Articolo metodologico

Stabilire un modello suino per studiare la conservazione dinamica dell'utero e il trapianto

DOI:

10.3791/67357

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20 dicembre 2024

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children's Boston, 3Plastic Surgery Research Laboratory, Department of plastic and reconstructive surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Gynecology and Obstetrics, CHU de Rennes, University of Rennes, 5Division of Plastic Surgery Research, Vascularized Composite Allotransplantation Program Development, Cedars-Sinai Hospital, 6Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, CHU de Rennes, University of Rennes, 7SITI Laboratory, UMR1236 INSERM, Établissement Français du Sang, University of Rennes

In questo articolo

Sommario

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Viene descritto un modello dettagliato e riproducibile di utero suino, dall'approvvigionamento chirurgico all'inizio della perfusione meccanica, consentendo lo studio della conservazione dell'utero nel trapianto.

Abstract

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Ad oggi, il trapianto di utero è l'unica opzione per le donne con infertilità uterina assoluta, come quelle con sindrome di Rokitansky, per vivere la gravidanza e partorire. Nonostante il crescente interesse per il trapianto di utero negli ultimi anni, diverse questioni richiedono ancora ulteriori ricerche, tra cui il danno da ischemia-riperfusione e il suo impatto sulla qualità del trapianto e sul rigetto. La letteratura recente ha evidenziato un tasso di complicanze trombotiche fino al 20% dopo il trapianto di utero. Questo tipo di complicanza può derivare da un danno alle cellule endoteliali indotto dall'ipossia, che spesso porta al rigetto del trapianto uterino. L'ipossia viene indotta durante la conservazione a freddo statica, che rimane il gold standard per la conservazione del trapianto nel trapianto di organi solidi. Recentemente, è stato dimostrato che la conservazione dinamica mediante perfusione meccanica migliora la conservazione a lungo termine degli organi convenzionali e marginali riducendo il danno ischemico e ipossico. In questo protocollo, miriamo a descrivere ogni fase chirurgica coinvolta nell'approvvigionamento dell'utero suino e nella conservazione dinamica, sulla base di entrambi i peduncoli uterini, per consentire la connessione e l'avvio del protocollo di perfusione della macchina.

Introduzione

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Il trapianto di utero (UTx) si è sviluppato in modo significativo negli ultimi dieci anni, con diversi team che hanno avviato programmi di ricerca clinica. Ad oggi, l'indicazione principale di UTx è l'infertilità uterina assoluta dovuta all'agenesia uterina, inclusa la sindrome di Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH). La sindrome MRKH è una malattia congenita con una prevalenza di una su 5.000 femmine nate vive1. UTx potrebbe potenzialmente affrontare ulteriori cause di infertilità, comprese quelle derivanti da isterectomia dovuta a malattia maligna, emorragia postpartum, fibromi uterini, sequele infettive e varie malformazioni congenite. Ciò suggerisce che circa 1 donna su 500 potrebbe essere idonea per UTx.

La prima UTx clinica si è verificata nel 2000 in Arabia Saudita2, ma le complicanze vascolari hanno portato a un'isterectomia tre mesi dopo. Da allora, sono stati eseguiti diversi casi di UTx, basati sia su donatori viventi che deceduti, con il risultato di oltre 80 nati vivi 3,4. Analogamente al regno del trapianto di organi solidi e degli allotrapianti compositi vascolarizzati (VCA), il rigetto immunitario è una sfida significativa nell'UTx. 5 Diversi fattori possono portare al rigetto del trapianto, tra cui l'insufficienza microcircolatoria e la stasi venosa, che possono portare a complicanze trombotiche. In una recente revisione che studia la vascolarizzazione uterina nei trapianti, Kristek et al. hanno riportato fino al 15% di trombosi arteriosa e fino al 5% di trombosi venosa6. Inoltre, l'ischemia fredda e calda sono fattori critici che devono essere affrontati per il successo del trapianto, poiché il danno da ischemia-riperfusione (IRI) può portare a disfunzione del trapianto e rigetto acuto 7,8. I miociti rispondono allo stress ischemico producendo lattato per un massimo di 6 ore9, dopodiché il danno alle cellule muscolari è irreversibile. L'impatto dell'ischemia fredda sul miometrio è stato documentato in studi clinici e l'uso di una soluzione intracellulare dell'Università del Wisconsin durante la conservazione a freddo statica (SCS) ha dimostrato di migliorare la conservazione con una migliore risposta contrattile alle prostaglandine e concentrazioni di ATP più elevate rispetto alla soluzione di acetato10 di Ringer. Tuttavia, l'impatto dell'ischemia calda e fredda rimane poco esplorato nell'UTx.

L'SCS rimane il gold standard per la conservazione del VCA, compreso l'utero, e per la maggior parte dei trapianti di organi solidi. Tuttavia, negli ultimi anni, i progressi significativi nei sistemi di perfusione delle macchine e nelle soluzioni di conservazione hanno portato a un cambiamento di paradigma. Ci sono ora forti prove a sostegno del fatto che la perfusione meccanica dinamica può migliorare e prolungare la conservazione degli organi solidi sani e marginali 11,12,13,14,15. Questa tecnica è ora comunemente utilizzata nella pratica clinica per il trapianto di polmone, cuore, fegato e rene 14,16,17,18. La conservazione dinamica degli organi ha dimostrato molteplici vantaggi, tra cui la riduzione al minimo delle lesioni da ischemia fredda e ipossia fornendo un apporto continuo di ossigeno e nutrienti, eliminando i metaboliti tossici e migliorando la qualità dell'innesto e i parametri di vitalità12,19. Sono state sviluppate diverse modalità, che vanno dalla perfusione meccanica ipotermica a quella normotermica (con o senza vettori di ossigeno), con diversi perfusi disponibili, ma solo pochi sono stati testati sull'utero20. Per garantire il contributo sostanziale di tali prospettive di ricerca, i modelli chirurgici preclinici pertinenti sono di cruciale importanza.

In questo lavoro, la perfusione meccanica subnormotermica (SNMP) viene utilizzata come metodo di conservazione dinamica ossigenata degli organi a temperatura ambiente (circa 20 °C) facendo circolare un perfusato attraverso una pompa a rulli e un ossigenatore. Viene utilizzato un modello suino che è rilevante per gli studi sull'UTx e sulla conservazione grazie alle sue somiglianze con il sistema riproduttivo umano in termini di anatomia, fisiologia e dimensioni dei vasi21,22. L'utero viene prelevato dopo la morte circolatoria, fornendo rilevanza per la donazione dopo la morte cardiaca e suggerendo la possibilità di un ritardo nell'approvvigionamento dopo tutti gli altri organi solidi rilevanti23,24. Inoltre, questo modello facilita lo sviluppo di studi di conservazione dell'utero all'interno di laboratori di trapianto consolidati che si concentrano su altri organi, applicando i principi delle "3R"25. L'obiettivo è quello di stabilire un nuovo modello di conservazione basato sui peduncoli uterini e valutarne l'affidabilità per la conservazione dinamica. Tutte le fasi della procedura sono dettagliate, dall'isterectomia alla conservazione, comprendendo i punti chiave evidenziati sull'utilizzo di SNMP.

Il protocollo descritto di seguito ha preceduto un esperimento preliminare basato su una singola pompa e un sistema di afflusso "Y-tubing" per entrambe le arterie uterine (Figura 1 supplementare). Dopo 4 h-SNMP, l'organo ha guadagnato oltre il 50% del suo peso iniziale. Il flusso, la pressione, la resistenza e la variazione di peso sono mostrati nella Figura 2 supplementare. Un singolo sistema di perfusione separato in due afflussi non consentiva la modulazione di ciascuna portata alla pressione di ciascun lato. In questo caso, la SNMP ha portato a un edema sostanziale in metà dell'organo (Figura supplementare 3). Questo sistema si è rivelato inadatto al modello uterino, anche perché non deve essere considerato un modello perfettamente simmetrico. Pertanto, in questo protocollo sono stati utilizzati due sistemi di perfusione meccanica, uno per ciascuna arteria uterina.

Protocollo

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Tutti gli animali hanno ricevuto cure umanitarie seguendo la Guida del National Institute of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e i protocolli sono stati approvati dal Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Complessivamente, 6 femmine di maialino dello Yucatan del peso di 30-40 kg sono state utilizzate per l'approvvigionamento dell'utero, con quattro uteri sottoposti a SNMP. Tutti gli animali sono stati eparinizzati con una dose completa (100 UI/kg) prima dell'eutanasia. L'approvvigionamento degli organi è avvenuto post-mortem con meno di 60 minuti di ischemia calda. Altri organi potrebbero essere stati prelevati dallo stesso donatore per studi diversi, secondo i principi delle "3R"25. Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i reagenti e le apparecchiature utilizzate nel protocollo.

1. Preparazione preoperatoria (giorno prima dell'intervento)

  1. Preparare la soluzione di perfusato. Per la perfusione subnormotermica della macchina, è stata utilizzata una soluzione Steen+ ottimizzata per VCA26,27. È stato utilizzato un litro di soluzione per utero e la composizione è dettagliata nella Tabella 1.
    NOTA: Al perfusato viene aggiunta una grande quantità di idrossido di sodio con l'obiettivo di raggiungere un pH di circa 7,5-7,6. Questo valore è espressamente elevato ma necessario in quanto il pH tenderà a scendere man mano che la macchina viene fatta circolare e ossigenata con una miscela di carboidrati (95% di ossigeno; 5% di anidride carbonica).
  2. Impostare il sistema di perfusione della macchina (Figura 1). Verificare la presenza di perdite e bolle quando il perfusato viene fatto circolare.

2. Approvvigionamento dell'utero post mortem

NOTA: Per simulare la donazione dopo la morte cardiaca e/o l'approvvigionamento post mortem, l'animale deve essere soppresso secondo le linee guida IACUC locali. Il dissanguamento deve essere preferito all'iniezione endovenosa di Pentobarbital al fine di evitare tossicità che potrebbero interferire con lo studio.

  1. Posizionare l'animale soppresso in posizione supina. Strofina la zona addominale e posiziona teli sterili.
  2. Praticare un'incisione ombelicale mediana di 10 cm con una lama #20.
  3. Aprire il tessuto sottocutaneo e l'aponeurosi con un bisturi elettrico monopolare.
    NOTA: Bisogna prestare attenzione a non danneggiare l'intestino aprendo la cavità addominale.
  4. Mettere da parte l'intestino tenue con una garza chirurgica ed esporre l'utero.
    NOTA: L'anatomia uterina del modello utilizzato è mostrata nella Figura 2A.
  5. Procedere in modo simile per i lati sinistro e destro come segue:
    1. Identificare i vasi uterini.
      NOTA: La vena uterina è posizionata lateralmente all'arteria uterina (Figura 3).
    2. Crea un'apertura nel legamento largo lateralmente alla vena uterina con una pinza ad angolo retto.
    3. Attraverso questa apertura, inserire 2-0 punti di sutura di seta per legare i vasi ovarici e rilasciare l'utero dal tessuto connettivo circostante nel legamento largo usando la cauterizzazione.
    4. Legare i vasi utero-ovarici con 2-0 punti di sutura di seta e rimuovere l'ovaio e il tubo.
    5. Scheletrizzare i vasi uterini e dividerli il più vicino possibile ai vasi iliaci interni.
      NOTA: È necessario prestare attenzione a mantenere il peduncolo il più a lungo possibile per facilitare l'incannulamento e anticipare la retrazione del peduncolo dopo che è stato reciso.
    6. Ripetere i passaggi 2.5.1-2.5.5 sul lato opposto.
  6. Rimuovere l'utero tagliando la cervice con un bisturi elettrico monopolare.
    NOTA: Utilizzare un lungo tempo di contatto per garantire una corretta coagulazione del vaso cervicale, prevenendo perdite durante la perfusione.

3. Preparazione per perfusione

  1. Su un tavolino, dilatare entrambe le arterie uterine utilizzando un dilatatore microchirurgico e inserire un antinfortunio. Fissare l'incannulamento con lacci di seta 3-0 (Figura 2B).
    NOTA: In questo caso, è stato utilizzato un angiocateter da 18 G per tutte le arterie. È necessario prestare attenzione a non inserire il catetere troppo in profondità per evitare l'incannulamento selettivo, poiché la biforcazione è relativamente vicina. Le vene uterine non sono incannulate, in quanto il deflusso venoso è sufficiente a mantenere aperto il lume di questi vasi, consentendo una facile raccolta. Oltre a far risparmiare tempo, l'incannulamento traumatico può portare a danni vascolari e potenzialmente influenzare il flusso venoso.
  2. Sciacquare lentamente e manualmente entrambe le arterie uterine con 20 ml di soluzione di eparina su ciascun lato fino a quando tutti i vasi sono stati lavati via e i deflussi sono chiari.
    NOTA: È necessario prestare attenzione a non lavare con alta pressione, che può portare a lesioni microvascolari e fallimento della perfusione.
  3. Pesare l'utero.

4. Perfusione meccanica subnormotermica

NOTA: Per l'utero sono necessari due sistemi indipendenti di perfusione meccanica. Ogni arteria uterina è collegata a un sistema di perfusione composto da una pompa a rulli, un ossigenatore, una trappola per bolle e un sensore di pressione. Il perfusato in un serbatoio circola attraverso tubi di silicone collegati agli elementi sopra elencati prima di passare attraverso l'organo attraverso l'arteria uterina fino alla vena uterina su ciascun lato, dove il perfusato esce e viene rilasciato nello stesso serbatoio.

  1. Collegare l'utero ai sistemi di perfusione della macchina collegando le cannule dell'arteria uterina al tubo di afflusso (Figura 1).
  2. Utilizzando la pompa a rulli, regolare la portata su un valore basso (2,5-4,0 mL/min) per mantenere una pressione arteriosa costante tra 25-35 mmHg.
  3. Valutare i parametri di vitalità in ogni punto temporale predefinito sia in entrata che in uscita utilizzando una siringa da 1 ml e analizzando i campioni con la macchina del sistema di gasanalisi ematica [ad esempio, metriche dei gas ematici (pH, pCO2, pO2, lattato, eccesso di basi, bicarbonato), glucosio, sodio, potassio, calcio, cloruro].
    NOTA: In questo protocollo, la perfusione dura 4 ore e i campioni dall'afflusso e dal deflusso vengono prelevati ogni 30 minuti.
  4. Pesare l'utero alla fine della perfusione.

Risultati

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Durante la perfusione, il sistema è stato collegato a un sensore di pressione che ha registrato la pressione durante l'esperimento. La pressione è stata inizialmente registrata per un sistema privo di utero, che è stata sottratta dalle registrazioni della pressione durante la perfusione uterina per ottenere la pressione reale dell'organo. La portata è stata adattata per mantenere la pressione all'interno dell'intervallo desiderato ed è stata controllata dalla pompa a rulli. La resistenza è stata calcolata utilizzando la formula R = P / Q (R: resistenza (mmHg.mL.min-1); P: pressione (mmHg); Q: portata (mL/min)).

L'evoluzione dei parametri di perfusione è mostrata nella Figura 4. La velocità media di flusso iniziale era di 5,2 (min 2,4, max 10,0) mL/min su entrambi i lati e non ha fluttuato molto durante l'esperimento. Sulla base della letteratura e di precedenti esperimenti, la pressione target è stata fissata a 25-35 mmHg. La pressione arteriosa iniziale media era di 26 (min 10, max 36) mmHg sul lato sinistro dell'utero e di 27 (min 16, max 39) mmHg sul lato destro. Poiché il flusso e la pressione erano leggermente stabili e bassi, anche il profilo di resistenza arteriosa risultante ha mostrato una curva piatta durante l'esperimento. La resistenza vascolare iniziale media era di 8,5 (min 1, max 13,3) mmHg.mL.min-1 su entrambi i lati (Figura 4).

La conservazione del SNMP è stata valutata in base a diversi parametri metabolici (Figura 5): clearance del lattato (differenza tra il deflusso del lattato e l'afflusso del lattato), la variazione di peso, la differenza tra il glucosio in ingresso e il glucosio in uscita che riflette il consumo di glucosio e il consumo di ossigeno. Il consumo di ossigeno è stato calcolato utilizzando la formula Consumo di O2= 0,0314 x Q x (pO2 in ingresso - pO2 in uscita) / W (Q: portata (mL/min), pO2: pressione parziale dell'ossigeno (mmHg), W: peso (g) e 0,0314 costante di Henry in acqua a 20 °C e 1 atm). La diminuzione dei livelli di lattato durante la prima ora di perfusione indica che la perfusione meccanica ha permesso la clearance del lattato dopo l'accumulo durante la fase ischemica calda. Il cambiamento di peso ha mostrato che nessuno degli uteri aveva edema. La curva ha evidenziato che la perdita di peso si è verificata principalmente durante le prime due ore e che il peso tendeva a stabilizzarsi in seguito. La differenza di glucosio tra l'afflusso e l'efflusso è diminuita durante la prima ora di perfusione prima di stabilizzarsi a valori bassi. Il consumo di ossigeno è rimasto costante durante la perfusione.

Dopo 4 ore di SNMP, è stata eseguita un'angiografia in ciascun utero, lavando lentamente 20 mL di mezzo di contrasto in ciascuna arteria uterina (Figura 6), che ha permesso la valutazione dell'albero vascolare dopo la fase di conservazione. In tutti gli organi, la microvascolarizzazione era ben identificata lungo la cervice, il corpo uterino e le corna.

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Figura 1: Modello chirurgico e sistema di perfusione della macchina. (A) Diagramma del sistema di perfusione della macchina utilizzato per l'SNMP dell'utero. (B) Fotografia rappresentativa di un utero suino sottoposto a SNMP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Diagramma dell'anatomia uterina umana (a sinistra) e suina (a destra) che mostra la principale vascolarizzazione attraverso l'arteria uterina. Le caratteristiche anatomiche dell'utero suino sono dovute principalmente alla presenza di un piccolo corpo diviso in due grandi corna uterine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Viste intra e post-operatorie. (A) Immagine intraoperatoria dell'utero dopo l'identificazione dei vasi uterini. (B) Immagini post-operatorie dell'utero dopo l'approvvigionamento e il lavaggio con eparina-soluzione salina. A: corpus; B: corna uterine; C: cervice; D: arterie uterine; E: vene uterine; F: tubo; G: ovaio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Profilo dei parametri di perfusione durante la perfusione meccanica di 4 ore su entrambi i lati uterini. (A) Velocità di flusso (mL/min). (B) Pressione (mmHg). (c) Resistenza arteriosa calcolata (mmHg.min.mL-1). Le curve indicano la media per ciascun lato dell'utero e le barre di errore indicano la deviazione standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Monitoraggio dei principali marcatori di ipossia durante la perfusione meccanica. (A) Clearance del lattato durante i primi 90 minuti di perfusione prima della stabilizzazione. (B) Il peso diminuisce durante la perfusione. (C) Differenza tra la concentrazione di glucosio in entrata e in uscita. (D) Consumo calcolato di O2 . I dati rappresentano la media per entrambi i lati di ciascun utero e le barre di errore mostrano la deviazione standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Angiografia rappresentativa dell'albero vascolare uterino dopo la conservazione subnormotermica. (A) Prima dell'iniezione del mezzo di contrasto. (B) Dopo l'iniezione del mezzo di contrasto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome del componenteQuantitàNome del componenteQuantità
Acqua deionizzata1LDestrano frazione bassa (~75 kDa)5 g
NaCl5,026 grammiAlbumina sierica bovina150 g
Kcl0,343 gIdrocortisone [50 mg/mL]0,2 ml
CaCl2 . 2H200,221 gDesametasone [1,6 g/100 mg]4 ml
NaH2PO40,187 gIdrossido di sodio [1 mol/mL]16 ml
NaHCO31,26 gEparina a basso peso molecolare200 UI
MgCl2 . 6H2O0,244 gInsulina200 UI
D-glucosio4,3 gVancomycin1,5 g
PEG (35 kDa)5 g

Tabella 1: Composizione della soluzione Steen+. NaCl: cloruro di sodio; KCl: cloruro di potassio; CaCl2. 2H20: cloruro di calcio diidrato; NaH2PO4: sodio diidrogeno fosfato; NaHCO3: bicarbonato di sodio; MgCl2 . 6H2O: cloruro di magnesio esaidrato; PIOLO; polietilenglicole.

Figura supplementare 1: Sistema di perfusione basato su pompa singola. (A) Diagramma del "sistema Y" a perfusione della macchina utilizzato per l'esperimento preliminare. (B) Fotografia rappresentativa dell'allestimento per l'esperimento preliminare. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Profilo dei parametri di perfusione durante 4.5h-SNMP per l'esperimento preliminare. (A) Portata (mL/min). (B) Pressione (mmHg). (c) Resistenza arteriosa calcolata (mmHg.min.mL-1). (D) Aumento di peso durante la perfusione. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Fotografia dell'utero alla fine dell'esperimento preliminare (4,5 h-SNMP). È evidente una distribuzione asimmetrica dell'edema, soprattutto nel corno destro (a destra dell'immagine). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

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Il trapianto di utero, spesso considerato parte della VCA, si è sviluppato rapidamente negli ultimi anni. Parallelamente, la perfusione meccanica ha iniziato ad essere esplorata nel VCA poiché ha dimostrato prove solide nel migliorare la conservazione degli organi solidi. La perfusione meccanica ipotermica e subnormotermica ha permesso una conservazione fino a 24 ore in modelli suini di VCA 26,27,28 miocutaneo e contenente osso. Poiché l'utero presenta sfide paragonabili al VCA contenente ossa e pelle, è fondamentale esplorare tecniche simili per l'UTx per migliorare la qualità della conservazione e i risultati a lungo termine29. Oltre a migliorare la qualità degli organi, un potenziale vantaggio della conservazione dinamica mediante perfusione meccanica è l'espansione del pool di donatori30. Il prelievo dell'utero da donatori viventi impone rischi sostanziali, come la lesione ureterale durante la dissezione del peduncolo uterino, ma anche l'interruzione ormonale e tutti i potenziali rischi associati alla menopausa precoce a causa dell'ovariectomia che può essere eseguita31,32. L'obiettivo di migliorare la qualità degli organi dei donatori deceduti eviterebbe la necessità di tali interventi chirurgici nelle procedure di reperimento dei donatori viventi. L'obiettivo finale sarebbe quello di consentire l'approvvigionamento dell'utero sia in donatori viventi che deceduti, al fine di soddisfare le esigenze delle donne con infertilità uterina assoluta33.

Questo articolo fornisce un modello riproducibile per l'approvvigionamento e la conservazione dell'utero suino utilizzando la perfusione meccanica. Migliorare la qualità e la durata della conservazione è rilevante per l'espansione del pool di donatori, consentendo alle donatrici cerebralmente morte di essere fonti affidabili per l'approvvigionamento dell'utero. Clinicamente, la maggior parte degli UTx è stata eseguita sulla base di donatori viventi, per lo più familiari o amici intimi. Il tempo di ischemia è un fattore critico per la vitalità finale dell'organo, in particolare nei donatori cerebralmente morti. L'IRI è definita come un danno cellulare causato da una successione di ischemia (interruzione della circolazione sanguigna nell'organo vascolare) e riperfusione (ritorno dell'apporto di ossigeno), spesso associata ad un aumento della temperatura, che contribuisce al danno cellulare. Questa cascata di eventi produce specie reattive dell'ossigeno, che alla fine portano a infiammazione cronica, apoptosi, rilascio di antigene e rigetto del trapianto 7,8,34. I tempi di ischemia calda (WIT) e fredda sono fattori critici nel processo IRI, ma solo pochi autori lo hanno studiato nell'utero. In uno studio che esplora l'effetto della conservazione a lungo termine della SCS nei topi UTx, il trapianto è stato eseguito dopo 24 ore di SCS, con gravidanze di successo sviluppate in cinque animali su sei. Tuttavia, dopo 48 ore di SCS, tutti i trapianti hanno mostrato necrosi35. In un altro studio che ha confrontato UTx in 14 pecore dopo 3 ore di SCS (n = 7) e 24 ore di SCS (n = 7), solo 7 animali erano vivi 8 giorni dopo il trapianto, con il 35% degli uteri considerati vitali per quanto riguarda l'edema e la necrosi, 2 uteri nel gruppo SCS 3 ore e 3 uteri nel gruppo SCS 24 ore36. È interessante notare che la contrazione del miometrio è stata mantenuta negli uteri vitali, ma la valutazione del metodo non è stata specificata. Ciò evidenzia l'importanza fondamentale di considerare che un trapianto uterino di successo comporta non solo un innesto vitale, ma anche mestruazioni funzionali e una gravidanza di successo. A questo proposito, la diminuzione dell'IRI e delle loro conseguenze negative è fondamentale per consentire un miglioramento della qualità dell'innesto e migliori tassi di successo dei nati vivi. Per garantire la coerenza, ci siamo assicurati di prelevare tutti gli organi dopo un WIT comparabile. Tutti i vasi all'interno del legamento largo sono stati coagulati o legati per garantire una misurazione della pressione pertinente e un'adeguata perfusione capillare all'intero organo. Il cateterismo è un altro punto cruciale in cui è necessario prestare attenzione per fissare la cannula evitando di danneggiare i vasi.

L'esperimento preliminare con un "sistema Y" ha portato all'ottimizzazione di due sistemi di perfusione indipendenti, indirizzando ciascuna arteria uterina separatamente. Infatti, uno dei parametri critici è la portata e la pressione di perfusione26,27, che portano ad adattare la portata, riflettendo la resistenza vascolare complessiva dell'organo. L'afflusso bilaterale ottimizzato ha permesso la clearance del lattato da ciascun lato dell'organo, come evidenziato nei nostri risultati (Figura 5), nonché misurazioni continue della differenza artero-venosa per tutti i parametri metabolici. A temperatura subnormotermica, la riossigenazione cellulare mediante perfusione meccanica consente l'eliminazione dei lattati accumulati durante la fase metabolica anaerobica associata a ipossia e ipoperfusione durante l'approvvigionamento e l'incannulamento, mantenendo bassa l'attività metabolica ed evitando il rimbalzo del lattato. Risultati simili sono stati trovati negli arti posteriori di ratto19. In un altro modello anatomico, Dion et al. hanno mostrato un approccio diverso prelevando l'utero con l'aorta nel loro studio di perfusione ipotermica37. Sarebbe di grande interesse per gli studi futuri confrontare correttamente la perfusione singola basata sull'aorta con il modello sviluppato nel nostro protocollo.

Mentre qui viene descritto un modello riproducibile per la perfusione meccanica dell'utero suino, una delle principali preoccupazioni è l'idoneità per ulteriori trapianti. Al fine di confermare l'efficacia dei protocolli di conservazione, il trapianto è fondamentale poiché riproduce il contesto clinico. Ciò richiede anastomosi microchirurgiche arteriose e venose. Diversi studi hanno dimostrato che la vena utero-ovarica può essere utilizzata nelle UTx cliniche quando la vena uterina è di calibro insufficiente a garantire il drenaggio venoso 38,39. Un limite in questo modello è la mancanza di conservazione della vena utero-ovarica. Tuttavia, non è stato registrato alcun edema maggiore dopo 4 ore di SNMP in tutte le repliche incluse ed è stato osservato un deflusso venoso continuo da tutte le vene uterine. Ciò suggerisce una differenza tra il modello umano e quello suino con una potenziale semplificazione delle procedure UTx nei minipig dello Yucatan. Ulteriori studi dovrebbero includere l'estensione del tempo di perfusione oltre le 4 ore per determinare i limiti della conservazione dinamica. Per concludere, questo articolo descrive un modello di utero suino riproducibile per lo studio della conservazione basata sulla perfusione meccanica e fornisce una risorsa preziosa per indirizzare l'IRI con l'obiettivo di aumentare il numero complessivo di organi disponibili per UTx.

Dichiarazioni

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Tutti gli autori non hanno alcun interesse finanziario da dichiarare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal National Institute of Health nell'ambito del premio n. R01AR082825 (BEU) e dallo Shriners Children's 84308 (YB). HO e YB hanno ricevuto finanziamenti dalla Fondation des Gueules Cassées. Il supporto di Société Française de Chirurgie Plastique, Reconstructrice et Esthétique (SOFCPRE, Francia) e CHU de Rennes (Francia) a YB è ampiamente apprezzato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sistema di ossigenazione Affinity PixieMedtronicBBP241Ossigenatore
Bovin albumina siericaSigma-AldrichA9647Componente perfusato
Cloruro di calcio diidratoSigma-Aldrich223506Componente perfusato
Anidride carbonica OssigenoAirgas UN3156Anidride carbonica Miscela di ossigeno  a gas 
D-(+)-Glucosio monoidratoSigma-Aldrich49159Componente perfusato
DesametasoneSigma-AldrichD2915Componente perfusato
DestranoThermo scientific406271000Componente perfusato
Eparina sodio iniezioneEugia Pharma63739-953-25Componente perfusato
Mulina Insulina regolareumana Lilly0002-8215-01Componente perfusato
Idrocortisone sodio succinatoPfizer0009-0011-03Componente perfusato
Cloruro di magnesio esa-idratoSigma-AldrichM9272Componente perfusato
MasterFlex L/SCole-Parmer77200-32Pompa a rulli
Polietilenglicole 35000Sigma-Aldrich25322-68-3Componente perfusato
Cloruro di potassioSigma-Aldrich7447-40-7Componente perfusato
Monitor di pressione, portatile, PM-P-1Sistemi viventi StrumentazionePM-P-1Sensore di pressione
Radnoti  Bubble Trap Compliance ChamberRadnoti130149Bubble
RAPIDPoint500Siemens500Blood Gas System
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS5761Componente perfusato
Cloruro di sodioSigma-AldrichS9888Componente perfusato
Idrossido di sodioSigma-Aldrich72068Componente perfusato
Sodio fosfato monobasique diidratoSigma-Aldrich71505Componente perfusato
Siringa 1 mLBD309659Approvvigionamento di campioni
Vancomicina cloridratoArdesia eseguire prodotti farmaceutici70436-021-82Componente perfusato
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Riferimenti

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