Articolo metodologico

Un modello murino immunocompetente per la terapia termica interstiziale laser del glioblastoma

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DOI:

10.3791/67381

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15 novembre 2024

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1Department of Human Anatomy and Cell Sciences, University of Manitoba, 2Department of Pathology, University of Manitoba, 3Department of Medical Microbiology & Infectious Diseases, University of Manitoba, 4CancerCare Manitoba

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il glioblastoma è una forma devastante di cancro cerebrale primario e la terapia termica interstiziale laser sta emergendo come una promettente alternativa alla resezione chirurgica convenzionale per il glioblastoma inoperabile. Questo protocollo descrive un modello murino preclinico ottimizzato che può essere utilizzato per studiare gli effetti del trattamento o trattamenti adiuvanti e combinatori.

Abstract

Il glioblastoma (GB), la forma più aggressiva di cancro cerebrale primario, rappresenta circa la metà di tutti i tumori cerebrali primari di alto grado negli adulti e non ha cura. La terapia termica interstiziale laser (LITT) è un trattamento approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) per la GB e viene utilizzato in pazienti che potrebbero non essere candidati alla resezione chirurgica convenzionale. Sebbene l'efficacia clinica della LITT sia stata stabilita, la ricerca al di là degli studi di casi clinici e delle serie di casi è limitata e ostacolata dalla mancanza di un modello animale consolidato. Questo protocollo utilizza topi C57BL/6 e una linea cellulare di glioma cancerogeno CT2A singenico per ricapitolare fedelmente il GB umano, utilizzando anche un laser a grana ittrio e alluminio drogato al neodimio (Nd:YAG) a 1064 nm, come quello utilizzato in uno dei due sistemi LITT approvati dalla FDA, fornendo un'eccellente rilevanza preclinica. Il successo dell'istituzione di questo modello murino di LITT fornirà una preziosa piattaforma per studiare le caratteristiche uniche dell'ablazione LITT e i suoi effetti sul microambiente tumorale, portando potenzialmente a migliori strategie terapeutiche.

Introduzione

Il cancro è la prima causa di morte in Canada. Il glioblastoma (GB), la forma più comune di tumore cerebrale aggressivo, rappresenta dal 48% al 60% di tutti i tumori cerebrali primari di alto grado negli adulti1. La prognosi per la GB è particolarmente infausta, con una sopravvivenza netta a 5 anni del 4,8% con trattamenti convenzionali, tra cui resezione chirurgica, chemioterapia e radioterapia 1,2.

La terapia termica interstiziale laser (LITT) è una procedura approvata dalla FDA che utilizza un laser per l'ablazione ipertermica del tumore in situ in pazienti con tumori cerebrali inoperabili e fornisce un'interessante alternativa terapeutica alla resezione chirurgica convenzionale3. Tuttavia, manca un modello murino dettagliato e ben caratterizzato per il trattamento LITT del GB, il che ostacola la ricerca preclinica.

Questo protocollo mira a mostrare un modello murino preclinico ottimizzato per il trattamento della GB con LITT. Abbiamo scelto di utilizzare topi C57BL/6 e la linea cellulare di glioma singenico CT2A per questo modello principalmente perché CT2A ricapitola fedelmente il GB umano di alto grado con caratteristiche istologiche, invasività, chemio- e radio-resistenza simili, e caratteristiche staminali con auto-rinnovamento e ri-stabilimento dei tumori4. Queste caratteristiche forniscono un'eccellente piattaforma per una varietà di studi che coinvolgono risposte immunitarie o nuove strategie terapeutiche. Inoltre, gli aspetti tecnici di questo protocollo LITT sono facilmente adattabili anche ad altri modelli murini di allo- e xenotrapianto 4,5,6, che verranno ulteriormente discussi.

I vantaggi di questo protocollo includono risultati coerenti con un paradigma di trattamento LITT semplice ma efficace. Il laser a 1064 nm drogato con grafofmio Gnnet di ittrio e alluminio (Nd:YAG) è lo stesso utilizzato clinicamente in uno dei due sistemi attualmente approvati dalla FDA, consentendo esperimenti strettamente paralleli all'applicazione clinica della LITT per il trattamento del glioma di alto grado. Lo svantaggio principale di questo protocollo è l'estrema cura che deve essere prestata sia durante l'impianto di cellule tumorali che durante il trattamento LITT per ottenere risultati riproducibili. Inoltre, a causa della natura aggressiva della linea cellulare CT2A, il protocollo è altamente sensibile al tempo. La maggior parte degli esperimenti dovrà essere conclusa in un massimo di 20 giorni, il che potrebbe limitare le indagini su alcune risposte immunitarie adattative o altri meccanismi cellulari e molecolari che si verificano in un corso di tempo più lungo.

Protocollo

L'etica animale per questo protocollo è stata approvata dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Manitoba in conformità con le linee guida etiche stabilite dal Canadian Council for Animal Care (CCAC). Questo protocollo ha utilizzato topi immunocompetenti C57BL/6 di 8-12 settimane e la linea cellulare di glioma singenico CT2A per un modello preclinico con un'ampia gamma di applicazioni, inclusi esperimenti incentrati sull'analisi istologica, sui cambiamenti immunologici o sugli interventi terapeutici combinatori. Il protocollo può essere facilmente adattato ad altre specie di topi o linee cellulari in base ai requisiti sperimentali.

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Figura 1: Schema grafico del disegno sperimentale di base. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione cellulare in breve (Giorno 0)

  1. Prima di iniziare la coltura cellulare, assicurarsi che l'armadio e tutte le pipette necessarie siano completamente sterilizzati con UV ed etanolo.
  2. Riscaldare il DMEM/F12 con il 10% di terreno FBS, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e tripsina a temperatura ambiente (RT) utilizzando un bagno d'acqua.
  3. Pipettare il terreno dal pallone T25 e sciacquare brevemente le cellule con PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina alle cellule e incubare per 30-60 s fino a quando le cellule non si staccano dal pallone.
  4. Confermare le cellule staccate al microscopio ottico e aggiungere 4 ml di terreno per arrestare l'attività enzimatica della tripsina.
  5. Conta le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato.
    1. Miscelare 10 μl della sospensione cellulare con 10 μl di blu di tripano, quindi aggiungere 10 μl al vetrino di conteggio delle cellule.
    2. Inserire il vetrino nella macchina conta cellule e registrare il conteggio totale delle cellule, il conteggio delle cellule vive e la percentuale di cellule vive.

NOTA: Se non è disponibile una macchina per il conteggio automatico delle cellule, è possibile eseguire un conteggio manuale utilizzando un emocitometro.

  1. Calcolare le cellule necessarie per tutte le iniezioni programmate.
    NOTA: Per CT2A, si raccomandano 5000 cellule per 1,5 μl di volume iniettato e un minimo di 100 μl di volume totale per ogni preparazione.
  2. Centrifugare le celle a 134 x g per 5 minuti per pellettare le celle e aspirare quanto più terreno possibile.
  3. Risospendere il pellet cellulare con il 5% di estratto della membrana basale in PBS per il volume necessario in una provetta da microcentrifuga. Mentre le provette più piccole saranno più adatte per preparare la sospensione cellulare, una provetta da 2 ml è migliore per la conservazione durante l'intervento chirurgico poiché è meno probabile che le cellule si aggreghino sul fondo più arrotondato e si ridistribuiscano facilmente con un leggero sfarfallio.
  4. Tenere le cellule in ghiaccio per l'iniezione, preparando nuove sospensioni cellulari ogni 4-5 ore secondo necessità.

2. Impianto ortotopico (Giorno 0)

  1. Preparare l'area chirurgica e assicurarsi che tutti gli strumenti necessari siano sterili e pronti per l'uso.
  2. Anestetizzare il topo utilizzando isoflurano (3% vaporizzato in 1 L/min O2) in una camera monitorando la frequenza respiratoria (target 60 bpm).
  3. Ottenere e registrare il peso dell'animale per il dosaggio dei farmaci.
  4. Radere accuratamente l'area chirurgica per evitare occhi, orecchie e baffi.
  5. Trasferisci l'animale in un sistema stereotassico.
    1. Posizionare gli incisivi nel foro della barra del morso e regolare l'ogiva fino a quando non è aderente, serrando la vite di fissaggio per fissarla.
    2. Controllare la profondità dell'anestesia con pizzichi bilaterali delle dita degli arti posteriori e, se appropriato, fissare il cranio con le spine auricolari e regolare la testa dell'animale in una posizione neutra e piana.
    3. Monitora le temperature interne degli animali utilizzando una sonda di temperatura rettale lubrificata e fornisci un riscaldamento supplementare a 37 °C utilizzando un termoforo sotto il corpo.
      ATTENZIONE: Fare attenzione a non stringere eccessivamente l'ogiva, poiché anche una pressione moderata sull'osso nasale può causare l'arresto respiratorio. Se si utilizza un termoforo elettrico (ad esempio, un termoforo per un terrario), assicurarsi che le impostazioni della temperatura siano accurate e che la temperatura impostata rimanga costante.
  6. Applicare abbondantemente l'unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
  7. Somministrare iniezioni profilattiche e controllare la profondità dell'anestetico.
    1. Iniettare per via sottocutanea (s.c.) meloxicam o altri farmaci antidolorifici a lunga durata d'azione secondo le linee guida locali per le strutture animali (ad es. 5,0 mg/kg di meloxicam) utilizzando una siringa da 28 G x 1/2".
    2. Somministrare un'iniezione di 20 mg/kg s.c. di soluzione fisiologica preriscaldata per il supporto profilattico del fluido durante le procedure più lunghe.
    3. Ridurre l'anestetico all'1,5%-2,0% di isoflurano per mantenere la frequenza respiratoria target.
  8. Utilizzando una tecnica asettica, drappeggiare l'animale e preparare l'area chirurgica.
    1. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, applicare una soluzione disinfettante di iodio povidone o clorexidina. Partendo medialmente dal sito di incisione e ruotando il tampone dopo ogni passaggio, lavorare verso l'esterno, quindi utilizzando un batuffolo di cotone sterile fresco, applicare etanolo al 70% sul sito in modo simile.
    2. Ripetere lo scrub con iodio seguito da etanolo al 70% altre due volte (3 volte in totale, ciascuna).
  9. Ricontrollare la profondità dell'anestesia prima di procedere con l'esposizione chirurgica. Monitorare attentamente la frequenza respiratoria durante la procedura e regolare l'anestetico secondo necessità.
  10. Partendo dalla linea mediana e leggermente posteriormente agli occhi, praticare un'incisione medio-sagittale di 1-1,5 cm in direzione caudale utilizzando un bisturi a lama #15. In alternativa, estendi una breve incisione del bisturi con le forbici dell'iride.
    NOTA: Le incisioni devono iniziare dalla linea mediana ma, per le iniezioni unilaterali, possono essere leggermente angolate lateralmente per facilitare la visualizzazione e l'accesso simultanei di Bregma e della posizione del foro di bava.
  11. Usando un batuffolo di cotone sterile, rifletti i bordi della ferita per visualizzare il cranio e strofina delicatamente via il tessuto connettivo dall'area.
    1. Se necessario, utilizzare un batuffolo di cotone sterile imbevuto di perossido di idrogeno per pulire la superficie del cranio e visualizzare le suture craniche.
  12. Localizzare Bregma nel punto in cui le suture coronali sinistra e destra si incontrano sulla linea mediana con la sutura sagittale (vedere Figura 2).
    1. Utilizzando una resina acrilica colorata atossica e uno stuzzicadenti sterile in legno o simili, fare un segno molto piccolo sul Bregma.
      NOTA: In alcuni casi, le suture coronali sinistra e destra non si rispecchiano a vicenda; In questi casi, utilizzare una "linea di adattamento" per approssimare il punto in cui dovrebbero intersecarsi lungo il piano sagittale medio.
  13. Assicurarsi che la posizione della testa dell'animale non sia inclinata o ruotata (cioè su un piano piatto).
    1. Zero coordinate stereotassiche a Bregma. La coordinata x si riferisce al movimento nel piano mediale-laterale (ML), la coordinata y nel piano antero-posteriore (AP) e la coordinata z nel piano dorso-ventrale (DV).
    2. Assicurarsi che Lambda si trovi sullo stesso piano DV di Bregma (ad esempio, z = 0 in entrambi i punti di riferimento). Allo stesso modo, a +2,0 mm (x = 2) e -2,0 mm (x = -2,0) lateralmente a Bregma, assicurati che il cranio sia sullo stesso piano, con la coordinata DV/z approssimativamente uguale. Assicurati che il teschio sia sicuro e non si muova dopo alcuna regolazione.
  14. Praticare un foro di fresatura a +2,0 mm (ML) e +0,5 mm (AP) da Bregma (Figura 3).
    1. Utilizzando un trapano stereotassico, abbassare con cautela la punta della punta fino a quando non entra in contatto con Bregma e azzerare le coordinate.
    2. Sollevare leggermente la punta e regolare il trapano sulle coordinate AP e ML appropriate.
    3. Abbassare lentamente il trapano, facendo attenzione a sbavare solo attraverso il cranio.
    4. In alternativa, utilizzando una siringa da microlitro nel telaio stereotassico, abbassare la punta dell'ago fino a toccare Bregma e azzerare le coordinate.
    5. Solleva leggermente l'ago e regolalo sulle coordinate AP e ML appropriate.
    6. Abbassa la punta fino a toccare il cranio e annota la posizione esatta.
    7. Sollevare leggermente l'ago e fare un piccolo segno nella posizione target con un pennarello chirurgico.
    8. Solleva o ruota il portaago in modo che non sia d'intralcio e, usando un trapano a mano, fai una sbavatura attraverso il cranio, facendo attenzione a non danneggiare il cervello sottostante. ATTENZIONE: In generale, i topi maschi più anziani hanno crani relativamente più spessi e richiedono una perforazione più estesa. La perforazione manuale deve essere eseguita con attenzione, applicando una pressione minima, poiché le rotture improvvise attraverso il cranio danneggeranno le meningi sottostanti e/o il cervello.
      NOTA: Durante la procedura LITT, è necessaria un'estensione del foro di fresatura per accogliere la sonda della termocoppia. Questo può essere fatto più facilmente durante l'intervento di iniezione iniziale e facilita un intervento chirurgico LITT più rapido e snello. In alternativa, il foro della fresa può essere esteso allo stesso modo durante l'intervento chirurgico LITT, il che può ridurre il rischio di crescita extracranica del tumore.
  15. Creare un secondo foro di bava a +3,0 mm ML e +0,5 mm AP (1,0 mm lateralmente al sito di iniezione) per la termocoppia.
    1. Seguire la procedura di foratura come descritto nel passaggio precedente.
    2. Per evitare difficoltà legate alla ricrescita ossea, rimuovere l'osso tra i due fori.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare +2,0 mm ML, +0,5 mm AP e -2,5 mm DV di Bregma come coordinate per l'impianto del tumore. Questa posizione nello striato superiore produce una crescita tumorale costante, che è ben tollerata dagli animali, tuttavia, il protocollo può essere adattato ad altre posizioni.
  16. Preparare la sospensione di cellule di glioma di topo CT2A in una siringa da microlitri (5000 cellule in 1,5 μL).
    1. Rimuovere la provetta da microcentrifuga pre-preparata dal ghiaccio e sbattere delicatamente con la punta delle dita per ririmetterla in sospensione.
    2. Aspirare delicatamente 2 μl in una siringa da 5 μl o 10 μl, facendo attenzione a evitare bolle.
    3. Esprimere 0,5 μl per rimuovere l'aria e assicurarsi che l'ago sia innescato e funzioni correttamente.
    4. Pulire lo stelo dell'ago con un tampone imbevuto di alcol per rimuovere il liquido estratto e le eventuali cellule sulla superficie esterna (che possono causare la crescita del tumore leptomeningeo).
  17. Caricare la siringa in una pompa a siringa per microiniettore (o in un attacco stereotassico manuale) e abbassare lentamente l'ago.
    1. Abbassare lentamente l'ago fino alla profondità (z = -3,0 mm) e fare una pausa di 1 minuto.
    2. Ritrarre lentamente l'ago di 0,5 mm (z = -2,50 mm) e iniettare le cellule (≤ 0,5 μL/min). Mantenere asciutta l'area intorno alla siringa utilizzando una lancia di spugna microchirurgica, facendo attenzione a non rompere l'ago.
    3. Attendere almeno 2 minuti dopo il completamento dell'iniezione, quindi ritrarre lentamente la siringa per un periodo di 3-4 minuti. Assicurarsi che i primi 4-5 intervalli di retrazione siano di 100 μm per retrazione per evitare che le cellule vengano spostate dal sito di iniezione originale.
    4. Utilizzando un tampone imbevuto di alcol, pulire delicatamente l'esterno dell'ago da sangue o liquidi e sciacquare e pulire la siringa secondo le linee guida del produttore. Utilizzare PBS e acqua distillata tra un'iniezione e l'altra per assicurarsi che l'ago non si ostruisca. Al termine delle iniezioni, sciacquare generosamente l'ago con etanolo al 70% per rimuovere eventuali cellule rimanenti dall'ago.
      ATTENZIONE: Non lavare l'ago dopo ogni iniezione può causare un blocco. Se si inietta più di un tipo di cellula, utilizzare un ago separato per ciascun tipo per evitare ogni possibile contaminazione incrociata.
  18. Riapprossimare l'incisione, facendo attenzione a estroflesse leggermente i bordi della ferita in modo che il derma sottostante si tocchi. Chiudere la ferita utilizzando una clip per ferite o 3 punti interrotti con una sutura 5-0. Applicare la soluzione di iodio povidone sulla ferita chiusa.
  19. Togliere l'animale dal telaio stereotassico e metterlo in una gabbia di recupero rivestita di carta su un tappetino riscaldante impostato a 37 °C. Assicurarsi che la decubito sternale sia ottenuta prima di trasferire l'animale nella gabbia di casa con un piattino di cibo bagnato situato sul pavimento della gabbia.
  20. Monitorare l'animale almeno due volte al giorno, a partire dal giorno dell'intervento, per i 2 giorni successivi. Somministrare meloxicam dopo 24 ore, 48 ore e 72 ore, o secondo le linee guida dell'istituto.

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Figura 2: Illustrazione grafica di un cranio di topo e importanti punti di riferimento anatomici per la chirurgia stereotassica. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Illustrazione grafica che indica la posizione dei fori di bava e dell'apparato laser. Illustrazione che mostra le posizioni relative del punto di riferimento Bregma, (A) il foro di bava iniziale per la fibra laser (A') e (B) il secondo, o esteso, foro di bava per la sonda a termocoppia (B'). A destra è mostrata una rappresentazione ritagliata delle sonde laser in fibra e della termocoppia, che illustra come le sonde sono stabilizzate in un piedino terminale stereotassico con fori preforati alla dimensione e alla spaziatura desiderate. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Monitoraggio del carico tumorale pre-LITT (Giorno 9)

  1. Eseguire la risonanza magnetica (MRI) pesata in T2, seguendo le linee guida istituzionali, per valutare la crescita del tumore il giorno prima della LITT.
    NOTA: I tumori devono avere un diametro di ~1,5-2,0 mm.
    1. Ottenere una scansione coronale adeguata dell'intero cervello del topo utilizzando i seguenti parametri: sequenza di eco di spin veloce, TR = 5000 ms, TE = 45 ms, treni di eco = 7, FOV = 30 x 30 mm2, dimensione della matrice = 250 x 256, fette totali = 18, spessore della fetta = 0,3 mm, medie = 2.
      NOTA: Si raccomanda inoltre di eseguire una risonanza magnetica periodica a partire dal giorno 6 circa dopo l'impianto per confermare il successo dell'allotrapianto e per monitorare la crescita del tumore, in particolare durante gli esperimenti iniziali, poiché anche lievi modifiche alla procedura possono alterare la tempistica. CT2A è altamente aggressivo e gli animali devono essere monitorati attentamente. Una scintigrafia coronale pesata in T2 funziona bene per questo scopo. L'uso di cellule CT2A marcate con fluorescenza o luciferina in combinazione con il sistema di imaging in vivo (IVIS) può essere adatto anche quando l'accesso a una risonanza magnetica di piccoli animali non è disponibile. Tuttavia, la cinetica di crescita e altre caratteristiche del tumore differiranno da questo protocollo.

4. Chirurgia LITT (giorno 10)

  1. Come sopra nel paragrafo 2, ripetere i passaggi 2.1-2.13 per preparare l'animale alla LITT.
    NOTA: La guarigione della ferita dall'intervento precedente può avvenire in fasi diverse in base alle specie e alle variazioni nella sequenza temporale sperimentale. Fai attenzione ai tessuti più sottili o più delicati quando rifai l'incisione.
  2. Utilizzando un tampone sterile con punta di cotone, pulire delicatamente il cranio, eliminando i tessuti che oscurano il Bregma o il foro di bava precedentemente praticato. Se necessario, ripraticare il foro di bava, anche se a causa della velocità di formazione del tumore CT2A, ci si aspetta poca o nessuna ricrescita ossea.
  3. Con l'attacco LITT in posizione nel telaio stereotassico, azzerare le coordinate a Bregma per la punta della fibra laser.
    ATTENZIONE: La fibra laser è molto fragile e si spezzerà se piegata. Fare attenzione a fermarsi non appena la punta della fibra laser tocca il cranio.
  4. Sollevare leggermente la punta e spostarsi sulle coordinate ML e AP desiderate, quindi abbassare lentamente le sonde fino alla coordinata DV del bersaglio per arrivare al bersaglio (2,0 mm ML, 0,5 mm AP, -2,0 mm DV).
  5. Impostare i parametri del trattamento LITT: Modalità: continua; Potenza: 1 W
  6. Spostare il laser da Standby ad Attivo e attivare il laser per 60 s utilizzando il pedale. Se la temperatura supera i 46 °C, fare una breve pausa, quindi riattivare, cercando di mantenere la temperatura il più vicino possibile a 46 °C.
  7. Ritrarre lentamente il gruppo laser e pulire delicatamente la fibra laser e la termocoppia con un tampone imbevuto di alcol. Ruotare il gruppo in modo che non sia d'intralcio, facendo attenzione che le sonde non entrino in contatto con il telaio.
  8. Chiudere la ferita e recuperare l'animale come descritto nei passaggi 2.18-2.20 dopo l'impianto del tumore sopra.

5. Valutazione post-LITT (giorno 11)

  1. Eseguire la risonanza magnetica post-LITT pesata in T2 il giorno successivo al trattamento con LITT per valutare il successo dell'ablazione del tumore LITT utilizzando la sequenza e i parametri del passaggio 3.1 sopra.
    NOTA: Inoltre, una sequenza di recupero dell'inversione attenuata dal fluido (FLAIR) può anche essere utile per valutare l'edema post-operatorio.
  2. Eseguire scansioni di follow-up prima della fine dello studio per monitorare i cambiamenti post-trattamento o la ricrescita del tumore.

6. Fine degli studi (Giorno 11/Giorno 15/Giorno 20)

  1. Eutanasia degli animali agli endpoint sperimentali scelti secondo le linee guida dell'istituto.
    NOTA: Gli endpoint successivi al giorno 20 non sono fattibili con CT2A, anche con inoculazioni con un numero di cellule estremamente basso, poiché gli animali di controllo (ad esempio, chirurgia fittizia o nessun trattamento) e alcuni animali del gruppo di trattamento possono essere moribondi e richiedere l'eutanasia. Per esperimenti più lunghi, prendere in considerazione modelli alternativi di cellule di glioma di topo.
  2. Raccogli i tessuti per il fissaggio e la lavorazione.
    1. Eseguire la perfusione cardiaca con paraformaldeide (PFA) al 4% e raccogliere i tessuti di interesse.
    2. Post-fissare il tessuto cerebrale mediante immersione in PFA al 4% per una notte a 4 °C.
    3. Elaborare i campioni utilizzando le pratiche standard per l'analisi FFPE (FFPE) o congelata in formalina.

7. Analisi

  1. Verificare il successo dell'ablazione LITT utilizzando la risonanza magnetica pesata in T2 e convalidare utilizzando tecniche istologiche di base come una colorazione con ematossilina ed eosina.
  2. Eseguire tutte le analisi aggiuntive necessarie per gli esperimenti (ad es. immunoistochimica, immunofluorescenza).

Risultati

Il successo dell'impianto di tumore CT2A e dei trattamenti LITT può essere caratterizzato utilizzando la risonanza magnetica pesata in T2, come mostrato nella Figura 4, Figura 5 e Figura 6. Le immagini RM sono state ottenute utilizzando un magnete superconduttore privo di criogeni 7T con un foro di 17 cm e una bobina di testa di topo in quadratura utilizzando i parametri di sequenza delineati nel protocollo di cui sopra. Un'attenta aderenza a questo metodo dovrebbe portare a tassi di prelievo che si avvicinano al 100%, a una localizzazione costante del tumore e alla formazione di tumori approssimativamente sferici, come dimostrato nella Figura 4. Queste caratteristiche forniscono una base ottimale per i successivi trattamenti LITT e per eventuali ulteriori analisi. Allo stesso modo, come si vede nella Figura 5, anche le ablazioni LITT dovrebbero essere coerenti sia nelle dimensioni che nella posizione. Il nucleo centrale del tessuto ablato sarà composto da necrosi coagulativa e liquefattiva e facilmente visualizzabile come ipo-intensità (cioè nero) sulla risonanza magnetica pesata in T2. Nei giorni immediatamente successivi al trattamento con LITT, è anche tipico, a seconda del trattamento LITT eseguito, vedere un'area iper-intensa (cioè bianca) all'interno e intorno alla lesione corrispondente a edema perioperatorio. La Figura 6 mostra un risultato insufficiente ed evidenzia alcune delle potenziali insidie durante l'esecuzione di questo protocollo.

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Figura 4: Immagini RM coronali pesate in T2 della formazione ideale del tumore CT2A. Immagini rappresentative della formazione del tumore in tre topi C57BL/6 (A, B, C) a 12 giorni dopo l'impianto. Le frecce bianche indicano il bordo del tumore. Si noti la posizione coerente del tumore e la formazione approssimativamente sferica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Immagini RM coronali pesate in T2 dell'ablazione LITT ideale (1 giorno dopo LITT). Immagini rappresentative dell'ablazione tumorale LITT in tre topi C57BL/6 (A, B, C) a 13 giorni dopo l'impianto. Si noti la dimensione e la posizione costanti del nucleo della lesione necrotica. L'esecuzione di risonanze magnetiche pre-LITT e ablazioni LITT leggermente prima fornirebbe un migliore equilibrio tra le dimensioni ottimali del tumore per il targeting laser e la capacità di ottenere endpoint post-trattamento successivi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Immagini RM coronali pesate in T2 di trattamenti LITT pre-ottimizzati. Immagini di tre topi C57BL/6 (A, B, C) trattati con parametri laser e bersagli stereotassici identici prima dell'ottimizzazione del protocollo, come esempio di un risultato non ideale. Le frecce bianche indicano il bordo del tumore. Le aree delimitate mostrano la regione dell'edema. Si osserva una variabilità significativa, tra cui una crescita tumorale meno uniforme e uno scarso targeting dell'ablazione laser con conseguente danno tissutale incoerente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

C'è un corpo di letteratura in rapida espansione riguardo alla LITT; tuttavia, è principalmente limitato a studi di casi clinici sull'uomo o serie di casi. In effetti, sono stati dimostrati diversi potenziali benefici per la LITT, tra cui tassi e costi di complicanze post-operatorie più bassi, oltre a conferire una sopravvivenza libera da progressione comparabile 7,8,9,10,11. C'è anche una riduzione delle recidive locali con il maggiore successo del trattamento farmacologico sistemico, anche se le ragioni non sono ancora ben comprese12. Inoltre, i risultati promettenti per le applicazioni cliniche al di fuori della GB includono il trattamento delle metastasi e di altri tipi di tumore 3,12, la necrosi da radiazioni13, l'epilessia refrattaria14, le malformazioni vascolari15 e persino il disturbo ossessivo-compulsivo16. Al contrario, la ricerca che utilizza un modello murino è finora molto limitata, con poche eccezioni degne di nota, e queste possono essere difficili da replicare. Ad esempio, un recente studio sui cambiamenti di permeabilità della barriera emato-encefalica in seguito al trattamento con LITT ha utilizzato un generatore laser venduto in Europa per uso clinico, ma questo strumento non è approvato in Nord America17. Sebbene un tale sistema sembri adatto alla loro ricerca, ottenere il dispositivo è probabilmente proibitivo dal punto di vista dei costi per la maggior parte dei ricercatori e qualsiasi funzionalità proprietaria o altamente ingegnerizzata è difficile da replicare. Pertanto, un protocollo dettagliato di un modello animale preclinico accessibile e ottimizzato fornirà preziose opportunità di ricerca.

Le fasi critiche del protocollo includono l'identificazione accurata di Bregma per un targeting riproducibile sia durante l'allotrapianto che durante il successivo intervento chirurgico di ablazione LITT. Inoltre, prestare particolare attenzione alle fasi di iniezione rispetto alla velocità di erogazione e alle pause è fondamentale per il successo degli innesti di cellule tumorali e in caso contrario aumenta notevolmente il rischio di crescita extracranica del tumore e di una maggiore variabilità del tumore. È anche importante sottolineare che l'intervento chirurgico LITT deve essere pianificato quando il tumore è ancora relativamente piccolo (cioè ~1,5-2,0 mm di diametro). Nella nostra esperienza, i tumori CT2A spesso diventano di forma più variabile quando sono grandi, e i tumori molto grandi aumentano anche la difficoltà di estrarre il cervello, soprattutto se il tumore è cresciuto attraverso la superficie corticale. Va inoltre notato che un minimo di 24 ore, ad esempio tra la risonanza magnetica pre-trattamento e l'intervento chirurgico LITT, è un tempo sufficiente per una quantità significativa di crescita continua del glioma CT2A.

Diverse modifiche possono essere facilmente apportate a questo protocollo per adattarlo ad altri disegni sperimentali. In particolare, questo protocollo si concentra sui passaggi tecnici necessari per il successo dell'impianto ortotopico e degli interventi chirurgici LITT in un modello murino C57BL/6 syngeneic CT2A. Tuttavia, il modello descritto può essere facilmente sostituito per adattarsi a diversi obiettivi sperimentali. Linee cellulari tumorali singeniche meno aggressive come K1491 possono essere impiegate per eseguire esperimenti che richiedono punti temporali più lunghi, come quelli che coinvolgono risposte immunitarie innate e adattative. In alternativa, per gli esperimenti che non si concentrano sulle risposte adattative tumore-ospite, le linee cellulari derivate da pazienti o altri modelli di xenotrapianto in modelli murini immunocompromessi sono un'altra opzione praticabile. Per il lettore interessato, Haddad et al. (2021) forniscono una revisione completa dei punti di forza e dei limiti di diversi modelli murini comuni di glioma allotrapianto e xenotrapianto4. Un'altra modifica semplice, a seconda della disponibilità istituzionale e delle linee guida, è la sostituzione dell'anestetico per inalazione con alternative iniettabili come una combinazione di ketamina e xilazina ± acepromazina. Tuttavia, quando sono disponibili agenti inalatori e l'attrezzatura necessaria (ad esempio, ogiva stereotassica), se ne consiglia l'uso per diversi motivi. In primo luogo, riteniamo che gli anestetici per inalazione siano l'alternativa più sicura in quanto non richiedono un'iniezione intraperitoneale, non richiedono dosi ripetute per interventi chirurgici più lunghi o più impegnativi e possono essere facilmente titolati con un ampio margine di sicurezza18. Inoltre, l'anestetico per inalazione non richiede l'uso di sostanze controllate e fornisce un rapido risveglio e recupero dopo l'intervento chirurgico.

La risoluzione dei problemi per questo protocollo dovrebbe essere minima, con la maggior parte dei problemi derivanti da una cattiva tecnica di iniezione con conseguente formazione irregolare di tumori o crescita extracranica. I problemi di puntamento LITT possono essere corretti con una corretta identificazione dei punti di riferimento, un'appropriata stabilizzazione della fibra laser e un'attenta osservazione della fibra laser durante l'inserimento per garantire che non colpisca il lato del foro di bava e venga spinta fuori rotta.

I limiti del metodo includono il livello intermedio o avanzato di abilità chirurgiche e tecniche necessarie per eseguire le procedure, l'accesso ad attrezzature specializzate come una macchina per la risonanza magnetica per piccoli animali e un lungo protocollo di impianto ortotopico, che limita il numero di iniezioni che possono essere eseguite in un solo giorno. Poiché questo protocollo è inteso come un modello preclinico di glioma di alto grado, ci sono anche limitazioni intrinseche legate alla natura più aggressiva di alcune linee cellulari di glioma, come CT2A. Vaccinazioni con un basso numero di cellule, un sito di iniezione profondo all'interno dello striato, un'attenta tecnica di iniezione e un trattamento precoce aiuteranno a mitigare questi problemi, ma può ancora verificarsi una crescita occasionale extracranica o irregolare del tumore e sono giustificati disegni sperimentali brevi. Come discusso, anche la modifica di questo protocollo con una linea cellulare meno aggressiva è facilmente realizzabile.

Poiché questo protocollo è, per quanto ne sappiamo, l'unica descrizione dettagliata di un modello murino preclinico per la LITT di GB, è un passo significativo verso la fornitura di un modello consolidato per la futura ricerca scientifica di base.

Dichiarazioni

Siamo grati per il sostegno di Monteris Medical, inclusa la donazione in natura di apparecchiature laser.

Ringraziamenti

Le fonti di finanziamento per questo progetto includono il Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC)-Alliance, Mitacs-Accelerate, Research Manitoba-IPOC, Canadian Institutes for Health Research (CIHR) CGS-M e University of Manitoba Graduate Fellowship. Linea cellulare di glioma CT2A generosamente donata dal Dr. Peter Fecci della Duke University, Durham, NC. Vorremmo anche ringraziare l'Istology Service Lab e la struttura Small Animal and Material Imaging Core dell'Università di Manitoba per la loro eccellente assistenza tecnica in questo progetto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lance di assorbimentoFST18105-01Spugne emostatiche.
Pinze tissutali AdsonFST11006-12
C57BL/6 topiJackson LaboratoriesCeppo #000664Applicatori con punta in cotone maschio e femmina da 6 a 12 settimane
(6")Microscopia elettronicaScienze 72308
CT2A lineaGenerosamente donato dal Dr. Peter Fecci, Duke University.
Estratto di membrana basale a fattore di crescita ridotto Cultrex, PathClearBiotechne, R& D systems3433-010-01
DMEM/F-12, HEPESGibco, ThermoFisher Scientific11330032
Vetrini a doppia camera BIO-RAD1450003
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mLEppendorf22363352
Alcool etilico anidroGreenfield GlobalP016EAANDiluire al 70% con ddH2O
Siero fetale bovino, qualificato, CanadaGibco, ThermoFisher Scientific12483020
Glad Press-n-SealAmazon.ca
Trapano ad alta velocitàKopf InstrumentsModello 1474
K & J Termometro a termocoppiaOmegaHH509R
Metacam (meloxicam)WDDC114424
Pompa a siringa per microiniezioneWPIUMP3T-1
Siringa da microlitro (serie 700)Hamilton87908disponibili aghi personalizzati. Una smussatura ripida dell'ago aiuta con un'erogazione precisa e una lunghezza dell'ago più corta aiuta con la stabilità.
Cacciavite/Porta agoFST12500-12Una punta fine è la più adatta a causa dello spazio di lavoro ristretto, ma molti stili sono adatti in base alle preferenze dell'impugnatura.
Unguento oftalmico Opixcare PlusWDDC135941
Soluzione salina tamponata con fosfato (10x)Bioreagenti FisherBP399-4Diluire a 1x con ddH2O
Povidone-iodioThermoFisher Scientific3955-16Aliquat in tubi più piccoli da utilizzare con applicatori con punta in cotone.
Soluzione salina (normale)WDDC126588
bisturi, monouso (lama #15)FeatherFeather NO15
Forbici, chirurgiche finiFST91460-11Forbici per studenti fini, Iris o Bonn sono tutte adatte.
Cornice stereotassicaKopf InstrumentsModello 940Con console di visualizzazione digitale e mouse a cono e barre auricolari.
Porta siringa stereotassicoKopf InstrumentsModello 1772-FSe non si utilizza una pompa di iniezione.
Suture (monofilamento 5-0)EthiconMCP463GMonofilamento viola monocryl con punta a taglio inverso
Siringa, 28 G  (0,5 ml) BDBD 329461Siringhe da insulina BD Lo-Dose U-100
TC20 Contatore cellulare automatizzatoBIO-RAD1450102
Sonda a termocoppia, diametro fine (Tipo K)OmegaTJM-CA316-IM025G-150
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenoloGibco, ThermoFisher Scientific 25200072
Vetbond di 3M, colla per tessuti veterinari.WDDC126125
Wahl Peanut ClippersWDDC/Wahl100963Disponibile anche direttamente dal produttore.
Cuscinetto riscaldanteBensen Medical70308/121873È possibile utilizzare qualsiasi articolo simile.
Webcol Alcohol prepsElectron Microscopy Sciences71005-20Salvietta per la preparazione di alcol, 2 strati, misura media.
cellulare di glioma 12587704417 Sono

Riferimenti

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