Articolo metodologico

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

DOI:

10.3791/67616

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24 gennaio 2025

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1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per marcare le proteine con un tag proteico di fluorescenza nelle larve di zebrafish, un sistema in vivo recentemente sviluppato e modificato particolarmente utile per visualizzare le proteine a bassa abbondanza nel zebrafish.

Abstract

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La tecnologia knock-in (KI) mediata da CRISPR/Cas9 consente di marcare più facilmente le proteine fluorescenti nel pesce zebra (Danio rerio), un organismo modello preferito per l'imaging in vivo grazie alla sua trasparenza durante la fase iniziale di sviluppo. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'esecuzione di KI genici a fluorescenza ad alta efficienza, screening rapido per i fondatori di KI e tracciamento di proteine a bassa abbondanza nelle larve di zebrafish, che getteranno una base fondamentale per i successivi studi fisio-patologici su zebrafish. L'attuale protocollo include passaggi completi per la progettazione dell'sgRNA per il gene di interesse, la trascrizione in vitro dell'sgRNA, la trascrizione in vitro dell'mRNA Cas9, lo screening dell'sgRNA in vivo per quello con la più alta efficienza, la progettazione e la costruzione del plasmide del donatore, la microiniezione in larve di zebrafish, lo screening del fondatore di KI e l'imaging dal vivo del zebrafish. Vengono inclusi e discussi i passaggi critici, i suggerimenti per la risoluzione dei problemi, i metodi di controllo della qualità e i vantaggi e le applicazioni di questo protocollo. Questo protocollo garantisce risultati rapidi e accurati a basso costo ed è stato convalidato da diversi studi.

Introduzione

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Come organismo modello ben accettato, il pesce zebra (Danio rerio) è ampiamente utilizzato nella ricerca scientifica sullo sviluppo, la rigenerazione, la tumorigenesi, l'infezione e l'immunità, ecc. 1,2,3,4,5. Il pesce zebra è particolarmente adatto per l'imaging dal vivo in vivo se trattato con PTU (1-fenil 2-tiourea), un composto chimico tossico che inibisce la melanogenesi e rende trasparenti le larve di pesce zebra per un periodo di tempo relativamente lungo6. Sono disponibili anche ceppi di zebrafish trasparenti geneticamente modificati, come il casper7 e il crystal8, che consentono la visualizzazione dal vivo e il tracciamento del lignaggio fino all'età adulta. Oltre a questi sforzi per superare la pigmentazione per una migliore visualizzazione dal vivo nei pesci adulti, la nostra ricerca si concentra anche sullo sviluppo di potenti strategie di editing genetico per rendere l'etichettatura delle proteine fluorescenti più efficiente e meno artificiale.

La tecnologia KI basata sull'unione delle estremità mediata da microomologia mediata da CRISPR/Cas9 (MMEJ) è ora ampiamente applicata nelle modifiche genetiche in più organismi, incluso il pesce zebra, grazie alla sua efficienza KI relativamente elevata 9,10,11,12. Per ottenere il successo dell'imaging in vivo, è necessario affrontare due sfide. Uno sono le indels o cicatrici introdotte dal processo di ricombinazione; L'altro è che alcuni geni bersaglio sono espressi endogenamente a un livello basso, portando a segnali deboli del tag di fluorescenza co-espresso e al fallimento del rilevamento in vivo. Con l'obiettivo di ottenere un tagging efficiente e accurato delle proteine e di ridurre al minimo l'interferenza dei livelli di espressione genica endogena, un recente lavoro ha riportato una strategia ottimizzata che combina un metodo di tagging "VH" con amplificazione del segnale di fluorescenza e un raffinato flusso di lavoro dello screening germinale13, che è più adatto per la marcatura a fluorescenza di geni a bassa espressione e più efficiente rispetto ai metodi precedenti ottimizzando la spina dorsale del donatore e combinando la reazione a catena della polimerasi (PCR) e le verifiche della fluorescenza per implementare lo screening germinale al minor costo di tempo e fatica. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato passo dopo passo per il metodo riportato, comprese le fasi di preparazione degli embrioni e allevamento del pesce zebra, progettazione degli sgRNA, trascrizione in vitro degli sgRNA, trascrizione in vitro dell'mRNA Cas9, microiniezione di embrioni di pesce zebra, screening in vivo per gli sgRNA con la massima efficienza, progettazione e costruzione del plasmide del donatore, genotipizzazione del pesce zebra KI, screening della linea germinale KI e imaging e fenotipizzazione del pesce zebra KI. Questo protocollo all-in-one, che fornisce un metodo di etichettatura a fluorescenza all'avanguardia, promuoverebbe senza dubbio gli studi che utilizzano il pesce zebra in vari campi scientifici e andrebbe a beneficio dei lettori provenienti da diversi background accademici.

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Protocollo

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Tutti gli allevamenti e gli esperimenti del pesce zebra sono stati esaminati e approvati dal Comitato etico e per la gestione degli animali da laboratorio dell'Università di Xiamen e sono stati in stretta conformità con le buone pratiche sugli animali come definito dal Centro per gli animali da laboratorio dell'Università di Xiamen. Lo studio ha rispettato tutte le norme etiche pertinenti per l'uso degli animali.

NOTA: Tutti i pesci zebra adulti e larvali sono stati mantenuti seguendo protocolli standard a 28,5 °C con un ciclo luce/buio di 13/11 ore nel sistema di acquario di pesce zebra dell'Università di Xiamen. Gli embrioni sono stati conservati nel tampone embrionale (Tabella 1) in un'incubatrice controllata (temperatura, 28 ± 0,5 °C; luce, ciclo 13 ore luce/11 ore buio). L'alimentazione e il monitoraggio generale di tutti i pesci zebra sono stati eseguiti due volte al giorno (9 e 16). Il ceppo wild-type (WT) utilizzato in questa ricerca è stato Tübingen (Tü).

1. Scegliere i geni di interesse e progettare l'RNA guida

  1. Conoscere le informazioni del gene di interesse. Cerca nel database (https://zfin.org/) e assicurati che il numero di varianti genetiche sia noto. Decidi quale variante manipolare e scarica le informazioni sul gene bersaglio da Ensembl (https://www.ensembl.org/), tra cui la sequenza del genoma, la sequenza del cDNA e la sequenza codificante (CDS). Marcare esoni, introni, UTR, codoni di inizio e codoni di arresto nelle sequenze.
  2. Scegliere non più di 200 bp di CDS a monte del codone di stop (TAA, TAG o TGA) del gene bersaglio come regione bersaglio dell'sgRNA.
    NOTA: È meglio assicurarsi che questa regione non abbia polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) mediante il sequenziamento del DNA.
  3. Utilizza il sito Web CRISPRscan (https://www.crisprscan.org/) per progettare sgRNA candidati all'interno della regione target scelta e prevedere l'efficienza degli sgRNA.
    1. Inserire la sequenza di DNA nel riquadro di progettazione.
    2. Seleziona le informazioni corrispondenti, tra cui specie, discrepanze massime negli off-target, endonucleasi e promotore. In questo caso, scegli Zebrafish- Danio rerio, No mismatch, Cas9-NGG e promotore T7 in vitro.
    3. Fare clic su Ottieni sgRNA per ottenere alcuni sgRNA. Seleziona 5-7 sgRNA con un punteggio CRISPRscan alto e un punteggio off-target basso per lo schermo in vivo .
  4. Progettare primer PCR che fiancheggiano i siti target dell'sgRNA il cui prodotto è di circa 500 bp per la successiva amplificazione PCR, test di digestione enzimatica e sequenziamento per verificare l'efficienza del knockout dopo microiniezione di sgRNA/Cas9. Selezionare una sequenza di circa 20 bp nelle regioni a monte e a valle e assicurarsi che il contenuto di GC sia di circa il 50% e che il valore di Tm sia compreso tra 50 e 55°C.
    NOTA: Progettare due primer a monte e due primer a valle se è necessario fare combinazioni.

2. Preparazione di sgRNA

NOTA: La sequenza comune di scaffold dell'sgRNA (Figura 1) è stata clonata in un plasmide (Tabella dei materiali).

  1. La PCR amplifica la sequenza coniugata promotore-sgRNA T7 utilizzando primer e miscela PCR mostrati rispettivamente nella Tabella 2 e nella Tabella 3. Eseguire il programma PCR nella Tabella 4. Eseguire l'elettroforesi su gel (gel di agarosio, agarosio all'1,2% in tampone TAE; tampone TAE [Tabella 1]; 200 V; circa 5 min) con 2 μL di prodotti PCR per assicurarsi che i prodotti siano corretti (il MW è di circa 150 bp).
  2. Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione (Tabella dei materiali) o altri kit disponibili in commercio seguendo le istruzioni del produttore.
    NOTA: D'ora in poi, devono essere utilizzati reagenti e materiali privi di RNasi e le procedure devono essere condotte con particolare cautela per evitare la contaminazione da RNasi (vedere Discussione).
    1. Aggiungere il tampone legante ai prodotti PCR con un rapporto di volume 5:1 e mescolare. Applicare la miscela sulla colonna posta in una provetta di raccolta da 2 mL. Centrifugare a 17.900 × g per 1 min a 25 °C. Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna nella stessa provetta di raccolta.
    2. Aggiungere 750 μl di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 17.900 × g per 1 minuto a 25 °C. Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna nella stessa provetta di raccolta. Centrifugare a 17.900 × g per 2 min a 25 °C. Posizionare la colonna in una provetta pulita da 1,5 mL.
    3. Aggiungere 20 μL di acqua priva di nucleasi alla colonna, centrifugare a 17.900 × g per 2 minuti a 25 °C, per eluire il DNA e misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro.
  3. Utilizzare il sistema di produzione di RNA T7 nella tabella dei materiali o kit equivalenti per trascrivere in vitro 250 ng di DNA purificato. Sono necessarie operazioni e condizioni prive di RNasi.
    1. Preparare la reazione in provette per PCR (senza RNasi) secondo la Tabella 3 e mescolare delicatamente. Incubare a 37 °C in un bagno metallico per 2 ore.
    2. Aggiungere 0,5 μl di DNasi I (senza RNasi) e mescolare delicatamente. Incubare a 37 °C in un bagno metallico per 15-20 min.
    3. Precipitazione dell'etanolo
      1. Aggiungere acqua priva di RNasi a ciascuna reazione per far raggiungere il volume finale a 20 μL e trasferire i campioni in provette da 1,5 mL.
      2. Aggiungere 50 μl di etanolo al 100% (2,5 V, senza RNasi), mescolare bene, mettere la miscela in ghiaccio per 10 minuti e centrifugare a 21.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
      3. Scartare il surnatante, lavare il pellet con 500 μl di etanolo al 75% (privo di RNasi) e centrifugare a 21.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
      4. Scartare il surnatante, essiccare il pellet a 45 °C in un bagno metallico e scioglierlo con 40 μl di acqua priva di RNasi.
        NOTA: Per il KI, gli sgRNA devono essere precipitati con LiCl (vedi sotto), ma per il KO non è necessario.
    4. Eseguire i gel di agarosio (Gel di agarosio: 1,2% di agarosio in tampone TAE; tampone TAE [Tabella 1]; 200 V; circa 5 min) con 1-2 μL di RNA per stimare la qualità e quindi misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro.
      NOTA: gli sgRNA possono essere conservati a -20 °Cor -80 °C per un ulteriore utilizzo.

3. Preparazione dell'mRNA Cas9

  1. Eseguire la digestione enzimatica del plasmide Cas9 (Tabella dei materiali) per più di 1,5 ore utilizzando XbaI secondo le istruzioni del produttore (per la miscela di reazione, vedere la Tabella 3). Test mediante elettroforesi su gel (Gel di agarosio: 1,2% di agarosio in tampone TAE; tampone TAE [Tabella 1]; 200 V; circa 10 min) con 1 μL per verificare che la digestione sia accurata.
  2. Purificare i prodotti allo stesso modo dei prodotti sgRNA PCR (passaggi 2.2.1-2.2.3). Da qui in poi, sono necessari materiali e operazioni privi di RNasi.
  3. Utilizzare il kit di trascrizione T3 (Table of Materials) o kit equivalenti per la trascrizione in vitro dell'mRNA di Cas9.
    1. Preparare la reazione in provette per PCR prive di RNasi secondo la Tabella 3 e mescolare delicatamente. Incubare a 37 °C per più di 2,5 ore.
    2. Aggiungere 1 μL di Turbo DNasi priva di RNasi e incubare a 37 °C per 15-20 minuti.
    3. Precipitazioni LiCl
      1. Trasferire i campioni in provette da 1,5 mL, aggiungere 30 μl di LiCl (1,5 V) e mescolare delicatamente.
      2. Mettere il composto a -20 °C per circa 30 min e poi centrifugare a 21.000 × g per 30 min a 4 °C.
      3. Scartare il surnatante, lavare i pellet con 500 μl di etanolo al 75% (privo di RNasi) e centrifugare a 21.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
      4. Scartare il surnatante, essiccare il pellet a 45 °C e scioglierlo in 40 μL di acqua priva di RNasi.
  4. Misurare la concentrazione dell'mRNA Cas9 utilizzando uno spettrofotometro. Eseguire i gel di agarosio (Gel di agarosio: 1,2% di agarosio in tampone TAE; tampone TAE [Tabella 1]; 200 V; circa 10 min) con 1-2 μL di RNA per verificarne la concentrazione e la qualità.
    NOTA: Un OD 260/280 dovrebbe essere superiore a 2,0 e la concentrazione dovrebbe essere intorno o superiore a 1000 ng/μL. L'mRNA di Cas9 potrebbe essere conservato a -20 °Cor -80 °C per un ulteriore utilizzo.

4. Preparazione per la microiniezione

  1. Preparare il pesce zebra: la notte prima della microiniezione, mettere una femmina sana di pesce zebra e due maschi sani di pesce zebra in una vasca di accoppiamento, utilizzando un divisore per separare i maschi e le femmine per prepararli all'accoppiamento.
  2. Preparare l'agarosio al 4%, il tampone di lisi e il tampone embrionale (pH 8,0) (Tabella 1).
  3. Preparare gli aghi di vetro capillari per la microiniezione (Tabella dei materiali).
  4. Preparare le piastre per microiniezione: Versare 35 ml di agarosio fuso al 4% in una capsula di Petri da 10 cm e stendere delicatamente uno stampo di plastica per creare delle depressioni a forma di cuneo. Evitare le bolle d'aria picchiettando delicatamente lo stampo. Dopo che si è solidificato, aggiungere un po' di acqua distillata doppia (ddw) e posizionare la piastra a 4 °C per un uso successivo.

5. Test di efficienza dell'sgRNA mediante microiniezione

  1. Il giorno della microiniezione, preparare la miscela per microiniezione come elencato nella Tabella 5 su ghiaccio in un ambiente privo di RNasi.
  2. Caricare la soluzione di microiniezione nell'ago utilizzando un puntale per pipetta privo di RNasi (Tabella dei materiali). Attenzione a non portare bolle.
  3. Posizionare l'ago caricato in un micromanipolatore collegato a un microiniettore. Tagliare la punta dell'ago per iniezione al microscopio con le pinzette appuntite, pizzicando delicatamente la punta dell'ago per romperlo. Quindi, regolare la pressione di iniezione fino a quando l'ago espelle costantemente una gocciolina da 1 nL, che viene quantificata utilizzando un micrometro da tavolino e un capillare.
  4. Togliete il divisore e lasciate che il pesce si riproduca per circa 6 minuti. Raccogli e trasferisci gli embrioni allo stadio di 1 cellula in una capsula di Petri contenente un tampone embrionale.
    1. Esamina la salute degli embrioni al microscopio ottico e rimuovi eventuali uova o detriti non fecondati. Mettere da parte 20 embrioni sani come controlli non iniettati in una capsula di Petri separata e in un'etichetta.
  5. Trasferire e allineare delicatamente gli embrioni sani allo stadio di 1 cellula sulle scanalature della piastra per microiniezione riscaldata a temperatura ambiente (RT) utilizzando un piccolo pennellino. Rimuovere il tampone in eccesso.
  6. Eseguire tutte le operazioni successive sotto uno stereomicroscopio. Usa la punta dell'ago per regolare delicatamente la posizione dell'embrione in modo che l'asta dell'animale sia rivolta verso l'ago. Iniettare 1 nL della soluzione miscelata nell'asta animale.
  7. Circa l'iniezione di 100 embrioni è sufficiente per un sgRNA. Dopo l'iniezione, sciacquare delicatamente gli embrioni in una piastra a sei pozzetti con tampone embrionale. Mettere la capsula in un'incubatrice a temperatura costante di 28,5 °C. A circa 10 ore dalla fecondazione (hpf), esaminare lo sviluppo embrionale al microscopio stereoscopico e rimuovere gli embrioni morti.
  8. A 24 hpf, raccogliere gli embrioni in provette da 1,5 mL per la genotipizzazione (3 provette per sgRNA e 5 embrioni per provetta). Eliminare con cura l'acqua in eccesso con una pipetta, aggiungere 100 μL di tampone di lisi contenente proteinasi K (a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL) in ciascuna provetta e incubare a 56 °C per 1 ora e poi a 95 °C per 15 minuti.
  9. Aggiungere 200 μl di etanolo (2V), mescolare bene e centrifugare a 19.000 × g per 10 minuti a RT.
  10. Scartare il surnatante, lavare il pellet con 500 μl di etanolo al 70% e centrifugare a 19.000 × g per 3 minuti a RT.
  11. Scartare il surnatante, essiccare il pellet a RT e scioglierlo con 50 μl di ddw. Quindi, utilizzare 1 μl di estratti per preparare la miscela di reazione per la PCR (Tabella 3) (per i primer PCR, vedere la fase 1.4).
  12. Eseguire i gel di agarosio (Gel di agarosio: 1,2% di agarosio in tampone TAE; tampone TAE [Tabella 1]; 200 V; circa 10 minuti) con 2 μL di prodotti della PCR per confermare che la PCR ha successo, quindi eseguire digestioni enzimatiche (Tabella 3) per determinare l'efficienza degli sgRNA. Mescolare delicatamente la miscela per la digestione enzimatica. Incubare alla temperatura per il periodo di tempo suggerito dal produttore.
  13. Eseguire i gel di agarosio per i prodotti digeriti (Gel di agarosio: 1,2% di agarosio in tampone TAE; tampone TAE [Tabella 1]; 200 V; circa 10 minuti) con i prodotti PCR non digeriti come controlli per confermare se la digestione avviene.
    NOTA: Il sito di scissione di Cas9 si trova a circa 3 bp a monte del PAM, quindi il sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione è il migliore per coprire 6 bp a monte del PAM. Se l'efficienza dell'sgRNA è elevata, il taglio e la riparazione errata porteranno a indel, quindi c'è un'alta possibilità che l'enzima di restrizione non sia più in grado di riconoscere il sito di taglio. Se l'sgRNA è inefficiente e il sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione è intatto, la digestione enzimatica può avvenire normalmente. Attraverso l'elettroforesi su gel di agarosio è possibile distinguere se è avvenuta una digestione enzimatica.
  14. Se non esiste un sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione adatto, sequenziare i prodotti della PCR e analizzare l'efficienza dell'sgRNA mediante TIDE (https://tide.nki.nl/). Ricordati di fare la PCR e anche di sequenziare il DNA genomico WT come controllo.
    1. Apri il sito Web e fai clic su Avvia TIDE. Immettere la sequenza guida di sgRNA nel frame in Sequenza guida.
    2. Fare clic su Sfoglia in Cromatogramma campione di controllo (.ab1 o .scf) per inserire il risultato del sequenziamento per il controllo WT e fare clic su Sfoglia in Cromatogramma campione di test (.ab1 o .scf) per inserire il risultato del sequenziamento per il campione modificato.
    3. Fare clic su Aggiorna visualizzazione. Il sito web darà una percentuale della differenza tra le due sequenze. Una percentuale maggiore indica una maggiore efficienza dell'sgRNA. Un sgRNA con un'efficienza di knockout superiore all'80% è adatto per le successive procedure KI.

6. Costruzione del plasmide del donatore per l'etichettatura di proteine fluorescenti

  1. Progettare sequenze che verrebbero prima clonate nel plasmide e poi ulteriormente inserite nel genoma del pesce come Figura 2: una sequenza di 25 bp a monte del sito di clivaggio previsto di Cas9 è progettata come braccio di omologia sinistro e una sequenza di 25 bp a valle del sito di clivaggio previsto di Cas9 è il braccio di omologia destro. Introdurre la CDS tra il sito bersaglio dell'sgRNA e il codone di stop nel donatore per mantenere l'integrità del gene endogeno.
    NOTA: Il 5' del CDS complementato (elemento 4 in Figura 2) deve essere mutato come sinonimo per evitare la scissione secondaria del genoma ricombinante da parte del complesso sgRNA/Cas9.
  2. Utilizzare il clonaggio indipendente dalla legatura (LIC)14 utilizzando l'esonucleasi III (Tabella dei materiali) per la costruzione del plasmide donatore. Sono possibili anche altri metodi, come l'assemblaggio di Gibson. I primer di clonazione sono illustrati nella Figura 2. Gli elementi "1", "2", "3" e "4" sono trasportati dagli inneschi:
    1. Design Primer F1, che è composto da una sequenza sovrapposta con il vettore, l'elemento "1" e una parte dell'elemento "2".
    2. Design Primer R2, che è composto da una parte dell'elemento "1", dell'elemento "2" e dell'elemento "3".
    3. Design Primer F2, che è composto dagli elementi "3", "4" e dalla sequenza 5' del CDS che segue il sito bersaglio dell'sgRNA.
    4. Design Primer R1, che è composto dalla sequenza 3' del CDS del gene e da una sequenza sovrapposta con il vettore.
    5. Usa il cDNA del pesce zebra come modello ed esegui PCR usando i primer.
      NOTA: La sovrapposizione consigliata tra i primer o tra il primer e il vettore è di 15-20 bp. Questi primer sono specifici per il gene bersaglio e un esempio dei primer per cx39.9 e cx44.1 è riportato nella Tabella 2. Questo design è stato applicato con successo come descritto in precedenza13. Mappe plasmidiche dettagliate sono fornite nel File Supplementare 1 e nel File Supplementare 2. Le sequenze di DNA e proteine progettate di cx39.9 e cx44.1 sono fornite nel File supplementare 3.
    6. Purificare i prodotti della PCR allo stesso modo dei prodotti della PCR sgRNA (passaggi 2.2.1-2.2.3).
  3. Digerire il vettore donatore (Figura 3 e Tabella 6) con enzimi di restrizione adeguati. In questo esempio, gli enzimi sono PciI e Acc65I (Tabella dei materiali). Eseguire secondo le istruzioni del produttore (Tabella 3). Purificare il vettore donatore digerito allo stesso modo dei prodotti sgRNA PCR (passaggi 2.2.1-2.2.3).
  4. Quantificare i frammenti di PCR purificati e il vettore donatore digerito mediante elettroforesi su gel di DNA (gel di DNA: 1,2% di agarosio in tampone TAE; tampone TAE [Tabella 1]; 200 V; circa 10 minuti). Preparare la miscela di reazione per LIC secondo la Tabella 3.
    NOTA: Tutti i tubi e i componenti della reazione devono essere posizionati sul ghiaccio e la reazione e tutte le manipolazioni devono essere eseguite sul ghiaccio. Aggiungere 1 μL di Exo III (20 unità) alla reazione come ultimo componente e quindi pipettare immediatamente su e giù per miscelare bene tutti i componenti. Ricordarsi di includere una miscela di reazione senza frammenti di PCR come controllo per mostrare il potenziale di auto-ricottura del vettore digerito.
  5. Posizionare immediatamente la miscela di reazione sul ghiaccio e incubare per 60 minuti.
  6. Aggiungere 1 μl di EDTA 0,5 M (pH 8,0) per arrestare la reazione, pipettare su e giù per mescolare bene, quindi incubare a 60 °C per 5 minuti e poi su ghiaccio per 5 minuti.
  7. Trasformare le cellule competenti, come il DH5α, utilizzando i prodotti LIC e far crescere i batteri su piastre LB (Tabella dei materiali e Tabella 1) con antibiotici appropriati (Ampicillina in questo caso) per 16 ore.
  8. Assicurarsi che vi siano differenze di ordini di grandezza tra il numero di colonie sulle piastre contenenti frammenti di PCR e quello sulla piastra di controllo. Prelevare singole colonie dalle piastre LIC per l'analisi della digestione enzimatica e il sequenziamento del DNA.
  9. Estrarre e purificare i plasmidi del donatore corretti con un kit di purificazione allo stesso modo dei prodotti sgRNA PCR (passaggi 2.2.1-2.2.3). Assicurarsi che la concentrazione finale sia superiore a 300 ng/μL.

7. Microiniezione di embrioni di zebrafish per il gene KI

  1. Eseguire tutte le manipolazioni di microiniezione sopra descritte, ad eccezione della preparazione della soluzione di microiniezione secondo la Tabella 7.

8. Screening e identificazione di progenie marcata con proteine fluorescenti

  1. Osservare la fluorescenza al microscopio a stereofluorescenza 12-48 ore dopo la microiniezione.
  2. Applicare un nuovo metodo di retino13. Se si osserva una fluorescenza evidente, individuare le larve fluorescenti e allevarle. Se si osserva solo una traccia di fluorescenza o addirittura nessuna fluorescenza, allevare tutte le larve iniettate.
  3. A 1 mese di età, anestetizzare il pesce zebra microiniettato con tricaina allo 0,02% (Tabella 1). Per ogni zebrafish, raccogliere un piccolo pezzo della pinna caudale in una provetta PCR etichettata e conservare il pesce zebra anestetizzato corrispondente in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente acqua filtrata sterilizzata con raggi UV (pH 7,2) con la stessa etichetta.
  4. Utilizzare il metodo della lisi alcalina (tampone di lisi nella Tabella 1)15 per l'estrazione del DNA genomico, seguita dalla PCR a giunzione 5'. Progettare l'innesco in avanti a monte del braccio dell'omologia sinistro e l'innesco inverso sull'inserto (Figura 4). La dimensione del prodotto PCR è di circa 500 bp. Per esempi di inneschi, vedere la Tabella 2.
    NOTA: Per il pesce zebra fluorescente, questa PCR viene utilizzata per verificare l'accuratezza del KI, quindi il prodotto PCR viene quindi sottoposto a sequenziamento. Per il pesce zebra senza fluorescenza, questa PCR viene utilizzata per verificare se si verifica KI. Scegli i pesci positivi alla PCR e allevali fino all'età adulta come F0.
  5. Esaminare gli embrioni F1 ottenuti dall'accoppiamento dell'F0 sottoposto a screening con WT per i pattern di espressione della GFP e genotipizzati mediante PCR a giunzione.
    NOTA: Se l'inserimento del bersaglio avviene in F1 (perfetto o meno), il corrispondente F0 è definito come F0 ereditabile, il cui prodotto PCR viene quindi sequenziato. Se l'inserimento è accurato, l'F0 corrispondente viene definito come l'F0 desiderato.
  6. Quando si ottiene l'F0 desiderato, utilizzare la progenie per l'imaging per osservare e tracciare la proteina bersaglio.

9. Imaging ed elaborazione dei dati

  1. Determinare lo stadio di sviluppo da visualizzare. Preparate il pesce in anticipo. Aggiungere 1-fenil 2-tiourea diluito (PTU; 0,003%, Tabella dei materiali) al pesce per rimuovere i pigmenti, se necessario.
    NOTA: Il PTU sarebbe meno efficace se applicato dopo 24 hpf. In questo esempio, la PTU è stata aggiunta al tampone embrionale prima di 24 hpf e mantenuta nel tampone fino a 48 hpf quando le larve di zebrafish sono state processate per l'imaging.
  2. Aggiungere 2 ml di agarosio fuso al 4% (Tabella 1) in un piatto da 35 mm e lasciarlo da parte per solidificare. Trasferire il pesce nel tampone embrionale contenente lo 0,02% di tricaina (Tabella 1).
  3. Diluire 200 μL di agarosio fuso al 4% in 1 mL di ddw. Trasferire il pesce anestetizzato nell'agarosio diluito utilizzando una pipetta da 1 ml quando l'agarosio si sta raffreddando. Mescolare delicatamente e trasferire l'agarosio di montaggio nel piatto contenente il gel di agarosio solidificato al 4% preparato al punto 9.2.
  4. Posiziona il pesce in modo che la parte di interesse sia in alto.
  5. Utilizzare un microscopio a fluorescenza confocale verticale per l'imaging e l'elaborazione dei dati seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).

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Risultati

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Le giunzioni gap costituite da proteine polimeriche chiamate connessine sono essenziali per lo scambio di metaboliti e ioni a basso peso molecolare tra le cellule in contatto. Il metodo di marcatura delle proteine fluorescenti descritto sopra è stato utilizzato per marcare rispettivamente la connessina 39.9 (Figura 5A) e la connessina 44.1 (Figura 5B). La corretta KI è stata verificata mediante PCR a giunzione (Figura 6

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Discussione

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Per condurre questo esperimento senza intoppi e con successo, è necessario prestare maggiore attenzione ad alcuni aspetti importanti. Lo stadio ottimale di sviluppo del pesce zebra per l'iniezione dovrebbe essere lo stadio monocellulare. Il completamento dell'iniezione in questa fase può garantire che tutte le cellule prodotte attraverso la successiva divisione contengano i componenti necessari per il KI, aumentando così la probabilità di insorgenza simultanea di KI in tutte le cellule e...

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Dichiarazioni

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Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti in questo articolo.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Lu Zhou (Università di Xiamen) per la correzione delle bozze e l'editing di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzione 82388201 a J.H.; sovvenzione 31801158 a Y.Z.), dal National Key R&D Program of China (2020YFA0803500 a J.H.), dal CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2019-I2M-5-062 a J.H.), dal programma speciale per lo sviluppo scientifico e tecnologico locale della provincia del Fujian (2022L3079 a J.H.), e il programma di cooperazione distrettuale FuXia-Quan Zi-Chuang (3502ZCQXT2022003 a J.H.). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nelle decisioni di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1000 µ L  punte/Adi qualsiasi marcaPer tutte le manipolazioni Provette
1,5 mLN/Aqualsiasi marcaPer la conservazione e la centrifugazione di varie soluzioni
Provette da 1,5 mL (senza RNasi)/Adi qualsiasi marcaPer la conservazione e la centrifugazione di soluzioni prive di RNasi
10 &; L punteQualsiasi marcaN/APer tutte le manipolazioni
10 & micro; Punte a L (senza RNasi)Qualsiasi marcaN/APer manipolazioni senza RNasi
1000 & micro; L  punte (senza RNasi)Qualsiasi marcaN/APer manipolazioni senza RNasi
1-fenil 2-tiourea (PTU)SigmaP7629Per inibire la melanogenesi e mantenere le larve trasparenti
200 &; L punteQualsiasi marcaN/APer tutte le manipolazioni
200 µ Punte L (senza RNasi)Qualsiasi marcaN/APer manipolazioni senza RNasi
2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)VazymeP213-03PCR per test di efficienza sgRNA
Piastre da 35 mmCorning430165 Per l'imaging
di piastre a 6 pozzettiQualsiasi marcaN/APer l'allevamento di zebrafish individualmente e temporaneamente
Acc65INEBR0599SPer digestione enzimatica
Acido aceticoSigma695092Per la preparazione di tamponi TAE
AgarBiofroxx8211GR500Per piastre LB
Ampicillina, sale sodicoSangonA610028Per piastre LB
CaCl2SigmaC5080Per la preparazione di tamponi embrionali
capillariApparecchioHarvard30-0016Per la generazione di aghi per iniezione
Provette capillariQualsiasi marcaID (diametro interno) = 0,1 mmPer quantificare una goccia da 1 nL
CRISPRscanCRISPRscan  http://www.crisprscan.org/Per la progettazione di sgRNA
DH5&alfa;TIANGENCB101Per la trasformazione
EDTASigmaE6758Per la preparazione del tampone di lisi e del tampone TAE
EnsemblEnsembl https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/IndexPer trovare informazioni sui geni
EtanoloHUSHI64-17-5Per la purificazione e l'estrazione del DNA
Esonucleasi IIITakara2170ALIC
Microiniettore alimentato a gasWarner InstrumentsPLI-100APer microiniezione
Sistema di elettroforesi su gelWIX WIX-EP3000Per gel Guanti per elettroforesi
Qualsiasi marcaN/APer tutte le manipolazioni
Glucosiosgdbio10010518Per piastre LB
GliceroloSangonA501745Per piastre LB
gRNA-pMD19-TChina Zebrafish Resource Center (CZRC)Plasmide sgRNA CZP3 contenente impalcatura sgRNA
KClSigmaP5405Per embrione preparazione
tampone Soluzione di precipitazione al cloruro di litioThermofisherAM9480Precipitazione di sgRNA, senza RNasi
Agarosio a basso punto di fusioneSangonA600015Per la preparazione di gel di agarosio al 4%
Solfato di magnesiosgdbio20025118Per piastre LB
Bagno metallicoQualsiasi marcaN/APer incubazione a temperatura costante
Blu di metileneSigmaM9140Per la preparazione del tampone embrionale
Stampo per microineccitazioneFatto in casaN/APer generare scanalature per trattenere gli embrioni durante la microiniezione
Microloader, punta per il riempimento di Femtotips e altri microcapillari di vetro, sterile, 0,5 - 20 &; L, 100 mm, grigio chiaro, 192 pz. (2 rack e tempi; 96 pz.)Eppendorf5242956003Per caricare la soluzione di microiniezione nell'ago per iniezione, estrattore
per micropipetteStrumentoSutter P-97Per la generazione di aghi per iniezione
MicropipetteEppendorfN/APer tutte le manipolazioni
MicroondeQualsiasi marcaN/APer la colata di piastre per iniezione e gel di agarosio
MinElute PCR Kit di purificazione (50)QIAGEN28004Per purificare i prodotti della PCR e i prodotti della digestione, mMESSAGE mMACHINE T3 senza RNasi
di trascrizioneInvitrogenAM1348Trascrizione in vitro dell'mRNA Cas9,
2Qualsiasi marcaN/APer microiniezione
NaClSigmaS5886Per la preparazione del tampone embrionale e del tampone di lisi
NaHCO3SigmaS5761Per la preparazione di tamponi embrionali
NaOHSangonA100173Per la preparazione di tamponi TAE
Acqua priva di nucleasiThermofisherR0581Manipolazioni correlate all'RNA, senza RNasi
PciINEBR0655Sper digestione enzimatica
Qualsiasi marcaN/AProvette
per strisce PCRamplificazione PCR Qualsiasi marcaN/APer provette
PCRFEITONGKANGblp-200Per piastra
di PetriQualsiasi marcaN/APer l'allevamento di larve di pesce zebra ecc.
Rosso fenoloSigmaP0290Per microiniezione, senza RNasi
Porta pipettaWarner InstrumentsPLI-PH1Per microiniezione
PrimeStar (Premix)TakaraDR040APer clonazione molecolare
Proteinasi KMerck539480Per l'estrazione del DNA genomico
pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)China Zebrafish Resource Center (CZRC)di plasmideCZP11
Centrifuga refrigerataQualsiasi marcaN/APer centrifugazione correlata all'RNA
ScalaSartoriusBCE124-1CCNPer la colata di piastre di iniezione e gel di agarosio
ForbiciQualsiasi marcaN/APer il taglio di code di pesce adulto
SDSSangonA600485Per la preparazione
del tampone di lisiSpazzole piccole QualsiasimarcaN/APer spostare delicatamente gli embrioni su piastre per microiniezione
SpettrofotometroThermofisherNanoDrop 2000Per misure di concentrazione di DNA/RNA
Micrometro da palcoscenicoQualsiasi marcaDIV (Divisione) = 0,01 mmPer quantificare una goccia da 1 nL
Microscopio a stereofluorescenzaOlympusSZX16Per l'osservazione dell'espressione genica
StereomicroscopioMoticSMZ-168Per l'osservazione e la microiniezione
Sistema di produzione di RNA su larga scala T7 RiboMAX ExpressPromegaP1320Trascrizione in vitro di sgRNA, senza RNasi
Incubatrice a temperatura controllataQualsiasi marcaN/APer l'incubazione degli embrioni
TIDE TIDEhttps://tide.nki.nl/Per l'analisi dell'efficienza dell'sgRNA 
Tricaina metanosolfonatoSigmaA5040Per la preparazione della soluzione di tricaina
TrisSangonA600194Per la soluzione di tricaina, il tampone di lisi e la preparazione del tampone TAE
TryptoneOXOIDLP0042Per le piastre LB
PinzetteQualsiasi marcaN/APer il taglio degli aghi da iniezione
XbaINEBR0145SPer enzimatico digestione
Estratto di lievitoOXOIDLP0021Per piastre LB
Sistema di acquario per pesci zebraESEN ESEN-AW-S1Per l'allevamento di pesci adulti
Vasche di accoppiamento per pesci zebra (con divisore)Qualsiasi marcaN/APer l'accoppiamento dei pesci
Zeiss LSM 900+Airyscan2ZEISSZeiss LSM900Per l'imaging confocale dei pesci marcati con fluorescenza e l'analisi dei dati
ZFIN http://zfin.org/Per trovare informazioni sui geni
N da di NTubidel senza RNasi Kit N Per macchina PCR di PCR Modello Cas9

Riferimenti

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