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Articolo metodologico

Derivazione di un organoide cerebrale umano con sviluppo di microglia

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DOI:

10.3791/67491

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17 gennaio 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Cancer Genetics and Comparative Genomics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo per generare un organoide cerebrale umano con microglia residente incorporando cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) nello sviluppo di organoidi.

Abstract

Le colture tridimensionali (3D) di organoidi cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) forniscono un importante strumento alternativo in vitro per lo studio dello sviluppo del cervello umano e della patogenesi delle malattie neurologiche. Tuttavia, la mancanza di incorporazione di microglia negli organoidi cerebrali umani è ancora un grosso ostacolo per i modelli 3D di neuroinfiammazione. Gli approcci attuali includono l'incorporazione di microglia completamente differenziate in organoidi cerebrali maturi o l'induzione della differenziazione microgliale fin dallo stadio iniziale di corpi embrioidi (EB) derivati da iPSC. Il primo approccio manca la fase in cui la differenziazione microgliale interagisce con l'ambiente neurale adiacente, mentre il successivo approccio è tecnicamente impegnativo, con conseguente incoerenza tra gli organoidi finali in termini di quantità e qualità della microglia. Per modellare gli organoidi cerebrali con la microglia per studiare le prime interazioni tra lo sviluppo microgliale e neuronale, le cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) altamente pure differenziate dalle iPSC umane sono state incorporate nelle EB derivate da iPSC per produrre organoidi cerebrali. Utilizzando l'immunocolorazione e l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (sc-RNA-seq), abbiamo confermato che le HPC sono state incorporate negli organoidi 3D, che alla fine si sono sviluppati in organoidi cerebrali con microglia e neuroni. Rispetto agli organoidi cerebrali senza HPC, questo approccio produce una significativa incorporazione microgliale negli organoidi cerebrali. Questo nuovo modello 3D di organoidi, che consiste in proprietà di sviluppo sia microgliale che neurale, può essere utilizzato per studiare le prime interazioni tra lo sviluppo del sistema immunitario innato e del sistema nervoso e potenzialmente come modello per la neuroinfiammazione e i disturbi neuroinfettivi.

Introduzione

Le microglia sono cellule immunitarie residenziali nel cervello, che svolgono un ruolo critico sia nello sviluppo cerebrale che nell'omeostasi 1,2. L'attivazione della microglia provoca la produzione di fattori proinfiammatori, fagocitosi elevata e stress ossidativo reattivo, che rimuove gli agenti patogeni invasori e le cellule compromesse. Tuttavia, l'iperattivazione o l'attivazione prolungata della microglia può, d'altra parte, causare neurodegenerazione come meccanismo di patogenesi in molti disturbi neurologici, tra cui il morbo di Parkinson 3,4. È importante che le microglia siano incluse nei modelli pertinenti per lo studio dei disturbi neurologici umani. Negli ultimi anni, le cellule staminali umane sono state utilizzate per sviluppare organoidi 3D come modelli in vitro in alternativa ai modelli animali e agli studi su soggetti umani5. Idealmente, gli organoidi umani costituiscono più tipi di cellule e strutture tissutali simili ai corrispondenti organi umani, rappresentando meglio la fisiologia e la patogenesi umana rispetto ai modelli animali, ma senza le preoccupazioni etiche coinvolte direttamente negli studi sugli individui umani. Possono rappresentare il futuro della modellizzazione delle malattie umane per lo studio della patogenesi e dello sviluppo di farmaci e per la guida di terapie individualizzate6. Ad esempio, gli organoidi cerebrali umani 3D derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) hanno prevalso nel campo della ricerca neuroscientifica, modellando malattie infettive neurali tra cui ZIKA, SARS-CoV-27 e malattie neurodegenerative tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e il morbo di Alzheimer 8,9. Tuttavia, gli organoidi neurali 3D convenzionali che utilizzano l'inibizione dual-SMAD per indurre la differenziazione neuronale10 producono organoidi cerebrali privi di microglia, poiché derivano da progenitori reclutati dal sangue invece che dal lignaggio neuroectodermico da cui provengono i neuroni 11,12. Senza la presenza di microglia, gli organoidi sono inadeguati per modellare le infezioni del SNC, l'infiammazione e la neurodegenerazione associata.

Per affrontare questo problema critico, sono stati fatti tentativi di incorporare microglia differenziate negli organoidi cerebrali13 o di indurre la differenziazione microgliale all'interno degli organoidi fin dall'inizio utilizzando approcci alternativi invece dell'inibizione dual-SMAD13. Tuttavia, incorporando microglia differenziate negli organoidi cerebrali, le prime interazioni tra lo sviluppo neuronale e microgliale vengono perse. Ciò potrebbe essere importante nello sviluppo del SNC o nella patogenesi di disturbi neuroinfettivi che mirano allo sviluppo del cervello infantile, come nell'infezione da virus ZIKA14. D'altra parte, la differenziazione della microglia innata all'interno di organoidi cerebrali derivati da iPSC senza stadi intermittenti comporta un processo prolungato e ha una maggiore variabilità all'interno dei prodotti finali15. In questo protocollo, abbiamo incorporato le cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) derivate da iPSC nelle iPSC per creare corpi embrioidi (EB), che sono stati ulteriormente differenziati in organoidi 3D che includono sia neuroni che microglia.

Il nostro protocollo fornisce un approccio semplice che può essere adottato per studiare il sistema nervoso centrale umano coinvolgendo le prime interazioni neurone-microglia e la patogenesi delle malattie infettive neurali e della neuroinfiammazione che coinvolge l'attivazione microgliale.

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Protocollo

I campioni di sangue originali di donatori adulti sani sono stati raccolti presso la Banca del sangue di medicina trasfusionale del NIH e sono stati ottenuti moduli di consenso informato firmati in conformità con il NIH Institutional Review Board.

1. Produzione di cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) da iPSC umane

NOTA: Le cellule iPSC umane 510 e 507 sono state utilizzate per produrre i risultati rappresentativi. I metodi di generazione e manutenzione delle iPSC possono essere trovati in una precedente pubblicazione16.

  1. Giorno 0: Rivestire una piastra cellulare a 12 pozzetti aggiungendo 500 μL/pozzetto di soluzione ghiacciata di Matrigel (matrice di membrana basale [BMM]) diluita in terreno DMEM/F12 e incubarla per almeno 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
  2. Rimuovere completamente il surnatante di rivestimento e sostituirlo con 1 mL di terreno E8 Flex per pozzetto.
  3. Controllare la coltura di iPSC in una piastra a 6 pozzetti al microscopio per verificare che le iPSC siano di alta qualità e senza segni di differenziazione. Scegli una colonia di medie dimensioni contrassegnandola con un pennarello sotto il fondo della piastra.
  4. Rimuovere il terreno dalla coltura iPSC e aggiungere 500 μL di tampone di dissociazione iPSC dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,5 mM EDTA, 0,45 g/L di NaCl in DPBS) al pozzetto.
  5. Osservare al microscopio i segni di dissociazione cellulare quando tre o quattro file di cellule dai bordi della colonia iniziano a restringersi, con lo spazio vuoto che appare tra le cellule. Questo di solito richiede 1-3 minuti.
  6. Eliminare completamente la soluzione di EDTA. Spostare la colonia di iPSC contrassegnata pipettando 1 mL di terreno E8 Flex con forza e direttamente su di essa. Assicurarsi che la colonia si stacchi completamente in chiazze cellulari contenenti 20-50 cellule ciascuna dopo 1-3 volte di pipettaggio.
  7. Raccogliere il surnatante contenente cerotti cellulari e aggiungerlo al primo pozzetto dei pozzetti rivestiti nella piastra a 12 pozzetti.
  8. Miscelare il pozzetto pipettandolo una o due volte e trasferire 1 mL di cellule nel secondo pozzetto che contiene 1 mL di terreno.
  9. Ripetere il passaggio 1.8 due volte per ottenere colture di iPSC diluite in serie in un totale di quattro pozzetti.
  10. Incubare la piastra in un incubatore a 37 °C con CO2 al 5%.
  11. Dopo 24 ore, il giorno 1, controllare le colonie al microscopio e contare il numero di colonie passando attraverso tutti i campi in un pozzo continuamente. Scegli un pozzetto che contenga 10-20 colonie di iPSC.
  12. Sostituire il terreno con 1 mL di terreno A del Kit ematopoietico. Rimettere la piastra nell'incubatrice per 48 ore.
  13. Il giorno 3, rimuovere 500 μl di terreno esaurito e aggiungere 500 μl di terreno A fresco.
  14. Il giorno 4, osservare al microscopio e notare una significativa crescita e differenziazione cellulare dalle colonie di iPSC. Sostituire il terreno con 1 ml di terreno B.
  15. Monitorare la differenziazione cellulare al microscopio ed eseguire il cambio semi-terreno con 500 μL di terreno B a giorni alterni. Le cellule HPC-like compaiono nei giorni 6-7.
  16. Il giorno 10, osservare al microscopio singole cellule rotonde luminose con la morfologia delle normali HPC che galleggiano nel terreno o debolmente attaccate al singolo strato inferiore di cellule piatte, con alcuni aggregati di cellule sciolte.
    NOTA: Le HPC differenziate sono pronte per la raccolta per la caratterizzazione o ulteriori esperimenti.
  17. Raccogliere tutti gli HPC differenziati pipettandoli su e giù tre volte utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml per rompere gli aggregati cellulari e staccare gli HPC dalla superficie della piastra.
  18. Aggiungere le cellule in una provetta da 15 mL e centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno B.
  19. Contare le cellule e regolare la concentrazione a 1 milione di cellule/mL. In questa fase, vengono generati più di 1 milione di HPC. Quando viene controllato con la citometria a flusso, assicurarsi che la purezza sia superiore all'85% delle cellule con CD34+/CD43+. Assicurarsi che non si notino cellule morte significative (più del 5%).

2. Sviluppo di corpi embrioidi da iPSCs e HPCs miste

  1. Lo stesso giorno della raccolta degli HPC, assicurarsi che una coltura iPSC raggiunga anche l'80% di confluenza in un pozzetto in una piastra a 6 pozzetti (o due pozzetti in una piastra a 12 pozzetti).
  2. Trattare un pozzetto della piastra di coltura a micropozzetti per la formazione di EB con 500 μl di soluzione di risciacquo antiaderente aggiungendola per ridurre al minimo le bolle.
  3. Centrifugare la piastra a 2000 x g per 5 min in un rotore a secchiello oscillante dotato di portapiastre per rimuovere eventuali bolle.
  4. Rimuovere completamente la soluzione di risciacquo mediante pipettaggio e lavare i pozzetti due volte con 1 mL di DPBS e poi 1 mL di DMEM/F12 senza generare bolle.
  5. Dissociare le iPSC dalla piastra trattando le cellule con 1 mL di soluzione di Accutasio.
  6. Osservare al microscopio fino a quando le cellule mostrano segni di separazione ma sono ancora attaccate al fondo. Questo di solito accade entro 1-3 minuti dal trattamento con Accutase. Non digerire eccessivamente le iPSC.
  7. Rimuovere completamente la soluzione di Accutase senza disturbare le cellule e aggiungere 1 mL di terreno DMEM/F12 ai pozzetti. Inoltre, dissociare le cellule in singole cellule pipettando su e giù un paio di volte utilizzando un puntale da 1 ml.
  8. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL e riempirla fino a 5 mL con terreno DMEM/F12. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 min.
  9. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio e risospendere le cellule in 1 mL di terreno E8 Flex. Contare le cellule e regolare la concentrazione delle cellule a 1 milione di cellule per mL nel terreno E8 Flex.
  10. Mescola iPSC con HPC in un rapporto di 2:1 aggiungendo 1 milione di iPSC (1 mL) e mezzo milione di HPC (500 μL) insieme. Aggiungere tutte le cellule miscelate nel pozzetto precedentemente trattato della piastra di coltura a micropozzetti.
  11. Aggiungere 1 μL di soluzione madre Y27632 dell'inibitore di Rock (1 mM) per 1 mL di terreno nel surnatante. Agitare la piastra da un lato all'altro alcune volte per distribuire uniformemente le cellule.
  12. Centrifugare la piastra di coltura per micropozzetti a 300 x g per 5 minuti in un rotore a secchio oscillante dotato di portapiastre. Osservare al microscopio per vedere se le cellule si sono depositate nei micropozzetti. (Figura supplementare 1A).
  13. Senza disturbare le cellule, mettere la piastra in un incubatore cellulare a 37 °C, 5% CO2 .
  14. Il giorno 2, 48 ore dopo, osservare le cellule al microscopio per la formazione di EB. Quando gli EB sono chiaramente formati, continuare con il passaggio successivo (Figura 1B supplementare).
  15. Trattare una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti con tampone di risciacquo antiaderente (500 μl) per 15 minuti per ottenere una piastra di fissaggio bassa.
  16. Rimuovere completamente il tampone di risciacquo e lavare i pozzetti due volte con 1 mL di DPBS, quindi aggiungere 1 mL di terreno E8 Flex nei pozzetti.
  17. Risospendere gli EB nella piastra di coltura a micropozzetti pipettandoli per alcune volte con un puntale per pipetta con orifizio largo 1 ml.
  18. Per ogni pozzetto delle piastre da 24 pozzetti trattate a bassa aderenza, raccogliere e aggiungere 100 μl di terreno contenente EB. Ciò si tradurrà in 10-20 EB per pozzo. Aggiungere il mezzo E8 Flex al vecchio pozzo contenente gli EB rimanenti come backup.
  19. Incubare la piastra in un incubatore cellulare a 37 °C, 5% CO2 per 48 ore.

3. 3D induzione, proliferazione e maturazione degli organoidi neurali

  1. Il giorno 2 dopo la formazione di EB, scongelare aliquote di BMM su ghiaccio per almeno 30 minuti.
  2. Utilizzare un puntale da 20 μl pre-raffreddato e aggiungere 15 μl di goccia di BMM ghiacciata saggiamente sopra il terreno per ricoprire gli EB. Questo crea una pellicola di BMM su cui gli EB si attaccheranno e su cui cresceranno.
  3. Mettere la piastra in un incubatore cellulare a 37 °C, 5% CO2 .
  4. Il giorno 4, dopo la formazione di EB, rimuovere con cura 500 μl di terreno senza scartare gli EB e ripetere il rivestimento BMM seguendo il passaggio 3.2.
  5. Avviare immediatamente l'induzione neurale aggiungendo 500 μl di PSC Neural Induction Medium sulla parte superiore delle cellule.
  6. Nei giorni 6 e 8, eseguire il cambio del mezzo terreno rimuovendo con cura 500 μl di terreno senza toccare le cellule e aggiungendo 500 μl di terreno di induzione neurale.
  7. Nei giorni 10, 12 e 14, eseguire il mezzo di cambio del terreno con cellule staminali neurali (NSC): Knockout DMEM/F12 + 1x integratore di Glutamax + 1x integratore neurale + bFGF + EGF.
  8. Il giorno 15, trasferire l'intero pozzetto di sfere con terreno in una nuova piastra a 12 pozzetti trattata con soluzione di risciacquo antiaderente come descritto in precedenza. Aggiungere 500 μl di terreno di maturazione neuronale (DMEM/F12 + 1x integratore di N2 + 1x integratore di B27 + 1x antibiotici-antimicotici) sopra la coltura.
  9. Eseguire il cambio semi-medio con il mezzo di maturazione neuronale a giorni alterni.
  10. Durante la fase di maturazione, se ci sono segni di esaurimento della nutrizione, come il cambiamento di colore del terreno, spostare l'organoide su piastre a 6 pozzetti, che contengono fino a 3 ml di terreno per pozzetto.
  11. Opzionalmente, 17 giorni dopo la formazione di EB, integrare il terreno di maturazione con citochine (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) per 6 giorni per facilitare la maturazione microgliale.
  12. Il giorno 23, raccogli gli organoidi neurali risultanti per la caratterizzazione o ulteriori esperimenti.

4. Clearance e immunocolorazione di organoidi neurali 3D

  1. Fissare fino a 10 organoidi mediante immersione in 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C per 24 ore.
  2. Trasferire gli organoidi per pozzetto in una piastra inferiore trasparente a 96 pozzetti e lavare con 200 μl di DPBS 2 volte per 1 ora ogni volta agitando delicatamente.
  3. Permeabilizzare gli organoidi lavandoli una volta in metanolo al 50% in DPBS, metanolo all'80% in acqua a doppia distillazione (dd) e metanolo secco al 100% per 10 minuti ciascuno, a 4 °C agitando delicatamente.
  4. Lavare gli organoidi in serie in 20% DMSO/metanolo, 80% metanolo in dd acqua, 50% metanolo in DPBS, in 100% DPBS, quindi in DPBS con Triton X-100 allo 0,2%, per 10 minuti ciascuno a 4 °C agitando delicatamente. Sforzarsi di rimuovere completamente il tampone residuo dopo ogni lavaggio.
  5. Incubare in tampone permeabilizzante (DPBS con Triton X100 allo 0,2%, glicina 0,3 M e DMSO al 20%) agitando delicatamente per 40 minuti a RT.
  6. Bloccare nel tampone bloccante (DPBS con 0,2% Triton X100, 6% siero di capra e 10% DMSO) per 1 ora a 37 °C agitando delicatamente su uno shaker a 80 giri/min.
  7. Incubare con anticorpi in tampone di diluizione anticorpale (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubulina, 1:1000, 100 μL/pozzetto in DPBS con 0,2% Tween 20, 100 μg/mL di eparina, 3% di siero di capra e 5% DMSO) a 37 °C per 2 ore o in cella frigorifera con agitazione delicata a 80 giri/min per 3 giorni.
  8. Lavare con DPBS con 0,2% Tween 20, 100 μg/mL di eparina 5 volte, 10 min ciascuna a RT con agitazione delicata su uno shaker a 80 giri/min.
  9. Incubare con anticorpo secondario (1:200 capra anti-topo Alexa488) a 37 °C per 1 ora seguito da RT per una notte con agitazione delicata su un agitatore a 80 giri/min.
  10. Per la colorazione con mezzo di contrasto nucleare, eseguire la colorazione DAPI insieme all'incubazione degli anticorpi o in un tampone di lavaggio.
  11. Lavare gli organoidi 10 volte in tampone di lavaggio, 10 minuti ogni volta a 37 °C, agitando delicatamente.
  12. Osservare al microscopio. Se lo sfondo è ancora alto, continua a lavarlo 5 volte.
  13. Scartare il surnatante il più possibile. Aggiungere 200 μL di soluzione per la chiarificazione degli organoidi e incubare per 5 minuti prima dell'osservazione e scattare immagini utilizzando un microscopio confocale.

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Risultati

Il nostro protocollo segue uno schema per differenziare le HPC dalle iPSC e quindi mescolare le HPC con le iPSC per produrre EB, seguite dall'induzione, differenziazione e maturazione neurale (Figura 1). L'alta qualità della differenziazione HPC è fondamentale per il successo della formazione di EB e della successiva differenziazione degli organoidi. Viene utilizzata una tecnica di coltura di diluizione seriale per produrre il numero e la dimensione appropria...

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Discussione

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per la realizzazione di organoidi neurali 3D contenenti microglia innate da EB derivati da iPSC miste e HPC differenziate da iPSC. Si tratta di un approccio relativamente breve e semplice che coinvolge solo le tecniche e le attrezzature di coltura cellulare generalmente disponibili nella maggior parte dei laboratori.

Il fattore più critico per il successo di questo protocollo è la qualità della differenziazione HP...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è supportato dai fondi di ricerca intramurale NINDS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre per colture cellulari a 12 pozzettiCorning #3512
Piastra per coltura cellulare a 24 pozzettiSARSTEDT#83.3922
AccutaseThermoA1110501
Piastra Aggrewell 400Tecnologie delle cellule staminali#34411Denominata piastra per coltura a micropozzetti 
Alexa Fluor 488 capra anti-topo anticorpoLife techniologiesA11001diluizione 1:400
Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio anticorpoLife techniologiesA110121:400 diluizione
Allegra X-30R Centrifuga con rotore S6069Beckman Couler
Anti-aderenza  Soluzione di risciacquoStem Cell Technologies#07010
anticorpo anti-CD34Stem Cell Technologies#60013diluizione 1:100
anticorpo CD43 umanoStem Cell Technologies#60085diluizione 1:100
anti-IBA1 anticorpo rabbbitFujifilm019-197412.5 &; g/mL
anti-TREM2  ratto pAbRD Systemsmab172912.5 µ g/mL
Antibiotico-antimicoticoGibco15240-0621x
integratore di B27Life technologies17504-0441x
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CD200NovoproteinC311  Fiale CryoTube da 100 ng/mL
Thermo#368632
CX3CL1Peprotech300-31  100 ng/mL
DAPISigmaD95421 µ g/mL
DMEM/F12Life technologies12400-0241x
DMSOSigmaD2650
DPBSGibco#41901361x
kit medio E8 Flex ThermoA2858501
EDTAMediatech46-034-Cl 0,5 mM
EGFPeprotechAF-100-1520 ng/mL
EVOS FL Microscopio automaticoMicroscopiotermofluorescenza
FastStart Universal SYBR Green PCR master mixRoche#4913850001
GlutamaxGibco#35050079
Siero di capraSigmaG90234%
IL-34Peprotech200-34  100 ng/mL
ImageXpress Micro ConfocalMolecular Devices
Knockout DMEM/F12Gibco#10829018
M-CSFPeprotech300-25  25 ng/mL
MatrigelCorning#354277Matrice di membrana basale (BMM)
Topo anti-β Anticorpo III-tubulinaPromegaG712ADiluizione 1:1000
Contenitore Mr. FrostyThermo5100-0001
Integratore N2Tecnologie di vita17502-0481x
ParaformadeideSigmaP61484%
PSC Induzione neurale MediaGibcoA1647801
Inibitore della roccia Y27632Stemcell tecnologie#723041 mM stock
RT LTS 1000 ul puntali per pipetteRAININ#30389218  per il trasferimento di organoidi
STEMdiff Kit di organoidi cerebraliStem Cell Technologies#08570
Kit ematopoietico STEMdiffStemCell Technologies#5310Indicato come kit ematopoietico
StemPro Neural SupplementGibcoA1050801Indicato come integratore neurale
TGF-β 1Peprotech100-2150 ng/mL
Kit Plus per la purificazione dell'RNA totaleNorgen#48400
TritonX-100SigmaT92840,10%
Visikol Histo-Starter KitVisikolHSK-1Contiene la soluzione di chiarificazione degli organoidi HISTO-M, tampone di lavaggio
Zeiss LSM 510-META Microscopio confocaleZeiss
a  

Riferimenti

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