Circuiti immunometabolici nell'infezione per l'avanzamento delle terapie dirette all'ospite

Sommario

Qui viene presentato un protocollo per la progettazione, la costruzione e la somministrazione di circuiti sintetici inducibili basati su tetraciclina. L'effetto dei circuiti sintetici sull'eliminazione del parassita e sull'espressione delle citochine può essere studiato canalizzando la pipeline presentata. Questo protocollo è rilevante per i ricercatori che studiano le terapie basate su circuiti sintetici nelle malattie infettive.

Abstract

L'immunometabolismo è un fattore determinante nella progressione della leishmaniosi. L'approccio basato sulla biologia sintetica ha raccolto un'attenzione significativa come passo verso un intervento terapeutico mirato ai fattori associati all'ospite che guidano la leishmaniosi. La biologia sintetica comporta l'ingegnerizzazione di componenti genetici in modo ortogonale e modulare per modulare con precisione i sistemi biologici, conferendo nuove funzioni alle cellule. Nello studio presentato, la delucidazione di una pipeline sistematica per lo sviluppo di un circuito sintetico inducibile controllato da tetraciclina (TetON) mirava a fornire succinato deidrogenasi come agente terapeutico per facilitare l'eliminazione dei parassiti intracellulari della Leishmania . Il protocollo delineato descrive la progettazione di un circuito sintetico e la sua successiva validazione. La strategia proposta si concentra anche sull'incorporazione di circuiti sintetici nella spina dorsale del plasmide come veicolo di consegna. Inoltre, nelle linee cellulari di macrofagi murini sono stati utilizzati macchinari di somministrazione che impiegano nanoparticelle basate su poliplessi per la somministrazione di circuiti sintetici senza compromettere la morfologia cellulare. La standardizzazione del metodo è stata condotta per selezionare le cellule trasfettate e determinare la concentrazione di induzione ottimale per l'espressione del circuito sintetico. Le osservazioni rivelano una netta riduzione del carico di parassiti intracellulari nelle cellule trasfettate rispetto alle cellule infette. Le citochine pro-infiammatorie sono state espresse dopo l'infezione in cellule trasfettate e indotte da circuiti sintetici come meccanismo per promuovere l'eliminazione del parassita. Ciò sottolinea che il metodo basato sulla biologia sintetica è un approccio potente nella leishmaniosi, mirando ai fattori dell'ospite associati alla progressione della malattia.

Introduzione

Il progresso della medicina olistica e integrativa è un legame significativo che è stato identificato tra le alterazioni metaboliche nelle cellule immunitarie e la loro capacità di modulare il fenotipo delle cellule immunitarie nelle malattie infettive. L'immunometabolismo offre nuove prospettive per chiarire la patogenesi delle malattie infettive prevalenti nell'uomo. Inoltre, fornisce tecniche promettenti per lo sviluppo di vaccini e farmaci identificando nuovi bersagli per l'intervento¹. La riprogrammazione metabolica delle cellule immunitarie è identificata in varie malattie infettive, tra cui la leishmaniosi. Leishmania spp. è responsabile della leishmaniosi, di cui la Leishmania major (L. major) causa la leishmaniosi cutanea (CL). I parassiti L. major provocano un impatto significativo sul metabolismo delle cellule ospiti, in particolare nei macrofagi, per la proliferazione e la sopravvivenza come parassiti intracellulari². I macrofagi possono tipicamente polarizzarsi in sottogruppi classicamente attivati (M1) o attivati in modo alternativo (M2) in cui le cellule M1 possiedono un'elevata secrezione di citochine pro-infiammatorie e la produzione di ossido nitrico (NO) attraverso il metabolismo delle specie azotate. Le cellule M2 mostrano livelli elevati di citochine antinfiammatorie e mostrano un'elevata attività dell'arginasi attraverso il metabolismo dell'azoto³. Pertanto, entrambi i fenotipi differiscono non solo per la loro risposta immunitaria, ma anche per le loro vie metaboliche.

La biologia dei sistemi della leishmaniosi mira a identificare bersagli molecolari per la progettazione di nuove terapie attraverso la progettazione e lo sviluppo di farmaci. La ricostruzione delle reti di segnalazione e delle vie metaboliche aiuta a comprendere la leishmaniosi come modello olistico e trae informazioni per l'identificazione della componente principale che guida lo stato patologico. La modellazione matematica è uno degli approcci analitici applicati più favoriti per comprendere le complessità della leishmaniosi⁴. Le reti immunometaboliche e i modelli matematici hanno permesso l'identificazione della succinato deidrogenasi (SDHA) come componente chiave del fenotipo M1, che è espresso per eliminare il parassita⁵. La biologia sintetica ha applicazioni nella diagnostica, nello sviluppo di vaccini e nella terapia nella leishmaniosi. Il metabolismo mirato alla modulazione della risposta immunitaria può essere ottenuto attraverso strumenti di biologia sintetica. Per la modulazione dell'inositolo fosforil ceramide sintasi che regola il metabolismo degli sfingolipidi e altera la segnalazione immunitaria dell'ospite, è stato utilizzato un circuito genetico che possedeva un comportamento bistabile per regolare sinteticamente la robustezza intrinseca del modello di infezione da L. major ^6,7. Pertanto, i sistemi e la biologia sintetica possono fornire una piattaforma di ingegneria genetica basata su modelli per lo sviluppo della medicina di precisione nel sistema modello Leishmania.

Il fenotipo M1 è caratterizzato dall'espressione di reti di segnalazione immuno-metabolica in cui la produzione di citochine infiammatorie e vie metaboliche migliora sinergicamente l'eliminazione del parassita. La polarizzazione M1 indica la produzione di citochine pro-infiammatorie come l'interleuchina-12 (IL-12), l'interferone-gamma (IFN-γ) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α). Le vie metaboliche che sono altamente arricchite nel fenotipo M1 includono la glicolisi, la via del pentoso fosfato e il ciclo troncato dell'acido tricarbossilico (ciclo TCA)⁵. Il ciclo troncato del TCA dirige il meccanismo di eliminazione dei parassiti attraverso l'aumento dei livelli di succinato e citrato, che guidano la produzione di NO³. L'accumulo di succinato da parte di SDHA porta all'attivazione del fattore di trascrizione ipossia-inducibile fattore 1-alfa (HIF-1α), che induce la produzione di IL-1β⁸. Nel fenotipo M2, si osserva l'ossidazione degli acidi grassi, l'aumento dell'utilizzo della glutammina e l'aumento della fosforilazione ossidativa del glucosio insieme alla produzione di citochine antinfiammatorie come l'interleuchina-10 (IL-10), il fattore di crescita trasformante beta (TGF-β), l'interleuchina-4 (IL-4) e l'interleuchina-13 (IL-13)³. M2 presenta mitocondri allungati come caratteristica distintiva, che porta a una maggiore efficienza nella generazione di energia. Utilizzano acidi grassi, glucosio e glutammina come substrati per alimentare il ciclo del TCA, generando così ATP attraverso la fosforilazione ossidativa a un tasso più elevato per promuovere la crescita e la proliferazione dei parassiti⁹. L'enzima SDHA, responsabile dell'accumulo di succinato attraverso il TCA troncato, non solo può promuovere la produzione di NO, ma anche avviare un consumo di ossigeno succinato-dipendente attraverso il trasporto di elettroni¹⁰. Nei macrofagi infetti da Leishmania, l'SDHA viene sottoregolata di 2,17 volte, indicando che anche la respirazione aerobica potrebbe essere sottoregolata¹¹. Al fine di aumentare il consumo di succinato per indurre la produzione di NO mediata da citochine pro-infiammatorie e promuovere l'eliminazione del parassita, l'espressione di SDHA è essenziale.

Il circuito sintetico offre terapie mirate di precisione che possono alterare il sistema malato per ottenere un'oscillazione bistabile che può ripristinare un fenotipo sano a livello spaziotemporale. L'erogazione e l'espressione del circuito sintetico rendono il sistema dinamico e robusto. Un fattore fondamentale che contribuisce al progresso della biologia sintetica risiede nella capacità di assemblare parti ed elementi genetici in modo modulare per consentire la generazione di architetture complesse e funzionalità su misura¹². I vincoli associati alle tecniche di espressione tradizionali hanno stimolato l'emergere di circuiti sintetici plasmidici inducibili basati su operoni tetraciclina, consentendo così una rapida valutazione del plasmide e una facile somministrazione in vari tipi di cellule¹³. La proteina repressore tetraciclina-responsiva (TetR), quando esiste come dimero, mostra una forte affinità di legame con l'operone tet (TetO), sopprimendo efficacemente la trascrizione. Tuttavia, in seguito all'interazione del suo ligando, la doxiciclina (dox), il TetR subisce un'alterazione strutturale, con conseguente dissociazione dal TetO, consentendo di conseguenza alla trascrizione di procedere senza ostacoli. Questo circuito può esibire il controllo della traduzione proteica¹⁴. Pertanto, attraverso la metodologia definita, il circuito sintetico plasmidico inducibile basato sull'operone tetraciclina progettato è stato in grado di esprimere SDHA nel vettore pEGFP-N1. La valutazione dell'efficienza di trasformazione del circuito e della sua resa ha fornito informazioni sulla competenza di erogazione. Attraverso la digestione di restrizione del vettore, è stata confermata la determinazione dell'efficienza di clonazione. Inoltre, è stata osservata una linea cellulare di macrofagi di topo RAW264.7 trasfettata derivata da macrofagi peritoneali di topi Balb/c per l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) dose-dipendente della doxiciclina nelle cellule trasfettate. Inoltre, l'effetto di eliminazione del parassita nelle cellule trasfettate è stato corroborato con un'espressione del circuito sintetico. Inoltre, è stata osservata l'induzione e l'espressione di citochine pro-infiammatorie, che è stata diretta attraverso un aumento del punto temporale dell'infezione nelle cellule trasfettate e indotte del circuito sintetico, che era direttamente associato al funzionamento del circuito sintetico.

Protocollo

1. Coltura cellulare di cellule RAW264.7

NOTA: Utilizzare numeri di passaggio bassi per la sperimentazione. La linea cellulare RAW264.7 è stata acquistata dal National Cell repository of Biotechnology Research Innovation Council-National Centre for cell Sciences (BRIC-NCCS), Pune. Poiché la linea cellulare RAW264.7 è una linea cellulare di macrofagi, può iniziare a differenziarsi con l'aumentare dei passaggi. Dopo aver rianimato le cellule, utilizzare la linea cellulare per la trasfezione dopo 2 passaggi.

1. Seminare 5 x 10⁵ cellule della linea cellulare RAW264.7 in un pallone da 25 cm² integrato con 5 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 100 U.I./mL di penicillina come terreno completo.
2. Conservare le cellule per la crescita e la proliferazione in un incubatore con il 5% di CO₂ a 37 °C fino al raggiungimento del 90% di confluenza.
3. Eliminare il terreno e lavare 3 volte con 1 tampone fosfato salino (PBS). Aggiungere 1 ml di PBS al pallone, raschiare le cellule con un raschietto e raccogliere le cellule in una provetta da 1,5 ml.
4. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti a 24 °C e risospendere il pellet utilizzando una pipetta da 1 mL in 1 mL di terreno completo DMEM.
5. Contare le cellule nella camera di conteggio delle cellule utilizzando il tripano blu allo 0,5% per identificare la percentuale di cellule vive.

2. Coltura cellulare di L. major parassita

NOTA: L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) è stato un dono del BRIC-NCCS. I promastigoti dovrebbero avere un numero di passaggio inferiore a 10. Il numero di passaggi più basso assicura che il parassita sia sano e che la sua capacità di infettare i macrofagi sia maggiore.

1. Coltiva L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) nel Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) integrato con il 20% di FBS come terreno completo.
2. Seme 1 x 10⁶ promastigoti in pallone non ventilato da 25 cm² contenente 5 mL di terreno completo. Incubare il pallone a 27 °C per 5 giorni e osservare il promastigote L. major parassita in fase stazionaria a 20x in un microscopio a campo chiaro.
   NOTA: I promastigoti in fase stazionaria possono essere raggiunti in 4-7 giorni dopo la coltura. Sono caratterizzati dal loro stato flagellato allungato e dalla ridotta motilità.

3. Progettazione di un circuito sintetico in plasmide come vettore di consegna

1. Progettazione di parti del circuito sintetico
   1. Apri il software della cella Tinker e procedi alla scheda Parti. Seleziona il componente Promotore dalla libreria e posizionalo sulla tela per simboleggiare il promotore del citomegalovirus (CMV) all'interno del circuito sintetico. Recupera il sito di legatura del repressore, analogo al TetO, dalla scheda Parti e posizionalo adiacente al promotore sulla tela, integrandolo perfettamente con il promotore CMV.
   2. Incorporare l'operatore della tetraciclina (TetO), i siti di ingresso del ribosoma interno (IRES) e la regione codificante trascinando e rilasciando il sito di legame del repressore, il sito di legame del ribosoma (rbs) e la regione codificante sulla tela, integrandoli con i componenti genetici esistenti.
   3. Rinominare la regione codificante come TetR, che denota il repressore sensibile alla tetraciclina, che funziona come un regolatore negativo putativo all'interno del circuito sintetico. Unisci questi elementi genetici per facilitare la costruzione delle parti sintetiche.
   4. Incorporare una regione spaziatrice (sd1) sulla tela, progettata per essere scissa da proteasi cellulari come il teschovirus-1 2A (P2A) suino. Introdurre un'ulteriore regione codificante che rappresenta il gene di interesse, etichettarla come SDHA, al costrutto sintetico e integrarla con gli altri elementi.
   5. Adiacente alla regione codificante SDHA, integrare un'altra regione spaziatrice clivabile della proteasi (sd2), che sarà scissibile dalla proteasi cellulare P2A. Introdurre una regione codificante che rappresenta il gene reporter ed etichettarla come GFP nel costrutto.
      NOTA: L'espressione GFP potrebbe fornire una stima della produzione di SDHA e garantire che il circuito sintetico abbia un funzionamento logico¹³.
   6. Accanto a GFP, aggiungere un terminatore (ter1) e verificare le parti assemblate controllando se tutte le parti sono collegate. Il circuito deve apparire in rosso quando si fa clic su qualsiasi parte. Ciò conferma la formazione di un circuito genetico funzionale.
   7. Dalla scheda Reazione, assegna i tassi di regolazione, che includono i parametri e i valori iniziali per la produzione di proteine, a TetR, SDHA e GFP per delineare la reazione di traduzione all'interno del circuito sintetico.
   8. Aggiungere una piccola molecola dalla scheda Parti, denominarla Doxiciclina (dox) e assegnarle una funzione d'onda selezionando Input dalla scheda Parti e connessione e quindi facendo clic su Wave Input.
   9. Dalla scheda Regolamento , clicca su Reazione alla repressione. Trascina e rilascia la velocità di reazione sulla tela tra dox e TetR. Impostare la cinetica di reazione tra dox e TetR facendo doppio clic sull'icona Funzione d'onda su dox e regolando Doxyxycline.sin.amplitude su 10.
   10. Implementare la reazione regolatoria trascrizionale tra la proteina TetR e il sito di legame del repressore selezionando la reazione dalla scheda Regolazione e posizionandola sulla tela tra TetR e TetO.
   11. Facendo doppio clic su ciascun componente e reazione, impostare una concentrazione iniziale e un parametro per la simulazione. Clicca su Simulazione, scegli Deterministico e simula il circuito per 100 unità di tempo. Regola il grafico di simulazione dal pannello di controllo, che si apre con il grafico, e osserva il modello grafico per le proteine SDHA e TetR.
2. Identificazione di componenti genetici dal registro delle parti iGEM
   1. Apri il Registro delle parti biologiche standard (Tabella dei materiali) e clicca su Cerca. Inserisci il nome del componente genetico, ad esempio il promotore del CMV.
      NOTA: Il processo di ricerca dell'ID iGEM deve essere eseguito per tutti i componenti genetici del circuito sintetico. Vengono elencati i passaggi per l'identificazione dell'ID iGEM del promotore della VMC; Successivamente, i passaggi devono essere ripetuti per altri componenti.
   2. Per ottenere la sequenza nucleotidica del promotore CMV, fare clic sull'opzione Ottieni sequenza di parti e salvare il file come file di testo.
      NOTA: È fondamentale notare che sono disponibili stock di tutte le parti genetiche.
   3. Ripetere il passaggio 3.2.1 e il passaggio 3.2.2 per tutte le parti genetiche (operatore tetraciclina, sequenza Kozak, TetR, P2A e GFP) ad eccezione di SDHA.
   4. Per ottenere la sequenza di codifica della proteina SDHA, apri NCBI e scegli Nucleotide dal menu a discesa accanto alla finestra di ricerca. Digitare Succinato deidrogenasi e Mus musculus e cercare la sequenza nucleotidica.
   5. Fare clic sull'opzione CDS per ottenere la sequenza di codifica di SDHA e salvare la sequenza in un file di testo.
   6. Unisci la sequenza nucleotidica di tutte le parti regolatorie genetiche in un unico file in sequenza. Aggiungere il codone di inizio (ATG) subito dopo la sequenza di Kozak e rimuovere i codoni di stop interni per evitare la formazione di polipeptidi nascenti.
   7. Apri il sito web ExPASy¹⁵ e incolla la sequenza nucleotidica. Fare clic sull'opzione Traduci la sequenza . Seleziona 5'3' Frame 1 e rimuovi i codoni di stop, che verranno evidenziati in rosso nella sezione dei risultati.
      NOTA: Per identificare se la sequenza nucleotidica si sta traducendo efficacemente nella sequenza polipeptidica desiderata, è possibile utilizzare uno strumento di traduzione come ExPASy. Ciò garantisce la prevenzione di polipeptidi nascenti indesiderati. La selezione del vettore pEGFP-N1 per esprimere il circuito sintetico è ottimale, dato che il promotore del CMV e il gene GFP erano preesistenti all'interno del vettore. Tutte le parti genetiche sono state assemblate utilizzando un protocollo di clonazione (che è stato esternalizzato). Gli enzimi di restrizione utilizzati per la clonazione degli inserti sono NotI e XhoI. Questi siti enzimatici di restrizione si trovano all'interno del sito di clonazione multipla del vettore pEGFP-N1.

4. Trasformazione del circuito sintetico in cellule DH5α di Escherichia coli (E.coli)

1. Preparazione di cellule competenti di E.coli DH5α
   NOTA: Si consiglia di sterilizzare i reagenti in autoclave. I reagenti possono essere conservati a 4 °C fino all'uso.
   1. Coltura di 1 mL di inoculo fresco in 50 mL di Brodo Luria (LB) a 37 °C, 180 giri/min. Far crescere le celle per circa 2 ore fino a raggiungere una densità ottica (OD) di 0,4-0,6 a 600 nm.
   2. Centrifugare le celle a 4,696 x g a 4 °C per 15 minuti. Scartare manualmente il surnatante nel pallone capovolto la provetta da centrifuga da 50 mL e prelevare il pellet cellulare.
   3. Risospendere delicatamente il pellet in 2 mL di cloruro di magnesio (MgCl2) 0,1 M ghiacciato utilizzando una pipetta da 1 mL. Aumentare il volume fino a 20 ml con MgCl 2 ghiacciato_.
   4. Centrifugare la provetta a 4,696 x g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Risospendere delicatamente le cellule utilizzando una pipetta da 1 ml in 1 ml di cloruro di calcio 0,1 M ghiacciato (CaCl₂) e incubare su ghiaccio per 2 ore. Utilizzare le cellule competenti appena create per la trasformazione.
2. Trasformazione di cellule competenti con costrutto circuitale sintetico
   1. Misurare 50 μL di cellule competenti e aggiungere le cellule in una provetta da 1,5 mL. Metti il tubo sul ghiaccio. Aggiungere 10 ng di costrutto di circuito sintetico all'aliquota e tenere in ghiaccio per 3 minuti.
   2. Celle di shock termico a 42 °C per 3 minuti su un blocco riscaldante a secco. Una volta completata l'incubazione sul blocco riscaldante a secco, rimettere le cellule sul ghiaccio per 3 minuti, aggiungere 1 mL di LB alle cellule e incubare a 37 °C per 1 ora a 250 giri/min.
   3. Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule a 4.696 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta da 1 mL. Risospendere le cellule in 100 μL di LB e piastarle su agar LB contenente 50 μg/mL di kanamicina. Capovolgere la piastra e incubare a 37 °C per 24 ore.

5. Isolamento del costrutto di circuito sintetico

1. In una provetta da centrifuga da 50 mL, prelevare 10 mL di terreno LB e aggiungere 50 μg/mL di kanamicina come brodo di selezione per coltivare cellule trasformate per l'isolamento del plasmide. Prelevare una colonia trasformata utilizzando un puntale da 200 μl e aggiungerla al brodo di selezione.
2. Utilizzando un circuito di inoculazione, selezionare un'altra singola colonia, striare una piastra utilizzando la tecnica pentagonale e incubare a 37 °C per 24 ore al fine di mantenere isolati di singole colonie.
3. Far crescere le cellule durante la notte a 180 giri/min a 37 °C. Il giorno successivo, centrifugare la coltura a 4,696 x g per 20 minuti a 24 °C. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante capovolgendo la provetta e aggiungere 1 mL di tampone di risospensione (50 mM di Tris (idrossimetil) amminometano cloridrato (Tris-HCl), 10 mM di acido etilendiammine tetraacetico (EDTA), 100 μg/mL di RNasi A (pH-8,0)) al pellet e risospendere le cellule pipettando delicatamente.
   NOTA: Per aggiungere il tampone di risospensione RNasi A 5 minuti prima di aggiungere la miscela al pellet cellulare.
4. Incubare la miscela per 5 minuti a RT. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi (0,2 N di idrossido di sodio (NaOH), 1 % di sodio dodecil solfato (SDS)) alle cellule e mescolare capovolgendo la provetta per 2 minuti. Incubare la provetta per 5 minuti a RT.
5. Aggiungere 1 mL di tampone di neutralizzazione alle cellule (3 M di acetato di potassio (CH₃CO₂K)) e mescolare capovolgendo la provetta più volte. Centrifugare le cellule a 4.696 x g per 20 minuti a RT e raccogliere il surnatante in una provetta da 1,5 mL.
6. Aggiungere 500 μl di isopropanolo al surnatante e mescolare bene invertendolo. Incubare il surnatante con ghiaccio per 15 minuti e poi centrifugare a 12.000 x g per 30 minuti a 4 °C.
   NOTA: L'incubazione può variare da 5 minuti a 1 ora. Durante questo, si consiglia di mescolare delicatamente il contenuto capovolgendo ogni 5 minuti.
7. Scartare il surnatante, aggiungere 1 mL di etanolo al 70% (refrigerato) al pellet e centrifugare a 12000 x g per 5 minuti a 4 °C. Ripetere nuovamente questo passaggio.
8. Essiccare all'aria il pellet e risospendere il plasmide ottenuto in 20 μL di acqua sterile priva di nucleasi (NFW). Misurare la concentrazione di plasmidi su uno spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 260/280 nm.
   NOTA: Aggiungere più NFW se la concentrazione di plasmidi è molto alta da stimare tramite nanodrop. Il processo di diluizione plasmidico deve essere eseguito in una cappa laminare.

6. Elettroforesi su gel di agarosio (AGE) di circuito sintetico

1. Preparazione del campione di plasmidi per AGE
   1. In una provetta da 1,5 mL, misurare 20 μL di 1x Tris-acetato-EDTA (TAE). Aggiungere 4 μl di tampone di caricamento 6x e mescolare bene mediante pipettaggio.
   2. Fate girare rapidamente la provetta, aggiungete 1 μg del vettore plasmidico del circuito sintetico e mescolate bene pipettando la miscela. Questa miscela di reazione può essere caricata su gel di agarosio.
      NOTA: Evitare il pipettaggio rigoroso in quanto potrebbe danneggiare la struttura del plasmide. Invece, fai un giro veloce per mescolare i reagenti.
2. Digestione restrittiva del circuito sintetico
   1. In una provetta da 1,5 mL, aggiungere 2 μL di tampone di restrizione 10x, 1 μL di NotI e 1 μL di enzima di restrizione XhoI e mescolare bene facendo girare rapidamente il contenuto. Aggiungere 1 μg di vettore plasmidico a circuito sintetico e far girare rapidamente il contenuto.
   2. Portare il volume della provetta a 20 μl aggiungendo NFW al contenuto e facendo girare rapidamente la provetta. Incubare la provetta a 37 °C per 1 ora.
   3. Dopo l'incubazione, mantenere la provetta a 70 °C per 15 minuti in un blocco riscaldante asciutto per disattivare gli enzimi di restrizione. Raffreddare il contenuto della provetta e aggiungere 6 μl di tampone di caricamento alla miscela di reazione. Mescolare il contenuto facendo girare velocemente il tubo. Questa miscela di reazione può essere caricata su gel di agarosio.
   4. Prepara il gel di agarosio ed esegui il gel utilizzando un protocollo precedentemente descritto¹⁶. In breve, caricare campioni da 20 μl in ciascun pozzetto, caricare 5 μl di scala di DNA da 1 Kb ed eseguire il gel a 100 V. Scollegare l'alimentazione al termine dell'elettroforesi, acquisire il gel su un termocamera su gel e attivare l'opzione di fluorescenza per visualizzare le bande.

7. Trasfezione di un costrutto di circuito sintetico in una linea cellulare RAW264.7

1. Preparazione dei campioni
   1. Preparare i campioni per determinare l'effetto di eliminazione dei parassiti mediante circuito sintetico indotto. Il primo campione è costituito da cellule RAW264.7 non trasfettate (controllo), il secondo è costituito da cellule RAW264.7 infettate con promastigoti di L. major per 6 ore (6 ore infette), il terzo campione era costituito da cellule RAW264.7 trasfettate con circuito sintetico e indotte con dox (IMT), i campioni di punti temporali dell'infezione sono cellule RAW264.7 trasfettate con circuito sintetico e indotte con dox che è infettato da L. major promastigoti (IMTI) per diversi punti temporali 6 h (6 h IMTI), 12 h (12 h IMTI), 18 h (18 h IMTI) e 24 h (24 h IMTI).
   2. Per preparare tutti i campioni, raschiare le celle RAW264.7 da un pallone da 25 cm² e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a RT.
   3. Risospendere il pellet in 1 mL di terreno completo DMEM. Prelevare 10 μL di cellule risospese in una provetta da 100 μL, aggiungere 10 μL di blu di tripano allo 0,5% alle cellule e mescolare bene.
   4. Caricare 10 μl di miscela di cellule e tripano blu sul vetrino della camera di conteggio delle cellule e prelevare la conta delle cellule da 4 camere.
   5. Piastre delle cellule nel vetrino coprioggetti sul fondo di 96 pozzetti a 2 x 10⁴ cellule per pozzetto e incubare le cellule per 24 ore. Questo esempio è l'esempio di controllo. Questo passaggio rimane costante per la preparazione di altri campioni.
      NOTA: Preriscaldare il fluido a 37 °C a bagnomaria prima dell'uso.
   6. Per preparare un campione infetto di 6 ore, centrifugare 1 mL di promastigoti di fase stazionaria di L. major a 7.273 x g per 10 minuti. Risospendere il pellet in 500 μL di terreno completo DMEM e prelevare la conta cellulare su una camera di conteggio cellulare seguendo i passaggi 7.1.3-7.1.4.
   7. Aggiungere 2 x 10⁵L. major promastigotes al pozzetto e incubarli con CO₂ al 5% a 37 °C per 6 ore. Dopo l'incubazione, lavare le celle 3 volte con PBS.
   8. Per preparare il campione IMT, seminare le cellule seguendo i passaggi (7.1.2-7.1.5) ed eseguire i passaggi di trasfezione 7.2.1-7.2.6.
   9. Per preparare campioni di punti temporali di IMTI, seguire i passaggi 7.1.2-7.1.5 ed eseguire i passaggi di trasfezione 7.2.1-7.2.6. Eliminare il terreno completo DMEM contenente 500 μg/mL di geneticina (G418) e 1 μg/μL dox e lavare le celle 3x con 1x PBS.
   10. Aggiungere 2 x 10 promastigoti da⁵L. major ai pozzetti e incubarli per 6 ore, 12 ore, 18 ore e 24 ore. Dopo l'infezione, scartare i promastigoti contenenti DMEM Complete Media e lavare i pozzetti 3x con 1x PBS. Aggiungere 200 μL di terreno completo DMEM contenente 500 μg/mL di Geneticina (G418) e 1 μg/μL dox alle cellule e incubare per 24 ore.
2. Trasfezione di circuito sintetico
   1. In una provetta da 1,5 mL, aggiungere 24 μL di terreno a siero ridotto, che è un terreno minimo essenziale migliorato. Al terreno, aggiungere 1 μg di vettore pEGFP-N1 clonato con plasmide a circuito sintetico.
   2. In una provetta fresca da 1,5 mL, aggiungere 24 μL di Minimum Essential Medium e 1 μL di Polietilenimmina (PEI; 1 μg/μL). Mescolare bene pipettando la miscela almeno 10 volte e incubare a RT per 5 minuti.
   3. Trasferire la miscela di PEI nella provetta da 1,5 mL contenente la miscela di DNA. Mescolare bene pipettando goccia a goccia almeno 10 volte. Incubare il DNA: miscela di PEI a RT per 10 min.
   4. Scartare il terreno dai pozzetti sulle piastre inferiori del vetrino coprioggetti a 96 pozzetti e lavare le celle 3 volte con PBS. Utilizzando una pipetta, aggiungere delicatamente il DNA:PEI goccia a goccia alle cellule e agitare delicatamente la piastra. Incubare le cellule con CO₂ al 5% a 37 °C per 3 ore.
   5. Dopo l'incubazione, aggiungere 200 μl di terreno minimo essenziale fresco alle cellule, agitare delicatamente la piastra e incubare per 24 ore con CO₂ al 5% a 37 °C.
      NOTA: Il PEI è citotossico; Pertanto, si raccomanda di non incubare le cellule dopo la trasfezione per più di 24 ore.
   6. Il giorno successivo, eliminare il terreno e lavare le celle 2 volte con PBS. Aggiungere alle cellule il terreno completo DMEM contenente 500 μg/mL di Geneticina (G418) e 1 μg/μL di dox e incubare per 24 ore.
3. Fissaggio dei campioni per la microscopia confocale
   1. Per fissare tutti i campioni, lavare le cellule con 1x PBS 3x, aggiungere 100 μl di paraformaldeide al 4% alle cellule e incubare a RT per 10 minuti.
   2. Lavare le celle con PBS 3x. Al termine del lavaggio, aggiungere 1 μg/mL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) alle cellule e incubare a RT per 15 minuti al buio.
   3. Dopo l'incubazione, lavare le cellule 3 volte con PBS. Osservare le cellule al microscopio confocale per l'espressione della GFP e la colorazione DAPI.

8. Acquisizione di cellule trasfettate mediante microscopia confocale e quantificazione

1. Pulire il fondo del vetrino coprioggetti dei pozzetti utilizzando un panno assorbente. Attivare i comandi del microscopio a scansione laser confocale. Quindi, accendi il compressore e la lampada al mercurio.
2. Per azionare la macchina, i controlli del microscopio, il controllo della testina di scansione, la chiave laser, il modulo laser, la lampada, il controller del microscopio e la CPU devono essere accesi in sequenza.
3. Sul computer aprire il software (Tabella dei materiali) e fare clic su Abilita controllo scenico XY. Si aprirà un pop-up che chiederà di eseguire la pulizia per 7S3. Fare clic su No. Chiudi il grafico in tempo reale e regola le schermate di impostazione.
4. All'obiettivo 60x, aggiungere una goccia di olio da immersione, posizionare la piastra inferiore del vetrino coprioggetto a 96 pozzetti sul tavolino e spostare il tavolino sul piano X-Y per regolare la posizione dell'obiettivo sul pozzetto. Fare clic sull'oculare e selezionare il canale Alexa-488. Fare clic su Shutter Off per mettere a fuoco le celle sull'oculare. Regolare l'oculare in base al nucleo e alla messa a fuoco fine.
5. Fare clic su Shutter On presente sulla scatola di controllo del microscopio e spostare l'obiettivo per regolarne la posizione e mettere a fuoco l'area di interesse per osservare le cellule in contrasto interferenziale differenziale (DIC). Passa alla modalità EPI sulla scatola di controllo del microscopio per osservare le cellule nel filtro di lunghezza d'onda Alexa-488 per l'espressione GFP. Le celle dovrebbero apparire verdi.
6. Fare clic su Shutter Off, andare su Imaging LSM e scegliere la risoluzione dell'immagine come 1.024 x 1.024. Fare clic su Aggiungi fase e trascinare per aggiungere un canale verde come fase.
7. Sul programma Olympus cliccare su LSM e successivamente cliccare su Live Button per osservare le celle in contrasto di fase e il canale Alexa 488nm. Premere Ctrl e scorrere per mettere a fuoco le celle dal software per l'acquisizione delle immagini.
8. Regolare il guadagno e l'offset per regolare l'intensità della fluorescenza catturata dal rivelatore. Fare clic su Acquisisci, assegnare un nome alle immagini e fare clic su Salva.
9. Nel software di imaging, fare clic su File, selezionare tutte le immagini con estensione .oir e fare clic su Apri.
10. Fare clic su Tile View per visualizzare le immagini in tutti i canali. Per aggiungere una barra di scala alle immagini, fare clic su Visualizza e quindi scegliere l'opzione Barra di scala .
11. Per salvare le immagini dai singoli canali in scala di grigi a 16 bit, fare clic su File e selezionare Esporta immagine. Seleziona l'immagine e seleziona i segni di spunta su tutti i canali. Nella scheda Seleziona fotogramma dell'opzione Doppia visualizzazione, scegliere Sì. Nella scheda di output, scegli il colore RGB a 24 bit con l'opzione delle informazioni burn-in e scegli tiff come tipo di file per l'immagine. Nella cartella Esporta in , scegli la posizione del file appropriata per salvare le immagini e quindi fai clic su OK.
12. Per salvare le immagini unite, segui gli stessi passaggi, tranne per il fatto che nell'opzione di visualizzazione divisa, scegli No e nella scheda di output, scegli Canali uniti con informazioni di masterizzazione.
13. Per analizzare l'espressione di GFP nelle cellule, apri Fiji in Windows ed esporta il file tiff. Selezionare il colore verde per analizzare l'espressione GFP.
14. Selezionare l'area della cella utilizzando l'opzione dello strumento a mano libera e fare clic su Analizza per misurare l'intensità della fluorescenza. Ripetere il processo per 3 immagini.
15. Esporta i dati in un software di analisi ed esegui test statistici sui dati quantificati.

9. Saggio del carico parassita

1. Durante la visualizzazione delle cellule su un microscopio confocale, contare il numero totale di parassiti presenti nei singoli macrofagi.
2. Esamina casualmente 100 macrofagi e annota il numero di parassiti intracellulari. Eseguire test statistici tra infetti e punti temporali di campioni IMTI per esaminare l'effetto dell'espressione di SDHA sulla conta dei parassiti.

10. Quantificazione di IL-10 e IL-12 mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)

1. Preparare i campioni seguendo i passaggi 7.1 e 7.2 e raccogliere il terreno in una provetta da 1,5 mL. Conservare il supporto in ghiaccio o conservarlo a -20 °C fino a nuovo utilizzo. Seguire le istruzioni del manuale del kit utente ed eseguire l'ELISA per IL-10 e IL-12.

11. Profilazione delle citochine mediante PCR quantitativa a trascrizione inversa in tempo reale (qRT-PCR)

1. Preparare i campioni come indicato nei passaggi 7.1 e 7.2. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta e aggiungere 500 μl di reagente TRIzol e incubare le cellule per 2 minuti a RT.
   NOTA: Le fasi di isolamento dell'RNA devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare come precauzione di sicurezza contro la contaminazione da RNasi.
2. Raccogliere i campioni in una provetta da 1,5 mL, aggiungere 100 μL di cloroformio e mescolare capovolgendo le provette 5x-8x. Incubare i campioni per 15 minuti a RT. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
3. Si osserveranno tre strati, raccogliere lo strato superiore acquoso chiaro in una provetta fresca da 1,5 mL. Aggiungere 500 μl di isopropanolo allo strato acquoso, mescolare bene invertendo 10x e incubare i campioni per 15 minuti a RT. Dopo ogni 5 minuti, miscelare nuovamente i campioni capovolgendo le provette.
4. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e lavare il pellet 2 volte con etanolo al 75% in pirocarbonato di dietil (DEPC) allo 0,1% contenente acqua per 5 minuti e centrifugare a 8.000 x g a 4 °C.
   NOTA: Il DEPC contenente acqua degrada le RNasi e, pertanto, si consiglia di utilizzarlo per l'isolamento dell'RNA.
5. Infine, asciugare il pellet all'aria per 5 minuti a RT, scioglierlo in 20 μL di DEPC contenente acqua e misurare la concentrazione di RNA isolato, rapporto 260/280 e 260/230, utilizzando uno spettrofotometro.
   NOTA: Il rapporto 260/280 dovrebbe essere approssimativamente 2,0, che è generalmente indicativo di una forma pura di RNA, e il rapporto 260/230 dovrebbe essere compreso tra 2,0 e 2,2 per considerare che l'RNA isolato è privo di composti chimici indesiderati come il trizolo.
6. Per la preparazione di 20 μl di ciascun campione di cDNA, scongelare i reagenti con ghiaccio e farli girare brevemente per 15 s a RT. Dare un breve giro a tutti i reagenti e anche ai campioni di RNA prima dell'uso.
7. In una provetta da 100 μl sterilizzata in autoclave, prelevare 0,8 μl di dNTP 25x, 2 μl di primer 10x, 2 μl di tampone 10x. Aggiungere 1 μg/μL di concentrazione di RNA e aggiungere 0,5 μL di enzima trascrittasi inversa. Portare il volume a 20 μl utilizzando DEPC contenente acqua.
8. Dare ai campioni di cDNA un breve giro per 1 minuto a RT. Tenere i campioni sul ghiaccio.
9. Accendere il termociclatore, svitare il pannello superiore per allentare il supporto e posizionare i campioni sul blocco. Dopo aver posizionato i campioni, avvitare bene il coperchio.
10. Una volta acceso il sistema, fare clic su Esegui. Seleziona l'opzione Principale , quindi accedi al menu Programmi e seleziona l'opzione CDNA . Definire il volume del campione come 20 μl e fare clic su RUN. Il termociclatore esegue il programma in quattro fasi. Il primo passaggio è di 25 °C per 10 minuti, il secondo è di 37 °C per 2 ore, il terzo è di 85 °C per 5 minuti e il passaggio finale è di 4 °C per sempre.
11. Una volta che il ciclo entra nel quarto passaggio, fare clic su Invio e terminare il ciclo. Raccogliere i campioni e procedere con la qRT-PCR. Conservare i campioni di RNA a -80 °C e i campioni di cDNA a -20 °C.
12. Per la rilevazione delle citochine, scongelare i reagenti necessari 2x PCR Master mix, cDNA e sonde per TNF-α, IFN-γ, TGF-β e NFW su ghiaccio.
    NOTA: Tutti i reagenti, le miscele di reazione e i campioni devono essere conservati in ghiaccio.
13. In una provetta da 100 μl, preparare un campione di cDNA aggiungendo 1 μl di cDNA e 3,5 μl di NFW. Per preparare la miscela master, prelevare 5 μL di miscela master e aggiungere 0,5 μL di sonda in una provetta da 100 μL. Mescolare il contenuto facendo una breve centrifuga. Calcola il numero di campioni e geni bersaglio e prepara la miscela di reazione di conseguenza.
    NOTA: Aggiungere NFW e master mix sul fondo della provetta da 100 μl. Aggiungere cDNA e sonda alla parete della provetta da centrifuga come precauzione per garantire l'aggiunta del volume ed evitare la miscelazione incrociata di qualsiasi reagente.
14. Posizionare le strisce a 8 pozzetti nel raffreddatore PCR. Trasferire 5,5 μl di miscela master e flaconcino contenente la sonda sul fondo di ciascun pozzetto nelle strisce da 8 pozzetti. Di conseguenza, ripetere il passaggio per tutti i geni bersaglio.
15. Trasferire 4,5 μl della miscela di cDNA e NFW sulla parete del pozzetto in strisce da 8 pozzetti. Di conseguenza, ripetere il passaggio per tutti i campioni.
16. Sigillare le strisce con i coperchi e fare un breve giro di 10 s per mescolare i geni e i campioni nel pozzetto. Posizionare la striscia nello slot per campioni qRT-PCR e chiudere lo slot.
17. Sul desktop avvia il software e accedi come ospite. Sullo schermo apparirà un pop-up. Fare clic su Continua senza connessione.
18. Nel menu Configurazione, fare clic su Configurazione avanzata. In Proprietà esperimento scrivere il nome dell'esperimento nella scheda Nome esperimento. In quale tipo di esperimento si desidera impostare l'opzione, selezionare Quantitazione-TC comparativa (δδ ct).
19. In Quale velocità di rampa si desidera utilizzare nello strumento? , fare clic su Veloce (~ 40 minuti per completare una corsa). Nel menu di configurazione della piastra, definire i nomi dei geni nell'opzione Definisci target e digitare i nomi dei campioni in Definisci campioni.
20. Nella scheda Metodo di esecuzione, digitare 10 μl in Volume di reazione per pozzetto. Subito prima di tenere premuto il palco, fai clic su Aggiungi palco e seleziona Holding stage. Modificare la temperatura a 50 °C e il tempo a 2 min. Nella seconda fase di mantenimento non apportare modifiche, che saranno a 95 °C per 1 s.
21. Nella fase ciclistica Passaggio 1, modificare la temperatura a 95 °C e il tempo a 3 s. Al punto 2, modificare la temperatura a 60 °C e il tempo a 30 s. Fare clic su Esegui per avviare il ciclo qRT-PCR.

12. Analisi statistica

NOTA: per tutti i dati, la media è rappresentata come una barra e la deviazione standard rappresenta la barra di errore in un grafico a barre (valore p< 0,05 è considerato significativo).

1. Aprire il software di analisi dei dati e inserire i dati ottenuti dall'esperimento confocale.
2. Per l'analisi al microscopio confocale, applicare l'ANOVA unidirezionale ordinaria con il test di correzione di Tukey per il confronto di più gruppi per l'espressione di GFP. Considera i dati con p < 0,05 come statisticamente significativi. Preparare una rappresentazione grafica dei dati con la media rappresentata da una barra e la deviazione standard che rappresenta la barra di errore.
3. Per il test del carico di parassiti, creare un nuovo foglio e inserire i dati del conteggio dei parassiti per 100 macrofagi. Applicare l'ANOVA unidirezionale ordinaria con la correzione di Tukey tra tutti i campioni. Considera i dati con valore p< 0,05 come statisticamente significativi.
4. Per ELISA, eseguire l'ANOVA bidirezionale con il test di confronto multiplo di Tukey. Per la qRT-PCR, eseguire l'ANOVA unidirezionale con il test di correzione di Tukey.

Risultati

La disposizione delle parti genetiche che formano il circuito sintetico per esprimere il circuito sintetico è mostrata in (Figura 1A). Le parti corrispondenti sono state clonate nel vettore pEGFP-N1 in modo ortogonale e modulare, come rappresentato nella Figura 1B. La simulazione del circuito sintetico ha rivelato dinamiche oscillatorie sia nell'SDHA che nel repressore della tetraciclina. Questa osservazione suggerisce un pattern di espressione reciproca caratterizzato da funzioni d'onda periodiche. L'aumento della concentrazione di SDHA può essere attribuito all'induzione della doxiciclina, mentre l'espressione di TetR può derivare dalla diminuzione dei livelli di doxiciclina (Figura 1C). Data l'espressione oscillatoria inducibile di SDHA e TetR osservata in silico, è stata progettata e implementata una strategia per la somministrazione di circuiti sintetici attraverso il vettore plasmidico pEGFP-N1.

Le parti iGEM identificate per lo studio includono BBa_K1493803 per TetO, BBa_K4344028 per la sequenza di Kozak, BBa_C0040 per TetR e BBa_K1537016 per P2A, rispettivamente. L'ID di accesso NCBI per SDHA è NM_025848. Questi componenti sono stati assemblati per costruire un circuito sintetico TetON inducibile dalla doxiciclina, che copre un totale di 1317 coppie di basi (Supplementary File 1). Poiché il TetO funziona come un elemento regolatore del DNA, la sua sequenza non è stata tradotta. La sequenza a valle della sequenza di Kozak, che si estende da 5' TetR all'estremità 3' di P2A, posizionata a valle di SDHA, è stata scelta per la validazione in silico della traduzione. L'osservazione ha rivelato l'assenza di codoni di stop interni, garantendo una traduzione ininterrotta su tutta la lunghezza della sequenza (File supplementare 2). Le parti regolatorie di un circuito sintetico comprendente 1317 bp sono state inserite tra i siti di restrizione NotI e XhoI, che si trovano 5' a monte dell'EGFP (Figura 1B). I risultati del sequenziamento evidenziano che la sequenza di inserimento è stata clonata nel plasmide (File supplementare 3).

L'introduzione di un circuito immuno-metabolico nel ceppo DH5α di E. coli ha portato alla crescita di colonie trasformate che mostrano resistenza alla kanamicina, l'antibiotico impiegato come marcatore selettivo durante la trasformazione batterica. L'abbondante presenza di colonie trasformate sulla piastra di selezione era più elevata, il che suggerisce che le cellule competenti mostravano un alto potenziale di trasformazione, indicativo dell'efficienza del protocollo di trasformazione utilizzato (Figura 1D).

Una singola colonia è stata isolata e seminata in 10 mL di LB integrata con kanamicina per l'isolamento del plasmide. La resa plasmidica derivata da una coltura di 10 mL è dettagliata nella Tabella 1. Per questa procedura è stato impiegato un metodo standard per l'isolamento dei plasmidi. Le soluzioni tampone sono state preparate il giorno prima dell'isolamento del plasmide e le condizioni di incubazione sono state ottimizzate per massimizzare la resa del plasmide. La concentrazione di plasmidi ottenuta ha superato 1 μg/μL, con rapporti 260/280 e 260/230 superiori rispettivamente a 1,8 e 2,0. Questi risultati indicano che i plasmidi isolati erano di elevata purezza e privi di contaminanti come proteine, EDTA, carboidrati e fenolo.

È stato valutato lo spostamento della mobilità elettroforetica per il circuito sintetico isolato. La digestione di restrizione è stata eseguita utilizzando gli enzimi di restrizione NotI e XhoI, poiché questi erano i siti di restrizione in cui è stato inserito il circuito sintetico. Due bande sono state osservate su gel di agarosio all'1%, una banda vicino a 1500 bp e una tra 4 kb e 5 kb. Dato che la dimensione dell'inserto è di 1317 bp, la banda a 1500 bp corrisponde probabilmente all'inserto. Il vettore pEGFP-N1 ha una dimensione di 4,7 kb. Quindi, si presume che la banda vicino a 5 kb sia il vettore pEGFP-N1. Di conseguenza, si è dedotto che all'interno del vettore di consegna era presente un circuito sintetico completo e intatto. Inoltre, è stata rilevata una banda di circa 6 kb per il circuito sintetico intatto non digerito, indicando che il vettore pEGFP-N1 ospita un inserto di quasi 1,3 kb all'interno del vettore plasmidico (Figura 1E).

Figura 1: Progettazione e validazione di circuiti sintetici. (A) Rappresentazione di circuiti sintetici mediante l'assemblaggio di parti genetiche e componenti regolatori. (B) Grafico di simulazione deterministica che mostra l'espressione periodica di SDHA e TetR a 100 unità di tempo. (C) Colonie trasformate a circuito sintetico di E. coli DH5α resistenti alla kanamicina. L'unità è un'unità di 100 volte in quanto è una simulazione deterministica. (D) Elettroforesi su gel di agarosio di circuiti sintetici intatti e digeriti mediante enzimi di restrizione NotI e XhoI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Concentrazione di plasmidi (μg/mL)	260/280	260/230
1248.5	1.95	2.45
1123.1	1.89	2.43
1155.8	1.87	2.41
1056.8	1.94	2.47

Tabella 1: Resa del costrutto di circuito sintetico ottenuto dopo l'isolamento del plasmide. La tabella mostra la concentrazione di plasmidi in μg/mL, il loro rapporto 260/280 e 260/230.

Nelle cellule di controllo e in quelle infette, l'intensità di fluorescenza osservata era bassa per la GFP. Tuttavia, è stato osservato che la trasfezione del circuito sintetico con un rapporto 1:1 tra plasmide e PEI con 500 μg/mL G418 e l'induzione con 1 μg/μL dox inducono un'elevata espressione di GFP nelle cellule IMT. Nelle cellule IMTI di 6 ore, anche l'espressione di GFP era significativamente più alta, sebbene l'espressione di GFP fosse inferiore rispetto al campione IMT (Figura 2A, B). Inoltre, è stato osservato un aumento dell'espressione di GFP nei campioni IMTI a 12 ore, IMTI a 18 ore e IMTI a 24 ore. Questo aumento può essere dovuto a un aumento del tempo di infezione, che potrebbe aver indotto maggiori alternanze metaboliche nei macrofagi da parte del parassita residenziale¹⁷. I livelli intracellulari di SDHA potrebbero essere influenzati a causa di un aumento del tempo di infezione¹⁸. Poiché il dox è stato integrato in questi campioni IMTI, i livelli di SDHA attraverso i circuiti sintetici potrebbero essere aumentati, portando così ad un aumento dell'espressione di SDHA.

La colorazione DAPI è stata eseguita per identificare il numero di parassiti residenziali nei macrofagi. Nei macrofagi infetti principali di 6 ore L., il numero osservato di parassiti intracellulari era di 6 cellule per macrofago, che è più alto rispetto al campione IMTI di 6 ore, che aveva 1-2 parassiti intracellulari per macrofago. Dopo la trasfezione e l'induzione dox, è stata osservata una significativa riduzione del carico parassitario intracellulare in diversi momenti dell'infezione (Figura 2C). Le osservazioni hanno suggerito che i circuiti sintetici potrebbero aver indotto effetti di eliminazione dei parassiti stimolando l'espressione di SDHA.

Figura 2: Microscopia confocale a scansione laser. Immagini di campioni di controllo, infetti, IMT e IMTI. (A) Analisi dell'espressione della GFP in tutti i campioni sperimentali con una barra di scala di 50 μm per il controllo, 6 h infetti e IMT, 20 μm per 6 h IMTI, 10 μm per 12 h IMTI, 18 h IMTI, 24 h IMTI rispettivamente. I canali utilizzati erano DIC, DAPI, GFP e immagini unite di tutti i canali. (B) ANOVA unidirezionale con test di correzione di Tukey di tutti i campioni sperimentali (n=3) per l'espressione GFP (p < 0,05 è considerato significativo) Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. (C) ANOVA unidirezionale con test di correzione di Tukey è stata eseguita l'analisi della carica parassita in 100 cellule macrofagiche per campioni da (A) (n=3) (p < 0,05 è considerato significativo). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il rilevamento dei livelli di IL-10 e IL-12 nei terreni di tutti i campioni ha rivelato che le concentrazioni di IL-10 e IL-12 erano più alte a 6 ore dopo l'infezione, con una sottoregolazione dei livelli di citochine dopo l'infezione di 24 ore. Non c'è stata alcuna differenza significativa nei livelli di IL-10 e IL-12 dopo la trasfezione e l'induzione di circuiti sintetici. Inoltre, c'era una differenza non significativa nei livelli di IL-10 e IL-12 nei campioni di punti temporali IMTI (Figura 3). Il campione infetto di 6 ore è già stato riportato per mostrare l'espressione di IL-10 e IL-12^19,20, osservando una differenza non significativa in IL-10 e IL-12 ci ha fatto studiare l'effetto del circuito sintetico su altre citochine.

Figura 3: ELISA di IL-10 e IL-12 per identificare i loro livelli secretori in terreni di diversi campioni. I campioni (n=2) includono controllo, 6 ore infette, 24 ore infette, IMT, 6 ore IMTI, 12 ore IMTI, 18 ore IMTI, 24 ore IMTI. È stata eseguita l'ANOVA a due vie con l'analisi del test di correzione di Tukey (p <.05 è considerato significativo). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il rilevamento dei livelli di trascrizione di TNF-α, IFN-γ e TGF-β in campioni infetti a 6 ore, IMT e IMTI a 24 ore ha rivelato che è stato osservato un aumento significativo del TNF-α a 2,5 volte nel campione IMTI a 24 ore rispetto ai campioni di infezione e IMT (Figura 4). Nel campione IMTI delle 24 ore, è stato osservato un aumento di 35 volte dei livelli di IFN-γ rispetto ai campioni di infezione e IMT. I livelli di TGF-β, sebbene abbiano mostrato una significativa sovraregolazione fino a 1,5 volte nel campione IMTI delle 24 ore, la variazione relativa del ripiegamento era inferiore rispetto al TNF-α e all'IFN-γ, suggerendo che le citochine pro-infiammatorie sono significativamente sovraregolate nel campione IMTI delle 24 ore.

Figura 4: analisi qRT-PCR delle citochine. (A) TNF-α, (B) IFN-γ e (C) TGF-β per campioni infetti da 6 ore, IMT e IMTI per 24 ore (n=2). È stata eseguita l'ANOVA unidirezionale con il test di correzione di Tukey (p < 0,05 è considerato significativo). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Sequenza nucleotidica di parti genetiche assemblate per formare il circuito sintetico. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Sequenza tradotta di circuiti sintetici che esprimono TetR, P2A e SDHA. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Risultato del sequenziamento del circuito sintetico clonato nel plasmide pEGFP-N1. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

I risultati ottenuti sottolineano l'efficienza della tubazione, che è stata canalizzata per la progettazione e l'implementazione di un circuito sintetico. La costruzione di questo circuito sintetico è stato un passo verso lo sviluppo della medicina di precisione per malattie infettive come la leishmaniosi. Attraverso l'assemblaggio in silico di parti genetiche e la simulazione deterministica, è stato monitorato l'effetto modulatorio distinto del sistema TetON. L'effetto del circuito, in particolare, potrebbe aver portato all'espressione bistabile reciproca di TetR e SDHA/GFP. L'espressione di SDHA era periodica, il che potrebbe indicare che solo in presenza di doxiciclina la sua espressione era aumentata. Per osservare potenziali cambiamenti nei modelli di espressione in un periodo, è stata selezionata un'unità di tempo di 100. I risultati identificano che il circuito sintetico ha mostrato un comportamento periodico per TetR e SDHA/GFP, probabilmente attribuibile alla sua natura ortogonale²¹. L'assemblaggio di parti genetiche dal registro delle parti iGEM ha svolto un ruolo fondamentale, in quanto ha fornito i componenti genetici necessari per la costruzione di circuiti sintetici²². La disposizione modulare delle parti genetiche è essenziale in quanto la traduzione e il funzionamento del circuito potrebbero essere influenzati, il che potrebbe portare a un'espressione inefficiente e a un effetto modulatorio nelle cellule²³.

La dimensione dell'inserto del circuito sintetico era di circa 1,3 kb per garantire che la dimensione del vettore non fosse troppo grande, il che potrebbe potenzialmente ridurre l'efficienza di trasformazione²⁴. La selezione di un vettore appropriato è un passaggio critico in quanto deve possedere parti genetiche, che sono essenziali per aumentare il numero di copie nel sistema batterico e produrre un'elevata copia plasmidica, e il suo meccanismo di espressione deve adattarsi bene nel sistema dei mammiferi²⁵. Il vettore pEGFP-N1 è ben caratterizzato nella linea cellulare RAW264.7 e possiede una struttura plasmidica compatta con un sito di clonazione multiplo²⁶. Per l'isolamento dei plasmidi sono state impiegate soluzioni tampone standardizzate in laboratorio per garantire la produzione di plasmidi altamente concentrati e puri, che è stata convalidata attraverso la stima spettrofotometrica e l'AGE. L'inserimento del circuito sintetico nel vettore pEGFP-N1 è stato convalidato attraverso la digestione di restrizione e i campioni sono stati analizzati su AGE e sequenziamento. I risultati di AGE rappresentavano una banda di 1,3 kb di inserto, una banda di 4,7 kb di vettore pEGFP-N1 e una banda di 6 kb dell'intero circuito sintetico.

È stata eseguita la trasfezione utilizzando il rapporto 1:1, 1:2 e 2:1 del DNA: rapporti PEI, dove il rapporto osservato di 1:1 ha funzionato meglio senza interrompere la morfologia cellulare (dati non mostrati). Si consiglia di utilizzare una concentrazione di 400 μg/mL - 1000 μg/mL di G418 per la selezione di cellule trasfettate²⁷. Per la selezione delle cellule trasfettate è stato utilizzato un 500 μg/mL di G418 in quanto ha soppresso efficacemente la crescita delle cellule non trasfettate senza compromettere la crescita cellulare o la morfologia delle cellule trasfettate (dati non mostrati). Data l'importanza del fenotipo cellulare nell'efficienza della trasfezione, in particolare nelle linee cellulari di macrofagi, che possono subire differenziazione e diventare difficili da trasfettare, per la trasformazione²⁸ è stato utilizzato un basso numero di passaggi della linea cellulare RAW264.7. Il numero di passaggi cellulari potrebbe anche essere un fattore critico nell'efficienza della trasfezione. Un numero di passaggi elevato può portare a una trasfezione inefficiente²⁹. Dox è l'induttore preferito per il sistema di induzione Tet-ON grazie alla sua elevata efficienza di legame con TetR, alla distribuzione tissutale favorevole, alla bassa tossicità e a un'emivita di 24 ore^{e 30}. Dopo la trasfezione, le cellule sono state indotte con dox per 24 ore e sono state osservate per l'espressione di GFP. Per le cellule RAW264.7, la concentrazione di dox utilizzata per l'induzione del circuito sintetico era di 1 μg/mL, che rientra nell'intervallo raccomandato di 1-2 μg/mL³¹ (dati non mostrati). Tuttavia, la regolazione della concentrazione di SDHA dopo l'induzione è stata indeterminata. Nel complesso, la determinazione e la standardizzazione del numero di passaggi cellulari, la concentrazione di DNA: PEI, la concentrazione del marcatore di selezione della trasfezione nei mammiferi e la concentrazione di induzione della doxiciclina sono fattori cruciali nel processo di trasfezione.

A seguito dell'induzione del circuito sintetico post-infezione in diversi punti temporali, è stata osservata una significativa riduzione del carico di parassiti intracellulari. Un confronto delle cariche di parassiti tra campioni infetti e IMTI ha rivelato un carico inferiore nelle cellule indotte dal circuito sintetico, probabilmente attribuibile all'espressione di SDHA. Poiché l'espressione di SDHA è associata alla produzione di NO, è stato osservato che le cellule IMTI hanno una forma morfologica irregolare e ruvida, che si verifica nella linea cellulare RAW264.7 quando viene prodotto NO³². I livelli di IL-10 e IL-12 dopo l'infezione di 6 ore erano più alti poiché entrambe le citochine sono state segnalate per essere sovraregolate in questo momento, che subisce ulteriori modifiche fenotipiche per produrre IL-10 più di IL-12¹⁹. Poiché i livelli di IL-10 e IL-12 non hanno alterato significativamente la post-trasfezione e nei campioni IMTI, è stata eseguita la profilazione delle citochine per rilevare le risposte pro-infiammatorie e anti-infiammatorie delle citochine.

I livelli di espressione di TNF-α, IFN-γ e TGF-β sono stati identificati in campioni di infezione a 6 ore, IMT e IMTI a 24 ore. Per eliminare i parassiti intracellulari, il TNF-α e l'IFN-γ sono principalmente essenziali in quanto inducono esplosioni ossidative attraverso la produzione di NO. I macrofagi polarizzati M2 esprimono TGF-β, che sottoregola le citochine pro-infiammatorie³³. Il campione IMTI delle 24 ore ha mostrato un aumento dell'espressione di TNF-α e IFN-γ rispetto al TGF-β, il che suggerisce che i macrofagi, dopo la trasfezione e l'infezione con L. major, potrebbero essersi polarizzati in un fenotipo che esprime citochine pro-infiammatorie. Lo studio, quindi, fornisce informazioni sulle alterazioni fenotipiche indotte in seguito alla trasfezione con un circuito sintetico e mette in evidenza le dinamiche dell'infezione. L'effetto dei circuiti sintetici come terapia può essere studiato in quanto la loro induzione ha aumentato significativamente l'espressione di citochine pro-infiammatorie rispetto alle citochine anti-infiammatorie. Pertanto, lo studio non solo ha stabilito la pipeline di costruzione e somministrazione del circuito sintetico, ma ha anche dimostrato il suo potenziale terapeutico in un modello di leishmaniosi attraverso l'upregulation delle citochine pro-infiammatorie nelle cellule ospiti sfidate dalla Leishmania.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10 μ Punte a L	Tarson	521050
Tampone di restrizione 10X	BioLabs	R0146S	Digestione di restrizione
Punte da 1 ml	Tarson	521016
provetta da 1 ml	Eppendorf	30121023
200 μ Punte a L	Tarson	521010
Pallone da 25 cm2	Corning	430639	Per colture cellulari
4',6-diamidino-2-fenilindolo	ThermoFischer Scientific	D1306	colorazione nucleare
tubo da 50 ml	Corning	352070
piastre da 60 mm	Falcon	353002
6X TrackIt ciano/arancione Tampone	di caricamentoThermoFischer Scientific	10488085	Caricamento di campioni per
piastra inferiore per vetrino coprioggetto AGE 96 pozzetti	ThermoFischer Scientific	160376	Per imaging confocale e trasfezione
Micro piastra di test a 96 pozzetti a fondo piatto	Tarson	941196
Agarose Sigma		A9539	Per AGE
Assemblaggio di elettroforesi su gel di agarosio	GeNei	93	Per AGE
Flusso laminare batterico	ESCO Lifesciences	2120765	Per la trasformazione
Cloruro di calcio	Merck	C4901	Preparazione tampone/reagente
Flusso d'aria laminare per colture cellulari	ThermoFischer Scientific	1323TS	Per colture cellulari
Raschietto cellulare	Genetix	90020	Per colture cellulari
Divaricatore	cellulare Fischer Centrifuga	12822775
per provette da 1,5mL	Eppendorf	EP5404000537
Centrifuga per 50mL falcon	ThermoFischer Scientific	75004210
Chlorofrom	Fischer Scientific	67-66-3	Per l'isolamento dell'RNA
Incubatore a CO2	ThermoFischer Scientific	3110	Per cuvetta
	per colture cellulariEppendorf	6138000018	Stima della concentrazione di plasmidi
CYTIVA IQ 500 gel imager	Cytiva	29655893	Per ETÀ
DEPC TRATTATO H2O 1000 ML	ThermoFischer Scientific	Per l'isolamento dell'RNA
Doxiciclina	Merck	33429	Per l'induzione di cellule trasfettate
Blocco riscaldante a secco	Labnet		Per la trasformazione e l'inattivazione degli enzimi di restrizione
Dulbecco's Modified Eagle Medium Centro	nazionale per la scienza		Per la coltura cellulare
Etanolo	Sigma-Aldrich	1.00983	Tampone / Preparazione dei reagenti
Bromuro di etidio	Sigma	E7637	Per AGE
Acido etilendiammina tetraacetico	Fischer Scientific	12635	Tampone / Preparazione dei reagenti
Microscopio a campo chiaro Evos	ThermoFischer Scientific	AMEX1000
ExPasy	https://web.expasy.org/translate/		per la costruzione di circuiti sintetici
Siero fetale bovino	Gibco	16000-044	Per coltura cellulare
Software FV31S-SW	Olypmus		Acquisizione immagini
Geneticin	Gibco	1563411	per trasfezione
Metodo di assemblaggio Gibson per la clonazione	BIOMATIK		Costruzione di un circuito sintetico
Prisma	Graphpad		Analisi statistica
di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità	ThermoFischer Scientific	4368814	per la sintesi di cDNA
Isopropanolo	Fischer Scientific	13825	Preparazione tampone/reagente
Kanamicina	Sigma	60615	Per la trasformazione e la selezione delle colonie
Luria Bertini brodo	Himedia	M1245	Per la coltura E.coli
Cloruro di magnesio	Fischer Scientific	BP214	Preparazione tampone/reagente
Micro filt Flusso d'aria laminare verticale	Microfilt
Striscia MicroAmp Fast a 8 provette, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific	4358293	per qRT-PCR
Strisce ottiche MicroAmp a 8 tappi	ThermoFischer Scientific	4323032	per qRT-PCR
Forno a microonde	LG	MC-7649DW	per AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman sonde
Mm00443258_m1 (TNF)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman sonde
Mm01321739_m1(TGFB)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman sonde
topo ELISA Kit IL-10	ThermoFischer Scientific	BMS614	per ELISA
per topo ELISA Kit IL-12	ThermoFischer Scientific	BMS616	per ELISA
Multiskan Sky con touch screen + μ Piastra a goccia	ThermoFischer Scientific	51119600DP	ELISA
MX-M Miscelatore per piastre per colture cellulari a 96 pozzetti Agitatore da laboratorio regolabile 0-1500 giri/min Agitatore da laboratorio	DIAB
Centro nazionale per le biotecnologie https://www.ncbi.nlm.nih.gov			per la costruzione del circuito sintetico
Camera di Neubauer Marienfeld superior	640010		Per il conteggio delle celle
Pallone non ventilato da 25 cm2	Corning	353014	Per la coltura del parassita
NotI	BioLabs	R3189M	Enzima di restrizione
Acqua priva di nucleasi	Biodesign	1QIA	Preparazione del reagente
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 software	Olypmus		Elaborazione delle immagini
Olympus FV 3000	Olympus		Per imaging confocale
Terreni OPTI-MEM	Terreni di 31985070 Gibco		per Trasfezione
vettore pEGFP-N1 clonato con circuito sintetico	Biomatik
Penicillina	ThermoFischer Scientific	15070063	Per colture cellulari
Polietilenimmina	MERCK	764965	per trasfezione
Acetato di potassio	Fischer Scientific	YBP364500	Preparazione di tamponi/reagenti
Cloruro di potassio	Fischer Scientific	BP366	Preparazione di tampone/reagente
Fosfato di potassio Monobasico	Sigma	P5655	Preparazione di tampone/reagente
Alimentatore	BIORAD	1645070	Per AGE
Registro delle parti biologiche standard	https://parts.igem.org/Main_Page		per la costruzione di circuiti sintetici
RNAiso Plus	Takara	38220090	Per l'isolamento dell'RNA
RNasi A	ThermoFischer Scientific	12091021	Preparazione di tamponi/reagenti
Roswell Park Memorial Institute Medium	Centro nazionale per la scienza		Per la coltura di parassiti
Incubatore agitatore	REMI	CIS 24 plus	Per la coltura di E.coli
Cloruro di sodio	Qualigens	Q27605	Preparazione di tampone/reagente
Sodio Dodecil solfato	Sigma-Aldrich	L3771	Preparazione di tampone/reagente
Idrossido di sodio	Fischer Scientific	15895	Preparazione di tampone/reagente
Sodio fosfato bibasico	Sigma	S5136	Tampone /Reagente
Spettrofotometro	Eppendorf		Stima della concentrazione di plasmidi
Spin win	Trason	1020
StepOne plus Sistema di PCR in tempo reale	Tecnologie	di vita 272006777	Per qRT-PCR
StepOne versione software 2.3	Tecnologie		Per qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNG	ThermoFischer Scientific	4366072
Tinker cell			Costruzione e simulazione di circuiti sintetici
TrackIt 1 Kb Plus Scala DNA	ThermoFischer Scientific	10488085	Per AGE
Tris (idrossimetil) amminometano cloridrato	Himedia	MB029	Preparazione tampone / reagente
Tris-acetato-EDTA	SERVA	42549.1	Preparazione tampone/reagente
Trypan blue	Sigma	T8154	Per la conta cellulare
XhoI	BioLabs	R0146S	Enzima di restrizione