Per facilitare la rilevazione rapida e precisa di Acinetobacter baumannii, presentiamo un protocollo che impiega l’amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) in combinazione con l’endonucleasi LbaCas12a per identificare le infezioni da A. baumannii.
L’Acinetobacter baumannii, un batterio gram-negativo, è noto per causare gravi infezioni con alti tassi di mortalità. Il rilevamento rapido e accurato di A. baumannii è fondamentale per un trattamento tempestivo, un controllo efficace delle infezioni e la riduzione della resistenza agli antibiotici. Tuttavia, non esiste un metodo adatto per il rilevamento rapido e semplice in loco di A. baumannii. Il sistema CRISPR Trans Reporter (DETECTR) mirato all’endonucleasi del DNA offre un approccio rapido, preciso e sensibile al rilevamento di A. baumannii , integrando le capacità di riconoscimento specifiche del bersaglio di Cas12a con l’efficienza di amplificazione isotermica dell’amplificazione della ricombinasi polimerasi (RPA). Questo protocollo descrive in dettaglio la rilevazione di A. baumannii utilizzando RPA combinata con l’endonucleasi LbaCas12a. In questo articolo vengono descritte le seguenti fasi: estrazione del DNA, selezione di una specifica sequenza di DNA, progettazione del primer e dell’RNA CRISPR (crRNA), costruzione di un plasmide ricombinante positivo, configurazione del test Cas12a-RPA, ottimizzazione del sistema di amplificazione RPA, visualizzazione del test RPA-CRISPR/Cas12a utilizzando uno strumento di rilevamento della fluorescenza come uno strumento di PCR in tempo reale, e valutazione della sensibilità e della specificità.
In microbiologia clinica, l’individuazione delle infezioni da Acinetobacter baumannii rappresenta una sfida significativa. Questo batterio gram-negativo può causare infezioni con gravi sintomi clinici, anche con alti tassi di mortalità, in particolare tra i pazienti immunocompromessi1. I metodi tradizionali di rilevamento delle infezioni da agenti patogeni basati su colture richiedono molto tempo e possono mancare di sensibilità, il che può ritardare il trattamento antibiotico e compromettere gli esiti dei pazienti. L’identificazione rapida e accurata di A. baumannii è fondamentale per un trattamento efficace e il controllo dell’epidemia. Per soddisfare questa esigenza sono state esplorate tecniche molecolari che impiegano l’amplificazione degli acidi nucleici. Tuttavia, questi approcci richiedono spesso sofisticate apparecchiature per i cicli termici e possono essere limitati da tecnici ben addestrati e laboratori consolidati. Per superare queste sfide, la ricerca è sempre più focalizzata sullo sviluppo di metodi di amplificazione isoterma 2,3,4.
L’amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) è un metodo stabilito da Piepenburg et al 5 e utilizzato per amplificare il DNA, simile alla reazione a catena della polimerasi (PCR) ma senza la necessità di cicli di temperatura. Questo metodo include 50 mM di Tris (pH 7,5), 100 mM di acetato di potassio, 14 mM di acetato di magnesio, 2 mM di DTT, 5% PEG20000 (un polietilenglicole ad alto peso molecolare), 200 μM di dNTP, 3 mM di ATP, 50 mM di fosfocreatina, 100 μg/mL di creatina chinasi, 120 μg/mL di UvsX, 30 μg/mL di UvsY, 900 μg/mL di Gp32, 30 μg/mL di Bsu LF, 450 nM primer e modelli di DNA. Il processo di amplificazione inizia con il legame della proteina ricombinasi UvsX ai primer in presenza di 3 mM di ATP e 5% di PEG20000 formando un complesso ricombinasi-primer. Questo complesso facilita quindi la combinazione di primer con le sequenze omologhe sul DNA a doppio filamento.
Con l’aiuto di UvsY, la ricombinasi UvsX facilita lo scambio tra il primer e il filamento stampo, con conseguente spostamento di un filamento del DNA bersaglio. Gp32 aiuta a mantenere la struttura del DNA a filamento singolo. Infine, la ricombinasi si dissocia, e una DNA polimerasi (Bsu LF) in grado di spostare i filamenti di DNA si lega all’estremità 3′ del primer, allungandolo in presenza di desossiribonucleosidi trifosfati (dNTP). Questo processo si ripete ciclicamente, ottenendo un’amplificazione esponenziale. Tutti i processi di amplificazione possono essere completati entro 20-40 minuti e a temperature relativamente costanti tra 37 °C e 42 °C. Questo intervallo di temperatura è approssimativamente identico alle temperature fisiologiche, il che consente di condurre l’RPA in un ambiente minimalista, rendendo l’RPA uno strumento versatile ed efficiente per il rilevamento e l’analisi del DNA.
Il sistema CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) e CRISPR-Associated Protein (CRISPR-Cas) funziona come meccanismo immunitario adattativo nei batteri e negli archei, comprendendo i sistemi di Classe I e Classe II. La classe II include proteine come Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) e Cas14, che identificano e separano il DNA o l’RNA bersaglio guidati dall’RNA CRISPR (crRNA)6,7,8 . LbaCas12a (o Cpf1) è un’endonucleasi del DNA guidata da crRNA. Il crRNA funge da RNA guida all’interno del sistema CRISPR-Cas, dove si complessano con le proteine Cas. Sfrutta la sua regione spaziatrice per accoppiarsi con il DNA bersaglio, guidando efficacemente il complesso proteico verso le sequenze bersaglio. La sequenza 5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3′ funge da ripetizione conservata del crRNA, un elemento costante in tutti i crRNA di LbaCas12a. A seguito di questa ripetizione c’è un segmento specifico del bersaglio che differisce in base al bersaglio del DNA previsto. Questa sequenza di targeting varia da 18 a 24 nucleotidi di lunghezza.
La sequenza PAM (Protospacer-Adjacent Motif) (TTTV, dove V può essere A, C o G) si trova all’estremità 5′ del filamento non complementare del bersaglio del DNA. Il Cas12a taglia il DNA bersaglio a doppio filamento nella sequenza PAM. Successivamente, le proteine Cas attivate eseguono la trans-scissione non specifica del DNA a singolo filamento (ssDNA)9,10,11,12. Pertanto, l’ssDNA marcato con un fluoroforo e un quencher subisce la scissione, con conseguente emissione di un segnale fluorescente a seguito della scissione collaterale 8,13. L’intensità della fluorescenza può essere quantificata utilizzando un lettore di fluorescenza per una rilevazione precisa dell’acido nucleico14. In particolare, Cas12a è ampiamente utilizzato per l’analisi del DNA, con il suo legame e la scissione delle sequenze bersaglio subordinate al riconoscimento del motivo adiacente al protospaziatore (PAM), mentre Cas13a opera indipendentemente da tale requisito.
I sistemi CRISPR-Cas 15,16,17 facilitano la scissione all’interno di una singola reazione 18,19,20,21. La combinazione dei due precedenti può creare uno strumento robusto noto come A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) per il rilevamento degli acidi nucleici 22,23,24. Questo protocollo dimostra l’uso dell’RPA in combinazione con l’attività della DNasi di Cas12a per colpire e scindere in modo specifico una sequenza guidata da crRNA all’interno del gene 16s rDNA di A. baumannii, consentendo così un rilevamento sensibile e preciso del patogeno.
Il metodo A. baumannii-DETECTR presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi di rilevamento convenzionali25,26. In primo luogo, la caratteristica isotermica dell’RPA semplifica le procedure operative e riduce i costi grazie al suo meccanismo di amplificazione indipendente dal termociclatore5. In secondo luogo, l’endonucleasi Cas12a aumenta la specificità del saggio per mezzo del targeting mediato da crRNA e dell’accoppiamento di basi Watson-Crick7. Infine, l’utilizzo del metodo a una provetta di A. baumannii-DETECTR non solo consente di risparmiare tempo, ma riduce anche significativamente il rischio di contaminazione da ampliconi19.
Il protocollo delinea le fasi per l’estrazione dell’estrazione del DNA, la selezione delle sequenze di DNA bersaglio, la progettazione di primer e crRNA, la costruzione di plasmidi ricombinanti positivi, l’istituzione dell’impostazione del test Cas12a-RPA, l’ottimizzazione dell’ottimizzazione dell’amplificazione RPA e la visualizzazione dei risultati con l’utilizzo di strumenti di rilevamento della fluorescenza come una macchina per PCR in tempo reale, completo di valutazioni di sensibilità e specificità.
Il metodo A. baumannii-DETECTR è promettente nel migliorare gli esiti dei pazienti facilitando un trattamento tempestivo ed efficace, un robusto controllo delle infezioni e il contenimento della diffusione della resistenza agli antibiotici. Questo protocollo può fungere da linea guida completa per l’implementazione della tecnologia Cas12a-RPA, migliorandone l’utilità in vari contesti sanitari. Tuttavia, è fondamentale notare che ogni passaggio deve essere ottimizzato in base alle condizioni di laboratorio specifiche e alla varietà di campioni per garantire risultati coerenti e affidabili.
1. Costruzione del DETECTR A. baumannii
NOTA: La costruzione di A. baumannii-DETECTR è un processo in quattro fasi che coinvolge la progettazione di primer e crRNA, la costruzione di plasmidi ricombinanti positivi, la preparazione di soluzioni di reazione, l’amplificazione isotermica del DNA mediante RPA e la visualizzazione del saggio RPA-CRISPR/Cas12a. Lo schema del test DETECTR è illustrato nella Figura 1.
2. Valutazione della specificità della piattaforma di rivelazione basata su RPA-CRISPR/Cas12a
NOTA: Per testare la specificità di A. baumannii-DETECTR, gli acidi nucleici di A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Cockerella burnetii, Serratia e campioni umani sono stati sottoposti al test DETECTR.
3. Valutazione della sensibilità della piattaforma di rilevamento basata su RPA-CRISPR/Cas12a
4. Preparazioni mentre il campione è esposto alla luce UV e rilevamento LFS
I metodi diagnostici tradizionali per le infezioni da A. baumannii hanno varie restrizioni che li rendono meno accessibili e fattibili per i test point-of-care27. Ad esempio, la PCR ha una buona sensibilità e specificità, ma richiede apparecchiature specializzate per i cicli termici e flussi di lavoro complessi che devono essere eseguiti da professionisti. Il nuovo metodo qui presentato, che accoppia l’editing del genoma RPA e CRISPR-LbaCas12a con la ricombinazione, noto come saggio A. baumannii-DETECTR, consente un’efficiente manipolazione genetica. Fornisce un metodo di rilevamento rapido, sensibile e specifico per le infezioni da Acinetobacter baumannii , nonché per la diagnosi di altri patogeni batterici. Il flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1.
Il nostro metodo è particolarmente vantaggioso nella diagnosi e nella gestione delle infezioni, che dovrebbero facilitare il recupero del paziente e mitigare la diffusione di A. baumannii superando le carenze delle tecniche diagnostiche esistenti. Il sistema A. baumannii-DETECTR è stato trovato in grado di identificare A. baumannii con elevata specificità e sensibilità (Figura 5 e Figura 6). I nostri risultati hanno rivelato che solo il genoma di A. baumannii ha mostrato un cambiamento positivo della piega di fluorescenza durante la valutazione in tempo reale, mentre i genomi di tutte le altre specie hanno mostrato risultati negativi (Figura 5).
Per valutare la sensibilità della piattaforma di rivelazione RPA-CRISPR/Cas12a, i plasmidi ricombinanti pUC57-16s rDNA, positivi per A. baumannii, sono stati impiegati come bersagli per determinare il limite di rilevabilità (LOD) del sistema. Nel test RPA-CRISPR/Cas12a basato sulla fluorescenza, il rilevamento variava da una copia per microlitro a10-7 copie per microlitro, con un notevole aumento dell’intensità della fluorescenza osservato nel gruppo 1 copia/μL rispetto al gruppo di controllo negativo (Figura 6). È importante sottolineare che, per la diagnosi in tempo reale, i risultati del rilevamento possono essere visualizzati direttamente tramite un dispositivo portatile portatile, indipendente dalle apparecchiature di laboratorio, che è essenziale per la diagnosi in tempo reale.
Diversi fattori critici devono essere considerati per quanto riguarda il protocollo26. In primo luogo, è essenziale prevenire la contaminazione incrociata durante il processo di raccolta del campione, data l’elevata sensibilità del test A . baumannii-DETECTR. Inoltre, i reagenti di reazione devono essere protetti dall’esposizione diretta alla luce solare. Il rispetto di tutte le fasi procedurali è fondamentale per ottenere i migliori risultati possibili. Un controllo positivo, costituito da un plasmide che ospita frammenti genici specifici di A. baumannii, dovrebbe essere incorporato per verificare la corretta funzionalità del sistema A. baumannii-DETECTR nelle applicazioni pratiche.
Il protocollo dimostra che i parametri possono essere ottimizzati per specifiche condizioni di laboratorio e tipi di campioni, come la concentrazione del primer, il tempo di reazione e altre variabili. In questo esperimento, la combinazione ottimale di primer, le concentrazioni di primer e i tempi di reazione per l’amplificazione RPA sono stati selezionati per produrre la massima efficienza e specificità di amplificazione. Questo è stato determinato mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2 e Figura 3). Inoltre, un plasmide ricombinante positivo, contenente una regione conservata del genoma di A. baumannii , è stato utilizzato come controllo per garantire l’accuratezza del protocollo. Vale la pena notare che i kit commerciali per l’estrazione del DNA genomico batterico forniscono un metodo standardizzato e affidabile per l’estrazione del DNA in questo protocollo. Tuttavia, negli studi futuri, diversi tipi di campioni, come campioni clinici o ambientali, potrebbero richiedere metodi di estrazione specifici28 per isolare efficacemente il DNA di A. baumannii .
In assenza di segnali di fluorescenza rilevabili dal controllo positivo, è probabile che nella miscela di reazione siano presenti inibitori, il che richiede un cambio di reagenti. Al contrario, se l’intensità della fluorescenza è insufficiente per una chiara differenziazione, può essere utile prolungare la durata dell’incubazione. Tuttavia, un’incubazione prolungata potrebbe anche portare a falsi positivi26.
Le attuali metodologie di rilevamento di A. baumannii richiedono l’uso di costose apparecchiature PCR, sedi operative fisse e personale specializzato. Al contrario, il metodo qui proposto facilita una diagnosi accurata e sensibile di A. baumannii in contesti di campo, rendendola accessibile a una fascia demografica più ampia.
Le caratteristiche dell’amplificazione isotermica e i dati raccolti attraverso la fluorescenza rendono il flusso di lavoro di A. baumannii-DETCTER semplice e richiedono apparecchiature ridotte, oltre a rendere possibile l’esecuzione di una rapida rilevazione di agenti patogeni in aree remote o durante focolai. RPA-LFS 29,30,31,32, una nuova tecnica di amplificazione isotermica degli acidi nucleici, ha guadagnato una notevole trazione nel rilevamento di patogeni virali, batterici, fungini e parassitari grazie alla sua semplicità operativa e alle ridotte esigenze temporali. Il protocollo descrive in dettaglio il segnale di fluorescenza del campione sotto luce ultravioletta (UV) o il rilevamento di transilluminatore e strisce a flusso laterale (LFS). Può evitare di dipendere da strumenti ad alta precisione e tecnici specializzati, poiché l’ispezione visiva risulta in breve tempo (Figura 7), eliminando così la necessità di apparecchiature di laboratorio costose e complesse e la popolazione operativa. Inoltre, il metodo a una provetta non solo consente di risparmiare tempo, ma riduce anche il rischio di contaminazione da ampliconi33.
Gli studi futuri dovrebbero mirare a migliorare il metodo per renderlo praticabile per vari tipi di campioni e diverse condizioni ambientali, come l’esplorazione di tecniche di estrazione del DNA più efficienti e a basso costo. L’uso di A. baumannii-DETECTR non è solo per la diagnosi clinica, ma può anche essere utilizzato per la valutazione ambientale, il monitoraggio e la gestione dei focolai, consentendo alle comunità e agli ospedali di identificare rapidamente A. baumannii. Inoltre, modificando il crRNA e i primer, questo approccio diagnostico molecolare può essere adattato per il rilevamento di varie infezioni batteriche respiratorie, come Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus ed Enterobacter.
In sintesi, A. baumannii-DETECTR è in grado di identificare A. baumannii nel modo più rapido e accurato possibile grazie alla sua elevata sensibilità e specificità, al design intuitivo e alla portabilità. Questo metodo può migliorare i risultati di salute dei pazienti facilitando un trattamento tempestivo ed efficace, il controllo delle infezioni e mitigando la proliferazione della resistenza agli antibiotici, affrontando al contempo la crescente minaccia di infezioni da A. baumannii.
The authors have nothing to disclose.
-20 °C Freezer | Haier | HYCD-290 | China |
Agarose Basic | BioFroxx | 1110GR100 | China |
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by company | www.comatebio.com | ||
Cas12a cutting substrate – ssDNA – fluorescent type | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BHQ | China |
Cas12a cutting substrate – ssDNA – test paper type | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BIO | China |
Electrophoresis apparatus | BIO-RAD | POWER PAC1000 | USA |
Fluorescence quantitative PCR instrument | BIO-RAD | CFX Connect | USA |
Gel Imaging System | BIO-RAD | Gel Doc 2000 | USA |
https://ezassay.com/rna | |||
https://www.ezassay.com/primer | |||
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast | |||
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM) | EZassay Biotech. Co. Ltd. | HD-FMBO | China |
LbaCas12a (Cpf1) enhanced protein | EZassay Biotech. Co. Ltd. | CAS-12E-001 | China |
LED Transilluminator | LABGIC | BL-20 | China |
Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
Microcentrifuge | allsheng | Mini-6k | China |
PCR strip tubes | PCR strip tubes | PST-0208-FT-C | China |
TGrade Dry Bath Incubator | Tiangen biochemical technology | OSE-DB-01 | China |
Tianamp Bacteria DNA Kit | Tiangen biochemical technology | DP302-02 | China |
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TwistAmp Basic Kit | TwistDX | TABAS03KIT | UK |
Universal DNA Purification Kit | Tiangen biochemical technology | DP214-03 | China |