Articolo metodologico

Un modello murino unico per la valutazione quantitativa della formazione di biofilm su impianti chirurgici in ascesso sottocutaneo

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DOI:

10.3791/68067

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6 giugno 2025

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute (OTI), University of California, San Francisco (UCSF), 2Rosies Base, LLC, 3Department of Neurological Surgery, Weill Institute for Neurosciences, Brain and Spinal Injury Center (BASIC), University of California, San Francisco (UCSF)

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un modello sperimentale unico di infezioni correlate all'impianto che consente l'incubazione simultanea di due impianti con batteri in condizioni identiche all'interno di un singolo topo. Consente inoltre una valutazione precisa della formazione di biofilm sulle superfici implantari utilizzando metodi analitici comparativi ottimizzati, dimostrando tecniche avanzate per valutare le proprietà antimicrobiche dei biomateriali.

Abstract

Per sviluppare un nuovo biomateriale con proprietà antibatteriche per le procedure chirurgiche ortopediche, è fondamentale stabilire un modello animale sperimentale di infezioni correlate all'impianto che imiti da vicino lo stato patologico. Inoltre, è necessario un confronto quantitativo con campioni di controllo per valutare la formazione di biofilm sui materiali. Tuttavia, gli attuali modelli animali, che prevedono l'impianto di un singolo materiale per ogni individuo, possono produrre risultati incoerenti a causa dell'eterogeneità dello stato di infezione tra i soggetti. Inoltre, quantificare con precisione la formazione di biofilm su materiali in vivo rimane difficile e i risultati potrebbero non essere affidabili. Per affrontare questi problemi, questo studio ha dimostrato un modello murino unico di infezione correlata all'impianto che consente l'incubazione simultanea di due impianti con batteri in un ambiente chiuso all'interno di un singolo topo, formando un ascesso sottocutaneo incapsulato. Inizialmente è stata creata una sacca d'aria matura sotto la pelle della schiena. Due fili di acciaio inossidabile sono stati collegati e inseriti nella busta, seguiti dall'inoculazione di Xen 36, un ceppo bioluminescente di Staphylococcus aureus. Entro 14 giorni dall'inoculazione, si era formato un ascesso sottocutaneo attorno ai fili. Il biofilm è stato completamente rimosso dalla superficie di ciascun filo e le sospensioni batteriche disciolte sono state misurate con precisione utilizzando metodi ottimizzati per valutare la formazione di biofilm sull'impianto, determinare le unità formanti colonie ed eseguire l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi. Sfruttando l'operone lux dei batteri bioluminescenti, i livelli di espressione relativi di luxA e 16S rRNA sono stati utilizzati per determinare la carica batterica all'interno del biofilm su ciascun filo. Questo approccio analitico comparativo ottimizzato consente valutazioni precise della formazione di biofilm su due fili in condizioni di infezione uniformi all'interno di un singolo modello murino e può facilitare l'avanzamento di biomateriali con proprietà antibatteriche.

Introduzione

Le infezioni correlate all'impianto rimangono una sfida significativa in ambito clinico perché possono causare alti tassi di morbilità e mortalità in chirurgia ortopedica nonostante i progressi nella tecnica chirurgica e nella progettazione degli impianti1. Sebbene l'incidenza delle infezioni associate agli impianti chirurgici sia diminuita significativamente grazie ai moderni standard di controllo asettico nell'ambiente della sala operatoria e ai protocolli appropriati per la profilassi antibiotica perioperatoria, l'incidenza di infezioni correlate all'impianto in chirurgia primaria rimane del 2%-5%2.

Il principale meccanismo alla base delle infezioni correlate all'impianto è la formazione di un biofilm sulla superficie dell'impianto, che protegge i microrganismi dagli antibiotici e dal sistema immunitario, rendendo l'infezione difficile da sradicare 3,4. Poiché l'adesione batterica sulla superficie dell'impianto è fondamentale durante la prima fase di formazione del biofilm, ridurre al minimo l'adesione batterica e la successiva formazione di biofilm è una strategia essenziale per ridurre il rischio di infezioni correlate all'impianto. Nonostante le proprietà antibatteriche di varie tecnologie implantari, queste non sono state ampiamente utilizzate clinicamente a causa di eventi avversi, come tossicità cellulare e allergie 5,6,7,8. Pertanto, esiste ancora un'esigenza clinica insoddisfatta di impianti antibatterici che armonizzino sicurezza, efficacia, stabilità e durata per ridurre il rischio di infezioni correlate all'impianto. La ricerca e lo sviluppo di impianti con proprietà antibatteriche potrebbero far progredire la tecnologia chirurgica per superare questi problemi.

La valutazione delle proprietà antibatteriche di vari biomateriali utilizzando modelli di piccoli animali è essenziale prima di procedere a modelli animali più grandi e studi clinici9. Numerosi studi hanno dimostrato l'applicazione di modelli murini di infezioni correlate all'impianto utilizzando un batterio bioluminescente, che contiene l'operone luxABCDE 10,11,12,13,14,15. Sebbene questi modelli accelerino la ricerca nello sviluppo di impianti o tecnologie antibatteriche, presentano alcune limitazioni. In primo luogo, sono spesso necessarie competenze avanzate e attrezzature specializzate, come i raggi X o i sistemi di imaging dedicati, per valutare direttamente e con precisione la carica batterica sugli impianti inseriti nei modelli murini. In secondo luogo, mentre gli impianti raccolti in genere valutano un impianto solitario in un singolo sito di infezione per animale, le condizioni di infezione e le risposte immunologiche possono variare da individuo a individuo, portando potenzialmente a variabilità nei risultati delle valutazioni comparative. Pertanto, quando si confrontano gli effetti antibatterici di vari biomateriali in vivo, impiantarli e inocularli con batteri in contesti uniformi è più vantaggioso per affrontare questi problemi. Inoltre, è essenziale ottimizzare l'attuale metodologia e condurre valutazioni quantitative con riproducibilità e accuratezza, sfruttando le caratteristiche del modello animale e dei batteri utilizzati.

Questo studio presenta un nuovo approccio sperimentale per le infezioni correlate all'impianto in vivo che consente misurazioni precise per valutare la formazione di biofilm sulla superficie di due impianti all'interno di un singolo modello murino attraverso metodi analitici comparativi inter- e intra-individuali. Il biofilm su ciascun impianto può essere quantificato utilizzando metodi ottimizzati per la visualizzazione del biofilm sull'impianto, la determinazione delle unità formanti colonie (CFU) e l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) di un ceppo bioluminescente di Staphylococcus aureus, Xen 36. Lo studio precedente ha dimostrato che un nuovo impianto metallico possiede una promettente efficacia antibatterica in vivo contro lo Staphylococcus aureus utilizzando questo approccio completo16. Questa metodologia può essere facilmente implementata in un ambiente di laboratorio standard e può accelerare la ricerca nello sviluppo di biomateriali antibatterici.

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Protocollo

Tutte le procedure per gli animali sono approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California di San Francisco (UCSF) e vengono eseguite in una struttura BSL2 dopo la consultazione e l'approvazione da parte dell'UCSF Biosafety Hazard Program, amministrato dall'UCSF Environmental Health and Safety. Sono stati utilizzati topi C57BL/6 maschi e femmine (12-16 settimane, 25-50 mg). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dei batteri

  1. Utilizzare lo Staphylococcus aureus Xen36 (ATCC49525) bioluminescente come agente patogeno.
    NOTA: Questo ceppo è ottenuto dall'American Type Culture Collection (Manassas, VA) e utilizza in modo univoco un operone luxABCDE , che è ottimizzato e integrato nel plasmide nativo dell'ospite. Xen36 utilizza anche il gene di resistenza alla kanamicina legato all'operone lux .
  2. Aggiungere una piccola quantità di brodo di glicerolo congelato di Xen 36 e aggiungere i pezzi a 5 ml di brodo di soia triptico (TSB) contenente 200 μg/mL di kanamicina.
  3. Incubare la coltura per una notte a 37 °C in un'incubatrice vibrante (200 giri/min).
  4. Strisciare Xen36 su piastre di agar TSB (TSB in agar 1,5%) contenenti 200 μg/mL di kanamicina e incubare per una notte a 37 °C.
  5. Isolare singole colonie di Xen36 e coltura in 5 mL di TSB contenenti 200 μg/mL di kanamicina per una notte a 37 °C in un incubatore con agitazione (200 giri/min).
  6. Misurare l'assorbanza della coltura risultante a 630 nm.
  7. Diluire la coltura ed effettuare una coltura Xen36 di 1,0 x 108 CFU/mL in base all'assorbanza a 630 nm.
    NOTA: Una misura di assorbanza a 630 nm (contro un bianco TSB) di 0,5 equivale all'incirca a 1,0 x 108 CFU/ml di Xen36.
  8. Diluire la coltura e ottenere una coltura Xen36 di 1,0 x 105 CFU/mL.

2. Preparazione degli impianti collegati

  1. Utilizzare due fili a forma di asta composti da acciaio inossidabile chirurgico (SUS316L) disponibile in commercio, ciascuno con una lunghezza di 8 mm e un diametro di 0,5 mm.
  2. Collegare i due fili verticalmente inserendoli in entrambe le estremità di un puntale per pipetta da 20 μl tagliato a una lunghezza di circa 3 mm.
    NOTA: Inserire i fili collegati verticalmente nella punta dell'ago da 18 G (Figura 1). Assicurarsi che i fili siano saldamente fissati dalla punta della pipetta per evitare lo scollegamento.
  3. Autoclavare i fili prima di impiantarli chirurgicamente nei topi.

3. Creazione di una sacca sottocutanea matura

NOTA: 7 giorni prima dell'inoculazione batterica, creare la sacca d'aria come segue:

  1. Anestetizzare il topo (C57BL/6) con isoflurano al 2% per inalazione (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
    NOTA: Valutare il livello appropriato di anestesia osservando la frequenza respiratoria, il tono muscolare, il pizzicamento delle dita dei piedi, il riflesso corneale e il colore delle mucose. Usa un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
  2. Trasferire il topo anestetizzato sul letto chirurgico e radere la regione cervicale/toracica dorsale del topo.
  3. Tamponare e sterilizzare l'intera regione con etanolo al 70% e iodio povidone.
  4. Riempire una siringa da 10 ml con aria sterile e collegare un ago da 27 G all'uscita.
  5. Pizzicare delicatamente ed elevare la base del collo del topo per creare spazio tra il tessuto sottocutaneo e la fascia.
  6. Posizionare l'ago nella linea mediana tra le scapole del topo e iniettare 3 mL di aria sterile per via sottocutanea per creare la sacca d'aria (Figura 2).
    NOTA: Durante l'iniezione dell'aria, tenere premuti entrambi i lati della schiena con la mano opposta per assicurarsi che l'aria si diffonda al centro della schiena, creando una sacca al centro.
  7. Rimetti il mouse in una gabbia riscaldata con un pad termico e monitoralo attentamente fino a quando non si sarà ripreso dall'anestesia.
  8. Iniettare 3 ml di aria sterile come descritto sopra per mantenere il gonfiaggio della cavità e creare una sacca matura ogni 2 giorni.
    NOTA: Prima di ogni gonfiaggio, aspirare l'aria dalla busta per confermare il corretto posizionamento della punta dell'ago. Rimuovere con cautela la siringa dall'ago, lasciando la punta dell'ago nella busta. Rigonfiare la sacca con 3 ml di aria sterile.

4. Impianto di fili collegati e inoculazione batterica

  1. 7 giorni dopo la prima iniezione d'aria, anestetizzare il topo come descritto al punto 3.1.
    NOTA: Durante la procedura chirurgica, controllare costantemente che il topo respiri e sia anestetizzato. L'intera procedura chirurgica richiede solitamente 10-15 minuti se eseguita da un chirurgo qualificato. L'anestesia viene mantenuta posizionando un tubo che eroga isoflurano al 2% mescolato con ossigeno adiacente al muso del topo.
  2. Tamponare e sterilizzare l'intera regione con etanolo al 70% e iodio povidone.
  3. Iniettare bupivacaina per via sottocutanea appena prima dell'intervento chirurgico.
  4. Praticare un'incisione longitudinale mediana di 3 mm nella parte superiore della busta.
  5. Inserire un ago da 18 G contenente i fili collegati nella sacca attraverso il foro e spingere fuori i fili utilizzando una siringa interna di un ago spinale da 25 G (Figura 3A, B).
  6. Lasciando la punta dell'ago da 18 G all'interno della busta, rimuovere delicatamente il cilindro interno e iniettare 3 mL di coltura Xen36 1,0 x 105 CFU/mL utilizzando la siringa (Figura 3C,D).
  7. Rimuovere con cautela tutti gli aghi, chiudere la pelle utilizzando una clip per ferite e sigillare con adesivo topico per la pelle (Figura 3E, F).
  8. Assicurarsi che non vi siano perdite, rimettere il mouse nella gabbia individuale riscaldata con un pad termico e monitorare come prima.

5. Estrazione degli impianti dall'ascesso sottocutaneo

  1. Dopo l'eutanasia per sovradosaggio di isofluorano, radere la regione cervicale, toracica e lombare dorsale del topo, quindi tamponare e sterilizzare l'intera regione con etanolo al 70% e iodio povidone (Figura 4A).
    NOTA: L'eutanasia è stata condotta in conformità con le linee guida dell'American Veterinary Medical Association (AVMA) per l'eutanasia degli animali.
  2. Praticare un'incisione della linea mediana di 2 cm nella regione lombare ed esfoliare accuratamente il tessuto sottocutaneo con le forbici.
  3. Estendere l'incisione e la dissezione sottocutanea prossimalmente e separare il tessuto aderente che circonda l'ascesso (Figura 4B - D).
  4. Asportare l'intero ascesso sottocutaneo (Figura 4E).
  5. Tagliare l'ascesso ed estrarre con cautela il filo dall'interno dell'ascesso (Figura 4F).

6. Quantificazione del biofilm formato sulle superfici implantari

  1. Saggio con cristallovioletto
    1. Posizionare i fili estratti dall'ascesso nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente 1 mL di acqua deionizzata (DI).
    2. Trasferire i fili in nuovi pozzetti contenenti 1 ml di acqua deionizzata per rimuovere eventuali batteri poco aderenti dalla superficie dei fili.
    3. Fissare il biofilm sui fili con etanolo al 100% per 1 minuto e lasciarli asciugare.
    4. Trasferire i fili in nuovi pozzetti contenenti 1 mL di reagente cristallovioletto allo 0,1%.
    5. Dopo 15 minuti di colorazione, lavare delicatamente i fili due volte con acqua deionizzata per rimuovere il colorante in eccesso.
    6. Posizionare l'impianto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 250 μL di acido acetico al 33% per 15 minuti; Solubilizzare il cristallovioletto aderente al biofilm sull'impianto, quindi agitare per 1 minuto.
    7. Trasferire 200 μl della sospensione in una piastra a 96 pozzetti e misurare l'assorbanza a OD630 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Tutte le misurazioni vengono eseguite in triplice copia.
  2. Conteggio delle unità formanti colonie (CFU)
    1. Rimuovere eventuali batteri leggermente aderenti dalla superficie dei fili come descritto al punto 6.1.2.
    2. Inserire l'impianto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 200 μL di tripsina 10x e incubare a 37 °C per 1 ora.
    3. Vorticare per 1 minuto e sonicare in un bagno d'acqua a 100 W per 5 minuti, seguito da un ulteriore vortice per 30 s per staccare il biofilm nella sospensione.
    4. Inoculare 10 μl della sospensione diluita in serie sulle piastre di agar TSB (TSB in agar 1,5%) con 200 μg/mL di kanamicina.
      NOTA: Eseguire questa procedura in triplice copia per ogni soluzione.
    5. Dopo aver incubato le piastre a 37 °C per 24 ore, contare le colonie sulle piastre e calcolare il numero di cellule batteriche nella coltura originale utilizzando il conteggio medio delle colonie17.
      NOTA: Per garantire che tutti i batteri vengano rimossi dai fili, il che è fondamentale per una misurazione accurata, colorare i fili con cristallovioletto e osservarli dopo aver applicato la sospensione alle piastre. Negli esperimenti preliminari, la combinazione della dissociazione meccanica e chimica di cui sopra ha rimosso con successo tutti i biofilm di Xen36 dalle superfici del filo di acciaio inossidabile convenzionale (Figura 5).
  3. Analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR)
    1. Rimuovere eventuali batteri leggermente aderenti dalla superficie dei fili come descritto al punto 6.1.2.
    2. Posizionare l'impianto in una microprovetta da 1,5 mL contenente 600 μL di TSB.
    3. Estrarre il DNA utilizzando il sistema di lisi alcalina modificata senza pellet16.
      NOTA: Il volume finale di DNA eluito è di 20 μl.
    4. Diluire il DNA 1:10 e conservarlo a -20 °C.
    5. Eseguire la qPCR per i geni luxA e 16S rRNA 16.
      NOTA: Tutte le reazioni qPCR vengono eseguite in triplice copiato. Il volume totale della miscela di reazione è di 10 μl, contenente 3 μl di DNA mascherina, 5 μl di SYBR Green, 1 μl di acqua priva di nucleasi e 0,5 μl di ciascun primer. I primer per il gene luxA sono 5'- GAGCATTTCACGGAGTTTG -3' e 5'- ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'. I primer per il gene 16S rRNA sono 5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT - 3' e 5'- CACTGGTGTTCCTCCATATCTC - 3'. Le condizioni della PCR sono le seguenti: denaturazione iniziale per 2 minuti a 94 °C seguita da 40 cicli di 15 s a 94 °C, 30 s a 60 °C e 30 s a 72 °C e un'estensione finale a 72 °C per 5 min.
    6. Tracciato la media dei valori di soglia a tre cicli (Ct) viene tracciata rispetto a una curva di calibrazione generata con DNA purificato direttamente da colture di Xen36 puro diluite in serie per stimare la carica batterica sull'impianto (Figura 6).

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Risultati

Questo studio ha valutato l'affidabilità di un approccio completo utilizzando un nuovo modello murino di infezione correlata all'impianto con valutazioni quantitative ottimizzate della formazione di biofilm sulle superfici implantari, che è stato utilizzato nel precedente studio16. I due impianti identici sono stati utilizzati per esaminare il biofilm formatosi sulle loro superfici, con l'obiettivo di verificare che entrambi gli impianti potessero essere incubati c...

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Discussione

Questo studio ha dimostrato un approccio completo per valutazioni quantitative precise della formazione di biofilm su più impianti, sfruttando un nuovo modello murino e tecniche di analisi ottimizzate per l'infezione correlata all'impianto. Per garantire che due impianti fossero incubati in condizioni di infezione identiche nello stesso soggetto, è stata creata una sacca sottocutanea matura all'interno di un singolo topo attraverso ripetute iniezioni d'aria. Questo modello ha fornito un ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata parzialmente finanziata da un programma di ricerca cooperativa NSF tra industria e università chiamato Center for Disruptive Musculoskeletal Innovations (IIP-1916629), Komatsuseiki Kosakusho Co., Ltd. e Rosies Base, LLC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido aceticoTHOMAS SCIENTIFIC12-16-15-00
Agilent BioTek 800 TS Lettore di assorbanzaAgilentBT800TS
Aghi ipodermici sterili Air-Tite, calibro dell'ago: 18 gFISHER SCIENTIFICO14817151 (CS)
Aghi spinali BD: 25 gFISHER SCIENTIFICO22043805
agitatore per incubatore da bancoFISHER SCIENTIFICO
Bagno a ultrasuoni Branson, 115 V c.a., 60 HzFISHER SCIENTIFICO2489500
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicatore)RPI-T48500-500.0
Centrifuga sorvall picoFISHER SCIENTIFICO
CFX96 Modulo ottico in tempo reale Sistema qPCRBIO-RAD
Sterilizzatore compatto, 30LTHOMAS SCIENTIFIC LLC22A00N096 (EA/1)
Cristallo Violetto, 1%, Soluzione SCI_EDFISHER SCIENTIFICO10114-58-6
Piastra per colture cellulari Falcon a 24 pozzettiFISHER SCIENTIFICO877125
Piastra per colture cellulari Falcon a 96 pozzettiFISHER SCIENTIFICO8771001
Fisherbrand Miscelatore digitale a vorticeFISHER SCIENTIFICS
KanamicinaTHOMAS SCIENTIFIC LLC 15160054
Mannitolo Sale Agar 
FISHER SCIENTIFIC 
incubatore micirobiologicoTermo ScientificoCodice: 51028063H
PBS, soluzione salina tamponata con fosfato
Staphylococcus aureus ATCC 49525 (Xen36)Perkin Elmer119243
SYBR Green I Colorazione in gel per acidi nucleiciFISHER SCIENTIFICO
Tripsina 10x (2,5%)FISHER SCIENTIFICO15090046
Brodo di soia trittico NETA SCIENTIFIC INC 
Zyppy Plasmide Miniprep KiFISHER SCIENTIFICO501977785Sistema di lisi alcalina modificata senza pellet

Riferimenti

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