Articolo metodologico

Sviluppo di un modello di lesione polmonare acuta di suinetto neonatale che ricrea l'ambiente precoce dei polmoni del neonato pretermine

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DOI:

10.3791/68058

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31 ottobre 2025

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1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2Division of Neonatology, Karolinska University Hospital, 3Division of Neonatology, Children's Hospital of Eastern Ontario, 4Department of Obstetrics, Gynecology and Newborn Care, University of Ottawa, 5Faculty of Medicine, University of Ottawa

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un modello neonatale di suinetto di danno polmonare acuto che modella gli eventi patogeni precoci che si verificano nel polmone pretermine, tra cui quantità di tensioattivo inadeguata, iperossia, ventilazione ad alta pressione e infiammazione, per facilitare la comprensione dei fattori molecolari scatenanti della displasia broncopolmonare e migliorare la traduzione terapeutica.

Abstract

La nascita prematura è una delle principali cause di morbilità e mortalità pediatrica. La displasia broncopolmonare (BPD) è una grave conseguenza dell'estrema prematurità, che porta ad alterazioni della crescita polmonare ed effetti di sviluppo di lunga durata. La patogenesi della BPD è multifattoriale e include la ventilazione meccanica, l'iperossia e l'infiammazione come principali fattori del suo sviluppo. Attualmente, non esiste un trattamento per il BPD. In questo studio, viene presentato un nuovo modello di suinetto neonatale fattibile e riproducibile di danno polmonare acuto (ALI), che imita gli stimoli clinici affrontati dal polmone pretermine umano. Il modello multi-hit ALI neonatale di suinetto, che combina deplezione di tensioattivo, iperossia, ventilazione ad alta pressione e somministrazione intratracheale di lipopolisaccaride (LPS), provoca un'alterata ossigenazione, una funzione polmonare perturbata, un'infiammazione con infiltrazione di neutrofili e un danno polmonare istologico. I suoi principali vantaggi sono l'utilizzo degli stimoli dannosi noti per guidare la patogenesi della BPD e la sua bassa manutenzione. Genera ALI ad alta fedeltà, soddisfacendo i criteri ALI dell'American Thoracic Society. I modelli animali di grandi dimensioni, come questo modello di suinetto, sono fondamentali per comprendere i fattori patogeni precoci, identificare i bersagli terapeutici e facilitare la traduzione clinica ai pazienti.

Introduzione

L'estrema prematurità è una delle principali cause di morte nei bambini prima dei cinque anni di età1. La complicanza grave più comune della prematurità è la displasia broncopolmonare (BPD), una malattia polmonare cronica, con fattori multifattoriali tra cui infiammazione, stress ossidativo da iperossia e trauma indotto dal ventilatore2. Questo microambiente porta a una crescita polmonare compromessa, che può avere un impatto duraturo sulla crescita e sullo sviluppo dei neonati prematuri3. Attualmente, non esiste un trattamento per il BPD.

Una recente revisione sistematica sull'uso delle cellule stromali mesenchimali come potenziale trattamento per la BPD ha rilevato che i dati preclinici erano esclusivamente nei roditori4. Questo fenomeno è comune data l'ampia disponibilità, facilità d'uso e manutenzione dei modelli di roditori. Tuttavia, la riproduzione di studi su modelli animali di grandi dimensioni è fondamentale per garantire il successo degli sforzi traslazionali per nuove e imminenti terapie per i neonati prematuri. Molti studi clinici falliscono a causa di studi preclinici inadeguati5, rallentando lo sviluppo del trattamento per i pazienti. Sebbene l'utilizzo di un modello di primati non umani sia un modello preclinico preferito per gettare le basi per gli studi clinici sull'uomo, è laborioso, costoso e non facilmente accessibile. Il modello di suinetto neonatale è vantaggioso, con l'uso di farmaci e attrezzature simili all'assistenza neonatale, che imitano l'ambiente clinico di terapia intensiva neonatale, portando a una maggiore fattibilità per la traduzione clinica. Inoltre, il sistema immunitario dei polmoni suini assomiglia molto a quello degli esseri umani 6,7,8,9, condividendo oltre l'80% della varianza genetica del recettore toll-like 410, con i macrofagi che reagiscono ai lipopolisaccaridi (LPS)11,12 e alla produzione di ossido nitrico13 - potenziali contributori dell'infiammazione nel polmone umano14. Inoltre, il tensioattivo polmonare di origine suina è un trattamento clinicamente stabilito utilizzato per la malattia polmonare acuta nei neonati prematuri15 anni.

Questo protocollo presenta la generazione di un nuovo modello di lesione polmonare acuta (ALI) multi-hit per animali di grandi dimensioni in suinetti appena nati con risultati coerenti, standardizzati e traducibili in linea con i criteri ALI 16,17,18 dell'American Thoracic Society. Ripetuti lavaggi polmonari salini per la deplezione del tensioattivo con ventilazione ad alta pressione e successiva esposizione a LPS o ad altre sostanze tossiche sono stati utilizzati nei suini adulti per indurre danno polmonare18. Tuttavia, modelli simili disponibili nei suinetti neonatali sono scarsi 19,20. Questo protocollo descrive come indurre il danno polmonare con un protocollo adattato di lavaggi polmonari da deplezione di tensioattivo 21,22,23 in ventilazione iperossica e ad alta pressione, seguiti da un trigger infiammatorio utilizzando LPS instillato direttamente nel polmone. Questo modello è pronto per la somministrazione di un trattamento di scelta sia localmente (intratracheale - IT) che sistemicamente (endovenoso - IV) dopo il danno polmonare indotto, con monitoraggio del suo effetto nell'arco di 5 ore. Il quadro generale imita da vicino la condizione dei polmoni prematuri dei neonati. La deplezione del tensioattivo ricrea la sindrome da distress respiratorio, caratterizzata da una mancanza di tensioattivo alla nascita. Questo disturbo può essere associato a barotrauma, atelettotrauma e problemi di ossigenazione che richiedono alti livelli di ossigeno e ventilazione meccanica. Infine, la maggior parte dei neonati pretermine nasce in un ambiente infiammatorio a causa di corioamnionite o infezione, caratteristiche che si è tentato di replicare con la somministrazione di LPS in questo modello di suinetto. Questo modello multi-hit di ALI crea stimoli clinici simili a quelli affrontati dal polmone pretermine umano che offriranno preziose informazioni sui processi patogenetici precoci della BPD e sulla potenziale ottimizzazione della somministrazione della terapia per un'efficace traduzione clinica24.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono eseguiti da personale certificato in accordo con le normative nazionali e istituzionali (https://ccac.ca/en/guidelines-and-policies/) previa approvazione da parte del Comitato Zootecnico regionale e del Servizio Veterinario e Veterinario (protocollo OHRIe-3731). Per questo modello sono stati utilizzati suinetti appena nati di entrambi i sessi, di età compresa tra 0 e 3 giorni, con razza mista Yorkshire, Landrace e Duroc. Viene fornita una descrizione dettagliata delle fasi (numero di fase identificato tra parentesi) per la preparazione, l'anestesia, la gestione e il monitoraggio dei fluidi e dei farmaci utilizzati per l'intera durata dell'esperimento (1-3), le procedure chirurgiche (4) compreso un periodo di stabilizzazione (5) prima di indurre la lesione polmonare multi-hit (7), con l'osservazione post-lesione e la ventilazione di mantenimento (6, 8) che termina con l'eutanasia e il completamento dell'esperimento (10). Viene anche presentata una procedura standardizzata opzionale per il trattamento intratracheale (9). Il tempo totale dall'azienda agricola alla fine dell'esperimento e della raccolta dei campioni è di circa 12-15 ore. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione sperimentale

  1. Accendere e calibrare i monitor e il ventilatore prima dell'arrivo del suinetto. Assicurarsi che le schede di memoria siano inserite nel monitor per la registrazione continua dei dati durante l'esperimento.
  2. Impostare il ventilatore con una pressione inspiratoria di picco (PIP) di 15 cmH2O, una pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 6 cmH2O, un flusso inspiratorio di 8 L/min, una frequenza respiratoria (RR) di 30/min, un tempo inspiratorio (Tinsp) di 0,4 s, una frazione di ossigeno inspirato (FiO2) di 1,0 e, collegare un nuovo circuito di ventilazione e umidificatore.
  3. Preparare confezioni chirurgiche sterili, teli, materiali di consumo (compresi i farmaci - vedere la Tabella dei materiali), cateteri e la CRF stampata. Aumentare la temperatura della sala chirurgica a 25 °C o superiore come ritenuto necessario dal team di ricerca. Accendere la coperta riscaldante/materasso ad acqua a 39 °C. Preparare un sistema di riscaldamento ad aria forzata pronto all'uso se è necessaria un'ulteriore regolazione della temperatura.
  4. Mettere una sacca da 1 litro di soluzione fisiologica normale a bagnomaria calda (39 °C) per preparare i lavaggi polmonari.
  5. Installa pompe per infusione di farmaci (ketamina e propofol) e aggiungi nuove sacche di ringer lattato a temperatura ambiente e destrosio alle pompe dei fluidi.
  6. Il maialino rimane con la scrofa nella fattoria locale e ha libero accesso ad essa fino a quando non viene prelevata da un membro del team di ricerca. Annota il sesso, l'età, le dimensioni della cucciolata e l'ora di nascita.
    NOTA: In un veicolo di trasporto universitario approvato con un autista qualificato, un membro del team esperto è presente durante tutto il trasporto. Il suinetto viene posto in un grande trasportino morbido chiuso, che gli consente di muoversi in sicurezza, liberamente e di sdraiarsi senza restrizioni (con un cuscinetto termico in gomma per acqua calda avvolto in coperte, se necessario). Ciò garantisce che il maialino rimanga calmo (spesso addormentandosi) in questo ambiente rilassante. Il trasportino contenente il suinetto è fissato in posizione utilizzando la cintura di sicurezza. Il membro del team ha il ruolo di calmare dolcemente il maialino ed evitare rumori forti per mantenere il livello di stress del suinetto al minimo.
  7. All'arrivo all'istituto di ricerca, ridurre al minimo il rumore e tenere delicatamente il suinetto mentre si posiziona il cono nasale per anestesia sul viso.

2. Preparazione degli animali

NOTA: Questa sezione include l'induzione e il mantenimento dell'anestesia (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente).

  1. Avviare il flusso di O2 senza isoflurano quando si posiziona il cono anteriore. Quando il suinetto è calmo, iniziare l'isoflurano e aumentare fino a quando non viene somministrato isoflurano al 3% (circa 60 s). Monitorare attentamente la respirazione e regolare l'isoflurano di conseguenza.
  2. Verificare la mancanza di risposta del maialino tramite un pizzico duro.
  3. Una volta che il suinetto non risponde, pesarlo e misurarlo per il corretto dosaggio dei farmaci.
  4. Iniettare Buprenorfina HCL (0,04 mg/kg) per via intramuscolare (IM) con un ago da 25 G nella zampa posteriore per analgesia.
  5. Collegare il pulsossimetro allo zoccolo superiore destro (preduttale), al bracciale per la pressione sanguigna non invasivo (fino a quando l'arteria femorale non viene incannulata) e agli elettrocateteri ECG.
  6. Inserire 24 g di angiocaths in entrambe le orecchie. Fissare set di prolunghe da 6" lavati con soluzione salina con rubinetti a 4 vie. Sostenere l'orecchio con un abbassalingua per evitare l'ostruzione della posizione.
  7. Prelevare il sangue dal catetere auricolare inserito per la misurazione della glicemia (BG) con un glucometro calibrato secondo le istruzioni del produttore.
  8. Iniziare l'infusione di D5W per via endovenosa (EV) a 5 ml/kg/h e regolare in base ai livelli di glucosio nel sangue per raggiungere un livello di glicemia di 4-5 mmol/L.
  9. Somministrare iniezioni in bolo di analgesia/anestesia nella seconda vena dell'orecchio.
    NOTA: Per il loro uso ottimale e sicuro è necessaria una comprensione critica delle proprietà e degli effetti collaterali di questi farmaci.
    1. Somministrare un bolo di 2 mg/kg EV di ketamina diluita (10 mg/mL) e un bolo di 5 mg/kg EV di propofol (10 mg/mL, 1%) somministrato in più boli di volume inferiore. Attenzione alla possibilità che l'apnea si verifichi dopo un bolo di propofol. Continuare la somministrazione accurata di boli di propofol (per un totale di 5 mg/kg) fino a quando il suinetto non risponde al test di pizzicamento dell'alluce e si stabilisce l'infusione continua di propofol.
    2. Interrompere l'isoflurano (una volta iniziata l'infusione endovenosa di propofol) e continuare con l'anestesia endovenosa continua per tutto il resto dell'esperimento.
  10. Iniziare l'infusione continua del seguente regime anestetico con un'attenta titolazione in base alla frequenza cardiaca e alla pressione sanguigna, compreso il riflesso di sospensione per raggiungere la profondità chirurgica stabile dell'anestesia:
    1. Propofol (10 mg/mL) in ragione di 10-30 mg/kg/h (equivalente a 1-3 mL/kg/h) EV.
    2. Ketamina (100 mg/mL) in ragione di 5-10 mg/kg/h (equivalente a 0,05-0,1 mL/kg/h) EV.
      NOTA: Le linee di infusione per analgesia/anestesia sono collegate al catetere auricolare controlaterale dell'infusione D5W. Potrebbe essere necessario un aggiustamento dell'assunzione totale di liquidi e della temperatura ambiente per garantire un supporto e un'omeostasi adeguati.

3. Fluidi, farmaci e monitoraggio

NOTA: Questa sezione fornisce informazioni su come mantenere l'idratazione, l'apporto di glucosio, l'analgesia/anestesia e garantire un'adeguata revisione dei dati sperimentali, dei dubbi o dei problemi.

  1. Assicurarsi che la velocità di infusione endovenosa totale di liquidi combinati (LRS e D5W) per l'omeostasi sia generalmente di 5-8 ml/kg/h.
    1. Somministrare D5W al catetere venoso dell'orecchio a 5-10 ml/h (aggiustato ogni ora in base ai valori di glicemia arteriosa (BG) - target 4-5 mmol/L).
    2. Somministrare LRS attraverso il catetere venoso femorale a una velocità compresa tra 1 e 6 mL/kg/h per mantenere l'omeostasi dei fluidi. Per prevenire la coagulazione dell'accesso sia arterioso che venoso, collegare una sacca per infusione NS eparinizzata a pressione al trasduttore e mantenere la pressione tra 250-300 psi.
    3. Garantire un'adeguata profondità dell'anestesia generale e dell'analgesia durante l'intervento chirurgico e prima di iniziare il periodo di stabilizzazione (passaggio 5.1) e indurre il rilassamento muscolare.
  2. Monitoraggio dei diversi parametri (lavoro a tempo pieno per una persona durante l'esperimento).
    NOTA: Monitoraggio e documentazione dei segni vitali, delle impostazioni del ventilatore, degli interventi, dei campioni prelevati, dei farmaci, con dosi e tempi, in un CFR stampato prefabbricato (vedi Fascicolo supplementare 1) durante l'intero esperimento. I dati continui registrati dal monitor di pressione e dal ventilatore vengono salvati alla fine dell'esperimento per un'analisi successiva.
    1. Monitorare la saturazione di ossigeno (SpO2) - garantire il segnale del pulsossimetro preduttale (zoccolo superiore destro).
    2. Monitorare la frequenza cardiaca (FC) - collegare gli elettrocateteri ECG al suinetto.
    3. Per monitorare la temperatura, inserire il termometro rettale lubrificato a 3-4 cm di profondità e fissarlo alla coda con del nastro adesivo. Mantenere la temperatura rettale del suinetto a 38-39 °C regolando il termoforo e la temperatura ambiente (25 °C). Se si utilizza una fonte di riscaldamento elettrica, assicurarsi che sia posizionata una coperta extra tra il suinetto e il tappetino riscaldante per evitare ustioni.
      NOTA: Utilizzare una fonte di riscaldamento aggiuntiva come un sistema di riscaldamento ad aria forzata (come una coperta sovrapposta sopra il suinetto) se l'omeostasi della temperatura non viene raggiunta adeguatamente.
    4. Per la pressione arteriosa, eseguire il monitoraggio non invasivo con un bracciale di dimensioni adeguate fino a dopo l'intervento chirurgico, quindi determinare la pressione arteriosa invasiva, compresa la pressione arteriosa media (MAP) e la pressione venosa centrale (CVP), e documentare sulla CRF.
      NOTA: Assicurarsi che le cupole dei trasduttori arteriosi e venose siano posizionate e azzerate a livello del cuore per letture accurate.
    5. Eseguire il prelievo di sangue in momenti prestabiliti tramite catetere arterioso o venoso centrale. Eseguire l'analisi dei gas ematici di 0,1 mL di sangue arterioso eparinizzato utilizzando un analizzatore di sangue portatile (un dispositivo in grado di valutare al minimo pH, PCO2, PO2, HCO3, BE, BG, lattato, creatinina, Na, K, Cl - da annotare su CRF) per gestire la ventilazione e il controllo metabolico durante l'esperimento.
    6. Eseguire campionamenti biologici per future sperimentazioni e analisi: raccogliere sangue intero, plasma e urina in corso in momenti pertinenti durante il protocollo sperimentale, secondo gli obiettivi dello studio. Raccogliere anche campioni endpoint, tra cui liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF), tessuto polmonare e altri tessuti16,17, come rilevanti per gli obiettivi dello studio.
      1. Limitare l'anemia iatrogena e l'ipovolemia:
        1. Prelevare lentamente (equivalente a tre volte il volume dello spazio morto) il sangue in una siringa, mettere da parte e prelevare un volume sufficiente per future analisi sperimentali (0,4-1,5 mL)25 come i marcatori di stress infiammatorio e ossidativo. Adattare i volumi del campione al peso corporeo, al livello di emoglobina e alla stabilità del suinetto.
          NOTA: Il sangue dello spazio morto viene restituito all'animale e la linea viene lavata con soluzione fisiologica con almeno il volume equivalente che è stato prelevato per il prelievo di sangue (gas ematico ± sangue per esperimenti futuri) per liberare la linea di sangue, limitando la possibile occlusione dovuta a coaguli di sangue.
    7. Registrare tutti i parametri vitali e ventilatori nella CRF a intervalli regolari ogni 15-30 minuti, più frequentemente durante l'induzione dell'anestesia e della chirurgia, o se il suinetto è instabile.
    8. Annotare i cambiamenti nei farmaci dall'inizio dell'anestesia durante l'esperimento annotando l'ora di inizio e di fine, nonché le modifiche della dose.
    9. Valutare la profondità dell'anestesia valutando il pizzicamento della punta del piede/fascia coronarica per il riflesso di astinenza inizialmente a frequenza regolare. Una volta raggiunto il completo rilassamento muscolare, monitorare la frequenza cardiaca e la pressione sanguigna per una valutazione continua della profondità dell'anestesia.
    10. Puntare a quanto segue, se non diversamente specificato, durante l'esperimento: HR: 120-180 bpm, MAP: 50-80 mmHg, CVP: 3-10 cmH2O, Temperatura corporea: 38-39 °C, BG: 4-5 mmol/L, PaCO2: 35-45 mmHg, regolare RR (max 60 respiro/min), Volume corrente (VT): 7 mL/kg, regolare il PIP.

4. Procedura chirurgica (Tempo: ~30-40 min)

  1. Mantenere la ventilazione durante l'intervento.
    1. Mantenere un RR di 30 respiri/min, mirare al VT espiratorio a 10 ml/kg regolato da PIP, PEEP costante di 6 cmH2O, Tinsp di 0,4 s e FiO2 a 1,0.
  2. Stabilire un campo sterile eseguendo uno scrub cutaneo asettico preferito sul collo per la tracheotomia e sull'inguine per l'accesso ai vasi femorali utilizzando tecniche di lavaggio standard.
    1. Eseguire l'incisione del collo.
      1. Eseguire l'incisione cutanea sul collo con un bisturi tra la cartilagine cricoidea e l'incisura sternale (dimensione approssimativa di 10 cm). Utilizzare la dissezione smussata per isolare la trachea.
      2. Infilare due fascette ombelicali da 12 pollici sotto la trachea.
      3. Praticare un'incisione di 5 mm tra gli anelli tracheali e la porzione più anteriore della trachea, appena sotto la cartilagine cricoidea. Inserire il tubo endotracheale (ETT). Fai il primo nodo sopra la trachea più vicina all'incisione.
      4. Gonfiare il bracciale ETT, ritrarre delicatamente l'ETT fino a quando il bracciale non viene fermato dalla cravatta. Stringere il primo legame e fissare un secondo legame all'ETT. Questo metodo garantisce che la punta sia al di sopra della carena, confermata dall'auscultazione dei suoni respiratori simmetrici e bilaterali.
        NOTA: Il bronco del lobo destro cranico nasce prossimalmente alla biforcazione della trachea. Prestare attenzione all'ostruzione di questo bronco se l'ETT è posizionato troppo in profondità. Se si verificano problemi con la ventilazione o cambiamenti improvvisi, prendere in considerazione la regolazione del tubo. Il tronco vagosimpatico e i nervi laringei si trovano in questa zona del collo. È necessario prestare attenzione per evitare stimolazioni o lesioni a questi nervi.
    2. Eseguire l'incisione inguinale.
      1. Palpare l'arteria femorale, eseguire un'incisione cutanea superficiale all'inguine destro con un bisturi (circa 8-10 cm).
      2. Utilizzare la dissezione smussata per isolare l'arteria femorale e la vena.
      3. Infilare due suture (seta 3.0) sotto ciascuna delle arterie e vene femorali per isolarle26. Preparare i cateteri da inserire.
        1. Per il cateterismo della vena femorale corretta, sollevare entrambe le suture per occludere il flusso sanguigno. Collegare la vena femorale distale al sito di inserimento proposto.
          1. Inserire completamente il catetere, tirando leggermente indietro lo stiletto e legando la fascetta distale per fissare il catetere in posizione. Rimuovere lo stiletto e fissare il set di prolunga da 6 pollici con un rubinetto a tre vie che è stato innescato con soluzione fisiologica.
          2. Prima di fissare il catetere, prelevare una piccola quantità di sangue per garantire la pervietà. Fissare il catetere nel vaso utilizzando la fascetta di sutura prossimale, impedendo al catetere di scivolare fuori.
          3. Collegare la porta secondaria per l'erogazione del fluido di mantenimento e l'infusione dei farmaci. Collegare la porta primaria per la pressione venosa centrale.
        2. Per il cateterismo arterioso femorale destro, utilizzare sull'arteria femorale gli stessi passaggi descritti nei passaggi da 4.2.2.3.1.1 a 4.2.2.3.1.3.
          1. Collegare la prima porta del rubinetto a 3 vie per il monitoraggio invasivo della pressione sanguigna e perdere le incisioni all'inguine e al collo con graffette chirurgiche.
    3. Eseguire l'inserimento del catetere vescicale sovrapubico per l'accesso urinario.
      1. La vescica è localizzata superficialmente nell'addome inferiore, leggermente a sinistra della linea medio-sagittale. Pulire l'addome con tecnica asettica.
      2. Inserire un angiocatetere sterile da 18 G (2") parallelo alla parete addominale, craniale al paio di capezzoli più bassi (5-6 cm sotto l'ombelico), puntato verso l'ombelico mentre con una mano esercitare una leggera pressione su entrambi i lati della vescica per stabilizzarla e renderla leggermente più grande (il protocollo opzionale per l'aspirazione sovrapubica può essere trovato altrove27).
      3. Una volta confermato il flusso di urina, fissare il catetere all'addome per fissarne la posizione. Collegare un set di estensione di grande diametro al catetere. Posizionare l'estremità distale in una provetta da 50 ml posizionata sotto l'animale.

5. Stabilizzazione e reclutamento polmonare standardizzato post-operatorio (Tempo: ~30-60 min)

NOTA: La stabilizzazione inizia quando tutte le procedure chirurgiche sono completate. Una sufficiente profondità analgesica/anestesia è essenziale prima del rilassamento muscolare, in quanto garantisce che i parametri vitali, come la MAP e la FC, rientrino nel range normale e l'assenza di riflessi di astinenza. La MAP e la FC saranno monitorate continuamente durante tutto il protocollo per garantire la corretta profondità dell'anestesia.

  1. Somministrare rocuronio (0,3 mg/kg) in bolo EV (tramite l'accesso alla vena auricolare D5W) e iniziare un'infusione continua di rocuronio (5,5 mg/kg/h) per il rilassamento muscolare prima della manovra di reclutamento polmonare. Questa infusione continuerà per tutta la durata dell'esperimento per standardizzare la procedura di lavaggio e prevenire l'asincronia con il ventilatore.
  2. Eseguire una manovra di reclutamento polmonare standardizzata.
    1. Aumento graduale della PEEP: iniziare da PEEP 6 cmH2O, salendo di 1 cmH2O ogni minuto fino a raggiungere PEEP 10 cmH2O. Regolare PIP per mantenere VT 10 mL/kg.
    2. Rimanere a PEEP 10 cmH2O per 2 minuti prima di tornare a una PEEP 6 cmH2O in modo inverso (come al punto 5.2.1) mantenendo VT 10 mL/kg.
    3. Quando è stabile a VT 10 mL/kg su una PEEP 6 cmH2O, registrare le impostazioni respiratorie, i parametri fisiologici e prelevare un'emogasanalisi arteriosa (punto temporale VT 10 mL/kg su CRF).
      1. Assicurarsi che la PaO2 sia >400 mmHg (risposta prevista all'iperossia in un animale con polmoni sani). FiO2 1.0 viene utilizzato durante le fasi iniziali dell'esperimento per garantire una risposta appropriata all'iperossia come criterio di inclusione.
      2. Se questo non viene raggiunto:
        1. Controllare la posizione del tubo endotracheale, le impostazioni del ventilatore, l'erogazione di ossigeno e la corretta tecnica di prelievo del sangue. Ripetere una volta la manovra di reclutamento polmonare per garantire un reclutamento corretto.
        2. Se ancora non migliorato, escludere l'animale e sopprimerlo immediatamente (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) a causa del potenziale problema intrinseco del polmone (polmone malsano da precedente esposizione non sperimentale, cioè in allevamento).
      3. Regolare l'RR per mantenere PaCO2 tra 35-45 mmHg.
      4. Abbassare il PIP per raggiungere VT 7 mL/kg, mantenendo FiO2 1.0 e PEEP 6 cmH2O.
      5. Dopo la stabilizzazione, registrare le letture basali dei punti temporali per VT 7 mL/kg sul foglio CRF con parametri fisiologici e campioni, inclusi i gas ematici arteriosi e venosi. La stabilizzazione comprende i segni vitali, come nei passaggi 3.2.10, e i valori dei gas ematici di: PaO2: 400-500 mmHg, PaCO2: 35-45 mmHg, pH: 7,35-7,45, BG: 4-5 mmol/L.

6. Ventilazione per animali di controllo

  1. Utilizzare la ventilazione a volume controllato con un volume corrente di 7 mL/kg, PEEP di 6 cmH2O e FiO2 di 1,0. Non indurre lesioni polmonari negli animali di controllo (ad esempio, non eseguire la deplezione del tensioattivo o l'instillazione di endotossine).
  2. Continuare la ventilazione per circa 90 minuti in modo che corrisponda alla durata media richiesta per indurre il danno polmonare negli animali da esperimento (vedere il passaggio 7 e la Figura 1). Trascorso questo periodo, procedere direttamente al passaggio 10.

7. Induzione di danno polmonare acuto (modello multi-hit)

  1. Eseguire l'esaurimento del tensioattivo (Tempo: 1-2 ore)
    1. Prima di iniziare il lavaggio polmonare, accendere l'apparecchio di aspirazione e assicurarsi che sia pronto per l'uso. Posizionare il secchio di raccolta del lavaggio. Posizionare gli assorbenti sotto la testa dell'animale e sotto il tavolo operatorio per catturare tutto il liquido fuoriuscito e recuperato durante il lavaggio.
      1. Pesare i tamponi prima e dopo il lavaggio. Impostare il ventilatore su PEEP 5 cmH2O, PIP 25 cmH2O, RR 25/min e FiO2 1.0. Mantenere queste impostazioni di ventilazione a pressione controllata durante la procedura di lavaggio. Aspettatevi che la VT diminuisca di circa il 35%-45% durante il lavaggio completo.
    2. Scollegare il circuito ventilatorio dall'ETT e collegare l'apparecchio a imbuto di lavaggio (vedere File supplementare 1).
    3. Instillare 30 ml/kg di soluzione salina isotonica calda (NS) nei polmoni versando delicatamente NS nell'imbuto tenuto a circa 30 cm sopra il suinetto.
    4. Massaggiare la gabbia toracica premendo bilateralmente sulla parte laterale per fornire una "compressione" meccanica. Aiuta a spostare la soluzione salina nei polmoni e a farla circolare all'interno dell'apparato di lavaggio. Lasciare 2-3 secondi tra un massaggio e l'altro.
      NOTA: Evitare di massaggiare troppo rapidamente o troppo lentamente per evitare una rimozione inadeguata del tensioattivo o un ritorno venoso alterato. Non superare i 30 s per giro di lavaggio.
      1. Rimuovere il liquido di lavaggio abbassando l'imbuto sotto il suinetto. Scollegare leggermente l'imbuto dall'ETT per consentire al fluido di defluire nel secchio di raccolta sul pavimento.
      2. Eseguire l'aspirazione attiva per non più di 10 s. Inserire il catetere di aspirazione nell'ETT continuando il massaggio della gabbia toracica per facilitare il drenaggio dei liquidi. Monitorare la MAP e la frequenza cardiaca e ricollegare la ventilazione in anticipo se uno dei due parametri scende in modo significativo.
      3. Ricollegare il circuito ventilatorio. Se nell'ETT rimane del liquido in eccesso, eseguire una seconda aspirazione.
    5. Lasciare che il suinetto si riprenda per almeno 3 minuti tra i giri di lavaggio per ridurre lo stress e il rischio di intolleranza.
    6. Inizia il prossimo giro di lavaggio una volta che SpO2 torna al 100%. Se la SpO2 non ritorna al 100%, controllare la PaO2tramite l'emogasanalisi una volta che la SpO2 si è stabilizzata
      1. Se PaO2 >100 mmHg - ripetere i lavaggi polmonari (passaggi 7.1.2-7.1.6).
      2. Se PaO2 <100 mmHg, attendere 15 minuti mantenendo le impostazioni di ventilazione del lavaggio, quindi ripetere l'analisi dei gas nel sangue.
      3. Se PaO2 >100 mmHg - continuare il lavaggio e procedere al passaggio 7.1.6 per rivalutare l'entità della lesione.
    7. Verificare che la lesione da deplezione del tensioattivo sia raggiunta quando la PaO2 rimane <100 mmHg per 15 minuti. Interrompere il lavaggio e procedere al passaggio successivo.
  2. Instillare endotossina intratracheale (Tempo: 15 min)
    1. Preparare il lipopolisaccaride (LPS) da Escherichia coli (1,5 mg/kg) diluendo in NS fino a un volume totale di 2 ml in una siringa da 3 ml.
      NOTA: Selezionare il ceppo e la dose appropriati, riconoscendo la potenziale variazione degli effetti dipendente dal ceppo.
    2. Attendere 15 minuti dopo il lavaggio polmonare finale, quindi instillare LPS per via intratracheale (IT) con il suinetto in posizione supina.
    3. Migliorare la distribuzione omogenea di LPS nel polmone atelettatico utilizzando i seguenti passaggi:
      1. Sostituire l'estremità ETT standard con un adattatore con porta a Y per consentire la ventilazione simultanea e la somministrazione di LPS tramite un catetere attraverso la porta laterale con valvola.
      2. Applicare PEEP di 10 cmH2O per 1 min. Regolare il PIP per mantenere la TV a 7 ml/kg e impostare la RR a 40 respiri/min.
      3. Inserire un catetere attraverso la porta laterale nell'ETT a una profondità premisurata in modo che la punta si estenda di 1-2 mm oltre l'ETT.
      4. Iniettare l'LPS attraverso il catetere. Lavare il catetere con 1 mL NS seguito da un bolo d'aria da 9 mL per garantire l'erogazione completa.
      5. Rimuovere il catetere e chiudere la porta laterale.
      6. Continuare la ventilazione con PEEP 10 cmH2O (regolare PIP per mantenere VT 7 mL/kg) per 3 minuti dopo la somministrazione di LPS.
      7. Scollegare il circuito del ventilatore dall'ETT per 30 s per invertire qualsiasi reclutamento involontario di tessuto polmonare.
      8. Durante la disconnessione, regolare le impostazioni del ventilatore su FiO2 0,5, PEEP 6 cmH2O, PIP per mantenere VT 7 mL/kg e aumentare il RR a 40-60 respiri/min per ottenere PaCO2 di 35-45 mmHg.
      9. Una volta che la TV si è stabilizzata a 7 mL/kg, registrare le misurazioni fisiologiche del Timepoint a 0 ore e completare il foglio CRF. Regolare il RR in base a PaCO2 dall'emogasanalisi.

8. Ventilazione durante il periodo di osservazione (Tempo: ~6 h)

  1. Passare alla ventilazione a volume controllato con FiO2 a 0,5 e PEEP a 6 cmH2O. Regolare il PIP secondo necessità per mantenere la TV a 7 ml/kg (non impostare un PIP massimo). Regolare la RR, fino a un massimo di 60 respiri/min, per mantenere il normale PaCO2.
  2. Utilizzare le misurazioni orarie dei gas ematici per guidare le regolazioni RR durante il resto dell'esperimento. Regolare continuamente il PIP per mantenere la TV a 7 ml/kg.
  3. Applicare questi parametri di ventilazione in modo uniforme sia agli animali di controllo che a quelli con più colpi per l'intero periodo di osservazione di 6 ore (vedi Figura 1).

9. Procedura di trattamento - opzionale (Tempo: ~10-20 min)

  1. Per potenziali studi di intervento, somministrare l'agente terapeutico attraverso una via clinicamente rilevante come intratracheale (IT), endovenosa (IV), sottocutanea, intramuscolare o intranasale. Selezionare la tempistica del trattamento in base al disegno sperimentale. Se non viene somministrato alcun trattamento, passare al passaggio 10. Di seguito viene fornito un esempio di amministrazione IT:
    1. Posizionare il suinetto in decubito laterale destro.
    2. Mantenere la PEEP a 6 cmH2O. Regolare la PIP per ottenere una VT di 7 mL/kg.
    3. Inserire il catetere nella porta laterale valvolare alla lunghezza predeterminata (come descritto al punto 7.2.3.3). Instillare metà della dose o del volume previsto dell'intervento. Seguire con un bolo di 1 mL NS e 9 mL di aria. Limitare il volume totale a 2,5 ml/kg per ridurre al minimo il rischio di occlusione della ventilazione dopo l'iniezione in bolo.
    4. Sigillare la porta laterale della valvola con il tappo per evitare perdite di ventilazione.
    5. Riposizionare il suinetto in decubito laterale sinistro e ripetere i passaggi 9.1.3-9.1.4.
    6. Rimetti il suinetto in posizione supina. Regolare il PIP per mantenere la TV a 7 ml/kg.
    7. Continuare la ventilazione come descritto al punto 8.

10. Eutanasia e completamento dell'esperimento

  1. Eseguire le registrazioni fisiologiche finali e la raccolta dei campioni dopo 6 ore di ventilazione durante il periodo di osservazione (fase 8).
  2. Sopprimere l'animale con 120 mg/kg di Pentobarbital sodico EV (240 mg/mL) somministrato in bolo (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
  3. Garantire la morte di un animale con l'assenza di segni vitali (battito cardiaco, pressione sanguigna e respirazione). Auscultare per l'assenza di frequenza cardiaca e suoni respiratori con uno stetoscopio per la conferma della morte. La morte è ulteriormente confermata con una raccolta terminale di tessuti del cuore e del polmone.
  4. Raccogliere i campioni di tessuto e i fluidi corporei per ulteriori analisi biochimiche, molecolari e/o istologiche14,17 per esperimenti futuri.
  5. Salvare tutti i dati nell'apparecchiatura di monitoraggio e nel ventilatore, assicurarsi che le copie di backup vengano caricate sull'unità locale e sull'unità condivisa e spegnere tutte le apparecchiature.
  6. Smaltire tutti i materiali taglienti/a rischio biologico come indicato dalle politiche locali.
  7. Pulire tutte le superfici con il prodotto antisettico preferito.
  8. Lavare tutti gli strumenti e lasciare asciugare per una notte.

Risultati

Gli endpoint di questo modello sono allineati con i criteri dell'American Thoracic Society per l'ALI (minimo 3 su 4), che includono alterazioni fisiologiche, istologiche, infiammatorie e della barriera alveolo-capillare16,17. Ulteriori endpoint possono essere inclusi a seconda dello studio e a discrezione di ciascun gruppo di ricerca che desidera implementare questo modello. Il danno polmonare moderato è definito come un rapporto tra la frazione parziale di ossigeno nel sangue arterioso e la frazione di ossigeno inspirato (PaO2/FiO2, noto anche come rapporto P/F) < 200 mmHg e grave < 100 mmHg17. L'indice di ossigeno (OI) viene calcolato utilizzando la seguente formula: OI = (pressione media delle vie aeree (mAWP) * %O2)/PaO2 e valori compresi tra 8 e 16 sono classificati come lesione moderata28. Rispetto agli animali di controllo, gli animali con più colpi hanno mostrato un danno polmonare da grave a moderato a causa del loro indice di ossigenazione alterato, del rapporto P/F e della ridotta compliance del sistema respiratorio (Figura 2). Chiari segni di danno istologico erano presenti utilizzando un punteggio di danno polmonare istologico in modalità 516,17 (Figura 3), con afflusso di neutrofili nello spazio alveolare e interstiziale, detriti proteici che riempiono gli spazi aerei e ispessimento del setto alveolare. L'afflusso di neutrofili nel BALF fornisce un'indicazione dei processi infiammatori insieme all'aumento della citochina IL-6 nel tessuto polmonare (Figura 4).

figure-results-1
Figura 1: Diagramma di flusso del danno polmonare acuto nei suinetti neonati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Si osserva un'ALI da moderata a grave seguendo la lesione multi-hit presentata in questo protocollo. (A,B) L'aumento dell'indice di ossigenazione (tra 8-12) e il basso rapporto PaO2/FiO2 (P/F) si ottengono nel modello multi-hit qui presentato (linea rossa) rispetto al controllo (linea blu), in linea con il danno polmonare da moderato a grave. (C) La funzione polmonare è compromessa negli animali con più colpi, qui indicata come una diminuzione del >50 % della compliance del sistema respiratorio. Numero di animali (N): controllo (N = 5) e multi-hit (LPS ceppo O55:B5, 1,5 mg/kg) (N = 3). Tutti i valori utilizzati significano ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Il modello di ALI multi-hit mostra una lesione istologica eterogenea. (A,B) Si osserva evidenza macroscopica di lesione polmonare a chiazze che interessa preferenzialmente l'aspetto centrale posteriore del polmone multi-hit. (C, D) Immagini rappresentative (100x) di sezioni polmonari colorate con ematossilina ed eosina (H&E) che mostrano l'afflusso neutrofilo nello spazio alveolare e interstiziale, con ispessimento alveolare e settale nel polmone multi-hit. (E,F) Immagini rappresentative (400x) di sezioni polmonari colorate con H&E evidenziano la compromissione dell'integrità strutturale, l'infiltrazione neutrofila e la deposizione di detriti nello spazio alveolare del polmone multi-hit. I quadrati blu rappresentano l'area ingrandita in (E,F). La barra della scala nera rappresenta 100 mm (C,D) e 50 mm (E,F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Il modello multi-hit mostra una risposta infiammatoria dopo ALI. (A) Afflusso di neutrofili con neutrofili che raggiungono oltre il 75% della frazione delle cellule totali nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) 6 ore dopo il danno polmonare indotto (multi-hit) rispetto agli animali di controllo. (B) La citochina proinfiammatoria IL-6 è elevata nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) e (C) nel tessuto polmonare 6 ore dopo l'ALI indotta. Il numero di animali (N) varia a seconda del materiale disponibile al momento dell'analisi. Per il BALF (B) è stato utilizzato un test di immunoassorbimento enzimatico, mentre per il tessuto polmonare (C è stata eseguita la tecnologia a microsfere laser multiplex). Tutti i valori sono indicati come media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Modulo di monitoraggio del caso per il modello di lesione polmonare acuta del suinetto neonatale. Clicca qui per scaricare questo fle.

Discussione

Il modello ALI di suinetto neonatale è costituito da un modello multi-hit caratterizzato da lavaggio polmonare per la rimozione del tensioattivo (che imita la sindrome da distress respiratorio che porta ad atelettotrauma), elevata esposizione all'ossigeno (che porta a specie reattive dell'ossigeno), ventilazione meccanica (baro/volu-trauma), nonché somministrazione IT di LPS come stimolo infiammatorio, rispecchiando i vari componenti che si ritiene siano coinvolti nella patogenesi della BPD nei neonati pretermine2. Durante il processo di esaurimento del tensioattivo, c'è un aumento intenzionale della pressione e dell'ossigeno che contribuisce alla lesione. L'esposizione all'iperossia con FiO2 1.0 è di circa 3 ore e viene aggiunta un'alta pressione per circa 90 minuti durante la fase di lesione polmonare indotta (deplezione di tensioattivo, lavaggio e installazione di endotossine). Alti livelli di ossigeno inspirato durante la rianimazione (FiO2 0,9 0,9 vs. 22 0,3) nei neonati nati prematuri hanno provocato un aumento dello stress ossidativo e dell'infiammazione, con esposizione all'iperossia inferiore a 1 ora29. In caso di deplezione del tensioattivo nel modello di suinetto, i polmoni collasseranno/provocheranno atelettasia e la capacità di mantenere la pervietà alveolare sarà ridotta per un'adeguata ventilazione e ossigenazione. Pertanto, anche se le impostazioni sono ridotte nel periodo di osservazione, la rimozione del tensioattivo comporterà la necessità di una pressione più elevata per raggiungere un volume corrente di 7 mL/kg. I polmoni saranno in grado di produrre tensioattivo con il passare del tempo e l'entità del processo dannoso in corso potrebbe diminuire nel tempo. Tuttavia, questo nuovo modello di ALI di suinetto neonatale mostra un scarso recupero (Figura 2) della funzione polmonare (compliance) e dell'ossigenazione (rapporto PF) durante il periodo di osservazione per 6 ore dopo il danno polmonare indotto. Questo modello assomiglia molto alle circostanze postnatali iniziali più comuni che i neonati estremamente prematuri devono affrontare, rendendolo molto rilevante per gli sforzi traslazionali. Il modello crea una lesione polmonare acuta da moderata (100-200 mmHg) a grave (<100 mmHg) definita dal rapporto P/F28. L'effetto LPS con l'infiammazione raggiunge il picco da una a 2 ore dopo l'infortunio30. Questo modello può essere utilizzato come impalcatura che può essere manipolata da altri gruppi modificando la lunghezza dell'osservazione o del trattamento utilizzato per adattarlo al loro programma di ricerca.

Passaggi critici nel protocollo

Nonostante la priorità data all'accessibilità, questo modello animale di grandi dimensioni rimane complesso e richiede un team altamente qualificato che lavori in modo collaborativo per portare a termine questo esperimento. Ci sono passaggi critici nel protocollo che richiedono particolare cautela. Queste considerazioni sono fondamentali per garantire il successo di questo complesso quadro sperimentale.

Trasporto dell'animale

Si prevede che il distacco precoce dalla madre sia un momento estremamente stressante per l'animale, che potenzialmente porta all'incapacità di mantenere la stabilità cardiovascolare e alla possibile morte durante il trasporto. Tuttavia, il protocollo di trasporto (vedi passaggio 3) qui presentato consentiva animali molto calmi (alcuni addirittura addormentati), consentendo una sperimentazione completa. Sebbene sia difficile formulare raccomandazioni chiare sulla durata massima del trasporto, i suinetti sono stati in grado di sopportare comodamente un trasporto di circa 60 minuti nella nostra esperienza.

Ottimizzazione della ventilazione

Il ventilatore deve essere impostato in modo da compensare la conformità del circuito per garantire che l'intero volume corrente venga erogato ai polmoni. Ciò è particolarmente importante durante la deplezione del tensioattivo, poiché il suinetto può diventare emodinamicamente instabile se il volume corrente viene perso nel circuito. I ricercatori devono confermare che il ventilatore disponibile consentirà un'adeguata erogazione del volume corrente per un neonato. I ventilatori adulti spesso non sono in grado di raggiungere volumi correnti neonatali adeguati. Il PIP viene utilizzato per mantenere i valori del volume corrente espiratorio (7 mL/kg utilizzati in questo protocollo come precedentemente descritto da altri 14,19,20,21,31,32, tranne durante il lavaggio polmonare - vedere la sezione successiva). L'uso standardizzato dell'adattatore per tubo endotracheale con una porta laterale valvolare durante la somministrazione di LPS, o per qualsiasi trattamento IT, consente di mantenere la pressione delle vie aeree evitando la disconnessione dal circuito ventilatorio.

Strategia standardizzata di reclutamento polmonare dopo l'intervento chirurgico

L'atelettasia può svilupparsi nei polmoni dei suinetti durante le fasi preparatorie e chirurgiche. È stata somministrata una manovra di "reclutamento polmonare" dopo il rilassamento muscolare33 per garantire una corretta aerazione polmonare. Dopo la manovra di reclutamento, si prevede che la pressione parziale dell'ossigeno nel sangue arterioso sia superiore a 400 mmHg, data la normale risposta iperossica nei polmoni aperti sani. Se questo non viene raggiunto, il ricercatore deve considerare se i polmoni non sono stati reclutati in modo appropriato a causa di condizioni sperimentali non ottimizzate o se il suinetto può avere una condizione preesistente (ad esempio, se il suinetto proviene da un allevamento in cui possono verificarsi esposizioni sconosciute). Il protocollo consente di testare la prima spiegazione con il riavvio della manovra di reclutamento una volta per vedere se questo obiettivo può essere raggiunto. Se non si riesce a raggiungere una seconda volta i 400 mmHg di PaO2, considerare l'esclusione dell'animale, come una condizione preesistente che potrebbe esistere, che influenzerebbe in modo inappropriato i risultati sperimentali.

Una quantità sufficiente di liquidi e l'omeostasi metabolica sono della massima importanza

Ciò limiterà importanti effetti confondenti legati alla scarsa idratazione e al controllo metabolico. Questi suinetti a termine appena nati, di solito nati in una cucciolata numerosa, non avranno tutti un'opportunità simile di allattamento. In quanto tali, possono essere esposti a un certo livello di disidratazione postnatale prima di essere utilizzati nell'esperimento. Fornire un'assunzione totale di liquidi di 5-8 mL/kg/h è sufficiente per mantenere un buon volume intravascolare14,34. Garantire il controllo metabolico avviene con il mantenimento di un livello di glucosio nel sangue compreso tra 4-5 mmol/L (intervallo fisiologico normale per suinetti appena nati35,36). L'alto contenuto di lattato nel sangue è un altro riferimento utilizzato per riflettere uno scarso apporto di ossigeno e può eventualmente riflettere un basso stato del liquido intravascolare prima dell'ipossia. Un regime idrico sufficiente e un animale ben idratato resistono ai lavaggi di deplezione del tensioattivo con stabilità cardiovascolare e non generano acidosi grave. I valori di riferimento dell'emoglobina e di altri parametri biochimici variano a seconda dell'età e della specie37,38. L'emoglobina più bassa può influire sull'ossigenazione, che richiede un prelievo di sangue ottimizzato e conservativo39,40. Ogni prelievo di sangue è compensato con un uguale volume di NS. I livelli di elettroliti nel sangue, urea e creatinina sono stati utilizzati per seguire un regime di liquidi sufficiente.

Consentire un tempo di recupero sufficiente durante la procedura di lavaggio polmonare

Durante il lavaggio polmonare, è necessaria un'importante finestra di recupero di almeno 3-5 minuti tra ogni lavaggio per consentire un corretto ritorno venoso per evitare pericolose congestioni epatiche41, emorragie epatiche e insufficienza cardiaca destra. Questo fenomeno è stato osservato in alcuni animali all'interno della coorte sperimentale. Una gestione corretta e proattiva dei fluidi è fondamentale per il mantenimento della stabilità clinica. Ricreando un piccolo ambiente di terapia intensiva per questo modello di suinetto, è essenziale avere un medico, un neonatologo o un tecnico veterinario senior che possa facilitare la traduzione delle conoscenze tra i membri del team per riconoscere situazioni importanti e i piani di emergenza associati.

Risoluzione dei problemi consigliata

Il maialino sarà sottoposto ad anestesia generale e analgesia per tutto il tempo chirurgico e sperimentale. Una persona si dedica al monitoraggio del suinetto per l'intero esperimento. Ogni animale è diverso nella sua sensibilità e risposta agli anestetici. Il monitoraggio delle condizioni dell'animale subito dopo l'induzione dell'anestesia con parametri vitali e gas ematici orari è fondamentale. Fornirà informazioni sul livello di anestesia e sulla stabilità metabolica, oltre alla valutazione fisica, se necessario. C'è una variabilità nel numero di lavaggi polmonari (da 6 a 20) e quindi nel tempo (da 28-115 min), necessari per raggiungere la deplezione del tensioattivo.

Potenziali problemi e soluzioni durante l'induzione, la stabilizzazione e l'intervento chirurgico dell'anestesia: (1) Se si sviluppa l'apnea, il gas anestetico deve essere spento e la respirazione deve essere supportata con la ventilazione con maschera a sacco fino al ritorno della respirazione spontanea. (2) Se sono presenti segni di ipovolemia attraverso HR alta, MAP bassa o CVP bassa, è necessario somministrare un bolo di liquidi di 10 mL/kg di NS e prendere in considerazione un aumento del tasso di liquido di mantenimento. (3) Quando l'ipotensione con MAP decrescente a 30-40 mmHg, che non si risolve con il bolo di fluido, le pompe per anestesia devono essere diminuite/interrotte e i segni di perfusione e ipotensione devono essere rivalutati dopo 10-15 minuti. Analisi dei gas nel sangue per i livelli di emoglobina per valutare eventuali emorragie interne. (4) Se i sintomi respiratori indicano pneumotorace (desaturazione acuta o bradicardia >20%), il suinetto viene soppresso immediatamente.

Limitazioni

Il modello qui riportato rappresenta un'ALI neonatale a breve termine (6 ore) in un modello animale di grandi dimensioni. La cronicità delle lesioni che portano alla BPD è un fattore importante da considerare. Questo modello potrebbe non catturare completamente questo aspetto della patogenesi e i dati che informano l'andamento del danno polmonare oltre le 6 ore rimangono indeterminati. Ciononostante, la coerenza di questo modello rappresenta una solida base su cui costruire (estendendo la lunghezza/modificando il protocollo), consentendo versatilità ai gruppi di ricerca che lo implementeranno. Nonostante l'enfasi posta sull'accessibilità e la fattibilità di questo modello animale di grandi dimensioni durante la sua concezione, sono necessarie competenze specifiche per la corretta esecuzione dell'esperimento. L'esperienza clinica con una solida base in fisiologia e le conoscenze per gestire rapidi cambiamenti/deterioramenti tramite farmaci/infusione/ecc. sono necessari per l'implementazione e il completamento con successo nelle fasi iniziali. Questo insieme di competenze può quindi essere trasferito ai membri del team per la manutenzione continua del modello nel tempo. Inoltre, un team composto da un tecnico veterinario, tecnici di laboratorio e studenti laureati senior con i quali è stata stabilita una forte comunicazione e collaborazione può garantire una copertura adeguata di tutti i componenti di ogni esperimento. Si prevede che saranno necessari almeno tre membri del team per eseguire l'esperimento dall'inizio alla fine, quando il flusso di lavoro sarà ottimizzato.

Significato e sua potenziale applicazione

La traduzione clinica si basa su solidi studi di base a livello preclinico. Tuttavia, molti studi clinici falliscono a causa della mancata corrispondenza tra il modello preclinico e la fisiologia umana, evidenziando l'importanza di modelli animali di grandi dimensioni strettamente correlati per rafforzare il potenziale di traduzione. La generazione di un nuovo modello di danno polmonare neonatale è fondamentale per comprendere meglio gli eventi patogeni precoci, promuovendo un ambiente favorevole allo sviluppo della BPD nel polmone pretermine umano. Il modello qui presentato ricrea aspetti importanti di un ambiente di terapia intensiva (iperossia, ventilazione ad alta pressione e mancanza di tensioattivo) per i neonati prematuri durante i primi giorni di vita, che è strettamente modellato. Questo nuovo e versatile modello multi-hit per suinetti neonatali offrirà informazioni preziose sui processi patogenetici precoci della BPD, migliorerà le conoscenze sui candidati terapeutici e l'ottimizzazione della loro somministrazione terapeutica per un'efficace traduzione clinica. Fungerà da eccellente vettore per le collaborazioni, promuovendo un quadro di verifica delle ipotesi per studi proof-of-concept che variano dalla sicurezza all'efficacia e alla generazione di conoscenze. Fungendo da base per studi futuri, questo modello farà progredire in modo significativo gli sforzi di traduzione clinica per il danno polmonare acuto osservato nei neonati pretermine.

Dichiarazioni

Tutti gli altri autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.

Ringraziamenti

Siamo grati al dottor Martin Post, dell'Hospital for SickKids di Toronto, che ci ha generosamente prestato un ventilatore neonatale che è stato utilizzato durante questo progetto. Ringraziamo anche Dan DeVette e il suo team presso l'Animal Care and Veterinary Service, Heart Institute, University of Ottawa, per tutta l'assistenza durante lo sviluppo di questo modello. Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo per l'innovazione CHAMO di CHEO, dalla Stem Cell Network, dall'associazione della principessa Lovisa [HKH Kronprinsessan Lovisas förening], dalla David and Astrid Hagelén Foundation e dalla Swedish Heart Lung Foundation.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lama del bisturi #10Incisione cutanea
1 ml di siringaBectonDicksonBD309659Slip Tip 
Siringhe da 10 mlBectonDicksonBD302995Rinchiacchione per linee arteriose e venose
18 G angiocatheter InsyteCanulazione vescica
Siringhe da 20 mlBectonDicksonBD302830bolo fluido se necessario
Aghi ipodermici da 22 GBectonDicksonSiringa di ricarica
24 G angiocateteriInsyte160465Accesso all'orecchio e arteria e vena femorale
Aghi ipodermici da 25 gBectonDicksoniniezione intramuscolare (IM) di bupenorfina
Siringhe da 3 mlBectonDicksonIniezione di farmaci e rimozione dello spazio morto delle linee di monitoraggio
Cravatte di seta 3-0EthiconA304HUtilizzato per fissare cateteri arteriosi e venosi
Rubinetti di fermamento a 4 vieDiscofix, BraunD500456020collegati al fluido e le linee di monitoraggio per il lavaggio e il campionamento
Set di estensione da 6"Tecnologie di infusione SAIEst.-6collegato a flebo/linee arteriose 
Set di estensioni da 60"BBV6223Linee di infusione di farmaci
Adattatore di accesso AirLife Neo-Verso Y per tubi endotrachealiVyaireCSC300Utilizzato per somministrare materiale intratracheale
Bupenorfina, 0,3 mg/mLCDMV128140Bolo IM come antidolorifico
Destrosio, 5%BaxterJB0063Mantenimento della glicemia
Tende usa e getta3M3M1050Tende da campo sterili
Elettrodi ECG3M220790Elettrodi monouso per ECG
Catetere di somministrazione del tubo endotracheale (ETT)
Tubo endotracheale 3,5 Teleflex5-10107Utilizzato per la tracheostomia
Epinefrina, 1 mg/mLHospira07541L01Diluito con soluzione salina normale sterile fino a 0,1 mg/mL per la rianimazione se necessario
Analizzatore di gasoplastie ePOC  Siemens10736398Sistema di analisi del sangue ePOC con ospite NXS
Epoc schede campioneSiemensBD309659Cartucce per gas ematico
Formalina, tamponata al 10%Fisher ScientificSF100-4Fissazione polmonare
TermoforoKent ScientificTPZ-814EACoperta che circola acqua
Pompe per infusione endovenosa x 3Sigma AldrichZ401358Infusione di ketamina/propofol e rocuronio
Ketamina, 10 mg/mLVetochinolo112170Infusione continua (diluita con soluzione salina normale sterile) in pompa di siringa per il mantenimento anestesiale 
Ketamina, 100 mg/mLVetochinolo112170Usata come bolo per l'induzione dell'anestesia generale e pompa per siringa per il mantenimento dell'anestesia & nbsp;
Ringer lattatiBaxterJB2323Mantenimento del volume sanguigno
Attrezzatura di lavaggio: imbuto, connettore a 3 vie, connettore ETT, tubo di 4 piedin/an/aTubi fatti in casa per lavaggio
Lipopolisaccaridi, LPS (O55:B5), 100 mgSigma-AldrichL2880-100mgSecondo colpo di lesione polmonare
Umidificatore respiratorio MR850Fisher e PaykelMR850JXX*
Pentobarbital Sodio (Eutanil), 240 mg/mLVetochinolo381Bolus endovenoso per l'eutanasia umana
Trasduttore di pressioneForniture Veterinarie McCarthyV6402per pressioni arteriose/venose su Surgivet
Propofol, 10 mg/mLUsata come bolo per l'induzione dell'anestesia generale e pompa per siringa per il mantenimento dell'anestesia & nbsp;
PulsossimetroMaismoNEOPT-500
Rocuronio, 10 mg/mLAuropharma2498820Utilizzato dopo l'intervento chirurgico e prima dell'inizio dell'induzione del trauma polmonare, seguito da infusione continua
Soluzione fisiologica, 0,9%BaxterJB1324Lavaggio della linea sanguigna e rianimazione del volume sanguigno
Acqua sterilen/an/aPer umidificatore ventilatore
Catete di aspirazione 10 CH/25 cmMediplast608810251Utilizzato per il lavaggio broncheoalveolare del lobo polmonare
catete di aspirazione 6 CH/40 cmMediplast60880640rimuovere l'eccesso di soluzione salina durante il lavaggio
Strumenti chirurgici: manico per bisturi, pinze antizanzare, pinze per il pollice, forbici metzenbaum, graffette, forbici chirurgiche, retrattori, garza, ciotola in acciaio inoxN/AN/APacchetto chirurgico autoclavato
Chirurgico: manicaleta NIBP, sonda di temperatura,   2 tasse di pressione invasiva, ECG, pulsossimetroForniture Veterinarie McCarthyv9203Contiene: bracciale per la pressione sanguigna non invasiva (NIBP), termometro, pressione sanguigna (BP) invasiva 2x, elettrocardiografia (ECG) e pulsossimetro
Pompe a siringa x 3Pompe per anestesia
NastroFissare le linee IV dell'orecchio
Nastro a forma di omble.EthiconFissa il tubo endotracheale all'interno della trachea
Ventilatore (Servo-I)GetingeDeve avere impostazioni neonatali per un volume di marea adeguato
Circuito ventilatorioFisher e PaykelRT265Con umidificatore
Pinza di occlusione a tubo di Vorsen/an/aocclude il tubo durante il lavaggio

Riferimenti

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