Definizione e confronto dei metodi di rilevamento dell'attività T6SS basati sulla fluorescenza in Acinetobacter baumannii

Summary

Qui, proponiamo un metodo di rilevamento quantitativo basato sulla marcatura fluorescente (in particolare la luciferasi) per valutare in modo efficiente e accurato l'attività del T6SS batterico, adatto per l'analisi ad alto rendimento di ceppi clinici.

Abstract

Il sistema di secrezione di tipo VI (T6SS) è un meccanismo cruciale che media le interazioni intercellulari nei batteri Gram-negativi, in particolare in specie patogene come l'Acinetobacter baumannii. Studi precedenti hanno dimostrato che il grande plasmide pAB3 nel ceppo ATCC 17978 di A. baumannii codifica per una proteina simile a TetR che inibisce l'espressione dei geni principali di T6SS. Al contrario, il ceppo WT^R- , che manca di pAB3, può esprimere e secernere stabilmente la proteina effettrice T6SS Hcp e mostra la capacità di uccidere E. coli. Il gene tssM , uno dei geni fondamentali del T6SS, è essenziale per la sua attività; la sua delezione porta direttamente all'inattivazione di T6SS. Tuttavia, i metodi tradizionali di rilevamento dell'attività T6SS, come i saggi di uccisione, soffrono di bassa produttività e sensibilità insufficiente. Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo sviluppato metodi di rilevamento quantitativo basati sull'etichettatura fluorescente.

Per migliorare il rilevamento dell'attività del T6SS, abbiamo sviluppato tre metodi di marcatura fluorescente: (1) un metodo di rilevamento quantitativo basato sulla marcatura della luciferasi, che è caratterizzato da elevata specificità, sensibilità e riproducibilità, che lo rende adatto per l'analisi ad alto rendimento; (2) Un metodo di rilevamento basato sulla marcatura delle proteine fluorescenti verdi (GFP) che, nonostante sia suscettibile alle interferenze ambientali, offre il vantaggio di un'elevata produttività; (3) Rilevamento della citometria a flusso, che può valutare quantitativamente la vitalità batterica ma è complesso e costoso dal punto di vista operativo. Dopo un confronto completo, il metodo di etichettatura basato sulla luciferasi si è dimostrato il più accurato, sensibile e facile da usare. Quando applicato a 20 isolati clinici di A. baumannii, questo metodo è stato confermato per valutare rapidamente e accuratamente l'attività di T6SS.

Introduction

Il sistema di secrezione di tipo VI (T6SS) è un importante sistema di secrezione proteica nei batteri Gram-negativi, ampiamente coinvolto nella competizione batterica, nell'antagonismo contro gli ospiti eucariotici e nella regolazione delle risposte immunitarie dell'ospite ^1,2. Iniettando proteine effettrici tossiche nei batteri vicini o nelle cellule eucariotiche, il T6SS aiuta i batteri a mantenere un vantaggio competitivo in ambienti complessi. Negli ultimi anni, il ruolo significativo del T6SS nell'adattabilità batterica, nella patogenicità e nelle interazioni microbiche lo ha reso un hotspot di ricerca, in particolare nei patogeni multiresistenti, dove le sue funzioni forniscono potenziali bersagli per lo sviluppo di nuove strategie antibatteriche ^3,4,5.

L'Acinetobacter baumannii (Ab) è un patogeno opportunistico Gram-negativo ampiamente distribuito in ambito ospedaliero. Grazie alla sua elevata resistenza ai farmaci e alla forte adattabilità, è diventato un importante patogeno nosocomiale in tutto il mondo ^6,7,8. La sopravvivenza di A. baumannii in ambienti microbici complessi si basa su molteplici sistemi di secrezione, tra i quali il T6SS svolge un ruolo chiave nella sua competizione con altri microbi e nelle interazioni con l'ospite. Con il suo cluster genico T6SS altamente conservato e le funzioni ben definite, A. baumannii è diventato un modello ideale per lo studio dei meccanismi T6SS. Inoltre, la struttura unica del T6SS in A. baumannii fornisce una prospettiva distintiva per rivelare ulteriormente la diversità e le funzioni del T6SS.

Il cluster genico T6SS di A. baumannii contiene 12 geni proteici principali (come tssA-tssM, privo di tssJ) e diversi geni con funzioni sconosciute (come tagX, tagN, tagF, ecc.)^2,9,10. Tra queste, la proteina coregolata dall'emolisina (Hcp) è un componente importante del T6SS e la sua secrezione è considerata un segno distintivo del T6SS funzionale. Gli studi hanno dimostrato che il grande plasmide pAB3 in A. baumannii inibisce l'espressione di T6SS codificando una proteina regolatrice simile a TetR. Al contrario, i ceppi che hanno perso pAB3 (come WT^R-) possono esprimere e secernere stabilmente Hcp, mostrando una significativa attività di T6SS¹¹. Il gene tssM è uno dei geni principali del T6SS e la sua delezione porta direttamente all'inattivazione del T6SS.

Tuttavia, i metodi tradizionali di rilevamento dell'attività del T6SS (come i saggi di uccisione) presentano limitazioni quali la bassa produttività, la scarsa riproducibilità e la sensibilità insufficiente, che limitano fortemente lo studio approfondito e l'applicazione diffusa del T6SS⁵. Pertanto, lo sviluppo di metodi di rilevamento dell'attività T6SS efficienti e accurati è diventato una necessità urgente nella ricerca attuale. Questo studio mira a stabilire e confrontare i metodi di rilevamento dell'attività T6SS basati sulla marcatura fluorescente per superare le carenze dei metodi tradizionali. Attraverso la tecnologia di marcatura fluorescente, abbiamo ottenuto un monitoraggio quantitativo in tempo reale dell'attività del T6SS, fornendo uno strumento più preciso e affidabile per lo studio delle interazioni batteriche. Questo studio ha convalidato l'efficacia dei metodi di marcatura fluorescente e, confrontando i vantaggi e gli svantaggi di diverse strategie di marcatura fluorescente, ha fornito nuove prospettive e supporto metodologico per la ricerca futura. Non solo offre nuovi mezzi tecnici per la ricerca sul T6SS, ma getta anche una base scientifica per comprendere i complessi meccanismi delle interazioni batteriche e sviluppare nuove strategie terapeutiche antibatteriche.

Protocol

1. Fonti di ceppi e plasmidi

1. Utilizzare il ceppo standard ATCC 17978 di A. baumannii , E. coli (pZY01) e il ceppo clinico di A. baumannii isolato dal Dipartimento di Medicina di Laboratorio del Primo Ospedale dell'Università di Jilin.
2. Utilizzare il plasmide pZY01-GFP (che trasporta un gene di resistenza alla kanamicina, capace di espressione stabile in A. baumannii), che è stato modificato e conservato in laboratorio, e il plasmide pGEN-luxCDABE (che trasporta un gene di resistenza all'ampicillina) acquistato in commercio.
3. Coltura di A. baumannii ed E. coli in terreno di Luria-Bertani (LB) o in un terreno minimo contenente: 50 mM di tampone fosfato di potassio (pH 7,4), 15 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM di MgSO₄, succinato di sodio 0,2% (p/v) come unica fonte di carbonio ed estratto di lievito 0,01% (p/v)¹². Aggiungere antibiotici alle seguenti concentrazioni quando necessario: E. coli: ampicillina (100 μg/mL) e kanamicina (50 μg/mL); A. baumannii: streptomicina (100 μg/mL).
   NOTA: E. coli (pZY01) ed E. coli (pZY01-GFP) esprimono resistenza alla kanamicina. E. coli (pZY01) non ha un marcatore fluorescente, quindi può essere indicato come E. coli nel testo seguente.

2. Preparazione dei ceppi batterici prima dell'esperimento

1. Recuperare i ceppi batterici dal congelatore a -80 °C 2 giorni prima dell'esperimento. Inoculare i ceppi batterici su piastre di agar LB contenenti gli antibiotici corrispondenti. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
   NOTA: Assicurarsi che tutte le cellule conservino i plasmidi all'inizio dell'esperimento.
2. Scegli due colonie singole indipendenti di ciascun ceppo batterico 1 giorno prima dell'esperimento. Inoculare ciascuna colonia separatamente in due provette individuali contenenti 5 ml di terreno liquido LB. Incubare le colture per una notte a 37 °C con agitazione a 200 giri/min. Utilizzare queste impostazioni cultura per gli esperimenti successivi.
   NOTA: Ottimizzare il tempo di incubazione in base al tasso di crescita batterica per garantire l'ottenimento di una quantità adeguata di biomassa batterica.

3. Preparazione di ceppi di E. coli (GFP)/ E. coli (Luciferasi)

1. Trasformazione
   1. Aggiungere 50 ng di DNA plasmidico (pZY01-GFP o pGEN-luxCDABE, quantificato tramite NanoDrop a A260/A280) in 100 μL di cellule competenti DH5α di E. coli , rispettivamente, e mescolare delicatamente.
   2. Incubare in ghiaccio per 30 min, shock termico a 42 °C per 60 s, e porre immediatamente in ghiaccio per 30 s.
   3. Aggiungere 700 μL di brodo LB privo di antibiotici e incubare a 37 °C agitando a 180 giri/min per 2 ore.
2. Placcatura e coltura
   1. Centrifugare a 420 × g per 2 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 μl di brodo LB privo di antibiotici.
   2. Distribuire il prodotto di trasformazione pZY01 (GFP) su piastre di agar LB contenenti 50 μg/mL di kanamicina.
   3. Distribuire il prodotto di trasformazione pGEN-luxCDABE su piastre di agar LB contenenti 100 μg/mL di ampicillina. Incubare a 37 °C per una notte.
3. Verifica dei cloni positivi
   1. Scegli singole colonie ed estrai il DNA come modelli di reazione a catena della polimerasi (PCR) il giorno successivo. Eseguire l'amplificazione PCR e verificare mediante elettroforesi su gel di agarosio.
   2. Confermare i ceppi positivi ed etichettarli come E. coli (GFP) ed E. coli (Luciferasi).
      NOTA: Assicurarsi che la qualità delle celle competenti sia elevata per una trasformazione efficiente. Evitare l'eccesso di liquidi batterici durante la placcatura per evitare interferenze con l'isolamento di una singola colonia.

4. Western blotting

1. Preparazione del campione
   1. Raccogliere le colture batteriche e centrifugare (1500 × g, 10 min, 4 °C) per separare il pellet cellulare e il surnatante.
   2. Aggiungere una quantità adeguata di tampone di caricamento sia al pellet della cella che al surnatante. Far bollire a 100 °C in un bagno di metallo per 10 min. Centrifugare (1500 g, 10 min, 4 °C) e raccogliere i surnatanti come campioni proteici.
   3. Misurare la concentrazione di proteine utilizzando l'acido bicinchoninico (BCA) o il metodo Bradford e regolare alla stessa concentrazione.
2. Elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE)
   1. Preparare i gel SDS-PAGE con concentrazioni appropriate (ad es. 12% di gel separatore, 5% di gel impilabile)¹³.
   2. Caricare 20 μg di campioni di proteine nei pozzetti del gel insieme a un marcatore proteico precolorato da 1-2 μl. Eseguire l'elettroforesi a 100-120 V fino a quando l'indicatore blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel.
      NOTA: Tampone di funzionamento: Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,1% (p/v), acqua distillata fino a 1 L.
3. Trasferimento (Western Blotting)
   1. Rimuovere il gel dalle lastre di vetro e immergerlo nel tampone di trasferimento. Preparare una membrana in polivinilidene difluoruro (PVDF) o nitrocellulosa (NC), attivare la membrana in PVDF con metanolo e quindi immergerla nel tampone di trasferimento.
      NOTA: Tampone di trasferimento: 25 mM Tris, 192 mM di glicina, 20% metanolo
   2. Assemblare l'apparato di trasferimento in una struttura "a sandwich" (carta da filtro-gel-membrana-carta da filtro). Trasferimento a 100 V per 60-90 min (regolare il tempo in base al peso molecolare delle proteine; Le proteine della cellula ospite (HCP) hanno un peso molecolare di circa 17 kDa).
      NOTA: Immergere il serbatoio di trasferimento in acqua ghiacciata e aggiungere impacchi di ghiaccio per mantenere una temperatura bassa. Se il tempo di trasferimento è lungo, sostituire gli impacchi di ghiaccio a metà strada.
4. Inceppamento
   1. Dopo il trasferimento, immergere la membrana in una soluzione bloccante il latte scremato al 5%. Bloccare a temperatura ambiente (RT) su uno shaker per 1 ora o per una notte a 4 °C.
5. Incubazione degli anticorpi primari
   1. Lavare la membrana tre volte con soluzione salina tamponata Tris (TBS) contenente lo 0,1% di tampone Tween 20 (TBST), 5 minuti ogni volta. Incubare la membrana con anticorpi primari diluiti (anticorpo anti-Hcp di topo, diluizione 1:1000; anticorpo anti-isocitrato deidrogenasi (ICDH) di topo, diluizione 1:1000) a 4 °C durante la notte o RT per 2 ore.
6. Incubazione secondaria degli anticorpi
   1. Lavare la membrana con tampone TBST 3 volte, 5 minuti ciascuna. Incubare la membrana con anticorpo secondario diluito (IgG anti-topo coniugata con perossidasi di rafano [HRP], diluizione 1:3000) a RT per 2 ore.
7. Scoperta
   1. Lavare la membrana con tampone TBST 3 volte, 5 minuti ciascuna. Preparare il substrato chemiluminescente ECL e applicarlo uniformemente sulla membrana.
   2. Rilevare i segnali utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza e acquisire immagini (la proteina HCP ha un peso molecolare di circa 17 kDa, ICDH è un enzima metabolico citoplasmatico con un peso molecolare previsto di circa 45 kDa in A. baumannii).
      NOTA: L'ICDH è un importante marcatore di controllo della qualità che può essere rilevato solo nella frazione di pellet cellulare (contenente batteri intatti) e non nella frazione surnatante (contenente proteine secrete), dimostrando così che non si è verificata alcuna lisi cellulare durante la preparazione del campione. La secrezione di Hcp (17 kDa) dovrebbe essere visibile solo nei surnatanti dei ceppi attivi in T6SS.

5. Preparazione di piastre a 96 pozzetti con terreno di coltura LB agar

1. Aggiungere rapidamente il terreno di agar LB autoclavato privo di antibiotici, preriscaldato, in una piastra sterile a 96 pozzetti, 50 μl per pozzetto. Lasciare riposare la piastra a RT per almeno 1 ora per garantire la completa solidificazione del fluido.
2. Utilizzare piastre a parete nera con fondo trasparente per rilevare la fluorescenza GFP.
3. Utilizzare piastre a 96 pozzetti a prova di luce per rilevare la fluorescenza della luciferasi per evitare interferenze di fluorescenza a pozzetti incrociati.
   NOTA: Evitare di generare bolle durante l'aggiunta del terreno per garantire uno spessore uniforme del gel, che favorisce un contatto e una crescita batterica ottimali.

6. Saggio di uccisione di A. baumannii

1. Saggio di uccisione standard
   1. Coltura di ceppi mutanti WT^R- e ΔtssM durante una notte a 37 °C con agitazione in terreno LB integrato con 100 μg/mL di streptomicina, crescono E. coli separatamente in terreno LB contenente 50 μg/mL di kanamicina in condizioni identiche.
   2. Lavare due volte le colture batteriche con PBS sterile e risospenderle in un terreno LB fresco privo di antibiotici. Regolare l'OD₆₀₀ a 1,0 per la standardizzazione.
   3. Mescolare i ceppi mutanti WT^R- e ΔtssM con E. coli in un rapporto 1:1.
   4. Posizionare 10 μl della sospensione batterica mista su piastre di agar LB prive di antibiotici e incubare a 37 °C per 6 ore.
   5. Raschiare le macchie batteriche e risospenderle in 1 mL di PBS. Eseguire cinque diluizioni seriali da 10 volte.
   6. Posizionare 10 μl di sospensioni batteriche diluite su piastre LB contenenti kanamicina e incubare per una notte a 37 °C.
   7. Analizzare l'attività antibatterica T6SS-dipendente dei ceppi mutanti WT^R- e ΔtssM mediante conteggio delle colonie.
      NOTA: Assicurarsi che le sospensioni batteriche siano accuratamente miscelate per evitare errori sperimentali. Eseguire almeno tre repliche indipendenti per ogni campione per garantire l'affidabilità dei dati.
2. Rilevamento quantitativo dell'attività del T6SS mediante marcatura con luciferasi
   1. Standardizzare l'OD₆₀₀ di E. coli (Luciferasi), mutanti WT^R-, ΔtssM e altri ceppi (ad esempio, ATCC 17978, E. coli, Ab#40, Ab#170, Ab#180) a 1,0. Aggiungere 5 μl di sospensione batterica a una piastra a 96 pozzetti contenente agar LB privo di antibiotici. Dopo l'essiccazione all'aria al buio, misurare la bioluminescenza a base di luciferasi per verificare la specificità della luminescenza di E. coli (Luciferasi).
   2. Eseguire una diluizione seriale di 5 volte di E. coli (Luciferasi). Posizionare 10 μl della sospensione batterica diluita su una piastra a 96 pozzetti con agar LB e una piastra vuota a 96 pozzetti (entrambe a prova di luce). Misurare la bioluminescenza a base di luciferasi per valutare la sensibilità del metodo di rilevamento a base di luciferasi e confermare se l'agar LB interferisce con il segnale di luminescenza.
   3. Mescolare E. coli (Luciferasi) con mutanti WT^R-, ΔtssM e 20 ceppi clinici (OD₆₀₀ standardizzato a 1,0) in un rapporto 1:1. Diluire 10 volte, aggiungere 5 μl a una piastra a 96 pozzetti e impostare tre repliche tecniche.
   4. Dopo l'essiccazione all'aria al buio, misurare la bioluminescenza. Incubare a 37 °C al buio per 4-6 ore, quindi misurare nuovamente la bioluminescenza (lunghezza d'onda di emissione: 562 nm).
   5. Valutare quantitativamente l'attività antibatterica T6SS-dipendente confrontando i valori di bioluminescenza prima e dopo la co-coltura.
      NOTA: Assicurarsi che le sospensioni batteriche siano accuratamente miscelate per evitare errori sperimentali. Eseguire almeno tre repliche indipendenti per ogni campione per garantire l'affidabilità dei dati. Usa il t-test di Student per l'analisi statistica.
3. Rilevamento dell'attività del T6SS mediante marcatura GFP
   1. Seguire la stessa procedura dell'esperimento di marcatura della luciferasi (lunghezza d'onda di eccitazione: 480 nm, lunghezza d'onda di emissione: 509 nm).
   2. Miscelare E. coli (GFP) con mutanti WT^R- e ΔtssM (OD₆₀₀ standardizzato a 1,0) in un rapporto 1:1. Posizionare 10 μl su piastre di agar LB prive di antibiotici. Dopo l'essiccazione all'aria in RT, acquisire le immagini utilizzando il canale di fluorescenza GFP (programma Alex488, eccitazione: 488 nm, emissione: 509 nm) di un sistema di imaging multifunzionale.
   3. Incubare a 37 °C al buio per 4-6 ore, quindi acquisire nuovamente le immagini. Valutare l'attività del T6SS in base alle variazioni dell'intensità della fluorescenza delle macchie batteriche.
      NOTA: Eseguire tutti i passaggi al buio per evitare interferenze con i segnali di fluorescenza. Garantire un'accurata miscelazione delle sospensioni batteriche per evitare errori sperimentali. Eseguire almeno tre repliche indipendenti per ogni campione per garantire l'affidabilità dei dati.
4. Rilevamento della citometria a flusso
   1. Mescolare i mutanti WT^R- con E. coli (GFP) e i mutanti ΔtssM con E. coli (GFP) in un rapporto 1:1. Prelevare una quantità appropriata della sospensione batterica miscelata e diluirla a una concentrazione adeguata (tipicamente OD₆₀₀ di 0,1-0,5) utilizzando PBS sterile o tampone 1×.
      NOTA: 1× tampone si riferisce al tampone di colorazione per citometria a flusso (1×), gli ingredienti includono: 1× PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4), integrato con: 2-5% (v/v) FBS inattivato a caldo (o 1% BSA in alternativa), 2 mM EDTA.
   2. Centrifugare la sospensione batterica mista diluita a 300 x g per 2 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 1 mL di PBS sterile o tampone 1× e mescolare delicatamente. Filtrare la soluzione risospesa attraverso un filtro cellulare da 35 μm per rimuovere gli aggregati e garantire una sospensione a cella singola.
   3. Accendere il citometro a flusso, preriscaldare il laser e calibrare lo strumento.
      1. Impostare i parametri di rilevamento: utilizzare un laser a 488 nm per eccitare la GFP. Canale di rivelazione: FL1 (tipicamente un filtro da 530/30 nm per la rivelazione di fluorescenza GFP). Impostare i parametri di dispersione diretta (FSC) e laterale (SSC) per distinguere le cellule batteriche.
      2. Utilizzare E. coli non marcato come controllo negativo, regolare la tensione e il guadagno e assicurarsi che la popolazione GFP-negativa sia alla base del segnale di fluorescenza.
   4. Miscelare delicatamente il campione filtrato e trasferire 100 μl in una provetta per citometria a flusso.
      1. Analizzare i campioni utilizzando le seguenti impostazioni dello strumento: Impostare la soglia FSC-H su 19.000 per escludere i detriti, con valori di guadagno di 100 (FSC), 110 (SSC) e 80 (FITC).
      2. Per il gating, escludere inizialmente i detriti e i segnali non target nel grafico a dispersione FSC-A rispetto a SSC-A, seguito dall'analisi della popolazione nel canale FITC. Acquisire un minimo di 10.000 eventi dalla popolazione target (definita dalle caratteristiche FSC/SSC) per ogni campione.
   5. Analizza i dati utilizzando un software di citometria a flusso (ad es. FlowJo, BD FACSDiva).
      1. Tracciare grafici a dispersione FSC e SSC per controllare la popolazione batterica target. Tracciare gli istogrammi di fluorescenza FL1 per distinguere le popolazioni GFP-positive e GFP-negative.
      2. Calcolare la percentuale di cellule GFP-positive e l'intensità media di fluorescenza (MFI).
   6. Centrifugare la restante sospensione batterica miscelata a 300 g per 2 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 10 μL di acqua sterile e posizionarlo su piastre di agar LB prive di antibiotici.
   7. Incubare a 37 °C al buio per 5 ore, quindi raschiare le macchie batteriche e risospenderle in 500 μL di 1× PBS. Prelevare 100 μl della soluzione risospesa, diluire in modo appropriato ed eseguire la rivelazione con citometria a flusso, ripetendo i passaggi 6.4.4-6.4.5.
   8. Confrontare la percentuale di cellule GFP-positive e l'intensità della fluorescenza prima e dopo la co-coltura. Valutare l'effetto di uccisione dei mutanti WT^R- e ΔtssM su E. coli (GFP).
      NOTA: Assicurarsi che la sospensione sia a cella singola per evitare che l'aggregazione cellulare influisca sui risultati del rilevamento. Calibrare lo strumento prima del rilevamento per garantire l'accuratezza e la riproducibilità dei segnali di fluorescenza. Evitare di esporre i campioni a una luce intensa durante l'esperimento per evitare l'estinzione della fluorescenza GFP. Eseguire almeno tre repliche per ogni campione per garantire l'affidabilità dei dati.

Results

I metodi tradizionali per rilevare l'attività di T6SS prevedono in genere la co-coltura di ceppi predatori e bersaglio su piastre di agar LB prive di antibiotici per 5 ore, seguita dal raschiamento delle macchie batteriche, dalla loro risospensione e dall'esecuzione di diluizioni seriali. La sospensione batterica diluita viene quindi localizzata su piastre di agar selettive. Contando le colonie del ceppo bersaglio sulle piastre il giorno successivo, l'attività del T6SS può essere valutata qualitativamente. Tuttavia, ques...

Discussion

Il sistema di secrezione di tipo VI (T6SS) è un complesso macchinario multiproteico le cui funzioni sono realizzate principalmente attraverso la secrezione di proteine effettrici. Queste proteine effettrici mediano la competizione interbatterica uccidendo o inibendo altre specie batteriche, fornendo così al batterio ospite un vantaggio competitivo nelle comunità microbiche¹⁵. Oltre al suo ruolo nella competizione, gli studi hanno dimostrato che il T6SS è coinvolto...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10%, 15% Kit di preparazione gel SDS-PAGE	Epizyme	PG112-20
° C Congelatore	Haier	HYCD-290
37 ° C Incubatrice	Bluepard	181254254
4 gradi C Frigorifero	Haier	HYC390-80
C Congelatore	Haier	DW-86L726G(726L)Piastra
a 96 pozzetti	JET	TCP010096
Agar	Biofrox	8211KG001
Persolfato di ammonio (APS)	Thermo	7727-54-0
Cabina di sicurezza biologica	ESCO	AC2-4S1
Bilancia elettronica	Sartorius AG	BSA124S-CW
Apparecchio per elettroforesi	BIO-RAD	POWER
Macchina per il ghiaccio in scaglie	Citometro a	XB70
	BECKMAN COULTER	AW38143
Citometria a flusso Colorazione Tampone	proteintech	PF00018
Sistema di imaging su gel	BIO-RAD	Gel Doc 2000
Glycine	Zike	ZK-L2577
Centrifuga ad alta velocità	Eppendorf	5405IN106358
Anticorpo secondario di coniglio/topo coniugato HRP	proteintech	SA00001-2
LB Brodo	Solarbio	L8291
Centrifuga ad alta velocità a bassa temperatura	Thermo	17R
Metanolo	Thermo	R40121
Micro Spettrofotometro UV-Vis	Thermo	Nanodrop one
Microcentrifuga	allsheng	Mini-6k
Lettore di micropiastre	Bio-Tek	H1M
NuPAGE LDS Sample Buffer	Thermo	NP0007
Soluzione tampone fosfato (PBS)	Zike	ZK-L1649
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610374
SDS Tampone di caricamento del campione	Beyotime	poo15L
Latte scremato in polvere	Thermo	LP0033B
Dodecil solfato di sodio (SDS)	Zike	zk6885
Bagno d'acqua termostatico	JingHong	DK-420S
Apparecchio di trasferimento	Bio-Rad	PowerPac HC
Tris(idrossimetil)amminometano (Tris)	Zike	ZK-L2557
Apparecchio per elettroforesi verticale	Bio-Rad	Mii-PROTEAN Tetra