Articolo metodologico

In vivo L'imaging rivela il comportamento migratorio dei leucociti all'interno delle articolazioni

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DOI:

10.3791/68091

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9 dicembre 2025

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1Department of Frontier Medicine, Institute of Medical Science, St. Marianna University School of Medicine, 2Unit for Bioimaging, Institute of Medical Science, St. Marianna University School of Medicine, 3Department of Immunology and Parasitology, St. Marianna University School of Medicine, 4Nikon Solutions Co., Ltd

In questo articolo

Sommario

L'imaging in vivo delle articolazioni è una tecnica preziosa per scoprire il comportamento migratorio dei leucociti e la dinamica molecolare all'interno delle articolazioni infiammate. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'imaging in vivo delle articolazioni utilizzando un modello murino di artrite indotta dal collagene di tipo II (CIA).

Abstract

I leucociti sono cellule trasmesse dal sangue derivate dal midollo osseo che devono migrare nei tessuti per mediare l'infiammazione. Il controllo di questa migrazione, quindi, rappresenta un punto cruciale per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per attenuare l'infiammazione. Gli studi tradizionali sugli endpoint non ci hanno permesso di analizzare completamente il comportamento migratorio dei leucociti in vivo. I recenti progressi nella tecnologia di imaging, tuttavia, hanno fornito intuizioni senza precedenti sulla migrazione delle cellule immunitarie negli animali vivi, migliorando notevolmente la nostra comprensione della regolazione molecolare del traffico cellulare immunitario.

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'imaging in vivo delle articolazioni utilizzando un modello murino di artrite indotta dal collagene (CIA). I topi vengono immunizzati con collagene di tipo II emulsionato in un adiuvante di Freund completo, e la progressione dell'artrite viene monitorata tramite punteggi clinici e misurazioni dello spessore delle zampe. Al picco dell'artrite, i leucociti vengono visualizzati in vivo tramite microscopia confocale in topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti o in topi di tipo selvatico dopo l'iniezione endovenosa di anticorpi marcati fluorescenti e di Destrono ad alto peso molecolare per la colorazione dei vasi. Un'attenta esposizione chirurgica dell'articolazione, l'applicazione di agarosio e la corretta posizione della gamba permettono un'imaging stabile a lungo termine, tipicamente durato diverse ore. Questo approccio consente l'analisi in tempo reale dell'arresto leucocita, del strisciamento e della migrazione transendoteliale all'interno delle articolazioni infiammate.

Questo protocollo sarà prezioso per i gruppi di ricerca che indagano il traffico di leucociti nell'artrite e in altre malattie infiammatorie. Può anche fungere da piattaforma per la valutazione preclinica di terapie mirate alla migrazione delle cellule immunitarie.

Introduzione

Poiché i leucociti sono cellule trasmesse dal sangue derivate dal midollo osseo, devono entrare nei tessuti per causareinfiammazione 1. Il controllo di questo processo rappresenta un punto chiave in cui si potrebbero sviluppare nuove terapie per attenuare l'infiammazione2. In generale, il traffico leucocitario nel tessuto infiammato avviene nelle venule postcapillari e segue la cascata di adesioni, iniziando con la cattura dei leucociti a flusso libero da parte della parete del vaso. Inoltre, il processo è seguito da leucociti che rotolano lungo la parete del vaso nella direzione del flusso, arresto leucocitario sull'endotelio, rilascio dall'adesione e avanzamento in tutte le direzioni sulla superficie del vaso per localizzare un sito recettivo per la migrazione transendoteliale (TEM) in una posizione specifica all'interno del tessuto 1,3.

Questi passaggi distinti sono regolati da una combinazione di segnali molecolari, inclusi le selectine (per rolling), le integrine (per arresto, crawling) e chemoattractanti (CA) (per arresto, eventualmente strisciamento e TEM)3. I CA attivano i leucociti tramite sette recettori chemoattranti accoppiati alla proteina G (CAR) che coprono la proteina G (CAR) e svolgono ruoli critici nella cascata di adesione regolando all'alza l'affinità con l'integrina (portando all'arresto) e inducendo il TEM. Tuttavia, i meccanismi esatti dei TEM non sono completamente compresi. Gli studi tradizionali sugli endpoint e gli esperimenti in vitro non hanno fornito informazioni su come la segnalazione CA-CAR regoli dinamicamente il comportamento migratorio dei leucociti in vivo.

I recenti progressi nella tecnologia di imaging hanno fornito visioni senza precedenti sulla migrazione delle cellule immunitarie negli animali vivi, migliorando notevolmente la nostra comprensione della regolazione molecolare del traffico cellulare immunitario invivo 4,5,6.Ad esempio, questa tecnologia ha chiarito il controllo molecolare del traffico dei neutrofili verso siti di infiammazione tissutale, come la lesione termica delfegato 7 e la lesione cutanea laser8. Pertanto, abbiamo fatto domanda per indagare i meccanismi molecolari che controllano il traffico dei neutrofili verso i siti di infiammazionearticolare 9. L'imaging articolare in vivo descritto qui ha rivelato che il recettore C5a 1 (C5aR1) del componente del complemento è cruciale per avviare l'adesione dei neutrofili all'endotelio articolare, infiammando l'infiammazione all'interno delle articolazioni. C5aR1 ha facilitato l'arresto e la diffusione dei neutrofili dipendenti dall'integrina, seguiti da TEM mediati dal recettore leucotriene B4, e da un strisciamento guidato dal recettore chemoquina CC 1 (CCR1). Il recettore della chemochina CXC 2 (CXCR2) ha avuto un ruolo nelle fasi avanzate del TEM dei neutrofili nelle articolazioniinfiammate 10. Inoltre, l'imaging articolare in vivo ha rivelato un nuovo paradigma nelle reazioni di ipersensibilità di tipo III all'interno dell'articolazione, dove la C5a agisce come iniziatore dell'infiammazione, mentre le cellule residenti nei tessuti svolgono ruoli più significativi nell'infiammazione nell'attuale paradigma delle reazioni di ipersensibilitàdi tipo III 10,11.

Inoltre, abbiamo applicato l'imaging in vivo dell'articolazione per studiare la dinamica molecolare del C5a all'interno dell'articolazione. C5a caricato sul tessuto articolare nei topi selvatici veniva rapidamente trasportato nel lume vascolare, mentre nei topi carenti di C5aR2, C5a rimaneva interamente nel tessutosinoviale 12. Questi dati dimostrano che C5aR2, espresso sull'endotelio articolare, trasporta C5a nel lumen del vaso, un processo necessario per l'adesione neutrofila dipendente da C5aR1 nellearticolazioni 13.

L'imaging in vivo delle articolazioni è applicabile a tutti i modelli di artrite infiammatoria e consente un'osservazione a lungo termine (di solito un paio d'ore), anche se la visualizzazione dei tessuti profondi (>1 mm) può essere limitata a seconda del microscopio utilizzato. Insieme a questa tecnica, questa tecnica fornisce uno strumento potente per indagare il comportamento migratorio dei leucociti e la dinamica molecolare all'interno delle articolazioni infiammate. Condividiamo questo protocollo per l'imaging articolare in vivo a supporto dei gruppi di ricerca che studiano questo processo nelle articolazioni infiammate.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali della St. Marianna University School of Medicine (Approvazione n. TG240926-2 e TG250801-2) e condotta in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali.

1. Preparazione di un modello murino di artrite

NOTA: I modelli animali di artrite hanno fornito strumenti preziosi per comprendere la patogenesi della malattia e per sviluppare nuoveterapie 14. Sebbene diversi modelli murini di artrite presentino vantaggi e limitazioni uniche, l'artrite indotta dal collagene di tipo II (CIA) è stata ampiamente utilizzata in studi sulla patogenesi dell'artrite reumatoide (AR)14. In questa sezione descriviamo il protocollo dei modelli CIA per l'artrite (Forniture e strumenti sono mostrati nella Figura 1).

  1. Prepara una diluizione di collagene bovino di tipo II in acido acetico 0,05 M (concentrazione finale 4 mg/mL) scuotendo durante la notte a 4 °C.
  2. Per creare l'emulsione, si miscela la diluizione del collagene (4 mg/mL in acido acetico 0,05 M) con l'adiuvante di Freund completo (CFA) in un rapporto 1:1 in una siringa di vetro. Questo produce una concentrazione finale di collagene di 2 mg/mL nell'emulsione. Mescola vigorosamente a mano per circa 20 minuti. Questo processo genera calore, quindi raffredda la siringa di vetro contenente l'emulsione su ghiaccio. Usa un becher per controllare la consistenza dell'emulsione durante la preparazione.
    NOTA. Conserva la diluizione residua del collagene a -80 °C. Questo può essere usato per la seconda immunizzazione.
  3. Trasferire l'emulsione in una siringa di vetro da 1 mL dotata di un ago da 26 x 1/2 g e lasciarla in ghiaccio fino all'immunizzazione.
  4. Anestetizzare topi DBA1/J di 8 settimane (maschi o femmine) con iniezioni intraperitoneali di medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) e vetorphale (5 mg/kg).
    NOTA. I topi transgenici spesso hanno un background C57BL6. Il collagene di pollo è tipicamente usato per la CIA nei topi C57BL6; tuttavia, l'incidenza e la gravità della CIA nei topi C57BL6 sono inferiori rispetto a quelli DBA/1J. Se si utilizzano topi transgenici su background C57BL6, si considera di condurre uno studio pilota per valutare l'incidenza e la gravità della CIA.
  5. Rasi i peli intorno alla coda usando una tosa per prepararti all'immunizzazione.
  6. Iniettare lentamente un volume di 100 μL dell'emulsione (contenente 200 μg di collagene) nello spazio sottocutaneo lungo il dorso caudale (vicino alla base della coda) (Figura 2).
  7. Ripetere i passaggi da 1,2 a 1,6 al giorno 21 per la seconda immunizzazione (Figura 2).

2. Valutazione del punteggio clinico per l'artrite e misurazione dello spessore delle zampe

NOTA: La valutazione clinica dell'artrite e la misurazione dello spessore delle zampe sono essenziali per valutare l'attività della malattia. Tipicamente, i punteggi clinici per l'artrite e le misurazioni dello spessore delle zampe vengono effettuati ogni 1-3 giorni dopo la prima immunizzazione.

  1. Punteggio clinico per l'artrite: Annota la somma dei punteggi per tutte e quattro le zampe di ciascun topo. Usa il seguente sistema di punteggio:
    0 = Normale
    1 = Eritema e gonfiore di un dito
    2 = Eritema e gonfiore di due dita o eritema e gonfiore dell'articolazione della caviglia
    3 = Eritema e gonfiore di più di tre dita o gonfiore di due dita e articolazioni della caviglia
    4 = Eritema e grave gonfiore della caviglia, del piede e delle dita con deformità.
    NOTA. Un'articolazione della caviglia gonfia è definita come uno spessore della zampa superiore a 4 mm.
  2. Misurazione dello spessore della zampa: Misura lo spessore di ciascuna zampa usando pinze digitali a slitta. Usa lo spessore medio delle zampe su tutte e quattro le zampe di ogni topo.

3. Imaging in vivo delle articolazioni

NOTA: L'imaging in vivo delle articolazioni ci permette di osservare la migrazione dei leucociti nelle articolazioni e di analizzarne il comportamento all'interno del tessuto nei topi vivi. Per visualizzare le cellule, vengono utilizzati topi transgenici geneticamente modificati per esprimere proteine fluorescenti in cellule specifiche, così come topi iniettati via endovenosa con anticorpi anticellulari marcatori. I materiali utilizzati sono mostrati nella Figura 3.

  1. Anestetizzare i topi artritonenici intraperitonealmente con medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) e vetorphale (5 mg/kg).
  2. Rasi la gamba del topo con una tosa e usa la crema depilatoria (<60 s) per rimuovere eventuali peli residui. Evita l'applicazione prolungata per prevenire irritazioni cutanee.
  3. Rimuovere la crema con una garza umida (Figura 4A). Assicurati che tutti i peli vengano rimossi per evitare autofluorescenze indesiderate nell'area di immagini. Ripeti se necessario.
  4. Durante l'anestesia si applica un lubrificante corneale sterile su entrambi gli occhi per prevenire la disidratazione o l'ulcerazione corneale.
  5. Sotto un endoscopo chirurgico, eseguire un'incisione di 1 cm lungo la pelle usando microforbici (Figura 4B).
    NOTA. Questo passaggio è fondamentale. L'intervento chirurgico può scatenare il reclutamento di leucociti (soprattutto neutrofili). Evita qualsiasi danno che possa causare artefatti. A causa dell'angiogenesi nelle articolazioni artritiche, queste articolazioni sono soggette a sanguinamento. Possono essere necessarie più sessioni di pratica per un intervento chirurgico di successo.
  6. Posizionare le giunture artritiche sulla piastra di plastica (Figura 4C).
    NOTA. L'adesivo tissue può essere usato per aiutare a fissare la zampa del topo. Questo studio utilizza argilla per fissare una lama di vetro a una piastra di plastica.
  7. Copri l'area di imaging con circa 1 mL di agarosio all'1,5% con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Figura 4D).
    NOTA. Assicurarsi che l'agarosio si sia raffreddato per prevenire danni tissutitori, che potrebbero favorire il reclutamento leucocitario nell'area di imaging.
  8. Prepara il palcoscenico al microscopio.
    NOTA. Usa una borsa riscaldante per mantenere la temperatura corporea del mouse durante sessioni di imaging prolungate.
  9. Regola le impostazioni del microscopio confocale (potenza del laser, guadagno, offset, posizione, ecc.). Qui, esegui immagini su un microscopio confocale con una lente obiettivo a immersione in acqua 25, NA 1.1. Imposta l'eccitazione laser a 488 nm, 561 nm e 640 nm, e raccogli l'emissione a 488,0 nm, 561,6 nm e 638,5 nm.
    1. Controlla la velocità di scansione del microscopio. Utilizzare una risoluzione in pixel di 512 x 512, con 5 sezioni ottiche, uno stack Z di 4 μm e un tempo di ciclo di 15 s per consentire l'analisi delle singole celle mobili su un tempo sufficiente per ottenere dati significativi.
  10. Una volta identificata una posizione adatta, si inizia l'acquisizione dell'immagine.
    NOTA. Se si utilizzano anticorpi marcatori anticellulari per marcare i leucociti, iniettare gli anticorpi per via endovenosa 3 minuti prima dell'inizio dell'imaging artificiale. Per la visualizzazione dei vasi sanguigni, inietta contemporaneamente Qdots, anticorpi CD31 o Destronan. Ad esempio, iniettare circa 2 μg di anticorpi per topo di Ly6G per i neutrofili e CD4 per le cellule T, insieme a circa 80 μg di 680-250k di Ddestran per topo per la colorazione dei vasi sanguigni. Anticorpi e Destrono sono solitamente disciolti in 100 μL di PBS sterile. Tieni presente che alcuni anticorpi possono esaurire i leucociti, quindi verifica che gli anticorpi selezionati non riducano il conteggio dei leucociti.
  11. Elaborare le immagini file ND2 acquisite con il microscopio confocale utilizzando il modulo General Analysis 3 (GA3) del software di analisi immagini NIS-Elements (versione 6.20.00). Esegui l'estrazione delle regioni vascolari e la sottrazione di fondo. Dopo l'elaborazione di tutti i tempi, esporta le immagini come video.
    NOTA. Come parte dell'analisi, contare il numero di cellule aderenti ed estravasate.
  12. Dopo il completamento dell'imaging, si può permettere all'animale di recuperare come procedura di sopravvivenza oppure sopportare l'eutanasia umana, a seconda del disegno sperimentale. Se si intende la sopravvivenza, chiudere delicatamente il sito chirurgico e fornire cure post-operatorie adeguate in conformità con le linee guida istituzionali per la cura degli animali.
    NOTA: In questo studio, tutti gli animali sono stati soppressi umanamente immediatamente dopo l'imaging in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali.

4. Analisi statistica

  1. Presentare i dati come media ± errore standard della media (SEM). Eseguire analisi statistiche utilizzando il test t di Student per confronti tra due gruppi o ANOVA unidirezionale per più gruppi, seguita dal test post hoc di Tukey. Consideriamo un valore p < 0,05 come statisticamente significativo.
    NOTA: Tutta l'analisi è stata effettuata utilizzando GraphPad Prism versione 10.

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Risultati

Qui, maschi DBA/1J di 8 settimane vengono immunizzati con un'emulsione contenente collagene bovino di tipo II e CFA in un rapporto 1:1 al giorno 0 e al giorno 21. La valutazione clinica dell'artrite e le misurazioni dello spessore delle zampe vengono effettuate ogni 1-3 giorni tra il giorno 0 e il 42. Tipicamente, l'insorgenza dell'artrite si osserva intorno al giorno 28, con il punteggio clinico per l'artrite e lo spessore delle zampe che raggiungono il picco intorno al giorno 35 (

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Discussione

L'imaging in vivo delle articolazioni, a differenza degli studi endpoint tradizionali, offre intuizioni senza precedenti sui processi biologici dinamici nei topi vivi. Ad esempio, questa tecnica ci permette di comprendere come quattro diversi recettori chemoattranti - C5aR1, BLT1, CCR1 e CXCR2 - collaborino per avviare il reclutamento di neutrofili nelle articolazioni infiammate nell'artrite10,11. Inoltre, l'imaging ...

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Dichiarazioni

Y.M. ha ricevuto finanziamenti e finanziamenti per la ricerca dalla Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.

Ringraziamenti

Il lavoro di Y.M. è sostenuto dalla Società Giapponese per la Promozione della Scienza (JSPS) KAKENHI [borsa numero JP22K08531, JP25K02574]; Agenzia Giapponese per la Ricerca e lo Sviluppo Medico (AMED) [Numero di Sovvenzione 25bm1423033]; la Fondazione Memoriale Mochida per la Ricerca Medica e Farmaceutica; La borsa JCR per la promozione della ricerca per FRONTIER e la Mitsubishi Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
29 G x 1/2"TerumoSS-10M2913
0,1 M acido aceticoFujifilm016-18835
Siringa di plastica da 1 mLIn alto19531
Siringa da 1 mm per grassoTerumoSS-01T
18 G x 1 1/2"TerumoNN-1838R
26 G x 1/2"TerumoNN-2613S
680-250 kDa dextranoBiotium80135
Agaroseinvitrogen16520-100
Collagene bovino di tipo IICentro di Ricerca sul CollageneK42
Argilladebika93186
Completamente strano' s adiuvante (CFA)Chondrex7001
Microscopio confocaleNikonA1
Vetro di coperturaMatsunami Glass IND., LtdC024401
Pinza digitale a slittaMitsutoyo500-180-30
Tubo Falcon (15 mL)CorningNA
Tubo Falcon (50 mL)CorningNA
Anticorpo anti-topo Ly6G coniugato con FITCBiolegend127606
PinzaRobozRS-5070
PinzaNAPOXMA-48-2
Siringa e connettore di vetroTsubasa Industry Co., Ltd S7P
GrassoToray Dow Corning SiliconeNA
TagliacapelliWahlWA5109
TagliacapelliWahl9966
Depilazione crè IoKracieN/A
MedetomidinaMeijiN/A
Micro-forbiciRobozRS-5610
Micro-forbiciRobozRS-5630
MidazolamSandozN/A
Garza umidaNippon Paper Crecia Co., LtdS-200
Analisi delle immagini NIS-Elements 6.20.00NikonNA
PBS in tubo Falcon (50 mL)Shimadzu Diagnostics Corporation5913
Anticorpo anti-topo coniugato con PEBiolegend100408
Piastra di plasticaCorning351029
Prisma 10.3.1GraphPadNA
Vetro a slittaMuto Pure Chemicals Co., Ltd5115
Ambito chirurgicoOlympusVMZ
Legame tissutale3M1469SB
Vetorphale MeijiN/A

Riferimenti

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  3. Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
  4. Murooka, T. T., et al. HIV-infected T cells are migratory vehicles for viral dissemination. Nature. 490 (7419), 283-287 (2012).
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Migrazione leucocitariaInfiammazione articolareMicroscopia confocaleArtrite indotta da collageneTraffico di cellule immunitarieMigrazione dei neutrofiliMigrazione transendotelialeModello murino di artriteTraffico leucocitario

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