Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione.
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Articolo metodologico
In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione. Il metodo consiste nel impiantare una finestra del cranio di imaging, l'iniezione di un colorante fluorescente indicatore di calcio che può essere occupato da un gran numero di neuroni e, infine, registrare l'attività dei neuroni, con immagini di calcio lasso di tempo utilizzando un in-vivo due microscopio fotone. Co-iniezione di astrociti specifici coloranti permette di differenziare i neuroni da astrociti. La tecnica può essere eseguita in topi che esprimono molecole fluorescenti in specifiche sottopopolazioni di neuroni per comprendere meglio le interazioni di rete dei vari gruppi di cellule.
Protocollo
- Preparare la soluzione di indicatore fluorescente calcio. Noi usiamo coloranti estere acetossimetil o AM coloranti in breve. Si tratta di coloranti che possono essere captata dalle cellule quando iniettate extracellulare. Usiamo tipicamente Oregon-Green Bapta-1-AM o Fluo 04:00 ad una concentrazione di 1 mM. Coloranti AM può essere ottenuto da Invitrogen in flaconcini da 50 microgrammi. Per prima cosa preparare una soluzione al 20% del Pluronic F-127 in DMSO. Noi caldo la soluzione prima dell'uso tutti i giorni fino al suo chiaro. Noi sciogliere l'indicatore di calcio del F-127/DMSO Pluronic 20% per 15-20 minuti ad una concentrazione di 10 mm. Abbiamo poi diluire la soluzione....
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Discussione
Il vantaggio di questo metodo rispetto registrazioni elettrofisiologiche è che è meno invasivo e permette le registrazioni di attività nel fitto reti neuronali neuronali. Nel fare questa procedura s importante ricordarsi di prendere la massima cura quando si esegue la craniotomia non danneggiare la dura. Anche una piccola quantità di sanguinamento subdurale con molto oscuro l'imaging.
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Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Olga Garaschuk per le discussioni utili su come ottimizzare il caricamento di massa degli indicatori di calcio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagente | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagente | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforodamina 101 | Reagente | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagente | Invitrogen | P-3000MP | |
| Filtro centrifugo (0,45 micron) | Reagente | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
Riferimenti
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.
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Ristampe e permessi
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