Il presente protocollo descrive un metodo chirurgico standardizzato per l'induzione di aneurismi carotidei in un modello murino attraverso un singolo intervento chirurgico.
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Articolo metodologico
Un modello murino di formazione dell'aneurisma carotideo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli aneurismi cerebrali sono presenti in circa il 2%-5% della popolazione e rappresentano un problema significativo per la salute pubblica a causa dei loro alti tassi di mortalità e morbilità in caso di rottura. Nonostante i progressi nella ricerca, lo sviluppo di modelli animali efficaci e riproducibili rimane una sfida. Tra i modelli disponibili, gli aneurismi indotti chirurgicamente sono ampiamente utilizzati; Tuttavia, la complessità tecnica di queste procedure spesso ne limita l'accessibilità. Questi metodi richiedono una vasta esperienza chirurgica e sono associati a tassi più elevati di mortalità intraoperatoria o formazione di aneurisma incoerente, che possono compromettere l'affidabilità dei risultati sperimentali. Per affrontare queste limitazioni, questo articolo video introduce una procedura chirurgica semplificata per l'induzione di aneurismi carotidee nei topi, eseguita in un'unica sessione. Questo approccio semplificato ha dimostrato un impressionante tasso di successo dell'87% nell'indurre aneurismi carotidee nei topi femmina. Riducendo le sfide tecniche e migliorando la riproducibilità, questo metodo fornisce un'alternativa pratica e affidabile per la ricerca sull'aneurisma cerebrale. La sua adozione diffusa potrebbe facilitare studi standardizzati, accelerare lo sviluppo di strategie terapeutiche e, in ultima analisi, far progredire la nostra comprensione della fisiopatologia dell'aneurisma.
Introduzione
Gli aneurismi cerebrali sono dilatazioni localizzate nelle pareti dei vasi sanguigni cerebrali, che colpiscono circa il 2%-5% della popolazione generale. La rottura di questi aneurismi può provocare un'emorragia subaracnoidea, che comporta alti tassi di mortalità e morbilità 1,2. Comprendere la patogenesi degli aneurismi cerebrali e identificare potenziali bersagli terapeutici richiede modelli animali affidabili e riproducibili che imitino la malattia umana. Questo articolo introduce un metodo chirurgico standardizzato per indurre gli aneurismi carotidei nei topi, offrendo un'alternativa pratica ed efficiente ai modelli intracranici tecnicamente più impegnativi3.
Lo sviluppo di questa tecnica è motivato dalle sfide associate ai modelli di aneurisma cerebrale esistenti. I modelli di aneurisma intracranico, sebbene ampiamente utilizzati, richiedono procedure chirurgiche complesse e sono limitati dal piccolo calibro dei vasi intracranici, che ostacola la loro utilità per testare i dispositivi endovascolari e altri interventi 4,5. Inoltre, le variazioni nei metodi utilizzati negli studi, come le differenze nelle concentrazioni di elastasi e nei tempi di esposizione, riducono la riproducibilità e ostacolano i confronti tra studi. Standardizzando la procedura, questa tecnica affronta queste limitazioni e fornisce un alto tasso di successo nell'induzione dell'aneurisma con un rischio chirurgico minimo.
Rispetto ai metodi alternativi, il modello di aneurisma carotideo offre diversi vantaggi distinti. In primo luogo, la procedura chirurgica semplificata riduce le barriere tecniche, rendendola più accessibile a una gamma più ampia di laboratori. In secondo luogo, il calibro maggiore dell'arteria carotide rispetto ai vasi intracranici facilita la sperimentazione di approcci terapeutici, compresi i dispositivi endovascolari. Studi precedenti hanno dimostrato variazioni di questo modello con risultati promettenti, ma protocolli incoerenti hanno una riproducibilità limitata 6,7. Il nostro approccio perfeziona questi metodi, raggiungendo un tasso di successo dell'87% nei topi femmina e garantendo la coerenza tra gli esperimenti.
Nel contesto più ampio della letteratura, i modelli animali per gli aneurismi cerebrali sono fondamentali per comprendere i meccanismi della malattia, valutare i bersagli terapeutici e sviluppare strategie di intervento. I modelli sono stati sviluppati in varie specie, tra cui pesci zebra, ratti, conigli e cani, ognuno con vantaggi e limitazioni unici 3,8. Questo modello di aneurisma carotideo integra il repertorio esistente offrendo un equilibrio tra fattibilità tecnica e rilevanza per la malattia umana, rendendolo un'opzione ideale per i ricercatori che cercano un modello affidabile e riproducibile per gli studi preclinici.
Questo metodo è particolarmente adatto per i laboratori che mirano a studiare le basi molecolari e biomeccaniche della formazione di aneurisma, testare agenti farmacologici o valutare dispositivi endovascolari. I ricercatori dovrebbero considerare se le caratteristiche anatomiche e fisiologiche di questo modello sono in linea con i loro specifici obiettivi sperimentali. Fornendo un protocollo standardizzato e riproducibile, questa tecnica mira a far progredire la ricerca sull'aneurisma cerebrale e a promuovere una maggiore coerenza tra gli studi sul campo.
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Protocollo
Il protocollo sugli animali è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IS00022015) dell'Università di Pittsburgh. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J wild-type (WT), di 6-8 settimane di età. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione degli animali
- Indurre l'anestesia.
- Posizionare il topo in una camera di induzione e somministrare gas isoflurano alla concentrazione del 3%-4% per l'induzione utilizzando un sistema di vaporizzazione per anestesia (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente). Regolare la portata a 1,0-1,5 L/min di ossigeno.
- Monitorare l'animale per rilevare la presenza di segni di anestesia completa (ad esempio, mancanza di risposta agli stimoli esterni e riduzione della frequenza respiratoria).
- Trasferimento in sede chirurgica.
- Una volta che il topo è completamente anestetizzato, trasferirlo alla stazione chirurgica mantenendo l'anestesia con isoflurano a una concentrazione di mantenimento dell'1-3% e una portata di ossigeno di 0,8-1,0 L/min. Assicurarsi che il mouse sia collegato al sistema di erogazione dell'anestesia tramite un cono nasale.
- Mantenimento della temperatura.
- Posizionare il mouse su un tappetino riscaldante preimpostato a 36 °C. Collegare una sonda di temperatura per monitorare continuamente la temperatura corporea durante tutta la procedura. Se necessario, regolare l'impostazione del termoforo per mantenere una temperatura stabile.
2. Preparazione per l'intervento chirurgico
- Immobilizza l'animale.
- Posiziona il mouse in posizione supina. Utilizzare strisce di nastro chirurgico per fissare delicatamente ogni arto alla piattaforma chirurgica, assicurando che il corpo sia stabilizzato senza tensioni eccessive.
- Radere la zona del collo.
- Utilizzando un piccolo tagliacapelli chirurgico, radere il pelo dalla regione del collo (circa 2 cm x 2 cm di area). Rimuovere i peli sciolti con una garza chirurgica sterile.
- Sterilizzare il sito chirurgico.
- Applicare due cicli di soluzione di iodio povidone sulla zona del collo utilizzando applicatori con punta di cotone, seguiti da due cicli di etanolo al 70%. Lasciare asciugare l'area all'aria tra un'applicazione e l'altra per garantire una corretta sterilizzazione.
3. Stadio I: Legatura dell'arteria carotide comune
- Confermare l'anestesia.
- Esegui un test di pizzicamento delle dita dei piedi utilizzando una pinza smussata. La mancanza di ritiro o movimento riflesso conferma un'anestesia adeguata.
- Eseguire l'incisione della linea mediana.
- Utilizzando le forbici chirurgiche, praticare un'incisione verticale di 1 cm lungo la linea mediana del collo, partendo da appena sotto la mascella. Tagliare il derma e la fascia sottostante.
- Esporre la ghiandola sottomandibolare.
- Utilizzare una pinza smussata per mobilizzare lateralmente la ghiandola sottomandibolare, facendo attenzione a non danneggiare i tessuti circostanti. Sollevare delicatamente la ghiandola e separarla dallo sterno mediante dissezione smussata.
- Fissare la ghiandola con un piccolo divaricatore sterile o una clip per mantenere un campo chirurgico libero.
- Esporre il muscolo sternocleidomastoideo (SCM).
- Identificare visivamente il muscolo sternocleidomastoideo omolaterale (SCM). Usa una pinza smussata per sollevare delicatamente il muscolo e infilare una sutura di seta intrecciata 5-0 sotto. Riflettere il muscolo lateralmente tirando delicatamente la sutura per esporre la guaina carotidea.
- Isolare l'arteria carotide.
- Aprire la guaina carotidea utilizzando una pinza affilata. Separare con cura l'arteria carotide dalla vena giugulare adiacente e dal nervo vago.
- Per migliorare la visibilità, inserire una cuffia sterile in silicone o un divaricatore sotto l'arteria carotide. Evitare di causare traumi all'arteria o alle strutture circostanti.
- Legare l'arteria carotide.
- Usando una pinza affilata, raccogli l'arteria carotide e infila una sutura 9-0 sotto. Fare un doppio nodo sicuro per legare l'arteria, garantendo una tensione adeguata per occludere il flusso sanguigno senza danneggiare il vaso. Taglia le estremità della sutura per ridurre al minimo l'irritazione dei tessuti.
- Chiudere l'incisione.
- Approssimare i bordi della pelle utilizzando una sutura di nylon sterile (5-0) o graffette chirurgiche. Applicare una leggera pressione con una garza sterile per garantire l'emostasi.
4. Assistenza post-operatoria
- Monitora l'animale.
- Osservare quotidianamente l'animale per segni clinici di complicanze come rottura prematura dell'aneurisma (evidenziata da letargia improvvisa o ematoma), ictus, convulsioni o significativa perdita di peso (>10% del peso basale).
- Sopprimere prontamente gli animali (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) che presentano sintomi gravi per ridurre al minimo il dolore e l'angoscia.
- Cura delle ferite
- Immediatamente dopo l'intervento, applicare gel di lidocaina al 4% sul sito dell'incisione per alleviare il dolore locale. Applicare uno strato sottile di unguento antibiotico (ad es. bacitracina) per prevenire l'infezione. Ripetere la cura della ferita ogni giorno per almeno 3 giorni o fino a quando la ferita non mostra segni di guarigione.
- Ambiente di ripristino
- Metti l'animale in una gabbia di recupero pulita con lettiera morbida. Assicurati l'accesso a liquidi riscaldati o a un gel idratante per favorire il recupero. Monitora fino a quando l'animale non è completamente sveglio e mobile, quindi rimettilo nel suo alloggiamento standard.
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Risultati
Un totale di 15 topi femmina wild-type (WT) sono stati sottoposti alla procedura di induzione dell'aneurisma seguendo il protocollo standardizzato descritto (Figura 1). Due settimane dopo l'intervento, la formazione di aneurisma è stata raggiunta con successo in circa l'87% dei topi, come confermato dall'esame morfologico macroscopico (Figura 2 e Figura 3). Questi ri...
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Discussione
Il modello di aneurisma carotideo indotto dalla legatura dell'arteria carotide è stato inizialmente descritto negli anni '70 da Yasargil e Matsuda, che hanno utilizzato innesti venosi per indurre lo sviluppo dell'aneurisma 9,10. Successive modifiche a questa tecnica, tra cui l'aggiunta del trattamento con elastasi e della legatura carotidea, hanno permesso la generazione di aneurismi carotidei più grandi in modo più efficiente e ...
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sutura intrecciata assorbibile 5-0 | Ethicon / Ethilon | J463G | |
| Sutura monofilamento non assorbibile 5-0 | Ethicon / Ethilon | 8698G | |
| Sutura monofilamento non assorbibile 9-0 | Ethicon / Ethilon | 2829G | |
| Assorbenti per la preparazione dell'alcol | Medline | CUR45585RB | |
| Animal Pocket Pro Shaver | Wahl | 9861-900 | |
| Pinza Dumont #5 | Roboz | RS-5058 | |
| Pinzette in titanio Dumont; Modello #5 | Roboz | RS-5050 | |
| Pinza Graefe | Roboz | RS-5138 | |
| Pinza Tissutale Graefe | Roboz | RS-5155 | |
| Lidocaina, 4%, topica | Medline | 52565-009-50 | |
| Micro-clip dritta, 5 mm | Roboz | RS-5420 | |
| Forbici micro-dissezionanti | Roboz | RS-5610 | |
| Micro-Sclip dritto, 8 mm | Roboz | RS-5424 | |
| Pinza a zanzare, 4" | Roboz | RS-7100 | |
| Guanti in nitrilo | Fisherbrand | 19-130-1597 | |
| Penicillina-Streptomicina | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Elastasi pancreatica suina | Worthington | LS002274 | |
| Povidone-Iodio | Medline | MDS093943 | |
| Forbici, extra-fine | Roboz | RS-5880 | |
| Forbici, va bene | Roboz | RS-5840 | |
| Soluzione salina sterile allo 0,9% | Baxter | 2B1324X | |
| Applicatore di cotone sterile | Dynarex | 4303 | |
| Asciugamani chirurgici sterili e usa e getta, blu | Medline | MDT2168202H | |
| Rivestimento trasparente Tegaderm | 3M | 1624W |
Riferimenti
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