La configurazione proposta consente la ventilazione meccanica controllata e la risonanza magnetica del movimento del torace 3D nei topi e nei ratti. Abbiamo utilizzato questa configurazione per studiare la fisiopatologia alla base della disfunzione dei muscoli respiratori indotta dalla ventilazione meccanica.
Articolo metodologico
Risonanza magnetica cine 3D del movimento respiratorio in topi e ratti ventilati meccanicamente
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La fisiopatologia della disfunzione del diaframma nei pazienti ventilati meccanicamente deve ancora essere completamente compresa e sono necessari modelli animali adeguati per ospitare ulteriori ricerche. Le impostazioni della ventilazione meccanica, come il livello di pressione positiva di fine espirazione (PEEP), svolgono un ruolo cruciale. L'obiettivo era quello di sviluppare un metodo per l'imaging del movimento toracico 3D durante la ventilazione meccanica di topi e ratti a diverse impostazioni di pressione respiratoria. I ratti (Wistar) e i topi (C57BL/6) sono stati anestetizzati con un mix di ketamina, atropina e dexmedetomidina. L'anestesia è stata mantenuta mediante infusione continua attraverso un catetere peritoneale. Successivamente, è stata eseguita una tracheostomia per consentire la ventilazione meccanica degli animali. Gli animali sono stati inseriti in un sistema RM 7T mentre venivano ventilati con un ventilatore compatibile con MR. L'imaging cine 3D del torace è stato condotto utilizzando una sequenza di eco gradiente 3D con riempimento dello spazio k pseudo-spirale. Un segnale del navigatore, generato dal gradiente del riavvolgitore di selezione della fetta, è stato registrato ad ogni TR. Il binning retrospettivo e la ricostruzione dei dati in 12 intervalli di tempo respiratori sono stati eseguiti utilizzando un software sviluppato internamente. Abbiamo visualizzato con successo il movimento toracico in 3D in entrambe le specie durante la ventilazione meccanica, consentendo lo studio dei cambiamenti nella geometria del torace durante il ciclo respiratorio a diversi livelli di PEEP. Abbiamo scoperto che il binning retrospettivo delle strutture respiratorie era altamente facilitato dalla frequenza respiratoria fissa. Il protocollo qui presentato può essere utilizzato per studiare la geometria cardiaca e toracica e il movimento in topi e ratti ventilati meccanicamente.
Introduzione
La ventilazione meccanica è la pietra angolare del trattamento dell'insufficienza respiratoria acuta nell'unità di terapia intensiva. Sfortunatamente, può anche causare lesioni. Il danno polmonare indotto dal ventilatore, il danno cerebrale associato al ventilatore e la disfunzione del diaframma indotta dal ventilatore sono esempi di complicanze iatrogene associate alla ventilazione meccanica acuta 1,2,3. La fisiopatologia alla base di questi meccanismi di lesione rimane poco conosciuta. Il lavoro sperimentale negli animali ha identificato importanti meccanismi che sono alla base delle complicanze della ventilazione meccanica, consentendo la traduzione nella pratica clinica attraverso l'applicazione di nuove strategie di ventilazione4. Un esempio recente è la ricerca sull'impatto delle dissincronie del ventilatore sulla funzione del diaframma nei modelli di ARDS suina5. Tale ricerca su modelli animali ventilati meccanicamente è vitale per chiarire i meccanismi delle lesioni, anche con l'attuale tendenza ad allontanarsi dalla sperimentazione animale. Gli studi sugli effetti della ventilazione meccanica richiedono un sistema cardiopolmonare intatto e la capacità di simulare la fisiopatologia comunemente osservata in terapia intensiva4. I modelli animali di grandi dimensioni vengono utilizzati spesso perché imitano la fisiologia umana più da vicino rispetto ai roditori e possono essere ventilati con macchine utilizzate nell'unità di terapia intensiva4. I principali svantaggi sono i grandi costi associati all'utilizzo di animali di grandi dimensioni e la mancanza di modelli animali di grandi dimensioni geneticamente modificati per studiare i meccanismi molecolari della malattia 6,7. Pertanto, gli esperimenti sui roditori ventilati meccanicamente sono inevitabili fino a quando non sono disponibili alternative, come sofisticate colture di tessuti o modelli organ-on-a-chip.
Vari interventi che hanno migliorato i risultati negli animali non si sono tradotti nell'uomo 4,6, sottolineando l'importanza di comprendere in che modo i modelli animali di ventilazione meccanica comunemente usati differiscono dagli esseri umani. Gli effetti delle impostazioni del ventilatore sul sistema respiratorio sono determinati da una pletora di fattori che possono essere specie-specifici, come l'elastanza tissutale, il tono muscolare e la variazione della risposta agli anestetici comunemente usati 8,9,10,11. Queste differenze possono portare a effetti contrastanti sul movimento e sulla geometria del torace e dei polmoni che possono spiegare la disparità tra esseri umani e animali. Studiare l'effetto delle impostazioni di ventilazione sulla geometria e sul movimento del sistema cardiopolmonare può chiarire le differenze tra le specie e può aiutare a tradurre i concetti fisiopatologici derivati dagli studi sugli animali al contesto clinico. Il progresso tecnico della risonanza magnetica cardiovascolare risolta in movimento ha consentito l'imaging del cuore pulsante in modelli di roditori, fornendo informazioni su forma, funzione e fisiopatologia in modelli di roditori di malattie cardiovascolari12,13. Questi metodi sono sottoutilizzati per l'imaging del torace e del movimento durante il ciclo respiratorio negli animali ventilati meccanicamente.
Qui, presentiamo un metodo per studiare la geometria e i movimenti del torace nei roditori ventilati meccanicamente utilizzando la risonanza magnetica cine 3D. Ciò consente di studiare gli effetti acuti di numerose impostazioni del ventilatore o di altri interventi sulla geometria e sul movimento del torace nei roditori ventilati meccanicamente. Abbiamo applicato una nuova acquisizione di risonanza magnetica cine 3D pseudo-spirale, respiratoria-dipendente per piccoli animali ventilati13,14. In questo studio iniziale, abbiamo studiato gli effetti della pressione positiva di fine espirazione (PEEP), ma questo metodo può essere utilizzato anche per studiare l'effetto di altri interventi o impostazioni respiratorie, come il rapporto I: E, il volume corrente e la frequenza respiratoria. Questo metodo aprirà una serie di possibilità per l'imaging preclinico di modelli di roditori che richiedono la ventilazione meccanica nel campo della ricerca in terapia intensiva e oltre.
Protocollo
Tutte le procedure descritte sono state eseguite secondo la direttiva CE 86/609 dell'Unione Europea. Gli esperimenti sono stati approvati dall'Animal Ethics Board di Amsterdam UMC, sede VUmc e AMC. Topi C57BL/N e ratti Wistar sono stati ottenuti dai laboratori Charles River. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi e femmine di età compresa tra 3 e 6 mesi con un peso di 25-32 g e ratti maschi e femmine di età compresa tra 3 e 6 mesi con un peso compreso tra 200 e 400 g. Cibo e acqua sono stati forniti ad libitum. Tutti gli animali sono stati acclimatati per almeno 1 settimana prima dell'inizio degli esperimenti.
1. Preparazione del setup
- Preparare i farmaci per l'anestesia seguendo i dosaggi indicati al punto 2.
- Calibrare il ventilatore meccanico scorrendo il menu del ventilatore e facendo clic su Setup > More Ventilator > Calib&Tests. Eseguire tutti e quattro i test e le calibrazioni elencati: Test di tenuta, Spurgo dei tubi, Misurazione dello spazio morto e Spurgo dei tubi.
- Posizionare il ventilatore meccanico compatibile con la risonanza magnetica nella sala RM e tirare i cavi collegati al ventilatore compatibile con la risonanza magnetica attraverso il foro della macchina RM. Si può utilizzare un polmone di prova (ad esempio, un piccolo palloncino) per controllare la ventilazione proveniente dal ventilatore compatibile con la risonanza magnetica.
- Collegare il ventilatore meccanico compatibile con la risonanza magnetica al compressore e a una fonte di flusso di ossigeno.
- Preparare una colonna PEEP riempiendo una colonna di misurazione da 10 ml con acqua e segnando la profondità dell'acqua in centimetri. Posizionare il tubo espiratorio del ventilatore compatibile con la risonanza magnetica nella colonna PEEP. Una panoramica della configurazione è mostrata nella Figura 1.
- Fissare un cuscino respiratorio alla culla RM nella posizione in cui si troverà il torace dell'animale.
2. Anestesia e inizio della ventilazione meccanica
- Iniziare la sedazione dell'animale (topo o ratto) mettendolo in una camera a gas riempita con isoflurano al 4% in O2 al 100%.
- Pesare l'animale per determinare la dose di anestesia. Iniettare nel sito chirurgico (area laringea) 3 mg/kg di bupivacaina e applicare un unguento oculare in entrambi gli occhi.
- Posiziona l'animale su un termoforo mentre respiri spontaneamente il 2%-4% di isoflurano in ossigeno al 100% attraverso un cono nasale. Garantire il monitoraggio della frequenza cardiaca, della saturazione di ossigeno e della temperatura posizionando un pulsossimetro su una delle zampe dell'animale e inserendo la sonda del termometro rettale.
- Verificare l'assenza di riflessi prima dell'incisione. Sollevare la pelle che copre la laringe e la trachea con una pinza chirurgica e praticare un'incisione usando le forbici piegate.
- Sezionare senza mezzi termini le ghiandole salivari e la muscolatura sottostante fino a quando la trachea non è visibile.
- Usando una pinza piegata e affilata, sezionare il lato dorsale della trachea e posizionare la pinza sotto la trachea per tirare una sutura di seta intrecciata non assorbibile (misura 6/0) attorno alla trachea.
- Afferra la trachea da un anello di cartilagine e apri la trachea immediatamente sotto l'anello usando le forbici a molla.
- Incannulare la trachea con un Abbocath da 20 G (topo) o 14 G (ratto), tagliato a circa 1-1,5 cm di lunghezza. Legare la sutura attorno alla trachea cannulata per garantire una chiusura ermetica.
- Avviare la ventilazione dell'animale con un volume corrente di 7 mL/kg, frequenza di 150 BPM per i topi e 80 BPM per i ratti, 2 cmH2O PEEP con isoflurano al 3% in ossigeno al 100%.
- Eseguire un'iniezione intraperitoneale della dose di induzione dell'anestesia per iniezione (topo: ketamina 126 mg/kg, dexmedetomidina 0,1 mg/kg, atropina 0,5 mg/kg; ratto: ketamina 90 mg/kg, dexmedetomidina 0,25 mg/kg, atropina 0,05 mg/kg) e dopo 5 minuti, diminuire gradualmente il flusso di isoflurano (dal 3% allo 0% in 10 minuti) per consentire una transizione graduale dall'anestesia gassosa a quella per iniezione.
- Posizionare 24G Abbocath per via intraperitoneale e collegarlo al perfusore con i seguenti tassi di topo: ketamina 36 mg/kg/h, dexmedetomidina 0,02 mg/kg/h, atropina 0,075 mg/kg/h; ratto: ketamina 30 mg/kg/h, dexmedetomidina 0,015 mg/kg/h, atropina 0,075 mg/kg/h. Iniziare l'infusione.
NOTA: Abbiamo eseguito una tracheostomia per ventilare gli animali invece dell'intubazione orale perché questo ci ha permesso di posizionare una sutura intorno alla trachea. Ciò è stato necessario per evitare perdite d'aria, che è fondamentale per mantenere una PEEP sufficiente.
3. Risonanza magnetica in ventilazione meccanica
- Posizionare l'animale nell'apposita culla RM in posizione supina e posizionare sopra di essa la bobina MR appropriata per topi o ratti tenendo d'occhio il tubo tracheotomico.
- Arrestare e scollegare il ventilatore meccanico utilizzato in 1.2 e la pompa per anestesia e trasportare l'animale nella sala RM. Ricollegare l'animale al ventilatore compatibile con la risonanza magnetica e iniziare a ventilare con un volume corrente di 10 ml/kg e una frequenza di 150 BPM per i topi e 80 BPM per i ratti. Il volume corrente è maggiore rispetto al ventilatore utilizzato in 1.2 per reclutare il tessuto polmonare che potrebbe essere collassato durante il trasporto.
- Ricollegare la pompa per anestesia alle velocità sopra indicate per mantenere la profondità dell'anestesia. A seconda del sistema RM, posizionare le linee di anestesia all'interno o all'esterno del foro RM.
- Posizionare il sensore del misuratore di saturazione e frequenza cardiaca sull'arto posteriore dell'animale e inserire la sonda del termometro rettale. Collegare il sistema di monitoraggio respiratorio al cuscino respiratorio. Controllare tutti i segnali e assicurarsi che la frequenza cardiaca, la saturazione di ossigeno e la temperatura rientrino nell'intervallo fisiologico.
NOTA: Il monitoraggio respiratorio dovrebbe indicare la frequenza respiratoria impostata sul ventilatore compatibile con la risonanza magnetica e viene utilizzato solo per rilevare lo sforzo respiratorio dell'animale. In caso di sforzo respiratorio da parte dell'animale, la curva respiratoria mostra ulteriori picchi. Ciò richiede la somministrazione di una dose aggiuntiva di anestesia (1/3 del dosaggio iniziale di induzione). - Posizionare l'animale nello scanner RM con la bobina centrata sul torace e collegare i cavi a radiofrequenza alla bobina. C'è una bobina e una culla separate per adattarsi alla differenza di dimensioni tra topi e ratti (la bobina e la culla del topo hanno un diametro maggiore rispetto alla bobina del topo). Immergere il tubo espiratorio di 6 cm nella colonna d'acqua, somministrando 6 cmH2O PEEP.
- Titolare il volume corrente a 7-9 mL/kg a seconda della saturazione di ossigeno (scegliere il volume corrente più basso possibile con una saturazione del 100%).
4. Acquisizione scansione
NOTA: La Tabella 1 fornisce una panoramica delle impostazioni di scansione.
- Utilizzare metodi specificati dal fornitore per eseguire la calibrazione e lo spessoramento RF.
- Acquisire uno SCOUT con cinque immagini in orientamento coronale e assiale e assicurarsi che l'intero torace sia nel campo visivo (FOV). Uno SCOUT è una scansione veloce utilizzata per pianificare gli altri piani di imaging e di solito copre un campo visivo più ampio rispetto alle altre immagini. Se necessario, regolare nuovamente la posizione dell'animale nella culla e rifare lo SCOUT.
- Pianificare le scansioni 2D (vedere la Tabella 1 e la Figura 2) sulle immagini SCOUT. Assicurarsi che il piano coronale e sagittale coprano l'intero torace.
NOTA: Il piano sagittale è posizionato sulla parte superiore dell'emidiaframma destro per limitare la porzione del cuore all'interno del FOV. Acquistando lo SCOUT a 6 cmH2O PEEP, ci assicuriamo che il diaframma venga ripreso nella posizione più caudale. - Acquisisci le scansioni 2D a 6 cmH2O PEEP e ricostruisci immediatamente le immagini per verificare il posizionamento dell'animale e garantire la qualità dell'immagine (segui il passaggio 6). Se necessario, regolare nuovamente il posizionamento del FOV o dell'animale e ripetere le scansioni.
- Pianificare la scansione 3D (Figura 2) posizionando il FOV attorno all'intero torace e coprire le scansioni 2D. Assicurati che circa il 20% del FOV nella direzione della fetta sia all'esterno dell'animale per evitare artefatti di ripiegamento.
NOTA: Le scansioni 2D vengono aggiunte al protocollo perché il tempo di acquisizione è più breve rispetto alle scansioni 3D, rendendole adatte per testare rapidamente l'effetto degli interventi. - Acquisire la scansione 3D con lo schema di campionamento dello spazio k pseudo-spirale richiesto (Figura 3), consentendo un robusto binning retrospettivo dei dati e la visualizzazione del movimento respiratorio14.
- Ripetere le scansioni 2D e 3D a 3 cm H2O PEEP. Il tempo totale di scansione è stato di 2,5 minuti per scansione 2D e 15 minuti per scansione 3D.
NOTA: In questo caso, abbiamo adattato PEEP durante gli esperimenti. Abbiamo selezionato 0, 3 e 6 cmH2O PEEP perché sappiamo da esperimenti (ricerche precedenti e studi in corso) con animali ventilati a lungo termine che questi livelli di PEEP provocano cambiamenti rilevanti nel diaframma e nella geometria del torace15. Inoltre, abbiamo optato per l'utilizzo di zero, un livello medio e alto di PEEP in questo lavoro per mostrare l'effetto della PEEP. A seconda della domanda di ricerca, sono possibili altri interventi. Ad esempio, è possibile studiare gli effetti dei miorilassanti o di altri farmaci sulla geometria del torace. Il protocollo ci permette di studiare gli effetti all'interno del soggetto dell'intervento.
Figura 1: Panoramica della configurazione. (A) Una panoramica schematica della configurazione, (B) la configurazione della bobina per un topo, (C) la configurazione della bobina per un ratto, con un foro più grande della bobina del topo, (D) la configurazione della bobina rispetto allo scanner RM, (E) la colonna PEEP con tubo espiratorio posizionato a 3 cmH2O PEEP e (F) un primo piano della valvola che regola la ventilazione, indicando quali provette devono essere posizionate nella colonna PEEP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Pianificazione delle immagini RM per i cine 2D e 3D. Figura che mostra come è stato impostato il campo visivo per le scansioni 2D con orientamento sagittale e coronale (riga superiore e centrale) e le scansioni 3D con orientamento sagittale (riga inferiore). La colonna di sinistra rappresenta una delle fette dello SCOUT in orientamento assiale a livello del cuore, la colonna centrale mostra una fetta dello SCOUT in orientamento coronale e la colonna di destra mostra una fetta in orientamento assiale a livello del fegato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Pattern di campionamento pseudo-spirale RM. Il modello di campionamento è in direzione di codifica di fase ky/kz con dimensioni della matrice 80 x 80 ottimizzate per il binning retrospettivo del movimento respiratorio. Le spirali vengono create iniziando dal centro dello spazio k e poi girando verso l'esterno e di nuovo verso l'interno, ripetendo così ogni spirale. L'intero modello di campionamento viene eseguito con 25 ripetizioni per generare dati sufficienti all'interno di ciascun frame respiratorio. Ogni spirale ha un colore diverso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
5. Fine dell'esperimento
- Dopo aver terminato tutte le scansioni, rimuovere l'animale dallo scanner. Gli animali non possono sopravvivere all'esperimento a causa della tracheostomia. Eutanasia di topi con lussazione cervicale e ratti per dissanguamento.
- Salva tutti i file MR grezzi e ricostruiti.
| Tipo di scansione | SCOUT eco sfumato | Eco sfumato 2D | Eco sfumato 3D |
| Orientamento | Coronale e sagittale | Coronale e sagittale | Sagittale |
| Schema di campionamento k-Space | Cartesiano | Cartesiano | Pseudo-spirale |
| Numero di fette | 10 | 1 | 80 |
| Spessore fetta (mm) | 1 (Mouse) | 1 (Mouse) | 0.38 (Mouse) |
| 1 (Ratto) | 1 (Ratto) | 0.81 (ratto) | |
| Distanza tra le fette (mm) | 2 (Mouse) | 0 (Mouse) | 0 (Mouse) |
| 5 (Ratto) | 0 (Ratto) | 0 (Ratto) | |
| Campionamento delle fette* | 0.8 | 0.8 | 0.8 |
| FOV (lettura x fase x fetta; mm) | 35 x 35 (Mouse) | 30 x 23 (Mouse) | 30 x 23 x 30 (mouse) |
| 80 x 80 (Ratto) | 65 x 49 (Ratto) | 65 x 49 x 65 (ratto) | |
| Dimensione della matrice (frequenza x fase) | 256 x 192 | 256 x 192 | 211 x 80 x 80 |
| TR / TE (ms) | 45328 | 45330 | 45328 |
| Angolo di ribaltamento (°) | 15 | 15 | 10 |
| Numero di ripetizioni | 80 | 70 | 25 |
| Attivazione respiratoria | No | Sì, retrospettivamente | Sì, retrospettivamente |
| Tempo di imaging (min:s) | 2:02 | 2:23 | 16:00 |
| Livelli PEEP (cmH2O) | 6 | 6, 3, 0 | 6, 3, 0 |
Tabella 1: Parametri di acquisizione per tutte le scansioni. * Il campionamento della fetta indica quale percentuale dell'impulso di selezione della fetta viene utilizzata per l'imaging
6. Ricostruzione dell'immagine
- Per eseguire la ricostruzione dell'immagine, utilizzare il software sviluppato internamente disponibile su GitHub16. Eseguire questi passaggi per tutte le scansioni con un navigatore che richiede un gating respiratorio retrospettivo.
NOTA: È stato precedentemente descritto da Daal et al., ma quel lavoro si è concentrato sull'imaging cardiaco13. Qui, descriviamo un metodo per ricostruire le immagini respiratorie dell'intero torace. - Caricare il file di dati non elaborati facendo clic su Carica MRD. Questo visualizza il segnale grezzo del navigatore e il suo spettro nel pannello in alto a sinistra. Se il segnale respiratorio non è chiaramente visibile, adattare il navigatore principale nella scheda Impostazioni.
- In Filtri cardiaci/respiratori, inserire la frequenza respiratoria impostata sul ventilatore meccanico compatibile con la risonanza magnetica e impostare l'ampiezza su 15. Le impostazioni nelle altre caselle non sono rilevanti per questo tipo di ricostruzione. Premere Filtro per applicare le impostazioni, il che si traduce in un segnale del navigatore gated, come mostrato nella Figura 4. Assicurarsi che il segnale rosso nella casella Navigatore respirazione e Frequenza respiratoria seguano il segnale blu del navigatore grezzo.
- In Cine, selezionare il filmato respiratorio e impostare il numero di fotogrammi su 12 e il numero di dinamiche su 1. Nella scheda Geometria, attiva il PCA (livello 8) e il filtro Ringing. Premere Ordina k-spazio per applicare le impostazioni.
- Nei parametri CS reco, applicare le seguenti impostazioni: WVxyz 0.0010, TVxyz 0.0000, LLRxyz 0.0050, TVcine 0.015, TVdyn 0.000. Premi Reco Movies per avviare la ricostruzione.
- Ispeziona la ricostruzione nel pannello in basso a destra scorrendo i fotogrammi e (se applicabile) le sezioni. Esporta le immagini ricostruite premendo Esporta DCM e/o Esporta GIF.
7. Analisi delle immagini
NOTA: A seconda della domanda di ricerca, è possibile calcolare diversi parametri di risultato dalle immagini cine. Qui, ci concentriamo sui parametri che quantificano la geometria del torace, il volume polmonare e l'escursione.
- Aprire un apposito visualizzatore DICOM, ad esempio il software citato nella Tabella dei materiali e caricare un cine 2D cliccando su File > Apri e selezionando i file cine 2D. Identificare il telaio con la posizione del diaframma più alta (telaio di fine espirazione). Seleziona il fotogramma e aprilo nel visualizzatore DICOM.
- Misurare manualmente le dimensioni del polmone antero-posteriore e cranio-caudale (Figura 5) nel cine 2D sagittale e la dimensione sinistra-destra nel cine 2D orientato coronale utilizzando il pulsante di misurazione in microdicom. Ripetere queste misurazioni per tutti i livelli di PEEP o altri interventi. Queste misurazioni possono essere eseguite anche in un fotogramma del cine 3D, a seconda della scelta delle scansioni.
- Caricare il cine 3D nel programma di analisi delle immagini 3D e posizionare l'immagine nell'orientamento corretto facendo clic su Strumenti > Riorienta immagine. Compila SPL come codice RAI. Seleziona il fotogramma di fine espirazione scorrendo le dinamiche in Strumenti > Inspector Layer e quindi aumenta il numero di componenti.
- Inizializzare la segmentazione contornando manualmente la parte centrale dei polmoni in due sezioni per ogni orientamento (Figura 6). Usa la modalità pennello e regola le dimensioni del pennello se necessario.
- Avviare la segmentazione 3D premendo Contorno attivo nella barra degli strumenti principale. Assicurati che la casella rossa (ROI) copra l'intero torace. Attiva Inizializza con segmentazione corrente e premi Segmento 3D.
- Selezionare Soglia come modalità di presegmentazione e utilizzare solo una soglia superiore selezionando la modalità di soglia più a destra. Premere Avanti. Quindi salta il passaggio di aggiunta delle bolle premendo nuovamente Avanti. Poiché la segmentazione è già stata inizializzata al passaggio 7.5, non è necessario aggiungere alcuna bolla.
- Avviare il contouring attivo premendo il pulsante Riproduci e metterlo in pausa non appena la segmentazione raggiunge i bordi del polmone. Scorri le immagini per controllare la segmentazione. Premere Fine per finalizzare la segmentazione.
- Premi Aggiorna per visualizzare la segmentazione 3D nel pannello in basso a sinistra e ispezionarla e ruotarla.
- Salva la segmentazione come NiFTI facendo clic su Segmentazione > Salva immagine di segmentazione e file mesh STL facendo clic su Segmentazione > Esporta mesh di segmentazione.
- Annotare il volume polmonare che può essere trovato in Segmentazione, Volume e Statistiche.
- Registrare le immagini degli altri stati respiratori nella dinamica di fine espirazione utilizzando lo script fornito nel File di codifica supplementare 1. Applicare le trasformazioni calcolate alla segmentazione, ottenendo una segmentazione per ogni dinamica. Utilizza queste segmentazioni per calcolare i parametri dei risultati, come le escursioni in tutte le direzioni.
Risultati
Utilizzando il protocollo descritto in questo studio, abbiamo scansionato con successo un gruppo di 8 topi sani C57BL/6 WT e 8 ratti Wistar WT utilizzando uno scanner MRI da 7 Tesla. Siamo stati in grado di ventilare meccanicamente gli animali a diversi livelli di PEEP e di monitorare i parametri fisiologici di base durante la scansione (Figura 7).
Nella Figura 5, viene mostrato un esempio di tre scansioni 2D nel frame di fine espirazione di un topo e di un ratto con orientamento sagittale. Come si può notare, la PEEP introduce uno spostamento caudale del diaframma in entrambi gli animali, ma nei topi questo è accompagnato anche da un allargamento del torace, indicato da un aumento del diametro antero-posteriore.
Queste scansioni di alta qualità mostrano che utilizzando questa tecnica, possiamo misurare le dimensioni delle diverse parti del torace e mostrare gli effetti di varie impostazioni ventilatorie sul movimento del torace e del diaframma. Il breve tempo di scansione consente il confronto all'interno dei soggetti dei parametri di esito a cui si è interessati, riducendo il numero richiesto di animali. La tabella 2 mostra i parametri di esito di tutti gli animali.
La Figura 8 mostra le segmentazioni polmonari della dinamica di fine espirazione a tre livelli di PEEP con il corrispondente volume polmonare. Come previsto, l'aumento della PEEP ha comportato un aumento del volume polmonare. I filmati 3D vengono visualizzati anche come filmato nel Video supplementare 1 e nel Video supplementare 2.
Figura 4: Screenshot del software utilizzato per ricostruire le immagini con gating retrospettivo dei dati. Il gating dei dati si basa sul segnale del navigatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi di immagini 2D in un ratto e in un topo a tre livelli di PEEP, con le dimensioni del polmone antero-posteriore e cranio-caudale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Screenshot del software utilizzato per segmentare i polmoni nelle cine 3D. Nel pannello in alto a sinistra, viene mostrata una vista assiale del cine 3D con il polmone segmentato in rosso. Nel pannello in alto a destra viene mostrata una vista sagittale con il polmone segmentato in rosso. Nel pannello in basso a sinistra viene mostrato un rendering 3D del polmone segmentato. Nel pannello sinistro-destro, viene mostrata una vista coronale con il polmone segmentato in rosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Parametri vitali degli animali durante gli esperimenti. N = 8 topi (blu), N = 8 ratti (arancione). I dati sono mostrati come medi con SD. Si noti il calo della frequenza cardiaca quando gli animali entrano in un piano chirurgico di anestesia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Segmentazione 3D dei polmoni a tre livelli di PEEP con i volumi polmonari corrispondenti. Segmentazione di un polmone di ratto a PEEP 0 (colonna di sinistra), PEEP 3 (colonna centrale) e PEEP 6 (colonna di destra). Nella riga superiore è mostrato il lato posteriore dei polmoni. Nella riga centrale è mostrato il lato anteriore dei polmoni. I volumi mostrati nella riga inferiore sono misurati all'interno dei polmoni renderizzati in 3D visibili in questa figura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1: Filmato 3D di un mouse. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 2: Cine 3D di un topo. Clicca qui per scaricare questo video.
File di codifica supplementare 1: script per registrare le segmentazioni ad altre acquisizioni. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
Questo studio dimostra che l'imaging RM 3D con gating retrospettivo consente di misurare il movimento del torace in due modelli animali durante la ventilazione meccanica. Queste tecniche hanno il potenziale per essere utilizzate in future ricerche che coinvolgono l'imaging cardiaco e toracico in topi e ratti ventilati meccanicamente. Abbiamo scoperto che, a causa della frequenza di respirazione fissa, il binning retrospettivo era molto robusto.
Una fase fondamentale del protocollo è l'impostazione del corretto posizionamento degli animali all'interno delle bobine MR. Durante la scansione non è possibile riposizionare gli animali. Inoltre, il mantenimento della normotermia è molto importante per garantire che le misurazioni vengano effettuate in condizioni fisiologiche, poiché gli anestetici possono causare ipotermia attraverso la vasodilatazione periferica e gli impulsi a radiofrequenza di questo protocollo di risonanza magnetica possono causare ipertermia17,18. Nella Figura 7, le fluttuazioni della temperatura corporea possono essere osservate durante il breve periodo intorno al trasferimento degli animali allo scanner (intorno al segno di 1 ora) in cui non viene applicato calore da una fonte esterna. Un altro passaggio critico è la titolazione dell'anestesia, soprattutto nei topi. Il piano dell'anestesia in cui i topi non mostrano sforzo respiratorio ma mantengono stabili i parametri vitali è ristretto e richiede un attento monitoraggio del segnale respiratorio e la regolazione della velocità di infusione dell'anestesia. Nei ratti, non abbiamo riscontrato tali problemi all'interno dell'intervallo di sedazione utilizzato. La qualità dell'immagine sarà influenzata negativamente se ci sono sforzi respiratori dell'animale a causa della ricostruzione retrospettiva delle immagini in base alla frequenza respiratoria impostata. È possibile utilizzare un regime anestetico diverso, come l'anestesia per inalazione con isoflurano o anestetici alternativi per iniezione che causano una maggiore soppressione dello sforzo respiratorio. Il ventilatore CWE-MRI-1 per piccoli animali utilizzato in questo protocollo è compatibile con gli anestetici per inalazione19.
Ci sono tre passaggi critici per riprodurre il metodo MRI proposto in questo studio. Innanzitutto, deve essere utilizzata la stessa sequenza di risonanza magnetica di base (cioè 3D FLASH). Tale sequenza è disponibile praticamente su tutti i sistemi di risonanza magnetica. In secondo luogo, la traiettoria dello spazio k menzionata in questo lavoro (pseudo-spirale) può richiedere una patch software in grado di eseguire traiettorie dello spazio k definite dall'utente. Invitiamo i lettori a contattare l'autore corrispondente se desiderano replicare l'acquisizione. C'è esperienza nell'implementazione di questo tipo di acquisizione su sistemi di altri fornitori. Infine, la pipeline di ricostruzione che condividiamo come software open source è indipendente dal fornitore e, pertanto, applicabile a tutti i sistemi preclinici.
Abbiamo scelto l'attivazione retrospettiva e il binning rispetto all'attivazione prospettica per diversi motivi. In primo luogo, il triggering retrospettivo e il binning dei dati nello spazio k offrono la massima flessibilità nel numero di frame CINE respiratori ricostruiti, consentendoci di ottimizzare la risoluzione temporale, la risoluzione spaziale e il rapporto segnale/rumore. Inoltre, l'attivazione prospettica introduce un tempo morto alla fine di ogni ciclo respiratorio mentre lo scanner attende l'innesco successivo, il che può interrompere lo stato stazionario e provocare un ciclo incompleto. Con la ventilazione meccanica, questo tempo morto è minimo ma comunque presente.
Il limite principale di questo protocollo è l'incapacità di misurare le pressioni delle vie aeree o esofagee. Per quanto ne sappiamo, sul mercato non esistono sensori di pressione polmonare o esofagea compatibili con la risonanza magnetica per piccoli animali. Un'altra limitazione è la mancanza di misurazioni continue della pressione sanguigna all'interno della risonanza magnetica. Il protocollo di anestesia si basava su precedenti ricerche istituzionali. L'atropina è stata aggiunta a causa dell'elevata prevalenza di bradicardia e ipotensione osservata in precedenza. Sebbene il monitoraggio continuo della pressione arteriosa non sia stato possibile a causa dei vincoli dell'ambiente RM, l'ipertensione è improbabile, poiché non è stata osservata tachicardia (Figura 7). Il monitoraggio impiegato in questo protocollo consisteva nella frequenza cardiaca, nella saturazione di ossigeno, nella temperatura e in un segnale respiratorio basato sul movimento della parete toracica. Utilizzando queste misurazioni, una panoramica dei parametri vitali degli animali può guidare la somministrazione dell'anestesia, ma avere una lettura della pressione sanguigna potrebbe prevenire il sovradosaggio degli animali che mostrano sforzo respiratorio. Non sono stati pubblicati altri studi di risonanza magnetica riguardanti la fisiologia respiratoria dei roditori ventilati meccanicamente, ma questo metodo può essere impiegato per un'ampia gamma di questioni di ricerca al di fuori della ricerca respiratoria. Il programma di ricostruzione citato nel manoscritto (Retrospettiva) può essere utilizzato anche per ricostruire immagini durante tutto il ciclo cardiaco, consentendo così al ricercatore di acquisire immagini ad alta risoluzione del cuore e dei vasi senza artefatti di movimento. Questo protocollo può essere applicato in ogni progetto che richieda la ventilazione meccanica di ratti o topi durante la scansione. Si può, ad esempio, considerare lo studio della relazione tra le impostazioni di ventilazione meccanica e la funzione cardiaca. Altre opzioni includono l'imaging degli animali con il torace aperto o dopo interventi chirurgici che richiedono ventilazione meccanica.
Dichiarazioni
Ruslan Garipov è un dipendente di MR Solutions Ltd., Guildford, Regno Unito.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da ZonMW Grant 09120011910004 (GS, CO, LH) e NIH grant 5R01HL121500 (CO).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipaggiamento | |||
| Pompa a doppia siringa digitale 11 Plus | Apparato di Harvard (USA) | 229193-2 | Pompa a doppia siringa con funzioni programmabili per laboratori |
| Condizionatore di segnale AccuSens a canale singolo e multicanale | Opsens solutions inc. (Canada) | ACS-P4-N-62SC | Utilizzato con sensore di temperatura in fibra ottica per monitorare la temperatura corporea |
| Sensore di temperatura in fibra ottica | Opsens solutions inc. (Canada) | OTP-M | |
| Culla per mouse | É quipment Vé té rinaire Minerve (Francia) | ||
| Mousestat Jr. | Kent-scientific (Stati Uniti) | MSTAT-JR | Il MouseSTAT Jr. fornisce pulsossimetria accurata sia nei topi che nei ratti. |
| MR Scanner | MR Solutions Lt. (Regno Unito) | Visualizzazione MRS-7024 | |
| Monitoraggio compatibile con la risonanza magnetica e Sistema di cancello per piccoli animali | SA Instruments, Inc. (Stati Uniti) | 1030 | Modulo RT (modulo di interfaccia respiratoria), modulo di controllo/gating ERT, pacco batteria |
| Ventilatore compatibile con MRI-1 | CWE (Stati Uniti) | 12-07000 | Ventilatore meccanico adatto alla ventilazione di piccoli animali in ambienti di risonanza magnetica. Ventila con un principio basato sul volume controllato, flusso x tempo utilizzando valvole pneumatiche. |
| Unità di controllo della temperatura multistazione e PCA ad alta portata | É quipment Vé té rinaire Minerve (Francia) | ||
| Colonna PEEP | Colonna di misura del fluido riutilizzata | ||
| Ventilatore meccanico Physiosuite | Kent-scientific (Stati Uniti) | Ventilatore meccanico adatto alla ventilazione di piccoli animali. Ventila con un principio di controllo del volume e della pressione. | |
| Sensori per zampe per pulsossimetro, compatibili con la risonanza magnetica | Kent-scientific (Stati Uniti) | SPO2-MSE-Risonanza magnetica | Sensore zampa compatibile con risonanza magnetica per Mousestat Jr. |
| Culla per topi | É quipment Vé té rinaire Minerve (Francia) | ||
| Bobina RF, mouse | MR Solutions Lt. (Regno Unito) | Bobina RF da 38 mm per lo studio del corpo del topo | |
| bobina RF, ratto | MR Solutions Lt. (Regno Unito) | 65 millimetri bobina RF di volume di ratto per studi sul corpo di ratto | |
| Strumenti chirurgici | |||
| Abbocath 14G, 20G, 22G, 24G | Abbocat | 14G, 20G, 22G per l'uso come tubo endotracheale, 24G per l'infusione intraperitoneale di anestesia | |
| Ethilon 3-0 Sutura FD-1 con ago | Ethicon (Stati Uniti) | 663H | |
| Pinze #55 | Dumont (Svizzera) | 55 | |
| Forbici Metzenbaum | Strumenti per la scienza (Germania) | 14017-14 | |
| Porta aghi | Strumenti per la scienza (Germania) | 12005-15 | |
| Sutura intrecciata in seta non assorbibile 6/0 | Strumenti per la scienza (Germania) | 18020-60 | |
| Forbici a molla | Strumenti per la scienza (Germania) | 15033-09 | |
| Forbici per tenotomia Stevens | Strumenti per la scienza (Germania) | 14064-11 | |
| Pinze per legatura di sutura | Strumenti per la scienza (Germania) | 18025-10 | |
| Nastro medipore | 3M (Stati Uniti) | ||
| Farmaco | |||
| Atropina 0,25 mg/mL | |||
| Dexmedetomidina 0,5 mg/mL Dexdormitor | Orion pharma (Finlandia) | ||
| Unguento per gli occhi Duratears | Alcon Nederland BV (Paesi Bassi) | ||
| Isoflurano | AST pharma (Francia) | ||
| Ketamina 100 mg/mL Ketexx | Alfasan (Paesi Bassi) | ||
| Vaselina | Unilever (Paesi Bassi) | ||
| Software | |||
| Elastix | Istituto di Scienze dell'Immagine, UMC Utrecht (Paesi Bassi) | ||
| Scatto | Università della Pennsylvania (USA) | ||
| Matlab 2019a | Wolfram Research Inc (Stati Uniti) | ||
| Microdicom | Microdicom (Bulgaria) | ||
| Retrospettiva | Amsterdam UMC (Paesi Bassi) |
Riferimenti
- Bassi, T., Taran, S., Girard, T. D., Robba, C., Goligher, E. C. Ventilator-associated brain injury: A new priority for research in mechanical ventilation. Am J Respir Crit Care Med. 209 (10), 1186-1188 (2024).
- Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-induced lung injury. N Engl J Med. 369 (22), 2126-2136 (2013).
- Levine, S., et al. Rapid disuse atrophy of diaphragm fibers in mechanically ventilated humans. N Engl J Med. 358 (13), 1327-1335 (2008).
- Silva, P. L., Scharffenberg, M., Rocco, P. R. M. Understanding the mechanisms of ventilator-induced lung injury using animal models. Intensive Care Med Exp. 11 (1), 82(2023).
- Damiani, L. F., et al. Impact of reverse triggering dyssynchrony during lung-protective ventilation on diaphragm function: An experimental model. Am J Respir Crit Care Med. 205 (6), 663-673 (2022).
- Guillon, A., et al. Preclinical septic shock research: why we need an animal ICU. Ann Intensive Care. 9 (1), 66(2019).
- Larsson, L. Experimental animal models of muscle wasting in intensive care unit patients. Crit Care Med. 35 (9), S484-S487 (2007).
- Schwarte, L. A., Zuurbier, C. J., Ince, C. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Leith, D. E. Comparative mammalian respiratory mechanics. Am Rev Respir Dis. 128 (2 Pt 2), S77-S82 (1983).
- Vinegar, A., Sinnett, E. E., Leith, D. E. Dynamic mechanisms determine functional residual capacity in mice, Mus musculus. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 46 (5), 867-871 (1979).
- Oh, S. S., Narver, H. L. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc. 4 (2), e995(2024).
- Li, H., et al. Technical aspects of small animal CMR imaging. Front Phys. 8, ARTN 183(2020).
- Daal, M. R. R., et al. Quantification of mouse heart left ventricular function, myocardial strain, and hemodynamic forces by cardiovascular magnetic resonance imaging. J Vis Exp. (171), e62595(2021).
- Gottwald, L. M., et al. Pseudo-spiral sampling and compressed sensing reconstruction provides flexibility of temporal resolution in accelerated aortic 4D flow MRI: A comparison with k-t principal component analysis. NMR Biomed. 33 (4), e4255(2020).
- Sudy, R., et al. Different contributions from lungs and chest wall to respiratory mechanics in mice, rats, and rabbits. J Appl Physiol (1985). 127 (1), 198-204 (2019).
- Strijkers, G. J. Retrospective-v9.7: Self-gated cine MRI reconstruction. , Available from: https://github.com/Moby1971/Retrospective-v9.8 (2023).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (5), 577-583 (2013).
- Tang, M., Yamamoto, T. Progress in Understanding Radiofrequency Heating and Burn Injuries for Safer MR Imaging. Magn Reson Med Sci. 22 (1), 7-25 (2023).
- Munting, L. P., et al. Influence of different isoflurane anesthesia protocols on murine cerebral hemodynamics measured with pseudo-continuous arterial spin labeling. NMR Biomed. 32 (8), e4105(2019).
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