Articolo metodologico

Spiriometria ad alta risoluzione in una camera di piccolo volume

DOI:

10.3791/67442

⸱

25 luglio 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oroboros Instruments, 2Department of Pediatrics and Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General Hospital in Prague, 3Institute of Pathophysiology, Medical University of Innsbruck, 4Mitochondrial Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, 5Abliva AB

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, dimostriamo che la camera da 0,5 mL per la respirometria ad alta risoluzione mostra risultati coerenti con la camera da 2,0 mL se viene applicata un'appropriata correzione strumentale del fondo O2. Richiede meno campione, il che è vantaggioso per gli studi con disponibilità limitata o basse capacità respiratorie.

Abstract

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Lo studio dei flussi respiratori è decisivo per comprendere la complessa interazione tra i processi metabolici. Gli studi su cellule e tessuti con disponibilità limitata di campioni e basse frequenze respiratorie possono trarre beneficio da piccoli volumi sperimentali. Abbiamo esaminato se la camera da 0,5 mL produce risultati coerenti con la camera da 2,0 mL a concentrazioni di campione identiche utilizzate nella respirometria ad alta risoluzione con l'Oroboros. Il flusso di fondo di O2 era 4 volte superiore in camere da 0,5 mL rispetto a 2,0 mL alla saturazione dell'aria, ma era riproducibile, consentendo un'accurata correzione dello sfondo. La velocità di agitazione ottimale era compresa tra 550 rotazioni al minuto (rpm) e 750 rpm nella camera da 0,5 mL. I flussi respiratori nelle cellule viventi, nelle cellule permeabilizzate e nei mitocondri isolati sono stati misurati in parallelo nelle camere da 0,5 mL e 2,0 mL, utilizzando protocolli di titolazione Substrate-Uncoupler-Inhibitor con 14-20 titolazioni. I flussi di O2 nei diversi tipi di camera erano identici entro i limiti di rivelazione. La camera da 0,5 mL, che richiede quasi quattro volte meno campione rispetto alla camera da 2,0 mL, offre un vantaggio significativo per gli studi con quantità limitate di campione o basse capacità respiratorie.

Introduzione

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Lo studio delle vie respiratorie mitocondriali è fondamentale per far luce sui meccanismi metabolici alla base di varie malattie, invecchiamento o risposte allo stress, fornendo così potenziali bersagli per interventi terapeutici e migliorando le capacità diagnostiche 1,2,3. La respirometria ad alta risoluzione (HRR) consente un'analisi dettagliata del controllo della via mitocondriale e dell'accoppiamento nella fosforilazione ossidativa (OXPHOS) in una varietà di tipi di campioni e preparazioni4. Il volume della camera sperimentale è una caratteristica fondamentale della progettazione degli strumenti respirometrici. Il volume della camera precedentemente stabilito è di 2,0 mL negli Oroboros. Questo volume è stato ottimizzato per comportare un basso flusso strumentale di fondo di O2 e garantire l'omogeneità del mezzo agitato. Questi sono tra i criteri di qualità chiave per la misurazione accurata della respirazione in condizioni di basso ossigeno e iperossia necessarie per la cinetica dell'ossigeno mitocondriale e le fibre muscolari permeabili, rispettivamente 5,6,7,8,9. Inoltre, diversi inserimenti multisensore10 richiedono lo spazio della camera da 2,0 mL (Tabella 1).

Nel presente studio, abbiamo esaminato la fattibilità di ridurre il volume della camera per HRR da 2,0 mL a 0,5 mL. È possibile applicare una conta cellulare o una quantità inferiore di tessuto nei saggi respirometrici in una camera più piccola senza compromettere l'accuratezza? Il chiarimento di questa domanda è importante per lo studio di biopsie di tessuti umani e liquidi, cellule primarie e colture cellulari a crescita lenta1. Allo stesso modo, una riduzione del volume della camera è potenzialmente vantaggiosa negli studi su campioni con bassa attività respiratoria nei mitocondri difettosi11 e nelle vie mitocondriali con capacità intrinsecamente basse, come l'ossidazione degli acidi grassi nel cervello12. Tuttavia, la risoluzione può essere ridotta a camere di dimensioni ridotte a causa dell'aumento sproporzionato degli artefatti di retrodiffusione dell'O2 e della calibrazione del volume imprecisa13,14. Pertanto, abbiamo analizzato le prestazioni strumentali dell'Oroboros con la camera a piccolo volume (sV) calibrata a un volume sperimentale minimo di 0,5 mL, rispetto alla camera a volume classico (cV) calibrata a 2,0 mL. In particolare, abbiamo analizzato il flusso strumentale di fondo di O2 e la velocità di agitazione ottimale.

I protocolli di titolazione SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor) vengono utilizzati per valutare le frequenze e gli stati respiratori nell'analisi OXPHOS. I protocolli SUIT comprendevano da 14 a 20 titolazioni per saggio respirometrico e comportavano flussi respiratori di O2 che andavano da pochi pmol∙s-1∙mL-1 a centinaia di pmol∙s-1∙mL-1. Gli stati di controllo dell'accoppiamento includono il tasso di perdita L, cioè la componente dissipativa della respirazione, che non è disponibile per fosforilare l'adenosina-5'-difosfato (ADP) in adenosina-5'-trifosfato (ATP) e risulta dalla perdita di protoni, dallo slittamento dei protoni, dal ciclo cationico e dalla perdita di elettroni. La capacità P di OXPHOS rappresenta la respirazione dei mitocondri quando il trasferimento di elettroni, misurato come consumo di O2 (ossidazione), è accoppiato alla sintesi di ATP (fosforilazione) in presenza di ADP. La capacità di trasferimento di elettroni E nello stato disaccoppiato è quantificata mediante titolazioni di un protonoforo in presenza di substrati mitocondriali15. Il consumo di ossigeno residuo rox viene determinato dopo l'aggiunta degli inibitori del complesso I e del complesso III rotenone e antimicina A.

Abbiamo misurato la respirazione delle cellule e dei preparati mitocondriali nelle camere sV e cV. Le piastrine sono frammenti citoplasmatici anucleati di megacariociti e rappresentano una fonte facilmente reperibile di mitocondri umani. Pertanto, le piastrine sono state applicate come modello per cellule viventi (o particelle cellulari) con membrane plasmatiche intatte. La respirazione delle cellule del sangue funge da biomarcatore delle malattie mitocondriali sistemiche ed è correlata con l'idoneità bioenergetica degli organi metabolicamente attivi 16,17,18,19, sebbene questi risultati non possano essere generalizzati 20,21,22. I fibroblasti umani sono stati scelti per la loro applicazione come modello cellulare di disfunzione mitocondriale 1,23,24,25. L'integrità delle membrane plasmatiche è necessaria per la vitalità cellulare, ma la sua permeabilizzazione selettiva consente lo scambio di molecole tra il citosol e il mezzo circostante. Pertanto, i fibroblasti con membrane plasmatiche chimicamente permeabilizzate sono stati studiati come esempio di cellule permeabilizzate, rispetto ai mitocondri isolati utilizzati per valutare la funzione mitocondriale e necessari per separare le sottopopolazioni mitocondriali26,27.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per lo studio sulle piastrine umane, otto volontari hanno fornito il consenso informato scritto a partecipare allo studio, che è stato approvato dall'Autorità svedese per la revisione etica (n. 2013/181). Due linee cellulari di fibroblasti cutanei umani da neonati maschi sono state acquistate da ATCC e utilizzate secondo l'approvazione etica del Ministero della Salute della Repubblica Ceca (progetto: AZV MZ CR NU22-07-00474). Le procedure che coinvolgono i topi sono state condotte in conformità con la legge austriaca sulla sperimentazione animale e in conformità con la Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e altri scopi scientifici (Tierversuchsgesetz 2012; direttiva 2010/63/UE; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Il principio delle 3R è stato applicato per ridurre al minimo il numero di animali da esperimento.

1. Calibrazione del volume

  1. Montare le camere di piccolo volume (sV) o le camere di volume classico (cV) sugli Oroboros (Figura 1A, B; Tabella 1).
  2. Accendi l'Oroboros e connettiti a DatLab.
  3. Asciugare le camere.
  4. Pipettare 0,54 mL di H2O nel sV (0,50 mL di volume sperimentale effettivo più 0,04 mL di volume morto capillare) o 2,07 mL di H2O nel cV (2,00 mL di volume effettivo più 0,07 mL di volume morto capillare).
    NOTA: Per evitare perdite di liquido tra la parte superiore del cilindro di vetro e il supporto della camera in poliossimetilene (POM), inserire la punta della pipetta abbastanza in profondità da toccare la parete della camera di vetro.
  5. Accendere gli agitatori.
  6. Prima di chiudere la camera, inumidire gli O-ring dei tappi mantenendo asciutto il loro capillare. Allentare gli anelli di calibrazione del volume e inserire i tappi verso il basso fino a quando il liquido non riempie il capillare del tappo e appare una piccola goccia nel recipiente all'estremità superiore del capillare (Tabella 1).
  7. Serrare gli anelli di calibrazione del volume per fissarne la posizione in modo tale che il volume calibrato sia ottenuto in inserimenti consecutivi dei tappi.

2. Impostazione generale di Oroboros

  1. Avviare il software DatLab .
  2. Impostare la temperatura sperimentale (37 °C) e la velocità di rotazione dell'agitazione a 550 giri/min (9,2 Hz o rotazioni per s) nella camera sV o a 750 giri/min (12,5 Hz) nella camera cV. Impostare l'intervallo di campionamento dei dati a 2 s con livellamento superiore a 80 s (40 punti dati) nei test di fondo strumentali O2 o 40 s (20 punti dati) per la respirometria.
    NOTA: Le barre di agitazione magnetiche (AlNiCo rivestite in difluoruro di polivinilidene [PVDF]; Tabella 1) sono agitati da un campo magnetico rotante pulsato con un'intensità di campo di 3,5 mT a livello dell'agitatore nella camera.
  3. Eseguire la calibrazione dell'aria28 in MiR05 o nello stesso mezzo di incubazione utilizzato negli esperimenti successivi.
  4. Eseguire occasionalmente calibrazioni di ossigeno zero, ma mai immediatamente prima di iniziare gli esperimenti.
    1. Preparare una nuova soluzione madre di Na-ditionito sciogliendo la polvere di O2-Zero in 50 mM di tampone fosfato (pH 8,0) a una concentrazione di 2,5 mM o 10 mM per le camere sV o cV , rispettivamente.
    2. Titolare Na-ditionito in eccesso per ottenere il segnale grezzo R0 o corrente zero [μA] alla concentrazione di O2 0 μM14,28.

3. Test strumentale di base O2

  1. Camera sV
    1. Dopo la calibrazione dell'aria, chiudere la camera. Monitorare il segnale dell'ossigeno per circa 60 minuti fino a quando la concentrazione di O2 scende dalla saturazione dell'aria a circa 150 μM. Impostare quattro punti da J°1 a J°4 sul grafico "Pendenza O2 negativa".
      NOTA: Eseguire questo test strumentale di fondo O2 ogni giorno prima di iniziare un esperimento.
    2. FACOLTATIVO: Con una siringa di Hamilton, titolare il Na-ditionito preparato secondo il passaggio 2.4.1 per raggiungere una concentrazione di O2 di 100 μM (Figura 1C).
      NOTA: In un altro protocollo, il Na-ditionito viene titolato nella camera utilizzando la micropompa di titolazione-iniezione (TIP2k; Figura 1 supplementare e Figura 2 supplementare) per il confronto con un metodo standard per determinare il flusso di fondo strumentale O2 28.
  2. Camera cV
    1. Dopo la calibrazione dell'aria, chiudere la camera, attendere la stabilizzazione della pendenza O2 e impostare il segno J°1 sul grafico 'O2 slope neg.'28. Con una siringa di Hamilton, titolare il Na-ditionite preparato secondo il punto 2.4.1. in incrementi di 0,7 μL per adattarsi al regime diossigeno della V della camera e abbassare la concentrazione di O2 a 150 μM.
    2. Aggiungere un'altra fase di titolazione del Na-ditionito (circa 7 μL) per abbassare la concentrazione di O2 a 100 μM (Figura 1D).
  3. Analisi strumentale dei dati di fondo O2
    1. Calcola la pendenza strumentale di fondo O2 in DatLab28. Selezionate Flusso/Pendenza (Flux/Slope ) dal menu in alto.
    2. Apri la finestra di correzione dello sfondo O2. Selezionare File attivo come sorgente dello sfondo O2 e selezionare i segni J° da utilizzare per il calcolo della regressione lineare. Applicare la correzione dello sfondo O2.

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Figura 1: Camere a volume piccolo (sV) e a volume classico (cV) e test strumentale di fondo O2. (A) Seziones V. (B) Sezione cV. (C) Tracce rappresentative di pendenza negativa e segni J°1, sV (0,5 mL; verde) e cV (2,0 mL; blu). (D) Concentrazione di ossigeno corrispondente e segni R1. Tre titolazioni manuali di Na-ditionite (ca. 0,7 μL, 10 mM di stock; cV) e titolazione finale di 7,0 μL di 2,5 mM e 10 mM di stock rispettivamente nella camera sV e cV. I picchi causati dalle titolazioni sono stati eliminati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Aggiunta del campione alle camere Oroboros

NOTA: Il campione può essere aggiunto nella camera con due metodi: sostituzione parziale del volume (piastrine e fibroblasti nel presente studio) o sostituzione completa del volume (mitocondri isolati nel presente studio).

  1. Sostituzione parziale del volume
    1. Rimuovere il tappo completamente inserito. Pipettare ed eliminare un volume Vdal MiR05. Il Vout è di 60-70 μL per le piastrine e di 80-150 μL per i fibroblasti, calcolato in base alle concentrazioni cellulari nella sospensione di cellule madre.
    2. Equivalente a Vout, pipettare lo stesso volume VJ.i di sospensione di cellule madre (con concentrazione di cellule note) nella camera (Figura 2).
    3. Calcolare la concentrazione di cellule sperimentali nel volume effettivo V' (0,54 mL e 2,07 mL), maggiore del volume sperimentale effettivo V (0,5 mL e 2,0 mL).
      NOTA: Le concentrazioni della sospensione della cella madre e la concentrazione della cella sperimentale devono essere pianificate in modo da ottenere volumi di VJ.i = Vout compatibili con un piccolo errore di titolazione. Negli esperimenti con le piastrine, è stato utilizzato un prototipo di tappo per la V dellacamera con un volume morto capillare di 0,05 mL.
  2. Sostituzione completa del volume
    1. Prelevare l'intero terreno dalla camera e sostituirlo con almeno 0,54 mL o 2,07 mL di soluzione madre isolata di mitocondri alla concentrazione sperimentale del campione nelle camere sV o cV, rispettivamente.
    2. Chiudere la camera e aspirare la soluzione madre mitocondriale in eccesso dal recipiente del tappo.
      NOTA: La sostituzione completa del volume esclude qualsiasi variabilità nella concentrazione mitocondriale che può essere sostenuta titolando nella camera chiusa attraverso il capillare del tappo con una siringa Hamilton. Quest'ultimo metodo è applicabile a campioni di piccolo diametro preparati in sospensioni madre concentrate (ad esempio, mitocondri isolati); tuttavia, espone le cellule fragili a potenziali danni delle membrane plasmatiche a causa delle forze di taglio esercitate nell'ago lungo 51 mm della siringa di Hamilton (diametro interno di 0,41 mm). Ciò viene evitato rimuovendo il tappo e pipettando il campione nella camera mediante sostituzione parziale o completa del volume. Sono stati studiati tre tipi di preparati mitocondriali. Le preparazioni campione sono descritte nel fascicolo supplementare 1 1,26,29,30.
  3. Cellule viventi: piastrine umane
    1. Inserire i crioviali contenenti piastrine in un bagno d'acqua a 37 °C e scongelare il contenuto fino a quando non rimane poco ghiaccio.
    2. Aprire i crioviali e aggiungere 1 mL di terreno preriscaldato (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) lentamente in gocce.
    3. Mescolare delicatamente le piastrine e trasferirle in una provetta da centrifuga da 50 mL con un volume totale di 10 mL di terreno preriscaldato (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Centrifugare a 1000 g per 10 min a temperatura ambiente (RT) utilizzando un rotore oscillante (accelerazione 6, freno 2).
    4. Risospendere le piastrine in 0,25 mL di DPBS + 10 mM EGTA (RT) e aggiungerle nelle camere mediante sostituzione parziale del volume a una concentrazione iniziale di cellule sperimentali compresa tra 157 · da 106 a 210 · 106 x·mL-1 nella camera da 0,5 mL e da 164 · da 106 a 220 · 106 x·mL-1 nella camera da 2,0 mL (vedere31 per i dettagli sull'unità elementare x).
      NOTA: Un Oroboro era equipaggiato con le camere sV e cV nelle posizioni A e B, rispettivamente, utilizzate in parallelo con un altro Oroboro equipaggiato con le camere sV e cV nelle posizioni B e A, rispettivamente.
  4. Cellule permeabilizzate: fibroblasti umani
    1. Aggiungere le celle alle camere Oroboros mediante sostituzione parziale del volume fino a una concentrazione nominale di 0,75 · 106 x·mL-1 in entrambi i tipi di camera e calcolare la concentrazione effettiva (passaggio 4.1.3).
      NOTA: Diversi strumenti Oroboros sono stati utilizzati in parallelo, ciascuno dotato delle camere sV o cV .
  5. Mitocondri isolati: cuore di topo
    1. Aggiungere 15 μL di sospensione mitocondriale a 5985 μL di terreno di respirazione mitocondriale (MiR05), ottenendo una concentrazione di proteina mitocondriale di riserva compresa tra 0,013 e 0,026 mg∙mL-1.
    2. Aggiungere la sospensione mitocondriale alle camere Oroboros mediante sostituzione completa del volume.
      NOTA: Un Oroboro era equipaggiato con le camere sV e cV nelle posizioni A e B, rispettivamente, utilizzate in parallelo con un altro Oroboro equipaggiato con le camere sV e cV nelle posizioni B e A, rispettivamente.

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Figura 2: Aggiunta della sospensione cellulare mediante sostituzione parziale del volume. (A) Aggiunta nella camera da 0,5 mL sV e (B) nella camera da 2,0 mL cV. (1) Camera chiusa con volumi di mezzo di respirazione V e tappo riempito capillare Vstc, per la misurazione del fondo strumentale O2 flusso JO2°. (2) Tappo rimosso, Vstc scaricato nella camera con conseguente volume totale V'= V+Vstc. (3) Rimozione parziale del fluido Vout = -V J.i. Nella camera rimane un volume V''= V'+Vout. (4) Pipettare il sottocampione con volume V J.i di sospensione respirometrica di cellule madre nella camera, ottenendo un volume totale V# = V+Vstc di sospensione cellulare diluita. (5) Camera chiusa con capillare di tappo riempito (volume morto Vstc) per la misura del flusso di O2 volume-specifico JV,O 2 in un volume sperimentale V. Questa cifra è stata modificata rispetto alla Figura 2A in Conteggio cellulare e normalizzazione in HRR41. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Protocolli SUIT

  1. Titolare le soluzioni madre delle sostanze chimiche elencate nella Tabella supplementare 1 nelle camere con microsiringhe Hamilton, regolando i volumi di titolazione per ottenere le stesse concentrazioni sperimentali nelle camere sV e cV (vedere le legende delle figure 6, 8, 10).
  2. Selezionare il protocollo SUIT-003_D018 32,33 (per le piastrine nel presente studio).
  3. Selezionare i protocolli SUIT-001_D004 4,15,34,35 e SUIT-002_D007 4,15,35,36 (per i fibroblasti nel presente studio).
  4. Seleziona il protocollo SUIT-002_D005 4,15,35,37 (per mitocondri isolati nel presente studio).

6. Analisi dei dati SUIT

  1. In DatLab, impostare i contrassegni per definire le sezioni dei grafici selezionati.
  2. Selezionate Flusso/Pendenza (Flux/Slope ) nel menu in alto. Aprire la finestra Flusso/Inclinazione . Applicare la correzione del volume di titolazione per la diluizione dei campioni sospesi mediante ciascuna titolazione nel protocollo SUIT.
  3. Seleziona Indicatori dal menu in alto. Statistiche Open Mark per mostrare la mediana dei punti dati contrassegnati al basale corretta per sottrazione del consumo di ossigeno residuo (rox).
  4. Calcola l'intercetta e la pendenza tra i risultati accoppiati ottenuti nelle camere sV e cV mediante analisi di regressione invertita25,28 utilizzando un foglio di calcolo.
  5. Confrontare le frequenze respiratorie nello stato rox (flussi minimi di O2) nelle camere sV e cV con un t-test di Student accoppiato utilizzando il software jamovi 2.3.1338.
    NOTA: Poiché le due camere di uno strumento Oroboros sono funzionalmente indipendenti (ad eccezione della temperatura e degli intervalli di registrazione DatLab), le misurazioni in ciascuna camera possono essere considerate separatamente, in modo simile all'utilizzo di strumenti diversi. I risultati finali possono essere riportati come mediane o medie di più camere con informazioni sulla loro variabilità.

Risultati

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Si prevede che i segnali grezzi R1 [μA] dei sensori di ossigeno (POS) siano indipendenti dal volume della fase acquosa in equilibrio con la fase gassosa dell'aria nella camera "aperta", come confermato in Tabella supplementare 2. Nella camera chiusa, invece, il sottofondo strumentale O2Flusso vicino alla saturazione dell'aria J°1[pmol∙s-1∙mL-1] dipende dal volume V (Tabella supplementare 2). La O2Consumo del sensore [PMOL's-1] può essere previsto dal flusso di elettroni misurato come segnale grezzo corretto per zero R1-R0 [μA], il numero di carica 4 e-/O2e la costante di Faraday F = 96 485,33 C∙mol-1. 1 μA equivale a un flusso di elettroni (e-) delle 22.36-1. Dividendo per il numero di carica si ottiene una O2fluire15,39 di 2.591 pmol∙s-1·μA-1. La mediana registrata di R1-R0 è stata di 2,09 μA e 1,98 μA nelle camere da 0,5 mL e 2,0 mL, rispettivamente (Tabella supplementare 2; R0 = 0,006 ± 0,007 μA nella sV e R0 = 0,004 ± 0,003 μA nel cV camere), corrispondenti teoricamente a O2Consumi di 5,41 pmol∙s-1e 5,13 pmol-1. La O2Il flusso del sensore viene convertito nel flusso volumetrico specifico previsto alla saturazione dell'aria (J°R1) come 5.41 pmol∙s-1/0,5 mL = 10,82 pmol∙s-1∙mL-1e 5,13 pmol-1/2,0 mL = 2,56 pmol∙s-1∙mL-1negli anni 'V e cV camera, rispettivamente. Con lo stesso tipo di sensori polarografici di ossigeno nella camera da 2,0 mL e 0,5 mL, il fondo specifico per il volume O2flusso - calcolato dalla corrente R1-R0 (J°R1) - aumenta teoricamente di 4 volte in modo inversamente proporzionale al volume della camera. J°aria (a saturazione dell'aria, dove la retrodiffusione è zero; confrontare Tavolo 2 e Tabella supplementare 3) è stato calcolato per l'O2concentrazione alla saturazione dell'aria dalla regressione lineare del test sperimentale di fondo (Figura 3). J°aria si è avvicinato ai valori teoricamente attesi J°R1 per entrambe le camere (Tavolo 2). Le J°aria / J°R1il rapporto era 0,85 ± 0,04 e 0,92 ± 0,12 negli anniV e cV in linea con una serie indipendente di 52 misurazioni nella camera da 2,0 mL, in cui questo rapporto era 0,95 ± 0,12 (Tabella supplementare 4). J°aria era 3,9 volte superiore nella camera da 0,5 mL rispetto a quella da 2,0 mL. La rete O2Retrodiffusione J°50, calcolato a 50 μM O2dalla regressione lineare del test sperimentale di fondo, era solo tre volte superiore nella camera da 0,5 mL (Tavolo 2). La variabilità del fondo strumentale O2i flussi erano quasi identici nei due diversi volumi della camera, con deviazione standard (SD) di 0,5 e 0,3 pmol∙s-1∙mL-1per J°aria e 0,9 e 0,8 pmol∙s-1∙mL-1 per J°50negli anni 'V e cV camera di credito, rispettivamente (Tavolo 2). Nonostante il sottofondo strumentale più alto O2pendenze nella camera da 0,5 mL, la dipendenza del fondo O2flussi su cO2è stato altamente riproducibile in entrambi i tipi di camera (Figura 3D). Ciò si traduce in bassi valori dei residui <±1 pmol∙s-1∙mL-1per entrambe le camere (Tabella supplementare 5), in linea con il limite di rilevazione degli Oroboros28.

Abbiamo quantificato l'effetto della velocità di agitazione sul segnale grezzo di calibrazione R1 del POS tra 350 giri/min (5,8 Hz) e 950 giri/min (15,8 Hz) in incrementi di 100 giri/min (1,7 Hz) con la camera in configurazione "aperta". In questa configurazione, l'O2 disciolto nel mezzo è in equilibrio con la fase gassosa; pertanto, le variazioni del segnale grezzo (microampere [μA]) in funzione della velocità di agitazione non riflettono le reali differenze in cO2. I sensori di ossigeno hanno risposto a una variazione della velocità di agitazione con una piccola deviazione da R1 alla velocità predefinita di 750 giri/min, indipendentemente dal volume della camera (Figura 4). Nella configurazione "aperta", il rumore della pendenza di O2, definito come SD per ogni passo dopo la stabilizzazione del segnale, era più basso a 850 giri/min in entrambi i tipi di camera e aumentava quando la velocità di agitazione si discostava da questo valore in entrambe le direzioni (Figura 5A). Al di sotto dei 550 giri/min, il rumore della pendenza di O2 ha superato la soglia di ±4 pmol∙s-1∙mL-1, definendo la velocità minima pratica di agitazione. A causa di limitazioni tecniche, il limite superiore non è stato raggiunto, rendendo 950 giri/min la velocità di agitazione massima pratica (Figura 5A). All'interno di questo intervallo, la deviazione del segnale O2 da R1 era del <2,5 %. La chiusura delle camere non ha alterato il rapporto tra rumore e velocità di agitazione (Figura 5B). La costante di tempo esponenziale τ era di 2,53 ± 0,05 s a 550 giri/min e di 2,50 ± 0,05 s a 750 giri/min per la camera da 0,5 mL (Figura 3 supplementare).

Il protocollo SUIT-003_D018 applicato alle piastrine include fino a 14 fasi di titolazione. È progettato per studiare il controllo dell'accoppiamento di cellule viventi, ce e permeabilità della membrana plasmatica come indice di vitalità cellulare32. Il flusso di ossigeno misurato nei due tipi di camere (Figura 6) è risultato strettamente corrispondente in tutti gli stati respiratori (Figura 7). Sono necessarie riossigenazioni intermittenti per evitare l'ipossia funzionale o limitare la concentrazione sperimentale di O2 a un intervallo definito. Le riossigenazioni sono state eseguite aprendo la camera in posizione "aperta" dopo la titolazione del marciume. Alla chiusura della camera, il flusso di O2 si è stabilizzato entro 4 minuti nella camera da 2,0 mL, ma sono stati necessari circa 10 minuti nella camera da 0,5 mL prima della stabilizzazione e dell'impostazione del nuovo segno (Figura 6 e Figura 4 supplementare). La riossigenazione allo stato rox quando i flussi di O2 sono bassi evita un calo della concentrazione di O2 durante il tempo necessario per la stabilizzazione. Il rox inibito dal rotenone era 0,9 ± 0,6 e 2,0 ± 0,6 pmol∙s-1∙mL-1 a 98 ± 17 e 94 ± 17 μM O2 (media ± SD) nella camera sV e cV, rispettivamente. Il Rox è aumentato di 3,1 ± 0,9 e 0,9 ± 0,4 pmol∙s-1∙mL-1 dopo la riossigenazione a 159 ± 8 e 147 ± 11 μM O2 nella camera sV e cV, rispettivamente. La dipendenza dall'ossigeno di rox osservata nelle piastrine concorda con i risultati sui fibroblasti umani e sulle cellule endoteliali della vena ombelicale40.

Per l'analisi di OXPHOS nei fibroblasti permeabilizzati, abbiamo utilizzato due protocolli SUIT con un massimo di 17 e 20 fasi di titolazione (SUIT-001 e SUIT-002, rispettivamente35; Figura 8); pertanto, la correzione del volume di titolazione è particolarmente importante poiché alla fine di SUIT-002, la diluizione ammontava al massimo al 14% e al 10,5% rispettivamente nella camera sV e cV. La conta delle cellule dei fibroblasti di 0,35.106 x e 1.44.106 x nelle camere da 0,5 mL e 2,0 mL, rispettivamente, ha portato alla stessa concentrazione cellulare di 0,75.106 x∙mL-1. La combinazione di SUIT-001 e SUIT-002 ha affrontato 20 stati respiratori, tutti strettamente correlati nei tipi a due camere (r2 = 0,950 per SUIT-001 e r2 = 0,959 per SUIT-002). In entrambi i protocolli, il Complesso IV aveva una dispersione relativamente alta (Figura 9). La riossigenazione non è stata richiesta in SUIT-001 a partire da un flusso di O2 a basso volume specifico di 18,7 ± 7,0 pmol∙s-1∙mL-1 nello stato di routine (media ± SD), consentendo alla concentrazione di O2 di scendere a 56 μM fino alla sezione del protocollo legata al CIV (Figura 8A; 8Ama). Tuttavia, in SUIT-002, la riossigenazione è stata eseguita prima delle titolazioni disaccoppiatrici, aumentando la concentrazione di O2 da 100 μM a 180 μM (Figura 8B; 6Gp). Considerando il lungo tempo necessario per la stabilizzazione del disossidante dopo la riossigenazione, la riossigenazione durante le titolazioni con disaccoppiatore deve essere evitata.

Un protocollo SUIT abbreviato è stato applicato ai mitocondri isolati (Figura 10). La concentrazione di proteine mitocondriali è stata determinata dopo il test respirometrico, rendendo impossibile definire in anticipo la concentrazione accurata del campione nella camera. Il flusso respiratorio volume-specifico varia in funzione della concentrazione mitocondriale. Pertanto, i dati sono stati presentati come flusso specifico per il volume e per la massa proteica (Figura 11). Entrambe le rappresentazioni mostrano la stretta correlazione tra le misurazioni ottenute nelle camere da 0,5 mL e 2,0 mL (Figura 11).

Il rox del consumo di ossigeno residuo misurato dopo l'inibizione del Complesso III da parte dell'antimicina A può essere utilizzato come indice di prestazioni strumentali a frequenze respiratorie molto basse. In tutte le serie sperimentali, il rox era comparabile tra le camere da 0,5 mL e 2,0 mL (piastrine: t(5) = -0,34, p = 0,74; fibroblasti: SUIT-001: t(10) = 20,00, p = 0,06; SEME-002: t(10) = 11,00, p = 0,96; Mitocondri isolati: t(4) = -1,18, p = 0,27). La dispersione dei dati corrispondeva in gran parte all'incertezza strumentale di ±1 pmol∙s-1∙mL-1 13,28, come illustrato nella Figura 12. I file originali sono disponibili per l'accesso aperto presso il repository Zenodo: 10.5281/zenodo.11634408. 

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Figura 3: Flusso strumentale di fondo O2 per la camera sV (0,5 mL; verde e nero) e cV (2,0 mL; blu). Intervallo di concentrazione di O2 da saturazione dell'aria (ca. 180 μM) a circa 50 μM. Simboli aperti: concentrazioni di O2 ottenute senza Na-ditionito. Simboli solidi: Concentrazioni di O2 controllate da titolazioni manuali di Na-ditionite. Cerchi neri: concentrazioni di O2 controllate mediante titolazioni di Na-ditionite utilizzando il TIP2k nella camera da 0,5 mL (N = 8). I risultati dei test strumentali di fondo sono stati raggruppati dalla (A) Serie 1 (sV: N = 2; cV: N = 2) prima di utilizzare cellule viventi (ce); (B) Serie 2 (sV: N = 38; cV: N = 50) prima dell'uso di celle permeabilizzate (pce); (C) Serie 3 (sV: N = 10; cV: N = 10) prima di utilizzare i mitocondri isolati (imt). (D) Dati sovrapposti dai pannelli A-C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Effetto della velocità di rotazione dell'agitazione sul segnale POS alla saturazione dell'aria (camera "aperta") nella camera da 0,5 mL (verde) e nella camera da 2,0 mL (blu). Risposta [%] relativa ai segnali di calibrazione dell'aria corretti per R0 R1-R0 [μA] a 750 giri/min (sV: N = 4; cV: N = 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Rumore della pendenza di O2 in funzione della velocità di rotazione dell'agitazione. rumore espresso come deviazione standard in (A) camera «aperta»; (B) camera chiusa (0,5 mL, verde; 2,0 mL, blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Consumo di O2 di piastrine umane crioconservate nella camera da 0,5 mL. Tracce rappresentative della concentrazione di O2 [μM] (linee blu) e del flusso di O2 per cellula [amol∙s-1∙x-1] calcolate come flusso di O2 [pmol∙s-1∙mL-1] diviso per la concentrazione cellulare di 157∙106 x∙mL-1 (linee rosse, corrette per il flusso strumentale di fondo di O2; i picchi causati dalle titolazioni sono stati eliminati). La concentrazione di O2 è stata mantenuta al di sopra di 50 μM mediante riossigenazioni intermittenti (aria, camera "aperta", tonalità blu). Sequenza degli stati respiratori (titolazioni e velocità; protocollo SUIT-003_D018): ce1, respirazione di routine R delle cellule viventi. ce1P, piruvato 5 mM come substrato esterno. ce2Omy10 (pannello A), titolazioni Omy in incrementi di 5 nM; respirazione a tenuta L. ce3U0,3 (pannello A) e ce3U0,1 (pannello B), titolazioni con disaccoppiatore alla concentrazione ottimale di CCCP di 0,3 e 0,1 μM, rispettivamente; Capacità ET E. ce3Glc, glucosio 11 mM; E progressivamente inibito dal disaccoppiatore. ce4Rot, rotenone 0,5 μM che inibisce CI; Consumo di ossigeno residuo Rox. ce5S, succinato 10 mM; stimolare l'E nelle cellule permeabili alla membrana plasmatica. 1Dig15 (pannello A) e 1Dig10 (pannello B), titolazioni di digitonina in 5 μg·mL-1 raggiungono concentrazioni ottimali di 15 e 10 μg·mL-1, rispettivamente per la permeabilizzazione completa della membrana plasmatica; capacità ET della via del succinato SE. 1c, citocromo c 10 μM; test di integrità della membrana esterna mitocondriale. 2Ama, antimicina A 2,5 μM che inibisce CIII; Rox. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Correlazione della respirazione delle piastrine umane crioconservate misurata nella camera da 0,5 mL e 2,0 mL. Il flusso di O2 corretto per Rox è stato valutato nel protocollo SUIT-003_D018 (Figura 6); N = 6. (A) Con oligomicina Omimia; (B) senza Omy. Pendenze figure-results-6 medie e intercette figure-results-7 della regressione dei minimi quadrati invertiti e coefficienti di determinazione r2 calcolati da tutti i dati. Le linee nere tratteggiate rappresentano le linee di identità. Le linee rosse rappresentano le linee di regressione calcolate. Sono stati esclusi i flussi di O2 nello stato dopo l'aggiunta di glucosio (vedi Figura 6). I protocolli con e senza oligomicina sono separati nei pannelli A e B per evitare la sovrapposizione dei punti dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Consumo di O2 di fibroblasti nella camera da 0,5 mL. Tracce rappresentative di cO2 (linee blu [μM]) e flusso di O2 per cellula calcolate come flusso di O2 [pmol∙s-1∙mL-1] diviso per la concentrazione cellulare (0,75·106 x∙mL-1), corrette per il flusso strumentale di fondo di O2 (sono state eliminate le linee rosse, i picchi causati dalle titolazioni). La concentrazione di O2 è stata mantenuta al di sopra di 50 μM mediante riossigenazioni intermittenti (aria, camera "aperta", tonalità blu). Sequenza degli stati respiratori (titolazioni e velocità). (A) Protocollo SUIT-001_D004: ce1, respirazione di routine R. +Dig, digitonina 10 μg·mL-1 (ce a pce), respirazione endogena residua ren. 1PM, piruvato 5 mM e malato 2 mM; Respirazione con perdita di percorso NN L. 2D, ADP 2,5 mM; Capacità OXPHOS della via NP. 2c, citocromo c 10 μM; test di integrità della membrana esterna mitocondriale. 3U1.5, titolazioni disaccoppiatrici alla concentrazione ottimale di CCCP 1,5 μM; Capacità ET collegata al NADH NE. 4G, glutammato 10 mM; N(PGM)E. 5S, succinato 10 mM; NS-pathway ET capacità NSE. 6Rot, rotenone 0,5 μM; capacità ET della via del succinato SE. 7Gp, glicerofosfato 10 mM; SGpE. 8Ama, antimicina A 2,5 μM; Rox. 9AsTm, ascorbato 2 mM e TMPD 0,5 mM; substrati per la stimolazione CIV; la camera è stata tenuta aperta per 20 minuti per consentire l'equilibrio redox senza esaurimento dell'ossigeno4; O2 flussante fuori dal calcare dopo la chiusura della camera (205 amol·s-1·x-1). 10Azd, azide 100 mM; Flusso chimico di fondo dipendente dall'ossigeno CHB. (B) Protocollo SUIT-002_D007: ce1, R. +Scava, ren. +D, stimolante ren. +M.1, malato 0,1 mM e 1Oct, ottanoilcarnitina 0,5 mM; Capacità OXPHOS FP = J(1Oct)-J(+M.1). 1c. 2M2, malato 2 mM che supporta la via N anaplerotica; F(N)P. 3P e 4G, attivazione progressiva a FNP. 5S, FNSP. 6Gp, FNSGpP. 7U1.5, FNSGpE. 8Rot, SGpE. 9Ama, rox. 10AsTm O2 flusso fuori scala 207 amol·s-1·x-1. 11Azd, cap. In generale, l'attività del Complesso IV è la differenza dei tassi, J(AsTm)-J(Azd) a concentrazioni di O2 strettamente corrispondenti. Per ulteriori dettagli, vedere la Figura 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Correlazione della respirazione dei fibroblasti permeabilizzati nella camera da 0,5 mL e 2,0 mL. Flusso di O2 corretto per Rox in (A) SUIT-001_D004 e (B) SUIT-002_D007 (N = 6). Pendenza figure-results-10 media e intercetta figure-results-11 della regressione dei minimi quadrati invertiti e coefficiente di determinazione r2 calcolati da tutti i dati. La linea nera tratteggiata rappresenta la linea di identità. Le linee rosse rappresentano le linee di regressione calcolate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10: Consumo di O2 di mitocondri cardiaci di topo isolati in camere da 0,5 mL (verde) e 2,0 mL (blu). Tracce rappresentative di (A) flusso di O2 massa-specifico alla concentrazione di proteine mitocondriali 0,023 mg∙mL-1 (corretto per il flusso di fondo strumentale di O2 , i picchi causati dalle titolazioni sono stati eliminati) e (B) concentrazione di O2 [μM]. Sequenza degli stati respiratori (titolazioni e velocità) seguendo il protocollo SUIT-002_D005: imt, respirazione endogena residua ren. +D, ADP 2,5 mM; stimolante ren. +M.1, malato 0,1 mM e 1Oct, ottanoilcarnitina 0,5 mM; Capacità OXPHOS FP = J(1Oct)-J(+M.1). 1c, citocromo c 10 μM; test di integrità della membrana esterna mitocondriale. 2M2, alto malato 2 mM che supporta la via N anaplerotica; F(N)P. 3P, piruvato 5 mM; FNP. 4G, glutammato 10 mM; FNP. 5S, succinato 10 mM; FNSP. 6Gp, glicerofosfato 10 mM; FNSGpP. 7U0.5, titolazioni disaccoppiatrici alla concentrazione ottimale di CCCP 0,5 μM; FNSGpE. 8Rot, rotenone 0,5 μM che inibisce l'IC; SGpE. 9Ama, antimicina A 2,5 μM che inibisce CIII; Consumo di ossigeno residuo Rox. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 11: Correlazione della respirazione di mitocondri cardiaci isolati di topo misurati nelle camere da 0,5 mL e 2,0 mL. Flusso O2 nel protocollo mostrato nella Figura 10 (N = 4). (A) Flusso di O2 volume-specifico. (B) Flusso di O2 corretto per Rox diviso per la concentrazione di proteina mitocondriale (0,013 - 0,026 mg∙mL-1). Pendenza figure-results-14 media e intercetta figure-results-15 della regressione dei minimi quadrati invertiti e coefficiente di determinazione r2 calcolati da tutti i dati. Le linee nere tratteggiate rappresentano la linea di identità. Le linee rosse rappresentano la linea di regressione calcolata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 12: Consumo di ossigeno residuo nelle camere da 0,5 mL e 2,0 mL. Flusso per volume misurato dopo l'aggiunta di antimicina A, combinato da esperimenti con cellule viventi (ce, quadrati), cellule permeabilizzate (pce, cerchi) e mitocondri isolati (imt, triangoli). Pendenza figure-results-17 media e intercetta figure-results-18 della regressione dei minimi quadrati invertiti. Linea tratteggiata: linea di identità. Linea rossa: linea di regressione calcolata. Ombra: gamma di risoluzione strumentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ModulosVcV
Camera sperimentale volume V0,5 ml2,0 ml
Diametro interno del cilindro di vetro12,0 millimetri16,0 millimetri
Diametro esterno del cilindro di vetro24,0 millimetri24,0 millimetri
Spessore della parete di vetro6,0 millimetri4,0 millimetri
Barra di agitazione rivestita in PVDF11,5 x 6,2 millimetri15,0 x 6,0 millimetri
Diametro capillare del tappo1,00 millimetri1,30 millimetri
Area della sezione trasversale del capillare del tappo0,79 mm21,33 mm2
Lunghezza del capillare del tappo50,64 millimetri48,86 millimetri
Volume capillare del tappo39,8 μl64,9 μl
Tappo capillare volume morto Vstc con una piccola gocciaa0,04 ml0,07 ml
Volume V' per la calibrazione del volume0,54 ml2,07 ml

unLa goccia dovrebbe corrispondere a 5 μl per la camera cV e vicina a 0 μl per la camera sV.
Tabella 1: Dimensioni dei moduli di piccolo volume (sV) e di volume classico (cV) con tappi in polietere etere chetone (PEEK).

J°air / [pmol∙s-1∙mL-1]J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
Camera sperimentale volume V0,5 ml2,0 ml0,5 ml2,0 ml
Significare9.222.37-3.17-1.17
Mediano9.252.36-3.08-1.04
Deviazione standard0.490.340.930.83
Minimo8.201.79-5.11-3.72
Massimo10.413.42-0.820.67

Tabella 2: J°aria estrapolata alla saturazione dell'aria e J°50 calcolata a una concentrazione di 50 μM O2 . Dati aggregati dei test strumentali di fondo nelle serie 2 (pce) e 3 (imt) e prima delle titolazioni TIP2k (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 mL: N = 60).

File supplementare 1: Preparazioni dei campioni. Piastrine umane, fibroblasti umani e mitocondri isolati da cuori di topo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 1 supplementare: Test strumentale di fondo O2 utilizzando il TIP2k. Tracce rappresentative del test eseguito utilizzando il TIP2k per titolare la Na-ditionito (2,5 mM) nella camera da 0,5 mL. Fluido: MiR05, temperatura: 37 °C, velocità di agitazione: 750 giri/min. I picchi causati dalle titolazioni sono stati eliminati. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Flusso strumentale di fondo O2 J°1 in funzione della concentrazione di O2 . Camera sV (0,5 mL; verde, N = 48) e Camera cV (2,0 mL; blu, N = 60) nelle serie 2 (pce, cerchi) e 3 (imt, triangoli) e prima delle titolazioni TIP2k nella camera da 0,5 mL (cerchi neri, N = 8). Linee rosse: mediana ± SD. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Costante di tempo esponenziale τ in funzione della velocità di rotazione dell'agitazione. Valori τ individuali per la camera da 0,5 mL a 37 °C (N = 2). Nella camera da 0,5 mL τ era 2,53 ± 0,05 s a 550 giri/min, 2,50 ± 0,05 s a 750 giri/min e 2,47 ± 0,04 s a 850 giri/min. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 4 supplementare: Consumo di O2 di piastrine umane crioconservate nella camera da 2,0 mL. Traccia rappresentativa del protocollo SUIT-003_D018, comprese le titolazioni di oligomicina (Omy). Il flusso [pmol∙s-1∙mL-1] è stato corretto per il flusso strumentale di fondo O2 e diviso per la concentrazione cellulare (164∙106 x∙mL-1). I picchi causati dalle titolazioni sono stati eliminati. cO2 è stato mantenuto al di sopra di 60 μM mediante riossigenazioni intermittenti (aria, camera "aperta", tonalità blu). Sequenza degli stati respiratori (titolazioni e velocità): ce1, respirazione di routine R delle cellule viventi. ce1P, piruvato come substrato esterno. ce2Omy10, Titolazioni Omy in step di 5 nM; respirazione a tenuta L. ce3U2.0, titolazioni disaccoppiatrici a concentrazioni ottimali di 2 μM; Capacità ET E. ce3Glc, glucosio 11 mM; E progressivamente inibito dal disaccoppiatore. ce4Rot, rotenone 0,5 μM che inibisce l'IC; Consumo di ossigeno residuo Rox. ce5S, succinato 10 mM; stimolare l'E nelle cellule permeabili alla membrana plasmatica. 1Dig20, titolazioni di digitonina a concentrazioni ottimali di 20 μg·mL-1, per la completa permeabilizzazione della membrana plasmatica; capacità ET della via del succinato SE. 1c, citocromo c 10 μM; test di integrità della membrana esterna mitocondriale. 2Ama, antimicina A 2,5 μM che inibisce CIII; Rox. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Sostanze chimiche utilizzate nei protocolli di titolazione SUIT (Substrate-inhibitor-Uncoupler-Titration). Abbreviazioni e concentrazioni della soluzione madre per le camere sV e cV . Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Confronto tra R1-R0 e J°1 nelle camere da 0,5 mL e 2,0 mL. Dati aggregati dei test strumentali di fondo nelle serie 2 (pce) e 3 (imt) e prima delle titolazioni TIP2k (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 mL: N = 60). I dati sono stati mediati solo dalle serie sperimentali 2 (pce) e 3 (imt), che sono state eseguite a una pressione barometrica media di 94,9 kPa (Innsbruck, Austria), escludendo i dati della serie 1 (ce) ottenuti a livello del mare. Lo stesso tipo, ma diversi POS individuali sono stati utilizzati nelle camere da 0,5 mL e 2,0 mL. Pertanto, la variabilità tra i sensori deve essere considerata quando si confrontano le camere sV e cV. Mentre J°1 = 2,26 ± 0,41 pmol∙s-1∙mL-1 ottenuti sperimentalmente per la camera da 2,0 mL corrispondevano strettamente al valore calcolato, il J°1 sperimentale = 8,48 ± 0,53 pmol∙s-1∙mL-1 per la camera da 0,5 mL era inferiore al previsto. Ciò è stato spiegato dalle seguenti osservazioni. Dopo aver chiuso la camera, il flusso di fondo O2 più elevato nella camera da 0,5 mL abbassa le concentrazioni di O2 ai segni per J°1 impostati a intervalli di tempo comparabili (Figura 1). La concentrazione di ossigeno a J°1 era in media del 4,06 % e dell'1,72 % inferiore alla saturazione dell'aria nella camera da 0,5 mL e 2,0 mL, rispettivamente (Figura 2 supplementare, Tabella 2 supplementare). A un cO2 inferiore, la diminuzione del consumo di O2 da parte del sensore e una certa retrodiffusione di O2 riducono il J°1 determinato sperimentalmente. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: Concentrazione di ossigeno [μM] alla quale sono stati ottenuti i valori di taratura (R1) e J°1 e la loro differenza in %, la loro differenza in %. Dati aggregati dei test strumentali di fondo nelle serie 2 (pce) e 3 (imt) e prima delle titolazioni TIP2k (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 mL: N = 60). Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 4: J°1 misurato e previsto nella camera da 2,0 mL. Serie indipendente di test strumentali di fondo con O2k serie A (con tappi in titanio13), V = 2,0 mL (37 °C, soluzione di NaCl con fattore di solubilità O2 0,92; N = 52). nO2/Qe = 106/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙μC-1 = 2.591 pmol∙s-1∙μA-1. Sulla base dell'ipotesi che la retrodiffusione di O2 sia trascurabile a cO2,1, il che è vero solo a cO2,1 ~ cO2*. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 5: Residui di regressione lineare (valori assoluti [pmol O2∙s-1∙mL-1]) calcolati per ogni test strumentale di fondo O2. Dati aggregati dei test strumentali di base nelle serie 2 (pce) e 3 (imt) e prima delle titolazioni TIP2k. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La quantità di campione disponibile per la respirometria è spesso limitata, ad esempio negli studi di biopsie, cellule primarie o colture cellulari a crescita lenta con bassa conta cellulare1. Inoltre, le attività respiratorie sono depresse a causa di lesioni mitocondriali11 o quando si studiano vie mitocondriali con basse capacità, come l'ossidazione degli acidi grassi12. In questi casi, un basso volume della camera respirometrica offre vantaggi per la risoluzione del flusso di O2. Tuttavia, i flussi strumentali di O2 aumentano a volumi inferiori della camera e inducono errori quando non misurati in modo affidabile e non adeguatamente corretti in funzione della concentrazione di O2. La replicabilità dei test strumentali di fondo dell'O2 e delle correzioni di fondo è particolarmente importante per bassi volumi di camera. Valori quasi identici del flusso teorico (J°R1) e sperimentale (J°aria) di O2 forniscono la prova dell'accuratezza della misura polarografica con 4 e-/O2 alla reazione catodica del POS. La differenza tra J°R1 e J°air era di 1,64 ± 0,43 e 0,22 ± 0,31 pmol∙s-1∙mL-1 nella camera sV e cV, rispettivamente, indicando una precisione nelle misurazioni che rientra nel limite di rilevabilità della camera da 2,0 mL (±1 pmol∙s-1∙mL-1)28. Con lo stesso tipo di sensori polarografici di ossigeno nella camera da 2,0 mL e 0,5 mL, il flusso di fondo O2 specifico del volume aumentava di 4 volte in proporzione inversa al volume della camera, e la variabilità era quasi identica nei due volumi della camera, con SD di 0,5 e 0,3 pmol∙s-1∙mL-1 per J°air e 0,9 e 0,8 pmol∙s-1∙mL-1 per J°50 nelle sV e cV camera (tabella 2). Al minimo delle attività respiratorie - per le quali la camera di piccolo volume è stata progettata - anche piccoli effetti di fondo diventano significativi (Tabella supplementare 3; Figura supplementare 2). Pertanto, è necessaria una valutazione di routine del flusso strumentale di fondo O2 (Figura 1) per applicare la corretta correzione28.

È necessaria un'agitazione elevata e costante del fluido per mantenere un sistema omogeneo e garantire un segnale di ossigeno stabile. La velocità di agitazione di 750 giri/min è stabilita per la camera da 2,0 mL, ma la velocità ottimale non era nota nella camera da 0,5 mL. Le diverse geometrie della camera di vetro e della barra di agitazione (Tabella 2) richiedono una valutazione indipendente della velocità di agitazione ottimale. I sensori di ossigeno hanno reagito alle variazioni della velocità di agitazione tra 550 giri/min e 950 giri/min, con una piccola deviazione dal segnale O2 R1 a 750 giri/min, indipendentemente dal volume della camera. La costante di tempo esponenziale τ valutata per la camera sV era in accordo con τ riportata per la camera da 2,0 mL alla stessa velocità di agitazione13. Questi risultati suggeriscono che l'agitazione è ugualmente efficace in entrambe le geometrie della camera e che la velocità di agitazione predefinita di 750 giri/min (camera da 2,0 mL) può essere applicata alla camera da 0,5 mL. Sia nella configurazione della camera "aperta" che in quella "chiusa", la camera da 0,5 mL aveva un rapporto segnale/rumore più elevato, suggerendo una maggiore precisione come vantaggio della camera da 0,5 mL (Figura 5), sebbene non si possa escludere l'effetto della variabilità dei singoli POS. Poiché il rumore non è aumentato quando si abbassa la velocità di agitazione da 750 giri/min a 550 giri/min, ridurre la velocità di agitazione a 550 giri/min nella camera da 0,5 mL può essere utile per ridurre al minimo lo stress di taglio senza compromettere il rapporto segnale/rumore.

Tassi di consumo di O2 quasi identici sono stati misurati nelle camere da 0,5 mL e 2,0 mL in tre modelli sperimentali quando è stata applicata l'appropriata correzione di fondo. I risultati ottenuti con piccole piastrine di 2 μm di diametro42, fibroblasti vivi e permeabilizzati e mitocondri isolati suggeriscono che ci si può aspettare di ottenere frequenze respiratorie costanti nelle camere da 0,5 mL e 2,0 mL in un'ampia gamma di tipi di cellule e preparati mitocondriali. Le fibre muscolari permeabilizzate, tuttavia, non sono state testate nel presente studio. La misurazione accurata del rox richiede il controllo dei livelli di ossigeno40 e un'elevata risoluzione strumentale1. Il flusso di O2 specifico del volume di rox può essere basso quanto il limite di rilevamento. Le riossigenazioni non sono necessarie quando in un esperimento si utilizza una bassa conta cellulare o quantità generalmente basse di campioni. Se necessario, tuttavia, si consiglia di eseguire riossigenazioni in stati respiratori con basso flusso di O2 per evitare un rapido calo della concentrazione di O2 durante il periodo necessario per la stabilizzazione del flusso di O2. La stabilizzazione del flusso di O2 dopo la riossigenazione richiede più tempo nella camera da 0,5 mL.

Come contributo al controllo di qualità, occorre prestare particolare attenzione alla diluizione del campione in sospensione durante la sostituzione parziale del volume. Dopo la rimozione del tappo completamente inserito, il volume totale V' del mezzo di respirazione nella camera è dato dal volume sperimentale V e dal volume capillare del tappo Vstc (Tabella 2). Pertanto, il volume madre V J.i viene diluito nel volume effettivo V', che è maggiore di V, risultando in un fattore di diluizione V/V' di 0,5/0,54 = 0,926 e 2,0/2,07 = 0,966 rispettivamente nelle camere da 0,5 mL e 2,0 mL (Figura 2). Negli esperimenti con le piastrine, è stato utilizzato un prototipo di tappo per la V della camera con un volume morto capillare di 0,05 mL, corrispondente a un fattore di diluizione di 0,909.

Nella camera da 0,5 mL sono necessarie quantità quasi quattro volte inferiori di cellule viventi, cellule permeabilizzate e mitocondri isolati nella camera da 0,5 mL rispetto alla camera da 2,0 mL a concentrazioni di campione identiche (quantità per volume), producendo risultati quantitativamente comparabili del consumo respiratorio di O2 normalizzato per la conta cellulare o la massa proteica. Ciò indica che la V della Camera è uno strumento prezioso per gli studi in cui la quantità di campioni disponibili è limitata. D'altra parte, l'applicazione di una quantità identica di campione nella camera sV aumenta il flusso di O2 volume-specifico e quindi riduce l'incertezza delle misurazioni quando le attività respiratorie sono basse.

Il regime di ossigeno nel presente studio è stato limitato all'intervallo di saturazione dell'aria di O2 a 30 μM. L'applicabilità a livelli di ossigeno oltre questo intervallo richiede un'ulteriore valutazione per indagare la funzione mitocondriale a livello di normossia tissutale o ipossia43 e tessuti permeabilizzati a iperossia9. Diverse configurazioni multisensore dei moduli NADH e Q di Oroboros; Elettrodi pH, NO e TPP+ 10,44 - non possono essere alloggiati nella camera sV e richiedono la camera da 2,0 mL.

Dichiarazioni

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EL è un dipendente di Oroboros Instruments. EG è il fondatore e CEO di Oroboros Instruments.

LFGS è stato impiegato da Oroboros Instruments durante il progetto. EÅF ed EE sono dipendenti di Abliva AB, Lund, Svezia, che detiene un accordo commerciale con Oroboros Instruments.

LR dichiara di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Manuela Passrugger per aver raccolto i dati sui mitocondri isolati, Patrizia Guerth per il supporto tecnico nel test della velocità di rotazione dell'agitatore e Mateus Grings per l'analisi della costante di tempo dai test dell'agitatore. Ringraziamo il nostro partner, WGT Elektronik GmbH & Co KG, Kolsass, Austria, per le informazioni sui dati tecnici delle camere di vetro, dei tappi e sull'intensità del campo magnetico. Ringraziamo Luiza HD Cardoso, Alejandra Romero-Martinez, Ondrej Sobotka, Alba Timon-Gomez e Jaime Willis per i loro commenti. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 859770, progetto NextGen-O2k. Contributo all'azione COST CA15203 MitoEAGLE con il sostegno finanziario delle missioni scientifiche a breve termine (LFGS, LR).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anaconda3Anaconda Software Distributionhttps://www.anaconda.com/software
ADPMerck, Germania117105
Antibiotici-antimicotici 100xBiosera, FranciaXC-A4110ATTENZIONE H317 Può causare una reazione allergica cutanea
Antimicina ASigma-Aldrich, USAA8674ATTENZIONE H300  Fatale se ingerito, H400 pericolo acquatico a breve termine (acuto) 
AscorbatoSigma-Aldrich, Stati UnitiA7631
ATPSigma-Aldrich, Stati Uniti A 2383
BSA senza acidi grassiSigma-Aldrich, USAA 6003albumina sierica bovina
CaCO3Sigma-Aldrich, USAC 4830
CCCPSigma-Aldrich, USAC2759cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone ATTENZIONE H301 + H311 + H331 Tossico se ingerito, a contatto con la pelle o se inalato
Countess Contatore cellulare automatizzato Thermo Fisher Scientific, Stati UnitiAMQAX100
Citocromo cSigma-Aldrich, Stati UnitiC7752
DatLab Oroboros Instruments, AustriaVersione 7.4Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati
DatLab Oroboros Instruments, AustriaVersione 8.1Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati
DC Protein AssayBio-Rad, USA5000112Kit per il dosaggio delle proteine; ATTENZIONE H314 Provoca gravi ustioni cutanee e lesioni agli occhi
DigitoninSigma-Aldrich, USAD5628ATTENZIONE H301 Tossico se ingerito
DitiotreitoloSigma-Aldrich, USAD 0632ATTENZIONE H318 Provoca gravi danni agli occhi
DMEMPan Biotech, GermaniaP04-05551Dulbecco' s Eagle modificato' s medium
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650dimetilsolfossido
DPBSLonza Bioscience, SvizzeraLONBE17-512FDulbecco' senza calcio s soluzione salina tamponata con fosfato
EGTASigma-Aldrich, USAE 4378
FBSThermo Fisher Scientific, USAA5256701siero fetale bovino
GlucosioSigma-Aldrich, USA&nbsp; G7528
GlutammatoSigma-Aldrich, USAG1626
GlicerofosfatoSanta Cruz Biotechnologysc-215789
Heraeus Multifuge 3s LargeThermo Fisher Scientific, USACentrifuga HM3S
Hettich Rotina 380R Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Germania1701centrifuga
ImidazoleHoneywell Fluka, Austria56750ATTENZIONE H302 Nocivo se ingerito, H314 Provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi, H360D Può danneggiare il nascituro
jamovi Il progetto jamoviVersione 2.3.13software
K+-MESSigma-Aldrich, USAM 8250
Leucosep tubo Greiner Bio-One GmbH, AustriaZ642843-300EAprovetta da centrifuga con barriera in polietilene
MalatoSigma-Aldrich, USAM1000ATTENZIONE H319 Provoca grave irritazione agli occhi.
MannitoloSigma-Aldrich, Stati UnitiM 4125
MgCl2 Scharlau, SpagnaMA 0036
MiR05-KitOroboros Instruments, Austria60101-01Mezzo di respirazione mitocondriale
Miscelatore Swelab Instruments, SveziaTavolo a dondolo440S
Mr. Frosty Freezing Container ThermoFisher Scientific, USA5100-0001Freezing Container
OroborosOroboros Instruments, Austriail NextGen-O2k e l'O2k sono indicati collettivamente con il termine " Di Oroboros
Camera Oroboros cVOroboros Instruments, Austria23100-01camera a volume classico
Camera Oroboros sVOroboros Instruments, Austria33100-01camera a volume ridotto
Oroboros TIP2k-ModuleOroboros Instruments, Austria11100-03Micropompa per titolazione-iniezione
O2-Zero PowderOroboros Instruments, AustriaCodice 26600-02  Na-ditionito ATTENZIONE H251 Autoriscaldante: può prendere fuoco, H302 Nocivo se ingerito, H319 Provoca grave irritazione oculare
ottanoylcarnitinaBiotrend - APExBIO Technology, GermaniaB6371
OligomicinaSigma-Aldrich, USAO4876
FosfocreatinaSigma-Aldrich, USAP 7936
PiruvatoSigma-Aldrich, USAP2256ATTENZIONE H317 Può causare una reazione allergica cutanea
RotenoneSigma-Aldrich, USAR8875ATTENZIONE H300 Fatale se ingerito
Linee cellulari di fibroblasti cutanei   ATCC, USA
Sodio azideSigma-Aldrich, USAS2002ATTENZIONE H300 + H310 + H330 Fatale se ingerito, a contatto con la pelle o se inalato
Subtilisin ASigma-Aldrich, USAP 5380ATTENZIONE H318 - Provoca gravi lesioni oculari, H334 - Può causare sintomi di allergia o asma o difficoltà respiratorie se inalato
SuccinatoSigma-Aldrich, USAS2378
SaccarosioSigma-Aldrich, USAS 7903
Contatore di cellule del sangue Swelab AlfaBoule Diagnostics AB, Svezia1420041
Taurina Sigma-Aldrich, USAT 0625
Tecan Infinite TM F200Tecan, Svizzeraspettrofotometro
TMPDSigma-Aldrich, USAT3134N,N,N',N'-Tetrametil-p-fenilendiammina dicloridrato ATTENZIONE H315 Provoca irritazione cutanea, H319 Provoca grave irritazione oculare
TripsinaSigma-Aldrich, USAT4799ATTENZIONE H334 Può causare sintomi di allergia o asma o difficoltà respiratorie se inalato
VacuetteGreiner Bio-One GmbH, Austria15452520

Riferimenti

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