Per facilitare la rilevazione rapida e precisa di Acinetobacter baumannii, presentiamo un protocollo che impiega l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) in combinazione con l'endonucleasi LbaCas12a per identificare le infezioni da A. baumannii.
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Articolo metodologico
Rilevamento rapido e specifico delle infezioni da Acinetobacter baumannii utilizzando un sistema basato su amplificazione della polimerasi ricombinasi/Cas12a
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'Acinetobacter baumannii, un batterio gram-negativo, è noto per causare gravi infezioni con alti tassi di mortalità. Il rilevamento rapido e accurato di A. baumannii è fondamentale per un trattamento tempestivo, un controllo efficace delle infezioni e la riduzione della resistenza agli antibiotici. Tuttavia, non esiste un metodo adatto per il rilevamento rapido e semplice in loco di A. baumannii. Il sistema CRISPR Trans Reporter (DETECTR) mirato all'endonucleasi del DNA offre un approccio rapido, preciso e sensibile al rilevamento di A. baumannii , integrando le capacità di riconoscimento specifiche del bersaglio di Cas12a con l'efficienza di amplificazione isotermica dell'amplificazione della ricombinasi polimerasi (RPA). Questo protocollo descrive in dettaglio la rilevazione di A. baumannii utilizzando RPA combinata con l'endonucleasi LbaCas12a. In questo articolo vengono descritte le seguenti fasi: estrazione del DNA, selezione di una specifica sequenza di DNA, progettazione del primer e dell'RNA CRISPR (crRNA), costruzione di un plasmide ricombinante positivo, configurazione del test Cas12a-RPA, ottimizzazione del sistema di amplificazione RPA, visualizzazione del test RPA-CRISPR/Cas12a utilizzando uno strumento di rilevamento della fluorescenza come uno strumento di PCR in tempo reale, e valutazione della sensibilità e della specificità.
Introduzione
In microbiologia clinica, l'individuazione delle infezioni da Acinetobacter baumannii rappresenta una sfida significativa. Questo batterio gram-negativo può causare infezioni con gravi sintomi clinici, anche con alti tassi di mortalità, in particolare tra i pazienti immunocompromessi1. I metodi tradizionali di rilevamento delle infezioni da agenti patogeni basati su colture richiedono molto tempo e possono mancare di sensibilità, il che può ritardare il trattamento antibiotico e compromettere gli esiti dei pazienti. L'identificazione rapida e accurata di A. baumannii è fondamentale per un trat....
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Protocollo
1. Costruzione del DETECTR A. baumannii
NOTA: La costruzione di A. baumannii-DETECTR è un processo in quattro fasi che coinvolge la progettazione di primer e crRNA, la costruzione di plasmidi ricombinanti positivi, la preparazione di soluzioni di reazione, l'amplificazione isotermica del DNA mediante RPA e la visualizzazione del saggio RPA-CRISPR/Cas12a. Lo schema del test DETECTR è illustrato nella Figura 1.
- Progettazione del primer e del crRNA (vedi File supplementare 1)
- Progetta 12 coppie di primer uti....
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Risultati
In questo studio, presentiamo una nuova piattaforma diagnostica portatile denominata A. baumannii-DETECTR, che integra l'efficienza di amplificazione isotermica di RPA e il sistema CRISPR-Cas12a per l'identificazione rapida e affidabile sul campo di A. baumannii. Lo schema del test DETECTR è illustrato nella Figura 1.
Dodici coppie di primer sono state progettate utilizzando strume.......
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Discussione
I metodi diagnostici tradizionali per le infezioni da A. baumannii hanno varie restrizioni che li rendono meno accessibili e fattibili per i test point-of-care27. Ad esempio, la PCR ha una buona sensibilità e specificità, ma richiede apparecchiature specializzate per i cicli termici e flussi di lavoro complessi che devono essere eseguiti da professionisti. Il nuovo metodo qui presentato, che accoppia l'editing del genoma RPA e CRISPR-LbaCas12a con la rico.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal progetto del piano di sviluppo scientifico e tecnologico della provincia di Jilin, Cina (20240305027YY) e dal Dipartimento delle finanze della provincia di Jilin (JLSWSRCZX2023-55, JLSWSRCZX2021-041).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| -20 ° C Congelatore | Haier | HYCD-290 | Cina |
| Agarosio Basic | BioFroxx | 1110GR100 | Cina |
| Tutti gli oligonucleotidi e crRNA sono stati sintetizzati dall'azienda | www.comatebio.com | ||
| Cas12a substrato di taglio - ssDNA - fluorescente tipo | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BHQ | Cina |
| Cas12a substrato di taglio - ssDNA - tipo di carta di prova | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BIO | Cina |
| Apparecchio per elettroforesi | BIO-RAD | POWER | USA |
| Strumento PCR quantitativo a fluorescenza | BIO-RAD | CFX Connect | USA |
| Sistema di imaging su gel | BIO-RAD | Gel Doc 2000 | USA |
| https://ezassay.com/rna | |||
| https://www.ezassay.com/primer | |||
| Striscia di carta a flusso laterale (Biotina/FAM) | EZassay Biotech. Co. Ltd. | HD-FMBO | Cina |
| LbaCas12a (Cpf1) proteina potenziata | EZassay Biotech. Co. Ltd. | CAS-12E-001 | Cina |
| LED Transilluminatore | LABGIC | BL-20 | Cina |
| Acetato di magnesio, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| Microcentrifuga | allsheng | Mini-6k | Cina |
| PCR strip tubes | PCR strip tubes | PST-0208-FT-C | Cina |
| TGrade Dry Bath Incubator | Tiangen biochemical technology | OSE-DB-01 | |
| Cina Tianamp batteri DNA kit Tiangen | tecnologia biochimica | DP302-02 | |
| Cina TIANamp Kit DNA batterio. | TIANGEN BIOTECH (PECHINO) CO.; Ltd. | DP302 | Cina |
| TransStart FastPfu DNA polimerasi | TransGen Biotech. Co. Ltd. | AP221 | Cina |
| Kit di base TwistAmp | Kit | del DNA TwistDX TABAS03KIT | Regno Unito |
| Tecnologia biochimica Tiangen | DP214-03 | Cina |
Riferimenti
- Lenie, D., Alexandr, N., Harald, S. An increasing threat in hospitals: Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nat Rev Microbiol. 5 (12), 939-951 (2007).
- Li, P., et al.
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Ristampe e permessi
