Articolo metodologico

Studio delle interazioni tra cellule mieloidi e cellule CAR T in vitro e in vivo

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DOI:

10.3791/68013

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25 luglio 2025

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1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 4Division of Hematology, Mayo Clinic, 5Department of Immunology, Mayo Clinic

In questo articolo

Sommario

Dati i limitati modelli di xenotrapianto disponibili per studiare le interazioni tra CART umane e cellule mieloidi, abbiamo stabilito modelli in vitro e in vivo per comprendere l'impatto dei macrofagi umani sulle cellule CART. I risultati possono potenzialmente essere generalizzati per valutare i ruoli dei macrofagi nel microambiente tumorale e testare immunoterapie mirate ai macrofagi.

Abstract

La terapia cellulare con recettore T dell'antigene chimerico (CART) ha portato a notevoli successi clinici nel trattamento delle neoplasie ematologiche. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti recidiva entro 1-2 anni. Sono stati identificati diversi meccanismi che portano alla resistenza alla CART, tra cui l'inibizione delle cellule T da parte delle cellule mieloidi immunosoppressive. Prove crescenti hanno dimostrato che i monociti e i macrofagi nel microambiente tumorale (TME) contribuiscono a scarse prestazioni e risultati clinici della CART. I modelli preclinici per studiare le interazioni tra macrofagi umani e cellule CART sono limitati. Qui, discutiamo gli approcci per comprendere gli impatti dei macrofagi umani sulle cellule CART sia in vitro che in vivo. Descriviamo modelli di cocoltura in vitro per dimostrare che i macrofagi immunosoppressivi inibiscono le funzioni della CART. Inoltre, riportiamo un modello di xenotrapianto in cui macrofagi umani e cellule tumorali sono innestati sottocutaneamente in topi NSG per studiare le interazioni dei macrofagi M2-like con le cellule CART e le cellule tumorali. Questi modelli possono essere utilizzati per valutare il ruolo dei macrofagi nel TME e testare immunoterapie antitumorali mirate ai macrofagi.

Introduzione

La terapia cellulare con recettore dell'antigene chimerico autologo T (CART) ha ottenuto successi clinici nel trattamento di neoplasie ematologiche recidivanti o refrattarie, che hanno portato all'approvazione da parte della FDA statunitense di sei prodotti CART mirati al CD19 o all'antigene di maturazione delle cellule B (BCMA)1. Nonostante l'impressionante attività iniziale della terapia cellulare CART, la maggior parte dei pazienti recidiva entro i primi 1-2 anni dopo il trattamento2. Sono stati identificati diversi meccanismi di resistenza alla CART, tra cui la fitness subottimale delle cellule T, la fuga dell'antigene e la scarsa persistenza della CART, nonché l'inibizione mediata dal microambiente tumorale immunosoppressivo (TME)2,3. Le cellule mieloidi, come i monociti e i macrofagi, spesso costituiscono una parte significativa del TME e si sono dimostrate i principali inibitori di altre cellule immunitarie, comprese le cellule T 4,5. Gli effetti dannosi delle cellule mieloidi nel contesto dell'efficacia terapeutica delle cellule CART sono stati riportati in modelli preclinici e in studi clinici sia su tumori ematologici che solidi 3,6. L'inibizione mediata dalla mieloide può verificarsi fin dall'inizio del processo di produzione di CART: è stato dimostrato che i monociti nel prodotto di aferesi iniziale inibiscono l'espansione ex vivo di CART 7,8. Data l'accumulazione di prove di inibizione della CART mediata dalla mieloide, molti studi hanno mirato a ingegnerizzare le cellule CART per colpire ed eliminare i macrofagi immunosoppressivi nel TME per migliorare le risposte immunitarie5. Tuttavia, i meccanismi alla base delle interazioni tra le cellule CART e i macrofagi immunosoppressivi non sono ancora completamente chiariti. Inoltre, esistono limitati modelli di xenotrapianto disponibili al pubblico di queste interazioni. Pertanto, c'è un urgente bisogno di modelli che studino le interazioni tra macrofagi umani e cellule CART sia in vitro che in modelli murini.

Qui, descriviamo un metodo in cui le cellule CART umane CD19-targeted (CART19) vengono cocoltivate con cellule tumorali CD19+ e macrofagi M2-like polarizzati ex vivo . Inoltre, riportiamo un modello murino di xenotrapianto in cui topi immunodeficienti sono innestati sottocutaneamente sia con cellule bersaglio che con macrofagi umani, consentendo la valutazione di immunoterapie di interesse in un contesto con macrofagi immunosoppressivi. In particolare, abbiamo analizzato la proliferazione antigene-specifica di CART in presenza o assenza di macrofagi immunosoppressivi in vitro, mostrando una significativa inibizione nell'espansione delle cellule T sia nelle piastre transwell che in quelle di co-coltura diretta. Nel nostro modello di xenotrapianto, i topi NSG sono stati trapiantati sottocutaneamente con cellule tumorali e macrofagi umani sospesi in Matrigel per lo screening terapeutico. Questo modello animale ha dimostrato con successo che i macrofagi umani immunosoppressivi differenziati ex vivo erano in grado di promuovere la progressione tumorale nei topi NSG. Seguendo questo protocollo, è possibile testare l'efficacia delle terapie immunosoppressive mirate ai macrofagi, compresi i farmaci a piccole molecole, i biologici e altre terapie cellulari. Tuttavia, a causa delle limitazioni dell'uso di topi immunodeficienti per studiare il TME umano, i modelli proposti sono più adatti per gli studi proof-of-concept.

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Protocollo

Il protocollo seguente segue le linee guida dell'Institutional Review Board (IRB), dell'Institutional Biosafety Committee (IBC) e del Department of Comparative Medicine della Mayo Clinic nell'ambito del protocollo A00001767 dell'Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Preparazione di monociti classici umani per lo studio in vitro

  1. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da donatori di sangue sani come descritto in precedenza9. Brevemente, diluire il sangue intero con FBS al 2% in PBS con un rapporto di volume di 1:1, seguito dall'isolamento di PBMC in mezzo a gradiente di densità.
  2. Isolare i monociti classici umani (CD14+CD16-) dalle PBMC raccolte mediante selezione di biglie magnetiche negative secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Lavare brevemente, il numero appropriato di PBMC con tampone di isolamento e risospendere le cellule nel volume indicato secondo le istruzioni del produttore. Cellule marca, ad eccezione dei monociti classici, con un cocktail di anticorpi e microsfere magnetiche. Raccogli i monociti classici dal flusso continuo, mantenendo i non monociti nelle colonne.
    NOTA: Supponiamo che il 5% delle PBMC intere siano monociti classici e regolate di conseguenza il numero di cellule iniziali delle PBMC. Conservare le PBMC rimanenti per la conferma della purezza della popolazione di monociti nel passaggio 1.7. I monociti classici devono essere sempre isolati da PBMC fresche senza previa crioconservazione.
  3. Contare il numero di monociti isolati utilizzando un contatore di cellule (Tabella dei materiali) e centrifugare le cellule a 300 x g a 4 °C per 5 minuti. Risospendere le cellule nel tampone di isolamento cellulare per raggiungere 1 x 106 cellule/mL come concentrazione finale. Prelevare 100 μl di sospensione cellulare e trasferirla in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti.
  4. Trasferire 1 x 105 PBMC nella stessa piastra come controllo di gating negativo per confermare la purezza della popolazione di monociti classici mediante citometria a flusso. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 3 min. Tenere i monociti isolati sul ghiaccio durante i passaggi 1.5-1.12.
  5. Lavare rimettendo in sospensione le cellule con 200 μL di tampone FACS e centrifugare le cellule a 300 x g a 4 °C per 3 minuti. Decantare accuratamente i surnatanti.
  6. Per ogni campione, preparare 50 μL di tampone FACS contenente 0,3 μL di reagente vivo/morto (eccitazione a 405 nm), 0,5 μL di CD1410 anti-umano coniugato con APC (1 ng/μL) e 0,5 μL di CD1611 anti-umano coniugato con PE (1 ng/μL; Tabella dei materiali).
    NOTA: Per mantenere la colorazione costante, creare una miscela master per più campioni in base al numero totale di campioni. Trasferire 50 μL di soluzione colorante in ciascun pozzetto.
  7. Aggiungere 50 μl di soluzione colorante in ciascun pozzetto e mescolare delicatamente le cellule per evitare la formazione di bolle. Incubare le cellule al buio a temperatura ambiente per 15 minuti.
  8. Aggiungere 200 μl di tampone FACS a ciascun pozzetto e far girare le cellule a 300 x g a 4 °C per 3 minuti. Decantare accuratamente i surnatanti.
  9. Lavare aggiungendo 200 μl di tampone FACS a ciascun pozzetto e centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 3 minuti. Decantare accuratamente i surnatanti e risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS. Eseguire i campioni su un citometro a flusso (Tabelle dei materiali).
  10. Gate CD14+CD16- popolazione. Assicurati che la popolazione CD14+CD16- sia superiore al 90% delle cellule vive per una purezza ideale. Gate CD14+CD16- popolazione di singoletti vivi.
    NOTA: Si presume che gli utenti abbiano familiarità con l'analisi della citometria a flusso.

2. Differenziamento dei macrofagi M0 dai monociti classici umani

NOTA: La differenziazione dei macrofagi M2-like dai monociti classici umani è adattata da una precedente pubblicazione12.

  1. Centrifugare i monociti isolati a 300 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare i surnatanti. Risospendere le cellule nei terreni di coltura cellulare per raggiungere una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL.
  2. Aggiungere GM-CSF ricombinante umano per raggiungere una concentrazione finale di 10 ng/mL (Tabella dei materiali) e mescolare bene. Trasferire 100 μL di cellule in una piastra a 48 pozzetti trattata con coltura tissutale e aggiungere altri 50 μL di terreno di coltura cellulare. Assicurati che ogni condizione abbia 3 repliche per la lettura finale del giorno 11.
    NOTA: gli utenti possono aggiungere altri gruppi di esperimenti di conseguenza. Questo protocollo include solo cocolture sperimentali di cellule tumorali e cellule T con o senza macrofagi M2-like (Tabella 1).
  3. Trasferire 100 μL di cellule in un'altra piastra a 48 pozzetti e aggiungere altri 50 μL di terreno di coltura cellulare per la fenotipizzazione dei macrofagi. Assicurati di includere un pozzetto per la fenotipizzazione dei macrofagi M0 e uno per la fenotipizzazione dei macrofagi M2-simili.
  4. Aggiungere 200 μL di PBS nei pozzetti circostanti per prevenire l'evaporazione della coltura cellulare. Incubare i monociti a 37 °C per 7 giorni per differenziare le cellule in macrofagi M0.
  5. Per studiare le interazioni tra macrofagi differenziati e cellule CART19 compatibili con donatore, isolare 1 x 107 cellule T dalle PBMC dello stesso donatore e generare cellule CART19 seguendo una procedura di produzione CART di 8 giorni come precedentemente descritto 9,13,14.
    NOTA: Le cellule CART costimolate con il dominio di segnalazione CD28 sono generate da 5 x 106 cellule T come precedentemente descritto 9,13,14. In parallelo, le cellule T non trasdotte (UTD) vengono generate seguendo lo stesso processo 9,13,14. Le cellule T UTD saranno utilizzate come controllo negativo nella proliferazione delle cellule T per controllare la proliferazione allogenica.

3. Differenziazione dei macrofagi M2-like dai macrofagi M0 attraverso la cocoltura con cellule bersaglio

  1. Il giorno 7, prelevare la piastra a 48 pozzetti con macrofagi M0 e incubare su ghiaccio per almeno 30 minuti. Pipettare energicamente le cellule costantemente mantenendo la piastra sul ghiaccio.
    NOTA: La durata dell'incubazione del ghiaccio dipende da quanto sono aderenti i macrofagi, che possono essere diversi a causa della varianza del donatore. La prima miscelazione consiste nel raccogliere macrofagi poco aderenti, quindi un pipettaggio di 5 minuti dovrebbe essere sufficiente.
  2. Trasferire le cellule staccate in una provetta conica fresca da 15 mL (Tabella dei materiali) pre-raffreddata con ghiaccio. Aggiungere 200 μl di PBS ghiacciato ai pozzetti della piastra a 48 pozzetti e pipettare energicamente le cellule rimanenti ogni 10 minuti fino a quando la maggior parte dei macrofagi non si stacca dal fondo. Dopo ogni pipettaggio, controllare le cellule al microscopio e regolare il tempo di incubazione del ghiaccio in base alle esigenze, con tempi di incubazione più lunghi per le cellule più aderenti.
  3. Trasferire i restanti macrofagi M0 staccati nella provetta conica da 15 mL su ghiaccio. Mescolare attentamente le cellule e contare le cellule su un contatore di cellule.
  4. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare i surnatanti. Risospendere in PBS ghiacciato per raggiungere una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL.
  5. Trasferire 200 μl di cellule in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti (Tabelle dei materiali). Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 3 min. Decantare accuratamente i surnatanti. Come controllo di gating negativo, aggiungere un pozzetto extra colorato con i marcatori solo della popolazione parentale.
  6. Aggiungere 100 μl di tampone FACS integrato con 1 μl di soluzione bloccante del recettore Fc a ciascun campione. Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 3 min. Decantare accuratamente i surnatanti.
    NOTA: È importante pre-incubare i macrofagi con il tampone bloccante del recettore Fc prima dell'effettiva colorazione del marcatore per evitare risultati falsi positivi.
  7. Per il pozzetto del campione, preparare 50 μL di tampone FACS contenente 0,3 μL di reagente vivo/morto (eccitazione a 405 nm), 0,5 μL di CD1410 anti-umano coniugato con APC (1 ng/μL), 0,5 μL di CD20615 anti-umano coniugato con APC/Cy7 (2 ng/μL) e 0,5 μL di CD16316 anti-umano coniugato con PerCP (2 ng/μL; Tabella dei materiali). Per il controllo di gating negativo, preparare 50 μL di tampone FACS contenente 0,3 μL di reagente vivo/morto e 0,5 μL di CD14 anti-umano coniugato con APC.
  8. Aggiungere 50 μl di soluzione colorante in ciascun pozzetto e mescolare delicatamente le cellule per evitare la formazione di bolle. Incubare le cellule al buio a temperatura ambiente per 15 minuti.
  9. Aggiungere 200 μl di tampone FACS a ciascun pozzetto. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 3 min. Decantare accuratamente i surnatanti.
  10. Lavare aggiungendo 200 μl di tampone FACS. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 3 min. Decantare accuratamente i surnatanti e risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS.
  11. Eseguire i campioni su un citometro a flusso e selezionare la popolazione cellulare CD14+CD206+CD163+ . Utilizzare l'espressione di CD163 e CD206 sui macrofagi M0 come base per fenotipi M2-like. La migrazione della popolazione da CD163basso, CD206basso a CD163alto o CD206alto è prevista nei macrofagi M2-like. L'entità dello spostamento della popolazione può dipendere dal donatore.
  12. Preparare la linea cellulare tumorale di interesse e contare su un contatore di cellule.
    NOTA: Questo protocollo utilizza come bersaglio la linea cellulare di linfoma mantellare CD19+ non aderente, JeKo-1. Altre linee cellulari tumorali e la loro capacità di differenziare i macrofagi da M0 a M2-simili possono essere testate secondo necessità.
    1. Mantenere le cellule JeKo-1 con i terreni di coltura suggeriti dal fornitore (Tabella dei materiali) a 1 x 106 cellule/mL in un pallone di coltura tissutale. Mescolare le cellule tumorali nel pallone e contarle con un contacellule.
  13. Centrifugare le cellule bersaglio a 300 x g a 4 °C per 3 minuti e aspirare i surnatanti. Risospendere le cellule bersaglio con terreni di coltura cellulare per raggiungere una concentrazione finale di 2 x 106 cellule/mL.
    NOTA: Preparare il numero appropriato di cellule tumorali in base al numero di gruppi sperimentali. Assicurati che ci siano 2 x 105 cellule bersaglio per ogni gruppo di cocoltura di macrofagi M2-like, inclusa la piastra di fenotipizzazione M2.
  14. Trasferire 100 μl di cellule tumorali a gruppi di cocoltura di macrofagi M2-like nella piastra a 48 pozzetti preparata il giorno 0 e pipettare delicatamente per mescolare. Incubare le cellule a 37 °C per altre 24 ore.
    NOTA: Un rapporto 2:1 dei macrofagi JeKo-1: M0 è stato testato per la differenziazione del fenotipo M2-like. Altri rapporti possono essere testati secondo necessità.
  15. Il giorno 8, posizionare la piastra di fenotipizzazione simile a M2 sul ghiaccio, staccare vigorosamente le cellule e prepararsi per la fenotipizzazione come descritto nei passaggi 3.4-3.11.
    NOTA: I macrofagi M2-like sono molto più aderenti dei macrofagi M0, quindi è prevista la necessità di un'incubazione del ghiaccio più lunga. Questo protocollo utilizza solo ghiaccio e PBS ghiacciato per staccare i macrofagi e ridurre al minimo lo stress sulle cellule.
  16. Combina i file di citometria a flusso della fenotipizzazione M0 dal giorno 7 con la fenotipizzazione M2-like. Gate CD206 e CD163 della popolazione di cellule madri CD14+ del campione di macrofagi M0 e applicare la stessa strategia di gating al campione di macrofagi M2-like per visualizzare lo spostamento della popolazione.
  17. Per introdurre le cellule T nelle cocolture, raccogliere le cellule CART19 e UTD del giorno 8 generate nella fase 2.5 e trasferire le cellule in provette coniche da 50 mL. Mescolare bene con una pipetta e contare con un contacellulare.
  18. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare accuratamente i surnatanti. Risospendere le cellule T CART o UTD in terreni di coltura cellulare per raggiungere una concentrazione finale di 2 x 106 cellule/mL.
  19. Preparare la linea cellulare tumorale e contare sul contatore di cellule. Centrifugare le cellule a 300 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare i surnatanti.
  20. Risospendere le cellule tumorali con terreni di coltura cellulare per raggiungere la concentrazione finale di 2 x 106 cellule/mL. Trasferire 100 μL di cellule tumorali in pozzetti di cocoltura senza macrofagi M2-like (Tabella 1).
  21. Trasferire 100 μl di cellule CART o UTD T negli appositi pozzetti di cocoltura (Tabella 1). La cocoltura finale con macrofagi M2-like dovrebbe avere cellule tumorali, cellule T e macrofagi in un rapporto di 2:2:1. Utilizzare cocolture senza macrofagi come controlli.
  22. Per mantenere il volume finale coerente tra i gruppi, aggiungere altri 100 μL di terreno di coltura cellulare ai pozzetti senza macrofagi. Incubare le cellule a 37 °C per 3 giorni.
    NOTA: Se vengono utilizzate cellule CART allogeniche, gli utenti devono includere nelle cocolture cellule T UTD compatibili con donatore come controllo adeguato per rilevare qualsiasi espansione delle cellule T indotta dall'allogeneità. In questo caso, le cellule CART e UTD T precedentemente generate crioconservate devono essere scongelate e recuperate correttamente, seguite da almeno 3-4 ore di riposo prima di aggiungerle alle cocolture.

4. Analisi della proliferazione antigene-specifica di cocolture

  1. L'11° giorno, posizionare la piastra di cocoltura sul ghiaccio e pipettare energicamente le cellule. Mescolare bene le cellule e trasferirle in provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
    NOTA: La lettura primaria delle cocolture serve a quantificare l'espansione delle cellule T, quindi il distacco dei macrofagi non è necessario a meno che gli utenti non prevedano di analizzare anche altri marcatori sui macrofagi nello stesso pannello.
  2. Aggiungere 200 μl di PBS ghiacciato nei pozzetti del campione e pipettare energicamente. Trasferire la soluzione rimanente nelle stesse provette per microcentrifuga.
  3. Controllare i pozzetti al microscopio (10x) per assicurarsi che le cellule in sospensione vengano raccolte completamente. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare i surnatanti.
  4. Risospendere le cellule da tutte le condizioni con 200 μL di tampone FACS e trasferirle in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 3 min. Decantare accuratamente i surnatanti.
  5. Preparare 50 μL di tampone FACS contenente 0,3 μL di reagente vivo/morto (eccitazione a 405 nm) e 0,5 μL di CD317 anti-umano coniugato con APC (1 ng/μL; Tabella dei materiali) per ogni pozzetto del campione. Aggiungere 50 μl di soluzione colorante in ciascun pozzetto e mescolare accuratamente le cellule con una pipetta per evitare bolle.
    NOTA: In questa fase, ci saranno pellet a celle grandi. Per assicurarsi che tutte le cellule T siano state colorate, controllare il fondo della piastra per confermare che non ci siano pellet di cellule rimanenti dopo aver mescolato accuratamente.
  6. Incubare le cellule al buio a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere 200 μl di tampone FACS a ciascun pozzetto. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 3 min. Decantare accuratamente i surnatanti.
  7. Lavare aggiungendo 200 μl di tampone FACS. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 3 min. Decantare accuratamente i surnatanti e risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS.
  8. Eseguire i campioni su un citometro a flusso. Gate delle cellule CD3+ e quantificare il numero assoluto di cellule CD3+ vive come di seguito:
    figure-protocol-1
  9. Rappresenta graficamente il numero assoluto di cellule CD3+ in ogni condizione utilizzando GraphPad Prism.
    NOTA: Si prevede che le cocolture con macrofagi M2-like abbiano un numero assoluto di cellule T CD3 molto più basso rispetto alle condizioni in assenza di macrofagi M2-like.

5. Impatto dei macrofagi M2-like sulle cellule CART in un sistema transwell

NOTA: Le piastre Transwell separano fisicamente i macrofagi M2-like dalle cellule CART stimolate e consentono solo il traffico di molecole solubili tra i tipi di cellule, consentendo agli utenti di studiare le dinamiche delle interazioni indipendenti dal contatto tra macrofagi e cellule CART (Figura 1).

  1. Isolare 1 x 106 monociti classici umani e confermare la purezza della popolazione mediante citometria a flusso come descritto nei passaggi 1.1-1.10. Centrifugare 1 x 106 monociti a 300 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare i surnatanti.
    NOTA: Gli utenti potrebbero voler generare CART autologhe e cellule UTD compatibili con il donatore come descritto nel passaggio 2.5.
  2. Risospendere le cellule nei terreni di coltura cellulare per raggiungere una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL. Aggiungere GM-CSF ricombinante umano per raggiungere una concentrazione finale di 10 ng/mL e mescolare bene.
  3. Trasferire 200 μl di cellule risospese nel pozzetto inferiore di una piastra transwell a 24 pozzetti (0,4 μm) con 3 repliche tecniche. Aggiungere altri 100 μl di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto e assicurarsi che il fondo del pozzetto sia completamente coperto. Aggiungere 300 μL di terreno di coltura cellulare ad altri 3 pozzetti per condizioni senza macrofagi (controllo positivo).
  4. Aggiungere 200 μL di PBS nei pozzetti circostanti per prevenire l'evaporazione della coltura cellulare. Incubare le cellule a 37 °C per 7 giorni.
  5. Il giorno 7, preparare 1,4 x 106 cellule tumorali JeKo-1 e trasferirle in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare le cellule a 300 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare i surnatanti.
  6. Risospendere le cellule tumorali con terreni di coltura cellulare per raggiungere una concentrazione finale di 2 x 106 cellule/mL. Aggiungere 200 μl di cellule tumorali nei pozzetti inferiori di tutte le condizioni del campione e mescolare bene. Incubare le cellule a 37 °C per altre 24 ore. Utilizzare pozzetti inferiori con solo JeKo-1 come controllo positivo.
  7. Il giorno 8, raccogliere il giorno 8 CART e le cellule T UTD generate nel passaggio 5.1. e risospendere le cellule T in terreni di coltura cellulare per raggiungere una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL.
    NOTA: Se vengono utilizzate cellule CART allogeniche, gli utenti devono includere nelle cocolture cellule T UTD compatibili con donatore, come descritto nel passaggio 3.22.
  8. Contare e preparare 1,4 x 106 celle JeKo-1. Trasferire le cellule tumorali in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare le cellule a 300 x g a 4 °C per 5 minuti.
  9. Aspirare i surnatanti e risospendere le cellule nei terreni di coltura cellulare per raggiungere una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL. Trasferire 100 μl di cellule T preparate e 100 μl di cellule tumorali in ciascun pozzetto superiore per tutte le condizioni del campione.
  10. Mescolare accuratamente le cellule nel pozzetto superiore e incubare a 37 °C per 3 giorni.
  11. L'11° giorno, mescolare le cellule nella camera superiore e trasferirle in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Lavare i pozzetti superiori con 200 μl di PBS e trasferire le cellule rimanenti nelle provette della microcentrifuga.
  12. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare i surnatanti. Condurre il saggio di proliferazione delle cellule T come descritto nei passaggi 4.4-4.9.
    NOTA: I macrofagi M2-like polarizzati JeKo-1 possono sopprimere la proliferazione delle cellule T antigene-specifiche in modo indipendente dal contatto. Altri modelli di tumore possono essere testati secondo necessità.

6. Messa a punto di un modello di xenotrapianto con macrofagi umani e tumore in topi NSG

  1. Isolare 1 x 107 monociti classici umani e confermare la purezza mediante citometria a flusso come descritto nei passaggi 1.1-1.10. Utilizzare topi NSG trapiantati con JeKo-1 da solo come controllo per confermare gli effetti pro-tumorali dei macrofagi M2-like, come illustrato nella Figura 2.
    NOTA: Questo protocollo innesta topi NSG con 5 x 105 macrofagi umani per via sottocutanea. Il recupero dei macrofagi dopo il distacco il giorno 7 è di circa il 50%. Gli utenti possono regolare i numeri di cella di conseguenza e assicurarsi di preparare celle aggiuntive.
  2. Centrifugare i monociti isolati a 300 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare i surnatanti. Risospendere le cellule nei terreni di coltura cellulare per raggiungere una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL.
  3. Aggiungere GM-CSF ricombinante umano per raggiungere una concentrazione finale di 10 ng/mL e mescolare bene. Trasferire i monociti in un pallone di coltura tissutale T25 e incubare le cellule a 37 °C per 7 giorni.
  4. Il 7° giorno, pipettare energicamente le cellule sul ghiaccio ogni 10 minuti e controllare le cellule al microscopio fino a quando la maggior parte dei macrofagi non si è staccata. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml con ghiaccio, lavare il pallone con PBS ghiacciato per sciogliere le cellule rimanenti e unire le cellule nella provetta conica.
  5. Contare le celle sul contatore di celle. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare i surnatanti.
  6. Lavare e risospendere le cellule con 5 mL di PBS ghiacciato. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare i surnatanti.
  7. Risospendere le cellule in PBS ghiacciato per raggiungere una concentrazione finale di 2 x 107 cellule/mL. Trasferire la soluzione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e tenerla in ghiaccio.
  8. Preparare 1,5 x 107 cellule luciferasi+ JeKo-1 e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL.
    NOTA: A causa del basso numero di cellule iniettate, l'imaging a bioluminescenza (BLI) è necessario per monitorare il carico tumorale. Il numero di macrofagi e cellule tumorali per le iniezioni sottocutanee può essere aumentato secondo necessità. Se i tumori sono visibili e accessibili con un calibro dopo l'iniezione, è possibile utilizzare cellule tumorali di tipo selvatico.
  9. Centrifugare le celle a 300 x g a 4°C per 5 minuti e aspirare i surnatanti. Risospendere le cellule in PBS ghiacciato per raggiungere una concentrazione finale di 4 x 107/mL.
  10. Trasferire lo stesso volume di macrofagi e cellule tumorali in un'altra provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 mL e mescolare bene. Aggiungere lo stesso volume di matrice di membrana basale solubilizzata nella soluzione di cellule miste e mescolare bene con ghiaccio.
    NOTA: La matrice della membrana basale deve essere scongelata con ghiaccio durante la notte per evitare la solidificazione. A questo punto, ogni 100 μL di soluzione cellulare ha 5 x 105 macrofagi e 1 x 106 JeKo-1 sospesi nella matrice della membrana basale, che utilizza lo stesso rapporto del numero di cellule utilizzato nel protocollo di differenziazione dei macrofagi M2-like in vitro .
  11. Come controllo, trasferire le restanti cellule JeKo-1 preparate con lo stesso volume di PBS ghiacciato in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 mL, aggiungendo lo stesso volume della matrice della membrana basale alla soluzione cellulare e mescolando bene con ghiaccio.
  12. Preparare 10 topi femmina e maschio NOD-SCID-γ-/- (NSG) di 6-8 settimane (~20 g) per l'anestesia per inalazione con isoflurano al 2,5%. Introdurre l'anestesia con isoflurano utilizzando un apparecchio per anestesia inalante per roditori. L'isoflurano vaporizzato viene consegnato in una camera e in uno stadio riscaldato con coni nasali.
  13. Metti i topi nella camera anestetica per 1-2 minuti. Trasferisci i topi sui coni del naso sul palco riscaldato una volta persi i riflessi posturali e destri18. Mantieni i topi sul palco di riscaldamento durante tutta la procedura. Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi dei topi per prevenire danni alla cornea dovuti alla perdita del riflesso dell'ammiccamento durante l'anestesia.
  14. Radere accuratamente il fianco destro di ciascun topo per esporre la pelle dopo che i topi sono stati anestetizzati. Caricare una siringa da 0,5 mL con 100 μL di miscela di cellule JeKo-1-macrofagi e rimuovere accuratamente le bolle nella soluzione.
  15. Sollevare con cautela la pelle esposta a mano e inserire l'ago nella regione sollevata. Continui a sollevare la pelle con l'ago e prema un dito nel sito di iniezione. Cerca di non muovere l'ago una volta inserito per evitare forature accidentali e perdite di cellule.
  16. Rilasciare lentamente le cellule nello strato sottocutaneo e rimuovere con cura l'ago. Ripetere le iniezioni sottocutanee per tutti e 10 i topi NSG, con 5 topi che hanno ricevuto sia JeKo-1 che macrofagi e 5 topi che hanno ricevuto JeKo-1 da solo.
  17. Preparare la D-luciferina (Tabella dei materiali) a una concentrazione di 15 mg/mL. Caricare una siringa da 0,5 ml con 200 μl di D-luciferina e iniettare in ciascun topo per via intraperitoneale.
  18. Posizionare i topi anestetizzati sul palco per BLI 10 minuti dopo l'iniezione di D-luciferina. Eseguire il BLI per ciascun topo e registrare come basale (Giorno 0) il carico tumorale. Rimetti i topi nelle loro gabbie.
    NOTA: Gli utenti devono assicurarsi che i topi anestetizzati non vengano lasciati incustoditi fino a quando non riprendono conoscenza per mantenere la decubito sternale dopo la procedura di imaging.
  19. Monitorare il carico tumorale con BLI 2 volte a settimana fino al raggiungimento di endpoint sperimentali o umani. L'endpoint di sopravvivenza globale viene raggiunto una volta che il volume del tumore è pari o superiore a 2000 mm3, calcolato con la formula seguente:
    figure-protocol-2
    NOTA: La durata del monitoraggio del tumore può essere regolata in base allo scopo degli esperimenti e alle letture desiderate. A causa delle dimensioni estremamente ridotte del tumore nelle prime 2-3 settimane, il BLI è raccomandato per l'indicazione del carico tumorale. Una volta che i tumori diventano visibili e accessibili tramite calibro, si raccomandano sia le misurazioni BLI che quelle con calibro per un'analisi accurata del tumore.
  20. Studiare le interazioni tra macrofagi umani trapiantati e cellule CART19 autologhe in topi NSG, generare e attecchire macrofagi umani differenziati ex vivo come descritto nei passaggi 6.1-6.16. Isolare le cellule T autologhe dallo stesso donatore di sangue nella fase 6.1 seguendo il protocollo di produzione CART di 8 giorni come descritto in precedenza 9,13,14.
    NOTA: Ogni topo NSG viene trattato con 2 x 106 celle CART19. Gli utenti dovrebbero generare almeno 2 x 107 cellule CART per trattare 10 topi. Le cellule CART vengono crioconservate il giorno 8 e conservate fino a quando JeKo-1/macrofagi non vengono innestati nei topi, 5 giorni dopo le iniezioni sottocutanee.
  21. Dopo 5 giorni di iniezioni di tumore/macrofagi, randomizzare i topi in base al BLI come descritto nei passaggi 6.17-6.18. Scongelare e preparare le celle CART come descritto nel passaggio 3.22. Lavare le celle CART con PBS e centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 minuti.
  22. Risospendere le cellule CART in PBS per raggiungere una concentrazione finale di 2 x 107 cellule/mL. Caricare una siringa da 0,5 mL con 100 μL di cellule CART preparate e iniettare in ciascun topo trapiantato dal tumore per via endovenosa attraverso la vena caudale.
  23. Monitorare il carico tumorale con BLI una volta alla settimana per 4 settimane.
    NOTA: A causa delle funzioni immunosoppressive dei macrofagi umani trapiantati, nei topi iniettati con JeKo-1/macrofagi sono attesi un'alterata attività antitumorale di CART e un carico tumorale più elevato.

7. Conferma del fenotipo M2-like nei macrofagi umani trapiantati mediante colorazione in immunofluorescenza

  1. Per confermare il fenotipo M2-like indotto da JeKo-1 nei macrofagi umani trapiantati descritti nella fase 6 mediante colorazione in immunofluorescenza, seguire i passaggi 6.1-6.19 e aumentare il numero di macrofagi iniettati e luciferasi+ JeKo-1 rispettivamente a 5 x 106 cellule e 1 x 107 cellule per topo NSG.
    NOTA: Gli utenti devono assicurarsi che il volume finale di iniezione per ciascun topo sia di 100 μl.
  2. Il giorno 7, sopprimere i topi NSG con CO2, eseguire la lussazione cervicale e confermare la perdita dei riflessi corneali come precedentemente descritto19. Posiziona i topi sul banco di lavoro con i tumori rivolti verso l'alto. Spruzzare etanolo al 70% sui siti tumorali e raccogliere con cura i tumori innestati con forbici e pinze.
  3. Trasferire i tessuti tumorali in provette coniche da 50 mL riempite con 20-30 mL di paraformaldeide al 4% per la fissazione come descritto in precedenza20. Crioconservazione e criosezione di tessuti tumorali per la colorazione in immunofluorescenza secondo un protocollo20 precedentemente pubblicato.
  4. Vetrini di tessuto tumorale colorati con anticorpo CD206 di topo anti-umano coniugato con AF546 (1:50) e anticorpo iNOS anti-umano di coniglio coniugato con AF647 (1:100) diluito in tampone di colorazione in immunofluorescenza, seguito da colorazione e conservazione del nucleo come precedentemente descritto21.
    NOTA: Per ottenere risultati di colorazione ottimali, gli utenti devono eseguire la titolazione degli anticorpi di conseguenza, soprattutto quando vengono utilizzate diverse linee cellulari tumorali.
  5. Acquisizione di immagini in immunofluorescenza con microscopia confocale a 40x. Per confermare che i macrofagi umani innestati sviluppano un fenotipo simile a M2, aspettatevi di vedere l'espressione di CD206 umano e l'espressione minima di iNOS umano.

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Risultati

Lo scopo di questo protocollo è quello di stabilire modelli sia in vitro che in vivo per studiare le interazioni tra macrofagi immunosoppressivi umani e cellule CART a causa della natura complessa e della dinamica delle interazioni e dei limitati modelli di xenotrapianto esistenti. Seguendo il protocollo, i monociti classici umani isolati vengono differenziati per acquisire fenotipi M2-like e diventare immunosoppressivi funzionalmente.

Per confermare la purezza dei monociti c...

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Discussione

La terapia cellulare CART ha mostrato numerosi successi clinici nel trattamento di sottogruppi di pazienti con neoplasie ematologiche, ma la maggior parte dei pazienti recidiva entro 1-2 anni dall'infusione di CART 1,2. Sono stati identificati vari potenziali meccanismi di resistenza alla CART e si è scoperto che le cellule mieloidi immunosoppressive svolgono un ruolo importante nell'immunosoppressione della TME e nel successivo ...

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Dichiarazioni

SSK è un inventore di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Novartis (attraverso un accordo tra Mayo Clinic, University of Pennsylvania e Novartis), MustangBio (tramite Mayo Clinic) e Sendero (tramite Mayo Clinic). RLS e SSK sono inventori di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Humanigen (attraverso la Mayo Clinic). KY, RLS, TH, BK, ES e SSK sono inventori di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Immix. SSK riceve finanziamenti per la ricerca da Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte e Lentigen. SSK ha partecipato a riunioni consultive con Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio e Novartis. SSK ha fatto parte del comitato di monitoraggio e sicurezza dei dati con Humanigen e Carisma. SSK ha lavorato come consulente per Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma e Humanigen.

Ringraziamenti

Questo studio è stato in parte finanziato attraverso il Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), il Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), il National Institutes of Health grant R37CA266344-01 (SSK) e il Department of Defense grant CA201127 (SSK).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 0,5 mLFisher Scientifico329461
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mLEppendorf1415-2508 
Provetta conica da 15 mLCorning Scienze della Vita352097
Piastra a 24 pozzetti (0,4 μ m)Corning Scienze della Vita3397
Provetta conica da 50 mLCorning Scienze della Vita352098
CD206 anti-umano coniugato APC/Cy7Bioleggenda321119Anticorpo a flusso
CD14 anti-umano coniugato con APCBioleggenda325607Anticorpo a flusso
CD3 anti-umano coniugato con APCBioleggenda344811Anticorpo a flusso
autoMACS Soluzione di risciacquoMiltenyi Biotec130-091-222Tampone di isolamento dei monociti classiali 
Matrice della membrana basaleCorning Scienze della VitaCLS356237Matrice di membrana basale solubilizzata
Terreni di coltura cellulare10% siero AB umano 1% penicillina-streptomicina-glutammina in X-VIVO 15 Terreno cellulare ematopoietico privo di siero
Kit di isolamento classico dei monociti, umanoMiltenyi Biotec130-117-337
Sistema CytoFLEX  B5-R3-V5Beckman CoulterCodice C04652Citometro a flusso
D-luciferinaBiotecnologie dell'oroFORTUNA-1G
D-PBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco)Gibco14190250 
Unguento per gli occhiThermoFisher19-090-832
Tampone FACS2% FBS 1% sodio azide in PBS
Siero fetale bovinoCorning Scienze della Vita35-011-CV
Piastra a fondo piatto a 96 pozzettiCorning Scienze della VitaCLS3997
Siero AB umano in pool inattivato a caldo Ricerca innovativa4931
Human TruStain FcX (soluzione bloccante il recettore Fc)Bioleggenda422301
Liquido isoflurano   Piramal Pharma Limited66794-017-10
Sistema di imaging in vivo IVIS SpectrumPerkinElmer124262
Terreni di coltura per linee cellulari JeKo-110% FBS 1% penicillina-streptomicina-glutammina in terreno RPMI-1640
Kit di colorazione per cellule morte Aqua Fixable Live/Dead, per eccitazione a 405 nmInvitrogenL34966
Colonna LSMiltenyi Biotec130-042-401Selezione del cordone negativo
LymphoprepTecnologie delle cellule staminali07811Gradiente di densità medio
Soluzione stock MACS BSAMiltenyi Biotec130-091-376Tampone di isolamento dei monociti classiali 
Anticorpo di topo anti-umano CD206 coniugato con AF546 Santa Cruz BiotecnologiaSC-376232
ANNUIRE. Cg-Prkdcscid  Topi Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)Laboratorio Jackson 5557
CD16 anti-umano coniugato con PEBioleggenda302007Anticorpo a flusso
Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100x), LiquidoGibco10378-016
CD163 anti-umano coniugato con PerCPBioleggenda333625Anticorpo a flusso
Anticorpo iNOS di coniglio anti-umano coniugato con AF647 ProteintechCL647-18985
GM-CSF umano ricombinanteTecnologie delle cellule staminali78015
RPMI-1640 medioGibco11875093
SepMate-50 IVDTecnologie delle cellule staminali85450Isolamento di PBMC mediante centrificazione del gradiente di densità 
Sodio azide, 5% (p/v)Ricca Chimica7144.8-16
Piastra a 48 pozzetti trattata con coltura tissutaleCorning Scienze della Vita3548
Analizzatore di vitalità cellulare Vi-cell XRBeckman CoulterContatore di celle
X-VIVO 15 Terreno cellulare ematopoietico senza sieroLonza04-418Q

Riferimenti

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