever alla superficie del campione (a giudicare dalla messa a fuoco nell'immagine a contrasto di fase con ingrandimento 10x) prima di selezionare la funzione di avvicinamento nella finestra di spettroscopia di forza in modalità di contatto per abbassare il cantilever con incrementi più piccoli di 15 μm.
    6. Fare clic su Acquisisci per acquisire una curva di forza.
    7. Seleziona la curva di forza, aprila nella finestra del gestore della calibrazione e seleziona Modalità basata su contatto nella sezione del metodo.
    8. Utilizzando la funzione Select-fit Range , selezionare la curva di retrazione a sbalzo per un adattamento lineare della curva. Quindi, selezionare la casella di controllo Sensibilità per convertire l'unità di forza da V a N.
    9. Sollevare il cantilever di 100-200 μm nel liquido e selezionare la funzione Rumore termico . Ancora una volta, utilizzando Select Fit Range, adattare la curva della campana del rumore termico con una curva di Lorentz. Dopo l'adattamento della curva, selezionate la casella Costante molla (k). Verificare che la costante della molla (k) sia vicina al valore del produttore e annotarla per riferimento futuro. Dopo la calibrazione, l'unità di setpoint cambierà da mV a nN.
      NOTA: Il rumore termico è la frequenza naturale del cantilever a una particolare temperatura. La correzione del rumore termico è necessaria per una misurazione accurata della costante della molla.
  5. Acquisizione di curve forza-distanza
    1. Posizionare il campione montato su vetrino (vasi retinici o matrice subendoteliale) sullo stadio AFM e selezionare Spettroscopia di forza in modalità di contatto nella sezione dell'esperimento del software.
    2. Impostare la forza di setpoint a 0,5 nN e fare clic su Avvicinamento, che è significativamente superiore alla deflessione termica delle sonde a sbalzo SAA-SPH 1 μm e PFQNM-LC-A 70 nm, garantendo un approccio a sbalzo regolare verso il campione.
    3. Dopo che il cantilever ha rilevato la superficie ed è tornato all'altezza target di riposo, impostare il setpoint a 0,2 nN per la sonda a sbalzo SAA-SPH da 1 μm più rigida o a 0,1 nN per la sonda a sbalzo PFQNM-LC-A da 70 nm più morbida. Questa regolazione del setpoint assicura che sia i cantilever rigidi che quelli morbidi si pieghino facilmente durante l'indentazione del campione (fare riferimento alla sezione 3.1).
    4. Impostare la lunghezza Z a ~2,5 μm per garantire una separazione netta della sonda a sbalzo dai campioni biologici durante la retrazione (fare riferimento al passaggio 3.4.2) e la velocità Z a 2 μm/s (fare riferimento al passaggio 3.4.3).
    5. Utilizzando le viti del tavolino sul tavolino AFM, posizionare con cura la sonda a sbalzo nella posizione desiderata sul campione.
      NOTA: Poiché i capillari non sempre si allargano in piano sul vetrino, è sicuro ritirare il cantilever di altri 10-20 μm dall'altezza target di riposo prima di spostare il tavolino.
    6. Fare clic su Avvicinamento per avvicinare prima il cantilever al campione, quindi fare clic su Acquisisci per acquisire le curve di forza per le posizioni desiderate. Salvate tutte le curve di forza per l'analisi.
  6. Analisi dei dati
    1. Aprire la curva di forza nel software di elaborazione dati.
    2. Selezionare la curva della forza di retrazione per l'analisi dei dati (simile al passaggio 3.4.8).
    3. Utilizzando la funzione di livellamento dei dati, smussare la curva di forza con un filtro gaussiano per rimuovere il rumore indesiderato nei dati acquisiti.
    4. Utilizzando la funzione di sottrazione della linea di base, regolare il valore della pendenza e l'ampiezza della parte della linea di base (senza contatto) della curva di forza su zero.
    5. Fare clic sulla funzione Punto di contatto per portare automaticamente il punto di contatto della curva di forza alle coordinate (0,0) sugli assi X e Y.
    6. Utilizzando la funzione Posizione verticale della punta , calcolare la posizione verticale effettiva del cantilever sull'asse Y correggendo l'eventuale indentazione del campione.
    7. Sulla curva di forza elaborata, applicare la funzione Elastic Fit selezionando prima la forma e il raggio della punta (in base alla sonda a sbalzo selezionata), quindi l'adattamento della curva di forza utilizzando il modello Hertz/Sneddon.
      1. Se l'indentazione della matrice da parte della sonda con raggio di 70 nm supera i 70 nm, come in genere accade, selezionare la forma della punta del paraboloide . Per la misurazione della rigidità capillare, l'indentazione del campione da parte della sonda con raggio di 1 μm non supera mai 1 μm, quindi selezionare la forma della punta della sfera . Inoltre, se il punto di contatto della curva adattata non coincide con il punto di contatto della curva di retrazione effettiva, selezionare la casella di controllo Sposta curva (Shift Curve ).
    8. Annotare e conservare il valore del modulo di Young (rigidità).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Capillari retinici di topo
La misurazione della rigidità AFM dei capillari retinici isolati comporta fasi di manipolazione del campione che potrebbero potenzialmente danneggiarne l'integrità meccanostrutturale. Per evitare che ciò accada e quindi garantire la fattibilità, l'affidabilità e la riproducibilità delle misure AFM, gli occhi enucleati vengono fissati in formalina al 5% durante la notte a 4 °C prima dell'isolamento del vaso. Questo protocollo di fissazione lieve con concentrazione di formalina ridotta, bassa temperatura di fissazione, tempo di fissazione limitato e assenza di puntura corneale è stato sviluppato per ridurre al minimo eventuali artefatti di reticolazione/irrigidimento causati dalla fissazione chimica. Come mostrato nella Figura 2B, C, questa fissazione relativamente lieve assicura che il sistema vascolare retinico isolato sia strutturalmente robusto e sufficientemente durevole per la misurazione dell'AFM. Al contrario, i vasi retinici isolati dagli occhi non fissati (utilizzando il metodo ipotonico)4 o gli occhi brevemente fissi (per 8 ore) si frammentano o collassano, rendendoli così inadatti per la misurazione dell'AFM (Figura 2B).

Matrice subendoteliale retinica
La rigidità vascolare riflette la rigidità combinata delle cellule vascolari e della membrana basale (matrice subendoteliale)4. Poiché le cellule si adattano alla rigidità della matrice subendo un cambiamento simile nella propria rigidità, un processo chiamato reciprocità meccanica9, rigidità della matrice subendoteliale, diventa un importante determinante della rigidità vascolare complessiva. Per la misurazione della rigidità della matrice, è importante ottenere una matrice subendoteliale omogeneamente densa. Per le EC retiniche umane coltivate in terreno di coltura integrato con acido ascorbico, questo richiede solitamente 10-15 giorni (Figura 3A)4,5,6. Questa differenza nel periodo di coltura può derivare da differenze tra lotti di EC retiniche primarie disponibili in commercio. Inoltre, troviamo generalmente che le EC retiniche disponibili in commercio da topi C57BL/6 depositano una matrice più densa rispetto alla coltura primaria di EC retinica umana, indicando così differenze specie-specifiche. Come mostrato nella Figura 3A, le immagini a contrasto di fase forniscono solo una visione grossolana della matrice su scala macro. Tuttavia, la struttura fibrillare su scala nano-micrometrica diventa evidente nelle immagini a fluorescenza confocale ad alta risoluzione della matrice immunomarcate con anticorpi contro le proteine strutturali della matrice collagene IV e fibronectina (Figura 3B). Va notato che queste proteine della matrice forniscono anche spunti istruttivi alle cellule endoteliali legandosi a specifici recettori delle integrine9.

Misurazione della rigidità AFM
La selezione della rigidità a sbalzo appropriata (costante della molla, k) e della dimensione della sonda è essenziale per misurazioni affidabili e sensibili. Questi parametri devono essere scelti in modo che corrispondano alla rigidità e alle dimensioni del campione biologico. Dopo che il cantilever selezionato è stato montato sull'AFM, il raggio laser a infrarossi deve essere focalizzato sulla punta del cantilever e il punto laser riflesso deve essere centrato sul fotorilevatore. Questo allineamento laser garantisce un rilevamento preciso e sensibile della deflessione a sbalzo e, di conseguenza, la misurazione della rigidità. Una misurazione della rigidità AFM inizia con il piezo z che sposta il cantilever verticalmente verso il basso verso il campione. In questo momento non c'è deflessione a sbalzo, il che produce una linea di base piatta della curva di avvicinamento (Figura 4A). Quando la sonda a sbalzo entra in contatto con il campione e lo rientra, il cantilever si piega, causando la deflessione del laser sul fotorivelatore, che è rappresentata dalla deflessione verticale della curva di avvicinamento. Dopo aver applicato una forza di indentazione preimpostata (forza di setpoint) sul campione, il cantilever si ritrae nella posizione iniziale (altezza target Z) lontano dal campione. La curva di retrazione deviata viene quindi adattata al modello di Hertz/Sneddon per calcolare il modulo di Young (rigidità) del campione.

Dalla misurazione rappresentativa dell'indentazione della forza mostrata nella Figura 4, è chiaro che le curve di avvicinamento e retrazione ottenute da un capillare retinico isolato da un topo diabetico (Figura 4B) sono sostanzialmente più ripide di quelle ottenute da un topo non diabetico (Figura 4A). La pendenza più ripida delle curve di indentazione della forza indica una maggiore deflessione a sbalzo causata da una maggiore resistenza del campione all'indentazione della forza, che riflette una maggiore rigidità del campione13. Infatti, la successiva analisi dei dati delle curve di indentazione delle forze multiple ha rivelato che i capillari retinici dei topi diventano significativamente più rigidi nel diabete4. Va inoltre notato che il contatto tra la sonda a sbalzo e i campioni biologici spesso provoca un'adesione superficiale aspecifica, che porta a una deflessione negativa a sbalzo durante la retrazione, come si vede dall'estensione della curva di retrazione oltre la linea di base (Figura 4B). Inoltre, i campioni biologici come cellule, matrice e vasi sanguigni sono viscoelastici per natura e quindi possono subire una deformazione permanente e/o un cambiamento nella rigidità apparente a seguito dell'indentazione della forza. In tal caso, ciò si rifletterà nel disallineamento delle curve di avvicinamento e di retrazione (isteresi). In effetti, il confronto tra la Figura 4A e la Figura 4B conferma la tendenza prevista in cui l'indentazione della forza dei capillari più morbidi nei topi non diabetici produce un'isteresi maggiore rispetto a quella osservata nelle loro controparti più rigide. Come precedentemente riportato 5,6, anche la rigidezza (modulo di Young) delle matrici subendoteliali ottenute da colture di EC retinica viene calcolata nel modo sopra menzionato.

figure-results-1
Figura 1: Illustrazione schematica dell'incisione praticata su un occhio di topo per l'isolamento della retina. Usando una pinzetta per tenere il nervo ottico, un bisturi viene utilizzato per praticare un'incisione completa posteriormente al limbus per separare la retina del topo dal cristallino e dalla camera anteriore. La linea tratteggiata viola mostra la posizione dell'incisione verticale. Questo schema è stato disegnato utilizzando un software scientifico di immagini e illustrazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Ottimizzazione del protocollo per l'isolamento di vasi retinici di topo intatti per la misurazione dell'AFM. (A) L'immagine stereoscopica mostra una retina intatta isolata da un occhio di topo leggermente fissato prima delle fasi di isolamento capillare. Barra della scala: 2 mm. (B) Immagini rappresentative a contrasto di fase con ingrandimento 4x mostrano i vasi retinici di topo ottenuti utilizzando i diversi metodi di isolamento. Confrontando l'integrità strutturale e la durata dei vasi isolati, la digestione della tripsina delle retine da occhi enucleati fissati in formalina al 5% per 24 ore a 4 °C (riquadro rosso) è risultata produrre la vascolarizzazione retinica più adatta per la misurazione della rigidità AFM. I vasi retinici isolati con questo metodo mostravano una chiara rete vascolare che si diffondeva uniformemente lungo la superficie del vetro. Barra della scala: 500 μm. (C) La visione ad alto ingrandimento (20x) di una rete capillare retinica intatta, simile a quella mostrata in (B), conferma l'elevata integrità strutturale dei capillari ottenuti da occhi leggermente fissati. Barra di scala: 100 μm. Questa cifra è stata modificata da4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Matrici decellularizzate ottenute da colture primarie di REC umane e muvine. (A) Immagini rappresentative a contrasto di fase con ingrandimento 20x che mostrano aggregati di matrice subendoteliale su vetrini coprioggetti dopo la decellularizzazione di colture di 10 giorni (10 giorni) o 15 giorni (15 giorni) di REC umane o tovine. Barra della scala: 100 μm. (B) Immagini rappresentative a fluorescenza confocale ad alto ingrandimento (100x) di matrici decellularizzate ottenute da colture di REC umane 15 giorni e marcate con anticorpi anti-collagene IV e anti-fibronectina rivelano un denso collagene nanofibrillare IV e matrice di fibronectina. Barra della scala: 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Curve di distanza della forza dalla misurazione della rigidità AFM dei capillari retinici di topo. I grafici a linee indicano un approccio rappresentativo (colore chiaro) e una curva di retrazione (colore scuro) da una singola misurazione dell'indentazione della forza in una posizione di un topo capillare retinico isolato da un topo (A) non diabetico o (B) diabetico. Le curve di forza ottenute utilizzando una sonda a sbalzo emisferica SAA-SPH con raggio di 1 μm, tracciano la relazione tra la distanza cantilever-campione (controllata dallo z-piezo) e la forza verticale applicata che provoca la deflessione a sbalzo. (A) La freccia gialla indica l'avvicinamento a sbalzo guidato da piezo-z verso il campione, la freccia bianca indica il punto di contatto in cui la sonda a sbalzo entra in contatto con il campione e la freccia verde indica la deflessione a sbalzo fino a una forza di indentazione di setpoint (picco) (*). (B) Sia le curve di approccio che quelle di retrazione ottenute da un capillare retinico isolato da topi diabetici mostrano una pendenza marcatamente più ripida rispetto a quelle delle loro controparti non diabetiche (mostrate in A), il che indica una maggiore rigidità capillare nei topi diabetici. La punta della freccia indica un calo della curva di retrazione al di sotto della linea di base, che riflette la deflessione negativa della sonda a sbalzo causata dall'adesione tra la sonda e il campione durante l'indentazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'AFM è stato ampiamente utilizzato per misurare i cambiamenti associati alla malattia nella rigidità dei vasi più grandi, come l'aorta e le arterie16. Questi risultati hanno contribuito a stabilire il ruolo della meccanobiologia endoteliale nelle complicanze cardiovascolari come l'aterosclerosi17. Sulla base di questi risultati, abbiamo iniziato a studiare il ruolo precedentemente non riconosciuto della meccanobiologia endoteliale nello sviluppo di lesioni microvascolari retiniche nella DR precoce. Il successo in questa ricerca, tuttavia, si basa sulla misurazione accurata dei cambiamenti indotti dal diabete nella rigidità capillare retinica. Studi recenti hanno rivelato che, in modo simile ai grandi vasi, anche la rigidità dei capillari retinici e la matrice subendoteliale retinica secernita dall'EC possono essere misurate direttamente, in modo accurato e affidabile utilizzando AFM 4,5,6.

Questo approccio prevede l'isolamento dei capillari retinici di topo dagli occhi lievemente fissati utilizzando la digestione della tripsina. Sulla base dell'esperienza, questa fase di fissazione lieve è necessaria poiché i capillari isolati dagli occhi non fissati (utilizzando il metodo ipotonico) sono fragili e si frammentano, rendendoli inadatti per la misurazione della rigidità AFM4. Al contrario, una fissazione più forte e la conseguente necessità di un'estesa digestione della tripsina, che è stata riportata in altri protocolli di digestione della tripsina retinica18, possono anche compromettere l'integrità strutturale dei capillari, come giudicato dalla rottura delle giunzioni strette. Pertanto, la lieve fissazione capillare e la delicata digestione della tripsina impiegate qui aiutano a ridurre gli artefatti di rigidità derivanti da un'eccessiva reticolazione indotta dalla formalina e garantiscono l'integrità strutturale dei capillari per una misurazione affidabile della rigidità AFM.

Come approccio alternativo, uno studio recente ha riportato la misurazione della rigidità AFM dei capillari retinici da montature piatte retiniche leggermente fissate19. Eseguendo le rientranze della forza AFM sui capillari retinici all'interno della retina intatta, questo approccio consente la misurazione della rigidità in situ . Tuttavia, queste misurazioni della rigidità capillare probabilmente includono la rigidità della membrana limitante interna. Inoltre, questo approccio è limitato alla misurazione dei soli capillari superficiali accessibili su un supporto piatto retinico, tralasciando il plesso capillare più profondo che è specificamente interessato all'inizio della DR20. Questi problemi possono essere affrontati utilizzando questo approccio, che estrae i vasi in modo pulito (privi di tessuto retinico residuo) da tutti gli strati retinici. Attualmente stiamo ottimizzando questo protocollo per isolare i vasi coroideali da modelli animali di AMD precoce. Detto questo, ci rendiamo conto che la lieve fissazione in formalina impiegata nel protocollo può causare un artefatto di irrigidimento associato alla reticolazione nelle misurazioni AFM. Pertanto, sarebbe prudente interpretare i valori di rigidità vascolare ottenuti utilizzando questo approccio più in termini di variazioni relative della rigidità (tra diversi gruppi sperimentali) piuttosto che di rigidità assoluta.

A differenza dei capillari retinici che richiedono una fissazione lieve, la matrice subendoteliale ottenuta dalle colture di EC retinica può essere valutata senza alcuna modifica. Ciò è in gran parte dovuto alla robustezza della matrice depositata, che deriva da una combinazione di diversi fattori, tra cui l'aggiunta di acido ascorbico nel terreno di coltura (che migliora la sintesi del collagene15), la modifica chimica dei vetrini coprioggetti che impedisce il distacco della matrice durante la decellularizzazione e la durata prolungata della coltura (10-15 giorni). È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che l'aumento della rigidità della matrice subendoteliale indotto dall'iperglicemia in vitro è coerente con l'aumento della rigidità capillare retinica indotto dal diabete osservato in vivo4. Ciò non sorprende in quanto ci si aspetta che un aumento della rigidità della matrice aumenti la rigidità delle EC retiniche sovrastanti (a causa della reciprocità meccanica) che, insieme, aumentano la rigidità capillare complessiva. Infatti, abbiamo recentemente dimostrato che le EC retiniche diventano più rigide quando cresciute in condizioni diabetiche4, probabilmente attraverso un aumento della tensione citoscheletrica dell'actina Rho/ROCK-dipendente21. Questi risultati implicano anche che l'irrigidimento coroideale dell'EC osservato nel modello di scimmia rhesus di AMD precoce riflette l'aumento della rigidità della matrice subendoteliale coroideale e dei vasi intatti12, un'idea che è in fase di test in studi in corso. Nel complesso, il fatto che le alterazioni della rigidità nella matrice subendoteliale retinica non fissata e nelle EC rispecchino l'andamento osservato nei vasi retinici intatti lievemente fissati testimonia la validità dell'approccio di fissazione lieve.

La misurazione diretta della rigidità dei capillari retinici da modelli animali di DR non solo aiuta a stabilire la meccanobiologia endoteliale come un nuovo bersaglio terapeutico per la gestione della DR, ma fornisce anche un forte razionale per sviluppare in futuro nuove tecniche di imaging sensibili per la valutazione non invasiva della rigidità capillare retinica nei pazienti con DR. Tali tecniche non invasive potrebbero potenzialmente rilevare sottili cambiamenti nel flusso sanguigno che si prevede derivino dall'irrigidimento capillare, simili ai cambiamenti nella velocità dell'onda del polso arterioso che sono comunemente rilevati nelle malattie cardiovascolari indotte dal diabete. Le misurazioni della rigidità AFM dei capillari retinici isolati da occhi umani post-mortem da donatori diabetici forniranno un'importante prova di concetto a questo proposito. Dato che la rigidità capillare retinica aumenta precocemente nel modello murino (streptozotocina) di diabete di tipo1 4, l'uso efficace dell'AFM nella convalida delle modalità di imaging per la misurazione della rigidità può portare all'identificazione della rigidità capillare retinica come biomarcatore clinico per la patogenesi precoce della DR.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dal National Eye Institute/NIH grant R01EY028242 (a K.G.), dalla Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (a K.G.), dalla Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant dalla W.M. Keck Foundation (al Doheny Eye Institute) e dalla Ursula Mandel Fellowship e dall'UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (all'IST). Questo lavoro è stato anche sostenuto da una sovvenzione illimitata da Research to Prevent Blindness, Inc. al Dipartimento di Oftalmologia dell'UCLA. Il contenuto di questo articolo è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Isolamento capillare retinico
0,22 µ m Filtro per siringa in PVDFMerck MilliporeSLGVM33RSDurapore a basso legame proteico
10X Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza calcio % magnesioCorning20-031-CVConcentrazione finale 1X, pH 7,4
Piastra a 12 pozzettiFalcon Corning353043
15 mL Provetta da centrifugaCorning430791senza RNASI, non pirogeno
20 mL Siringa Luer-Lok TIPBD302830
5 3/4 pollici monouso in vetro borosilicato/Pipetta Pasteur non sterileFisherBrand13-678-20A
60x15 mm Piastra per coltura tissutaleFalcon Corning353002
Piastra a 6 pozzettiFalcon Corning353046
Aqua-Hold 2 Pap - Penna da 13 mlLaboratorio di dispositivi scientifici9804-02
Lama chirurgicaX-ACTO
#10Bard-Parker371110
Cera dentaleMicroscopia elettronica Scienze50-949-027
Microscopio da dissezioneSoluzione di formalina Am-scope
, tampone neutro, 10%Millipore SigmaHT501128-4LConcentrazione finale 5% (v/v)
Kimwipes - panno tergicristalloKimtech Science34133
Micro spatolaFine Science Tools10089-11
Agitatore orbitaleLab GeniusSK-O180
PELCO Economy #7 Acciaio inossidabile 115mm  PinzettaTed Pella, Inc.5667
Microscopio a contrasto di faseNikon TS2
Purifier Logic+ Classe II, Tipo A2 Cabina di biosicurezzaLabconco302380001
Provette per microcentrifuga Safe-Lock 2 mLEppendorf22363352
StereoscopioAmScopeserie SM-3 Zoom Stereomicroscopio trinoculare 3.5X-90X
Vetrino per microscopia Superfrost Plus - Linguetta bianca - Pre-pulito - 25x75x1,0 mmFisherBrand1255015
Tris Buffer, soluzione 0,1M, pH 7,4 - Grado biotecnologicoVWRE553-500MLpH 8 per soluzione di tripsina
Tripsina 1:250 in polvere Grado per coltura tissutaleVWRVWRV0458-25G10 % (p/v) soluzione di tripsina
Acqua Grado di biologia molecolareCorning46-000-CM
matrice subendoteliale
10X PBSCorning20-031-CV
1X PBS con calcio e magnesioThermo Fisher Scientific14040-117pH 7.4
Idrossido di ammonioSigma-Aldrich338818
Acido ascorbicoSigma-AldrichA4034
Collagene IV anticorpoNovus BiologicalsNBP1-26549
DNasi IQiagen79254
EtanolamminaSigma-Aldrich398136
Anticorpo FibronectinaSigma-AldrichF6140
FluoromountInvitrogen-Thermo Fisher Scientific00-4958-02
GelatinaSigma-AldrichG1890
Vetrini coprioggetti in vetro (12 mm)Fisher12-541-000
Microscopia elettronicabase di glutaraldeide16220
Cellule endoteliali retiniche umane (HREC)Cell Systems CorpACBRI 181
MCDB131 mediumCorning15-100-CV
Cellule endoteliali retiniche di topo (mREC)Cell BiologicsC57-6065
Triton X-100Thermo Fisher Scientific  BP151-100
TripsinaGibco-Thermo Fisher Scientific25200-056
AFM Misurazione
1 &; m SondaBrukerSAA-SPH-1UMUna sonda emisferica alta 19 micron con raggio finale di 1
micron, costante a molla 0,25 N/m
Sonda LC 70 nmBrukerPFQNM-LC-V2Una sonda emisferica alta 19 micron con raggio finale di 70 nm,
  Costante della molla 0,1 N/m
  fotocamerafamiglia XCAMToupcam1080P
HDMI Desktop per eseguire la fotocameraAsus Asus desktopIntel i5-6600 CPU , 8GB di RAM
Portapiatti per vetrino coprioggettiCellvisD29-14-1.5-N29mm piatto fondo in vetro con
  Microscopio
Nanowizard 4BrukerNanowizard 4Bioscience montato su un microscopio ottico per la misurazione sensibile delle proprietà meccanostrutturali (rigidità e topografia) di campioni biologici morbidi
Microscopio a contrasto di faseZeissAxiovert 200Microscopio invertito con obiettivo 10X
in acciaio al carbonio a Scienze a forza atomica da 14 mm

References

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