Imaging multiplex a immunofluorescenza basato su codice a barre del DNA per analizzare campioni FFPE da melanoma murino geneticamente riprogrammato

Summary

Questo protocollo fornisce una guida passo passo per la progettazione di un pannello di anticorpi in immunofluorescenza multiplex per l'imaging basato su codici a barre del DNA di tessuti murini di melanoma FFPE. Descriviamo anche una pipeline di analisi delle immagini utilizzando strumenti open-source per generare approfondimenti di proteomica spaziale nel microambiente immunitario del tumore del melanoma murino.

Abstract

Qui viene presentata una tecnica emergente di imaging multiplex basata su codici a barre del DNA basata sul Co-Detection-by-indEXing che analizza la proteomica spaziale dei microambienti tissutali. Il successo dell'imaging richiede un repertorio di pannelli anticorpali ben progettati e adeguatamente convalidati, ma attualmente ne esistono pochissimi per i campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). L'FFPE offre diversi vantaggi rispetto ai campioni freschi congelati, come l'ampia disponibilità, la facilità di manipolazione e conservazione e la capacità di realizzare microarray di tessuti (TMA). Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare un pannello di anticorpi per la visualizzazione e l'analisi di tessuti FFPE da un modello di melanoma murino trattato con nanoparticelle, che forniscono DNA plasmidico codificante segnali immunologici per la riprogrammazione del microambiente tumorale. Descriviamo anche una pipeline di analisi delle immagini utilizzando strumenti computazionali open source per l'annotazione dei tessuti, la segmentazione delle cellule, l'elaborazione dei dati proteomici, la fenotipizzazione delle popolazioni cellulari e la quantificazione delle metriche spaziali. Il protocollo offre applicazioni per la progettazione di pannelli anticorpali in FFPE murino e per la generazione di nuove intuizioni sulla proteomica spaziale di microambienti tissutali complessi.

Introduction

Il melanoma cutaneo è il tumore della pelle più comune, con tassi di malattia e mortalità variabili in tutto il mondo a seconda del momento della diagnosi e delle cure primarie¹. Nell'ultimo decennio, una maggiore comprensione biologica del melanoma ha contribuito a promuovere lo sviluppo di nuovi modelli di cancro per il trattamento dei tumori solidi². La recente ascesa dell'immunoterapia ha portato a un concetto rivoluzionario di trattamento del cancro basato sull'attivazione del sistema immunitario endogeno ^3,4.

Il microambiente tumorale (TME) è molto complesso e consiste di diverse cellule immunitarie, fibroblasti associati al cancro, periciti, cellule endoteliali e varie cellule residenti nei tessuti⁵. In passato sono state applicate diverse tecniche per studiare il TME, come la citometria a flusso e il sequenziamento di singole cellule, che compromettono il contesto spaziale in quanto sono necessarie per distruggere il tessuto tumorale. L'imaging al microscopio tradizionale, come l'immunofluorescenza (IF) e l'immunoistochimica (IHC), consente la visualizzazione di biomarcatori proteici senza distruggere i tessuti del campione. Tuttavia, questi approcci sono limitati a due o tre biomarcatori e non sono in grado di fornire una comprensione completa delle relazioni spaziali e strutturali all'interno del complesso TME ⁶.

Per affrontare questo problema, sono state sviluppate diverse tecniche di imaging multiplex per visualizzare spazialmente il complesso TME 7,8,9,10. Uno di questi è il CoDetection-by-inDEXing, rinominato sistema PhenoCycler, basato su anticorpi coniugati con oligonucleotidi di DNA¹¹. Il sistema è in grado di fornire l'imaging e l'analisi di una singola cellula di oltre 100 biomarcatori per campioni umani. Tuttavia, sono disponibili pochissimi anticorpi inventariati per visualizzare e analizzare campioni murini, in particolare campioni di FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded)¹². L'FFPE offre diversi vantaggi rispetto alla conservazione Fresh Frozen (FF), come la facilità di manipolazione e conservazione, la morfologia ben conservata nel tempo e, soprattutto, la capacità di preparare microarray di tessuti/tumori (TMA) che consentono la visualizzazione di diversi campioni su un singolo vetrino. Di recente abbiamo progettato e sviluppato un pannello di anticorpi murini FFPE CODEX/PhenoCycler e lo abbiamo applicato con successo per visualizzare e analizzare la proteomica spaziale di campioni di melanoma murino geneticamente riprogrammati¹³.

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire una guida passo passo per la progettazione di un pannello di anticorpi FFPE murini e descrivere il processo di coniugazione anticorpo-codice a barre, colorazione dei tessuti e imaging. Inoltre, presentiamo una pipeline di analisi delle immagini dettagliata che utilizza strumenti open source come i pacchetti QuPath e R. Dopo aver seguito questo protocollo, i ricercatori impareranno come progettare un pannello di anticorpi coniugati su misura, eseguire l'imaging multiplex utilizzando un dispositivo Phenocycler-Fusion e ottenere nuove informazioni sulla proteomica spaziale del melanoma TME. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per studiare vari microambienti immunitari tumorali e combinato con le tecniche di trascrittomica spaziale esistenti.

Protocol

Tutto il lavoro sugli animali è stato eseguito in conformità con le linee guida stabilite dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, utilizzando i numeri di protocollo approvati MO18M388 e MO21M384.

1. Selezione degli anticorpi

1. Progettare un pannello di anticorpi basato sul tessuto di interesse e sull'abbondanza del particolare biomarcatore. Scegliere i cloni di anticorpi in base alle precedenti applicazioni di successo della colorazione in immunofluorescenza (IF) e immunoistochimica (IHC) presenti in letteratura. Versioni sicure di questi anticorpi prive di portatore.
   NOTA: Un anticorpo purificato privo di vettore è importante per la coniugazione del codice a barre. Evita i conservanti a base di proteine come BSA, glutine, glicerolo, ecc. Se l'anticorpo senza vettore non è disponibile, richiedere un anticorpo personalizzato al fornitore o utilizzare un kit di rimozione BSA per produrre l'anticorpo senza portatore. L'azide di sodio non interferisce con la coniugazione degli anticorpi. Gli isotipi IgG sono raccomandati rispetto agli isotipi IgM.
2. Verificare questi cloni selezionati sul tessuto di interesse utilizzando l'imaging a immunofluorescenza convenzionale (IF)¹¹. Utilizzare l'imaging a doppia IF per confermare la specificità di alcuni cloni (ad esempio, eseguire l'imaging a doppia IF con FOXP3 e CD4 per confermare la colorazione per le cellule T regolatorie).
   NOTA: Quando possibile, è importante utilizzare lo stesso tessuto per la convalida IF che verrà utilizzato per la colorazione. Selezionare la soluzione appropriata per il recupero dell'antigene. In questo protocollo, abbiamo utilizzato un tampone AR9 fornito da Akoya Biosciences per recuperare tutti gli epitopi tissutali FFPE del melanoma murino. Altre soluzioni per il recupero dell'antigene, come AR6 o Universal, possono essere utilizzate in base ai requisiti dell'epitopo.

2. Coniugazione e conferma degli anticorpi

1. Assegna anticorpi verificati ai codici a barre con reporter complementari collegati ai fluorofori ATTO550 (Cy3), AF647 (Cy5) o AF750 (Cy7). Gli antigeni poco abbondanti di solito producono segnali più bassi; coniugare tali anticorpi a canali a bassa autofluorescenza come AF647 (Cy5). Coniugare antigeni altamente espressi a ATTO550 (Cy3) e AF750 (Cy7) a causa della possibilità di autofluorescenza.
   NOTA: Questo passaggio critico considera la sensibilità del canale e l'abbondanza dell'antigene. L'uso del canale AF488 per il tessuto FFPE non è raccomandato a causa della sua maggiore autofluorescenza.
2. Per la coniugazione anticorpo-codice a barre (4,5 ore), procurarsi il kit di coniugazione anticorpale. Conservare tutti i reagenti a 4 °C tranne la soluzione di riduzione 1, che deve essere conservata a -20 °C in piccoli flaconcini monouso.
   1. Misurare la concentrazione di anticorpi utilizzando uno spettrofotometro.
   2. Avviare la coniugazione degli anticorpi applicando 500 μl della soluzione di blocco del filtro a una colonna filtrante MWCO da 50 kDa per bloccare il legame non specifico degli anticorpi al filtro. Centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere il liquido in eccesso dalla colonna utilizzando una micropipetta da 200 μl.
      NOTA: La soluzione di riduzione 1 è un flaconcino di soluzione monouso, sufficiente per tre coniugazioni di anticorpi alla volta. Non riutilizzare la soluzione dopo lo scongelamento; Eliminare il reagente rimanente. Non utilizzare un filtro sopra la colonna filtrante MWCO da 50 kDa, poiché ciò può comportare una scarsa purificazione e coniugazione.
   3. Utilizzare un volume equivalente a 50 μg della soluzione anticorpale e aggiungerlo a un filtro MWCO da 50 kDa. Se necessario, regolare il volume totale a 100 μl utilizzando PBS. Centrifugare a 12.000 x g per 8 minuti a 4 °C. Durante questo periodo, preparare la miscela master di riduzione utilizzando 19,8 μl di soluzione di riduzione 1 + 825 μl di soluzione di riduzione 2 per tre coniugazioni di anticorpi.
   4. Scartare il flusso continuo e aggiungere 260 μl di miscela master di riduzione sulla parte superiore di ciascuna unità filtrante. Agitare la soluzione nell'unità filtrante per 2-3 secondi e incubare per 30 minuti a RT.
      NOTA: È fondamentale non superare i 30 minuti di incubazione per evitare un'eccessiva riduzione degli anticorpi, poiché ciò li danneggia e può causare una coniugazione fallita.
   5. Dopo 30 minuti di incubazione, centrifugare a 12.000 x g per 8 minuti a 4 °C e gettare il flusso sul fondo. Aggiungere 450 μl di soluzione di coniugazione alla sommità della colonna e centrifugare a 12.000 x g per 8 minuti a 4 °C. Durante la centrifugazione, preparare la soluzione di codice a barre CODEX. Muoviti rapidamente dopo aver recuperato il codice a barre da -20 °C, poiché il codice a barre inizia a degradarsi.
      NOTA: I codici a barre sono solitamente forniti in piccole fiale di vetro contenenti prodotti liofilizzati (scaglie o polvere) conservati a -20 °C. Queste fiale possono essere utilizzate per coniugare 50 μg di anticorpi in una sola volta. Si raccomanda di non coniugare più di tre anticorpi alla volta.
   6. Individuare con cura il codice a barre liofilizzato nella parte inferiore della fiala di vetro (potrebbe anche essere attaccato alle pareti). Battere la fiala di vetro su un tavolo per portare i solidi sul fondo. L'individuazione del prodotto liofilizzato è essenziale per la sua dissoluzione in 10 μL di acqua di biologia molecolare priva di nucleasi. Dopo aver aggiunto 10 μl di acqua priva di nucleasi, aggiungere 210 μl di soluzione di coniugazione a ciascun codice a barre. Sciogliere tutto il materiale liofilizzato e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Accantonare.
   7. Dopo aver completato la centrifuga al punto 2.2.5, scartare il flusso e aggiungere la rispettiva soluzione di codice a barre dal passaggio 2.2.6 alla parte superiore di ciascuna unità filtrante. Conservare 1 μg dell'anticorpo iniziale non coniugato; Questo verrà eseguito insieme al campione di anticorpi coniugati da 5 μL durante la convalida dell'elettroforesi su gel.
   8. Etichettare ogni provetta con il rispettivo nome dell'anticorpo e del codice a barre. Chiudere il coperchio e mescolare la soluzione agitando per 2-3 s. Incubare la reazione di coniugazione anticorpo-codice a barre per 2 ore a RT.
   9. Dopo 2 ore di incubazione, rimuovere 5 μL di anticorpo coniugato e conservarlo in una provetta PCR da 0,2 mL per confermare la coniugazione mediante elettroforesi su gel.
   10. Centrifugare la soluzione di anticorpi coniugati rimanente a 12.000 x g per 8 minuti a 4°C. Aggiungere 450 μl di soluzione di purificazione sulla parte superiore della colonna, centrifugare a 12.000 x g per 8 minuti a 4 °C ed eliminare il flusso. Ripetere questo passaggio di purificazione 2 volte, aggiungendo ogni volta 450 μl di soluzione di purificazione e facendola girare verso il basso.
   11. Dopo la 3a^{centrifugazione} , scartare il flusso attraverso. Il filtro superiore conterrà gli anticorpi coniugati con codice a barre.
   12. Per raccogliere l'anticorpo coniugato, etichettare il nuovo tubo esterno che contiene la colonna filtrante con l'anticorpo e il codice a barre corrispondenti. Tagliare il coperchio del tubo esterno prima della centrifugazione. Aggiungere 100 μl di soluzione di conservazione degli anticorpi a ciascuna unità filtrante e posizionare il tubo esterno appena etichettato capovolto sopra la colonna filtrante.
   13. Capovolgere la colonna filtrante per raccogliere l'anticorpo coniugato nel tubo esterno e ruotare verso il basso a 3.000 x g per 2 minuti a RT. Questo dovrebbe raccogliere circa 120 μL di soluzione di anticorpi coniugati. Trasferire in una provetta sterile per microcentrifuga e conservare a 4 °C per 18-24 mesi.
       NOTA: Per evitare un'elevata colorazione nucleare di fondo dopo la coniugazione, si raccomanda di non utilizzare questi anticorpi per almeno 2 giorni.
3. Eseguire la conferma della coniugazione mediante elettroforesi su gel come descritto nel protocollo¹³ già pubblicato.
   NOTA: Questo processo conferma solo il successo della reazione di coniugazione chimica utilizzata per coniugare i codici a barre con gli anticorpi. È facoltativo, poiché la convalida degli anticorpi è possibile solo dopo la colorazione e l'imaging del tessuto.

3. Preparazione del campione FFPE murino

1. Ottenere campioni di tessuto FFPE da topi femmina C57BL/6J impiantati con tumori del fianco B16F10. Trattare i topi con iniezioni intratumorali di nanoparticelle a base di poli(β-amminoestere) contenenti plasmidi 4-1BBL e IL-12, insieme alla somministrazione intraperitoneale di anti-PD1 a 9, 11, 16 e 18 giorni dopo l'impianto¹⁴. Sacrificare i topi il giorno 20 e fissare i tumori in formalina al 10%, incorporata in paraffina, quindi sezionare il nucleo dei servizi tissutali oncologici della Johns Hopkins.
2. Considerare attentamente le specifiche dell'area di imaging fornite nel manuale dell'utente e montare campioni da 5 μm su un vetrino all'interno dell'area di imaging. Siamo stati in grado di montare quattro diversi campioni di tumore su un unico vetrino.
   NOTA: È essenziale utilizzare i vetrini consigliati disponibili per l'imaging, come i vetrini adesivi Leica Apex o i vetrini Fisherbrand Superfrost Plus. Questo aiuterà la cella di flusso ad aderire saldamente al vetrino.

4. Colorazione e imaging dei tessuti FFPE

1. Verifica e ottimizzazione della concentrazione anticorpale e dei tempi di esposizione: Per verificare il successo della coniugazione anticorpo-codice a barre, colorare il tessuto di interesse con 6-9 anticorpi coniugati. Eseguire il dispositivo di imaging multiplex e annotare ogni concentrazione di anticorpi e il tempo di esposizione. Regolare le diluizioni e i tempi di esposizione secondo necessità, quindi eseguire 6-9 nuovi anticorpi con quelli precedentemente verificati e annotare eventuali regolazioni. Seguire i passaggi seguenti per la colorazione e l'imaging.
2. Colorazione e imaging dei tessuti
   1. Il giorno prima della colorazione, cuocere i vetrini di tessuto FFPE in forno a 60 °C per una notte. Il giorno successivo, raffreddare i vetrini per 10 minuti a RT prima di iniziare le fasi di deparaffinazione e reidratazione dei tessuti.
   2. Iniziare la deparaffinizzazione del tessuto incubando in una soluzione di xilene 2 volte per 5 minuti ciascuna.
   3. Per reidratare il tessuto, farlo passare attraverso due cicli di soluzione di etanolo al 100% per 5 minuti ciascuno. Quindi, passalo attraverso una serie di soluzioni alcoliche dal 90% al 70%, 50% e 30% per 5 minuti ciascuna. Infine, lavare il fazzoletto con acqua distillata due volte per 5 minuti ciascuno.
      NOTA: Per le fasi di deparaffinazione possono essere utilizzate alternative meno tossiche allo xilene, come una soluzione Neoclear. Eseguire la deparaffinazione e la reidratazione sotto una cappa aspirante.
   4. Diluire 10 tampone AR9 a 1 x utilizzando acqua distillata. Riempire un barattolo Coplin con 50 ml di 1 tampone AR9, assicurandosi che i vetrini siano completamente immersi nel tampone di recupero dell'antigene.
   5. Riempi una pentola a pressione con acqua in modo che il livello sia a metà del barattolo Coplin, quindi incuba ad alta pressione per 20 minuti.
      NOTA: È possibile utilizzare una pentola a pressione specializzata o una camera di decloaking per un migliore recupero dell'antigene impostandola a 120 °C per 10 min.
   6. Dopo aver completato la fase della pentola a pressione, raffreddare i vetrini per 45-60 minuti. Sciacquare il vetrino con acqua distillata 2 volte per 2 minuti ciascuno. Quindi, trasferisci il vetrino nel barattolo contenente 1x PBS.
   7. Per ridurre al minimo l'autofluorescenza, eseguire una fase di sbiancamento sul tessuto prima di colorare con gli anticorpi. Preparare una soluzione sbiancante (25 mL di 1x PBS + 0,8 mL di 1M NaOH + 4,5 mL di H₂O₂) utilizzando i reagenti e le concentrazioni raccomandate. Incubare i vetrini in un contenitore di plastica contenente la soluzione sbiancante tra due lampade a LED per 45 minuti a temperatura ambiente. Ripetere con soluzione decolorante fresca per altri 45 minuti.
   8. Iniziare a preparare la soluzione cocktail di anticorpi durante questa fase di sbiancamento, soprattutto se nel pannello sono presenti diversi anticorpi con varie diluizioni. Recupera tutti e quattro i bloccanti (G, S, J e N) e mettili sul ghiaccio, poiché alcuni impiegano tempo a scongelarsi da -20 °C.
   9. Dopo il fotosbiancamento, lavare il fazzoletto con 1x PBS, 2x per 2 minuti ciascuno. Spostare il fazzoletto in barattoli contenenti tampone di idratazione e lavare 2 volte per 2 minuti ciascuno.
   10. Trasferire i vetrini di tessuto nel tampone di colorazione e lasciarli equilibrare per 30 minuti. Se non preparato durante la fase di sbiancamento, preparare la soluzione di cocktail di anticorpi durante questo periodo.
   11. Preparare 300 μL di soluzione di cocktail di anticorpi per colorare due vetrini (di solito, se si utilizza una camera di plastica di ibridazione, 100-120 μL di cocktail di anticorpi sono sufficienti per colorare ogni vetrino).
   12. Colorare i vetrini applicando una soluzione cocktail di anticorpi all'interno della camera di umidità per una notte a 4 °C.
       NOTA: Tutti gli anticorpi qui mostrano un segnale positivo quando vengono colorati durante la notte a 4 °C. Tuttavia, il tempo di colorazione e la temperatura di ciascun anticorpo possono variare e devono essere ottimizzati. Le condizioni di colorazione più comunemente utilizzate sono 3 ore a RT o durante la notte a 4 °C. Se necessario, è anche possibile colorare alcuni anticorpi inizialmente a temperature diverse e poi gli anticorpi rimanenti durante la notte a 4 °C. Lavare successivamente il fazzoletto con PBS se è necessaria una colorazione sequenziale.
   13. Il giorno successivo, eseguire la fissazione post-colorazione. Rimuovere la camera di plastica e conservare il cocktail di anticorpi raccolto a 4 °C. Lavare i vetrini 2 volte nel tampone di colorazione per 2 minuti ciascuno. Successivamente, spostare i vetrini su una soluzione di fissaggio post-colorazione da 40 mL (4 mL di Paraformaldeide al 16% + 36 mL di tampone di conservazione) e incubare per 10 min. Risciacquare con PBS 3 volte per 2 minuti ciascuno.
   14. Immergere i vetrini nel metanolo ghiacciato per 5 minuti, quindi risciacquare con PBS 3 volte per 2 minuti ciascuno. Applicare una soluzione fissativa finale (20 μL, una provetta + 1 mL di PBS) sui vetrini sotto una camera di umidità. Di solito, 200 μL di soluzione fissativa sono sufficienti per vetrino. Lasciare riposare il fissativo per 20 minuti a RT. Eseguire tre lavaggi finali in PBS per 2 minuti ciascuno.
       NOTA: Non rimuovere preventivamente il tubo di fissaggio da -20 °C; Scongelare solo prima dell'applicazione.
   15. In caso di imaging immediato, pulire il vetrino attorno al tessuto utilizzando un panno privo di lanugine e applicare la cella di flusso premendola per 30 s utilizzando l'attrezzatura di assemblaggio della cella di flusso. In caso di imaging successivo, conservare il vetrino (senza applicare la cella di flusso) nel buffer di conservazione a 4 °C. Quando si è pronti per l'imaging, trasferire i vetrini dal buffer di archiviazione al PBS per 10 minuti prima di applicare la cella di flusso.
3. Inizia a preparare il buffer in esecuzione 1x con l'additivo in base ai cicli desiderati nell'esperimento. Preparare buffer DMSO bassi (1:4) e alti (9:1) mescolandoli come DMSO a 1 parte con buffer di funzionamento a 4 parti e DMSO a 9 parti con buffer di funzionamento a 1 parte necessari per i cicli desiderati. Risparmia circa 20 ml di tampone 1x con additivo per realizzare una piastra reporter. Per calcolare il buffer 1x richiesto con buffer additivi e buffer DMSO alto/basso, consultare il gestore degli strumenti.
4. Inizia a preparare la piastra reporter. Innanzitutto, crea la soluzione stock reporter richiesta per il numero totale di cicli. Etichettare le provette per microcentrifuga da 1 ml di colore nero o ambrato con i nomi dei cicli. Aggiungere 250 μl di soluzione madre reporter e 5 μl di ciascun reporter alla provetta corrispondente. Quindi, trasferire la soluzione in una piastra nera a 96 pozzetti e sigillarla con un foglio adesivo.
5. Avviare il dispositivo, utilizzare il gestore degli strumenti per impostare i parametri e i tempi di esposizione (come da Tabella 1) e acquisire le immagini. La Figura 1 riassume i processi pre e post colorazione.

5. Annotazione tissutale e segmentazione cellulare

1. Configura un progetto e un'area di lavoro.
   1. Installa l'ultima versione del software di analisi patologica digitale (ad esempio, QuPath versione 0.5.1 o successiva). Fare clic su Crea progetto per scegliere una cartella di destinazione per lo spazio del progetto.
   2. Fare clic su Aggiungi immagini > Scegli file, quindi accedere al file QPTIFF (prodotto dall'imaging a immunofluorescenza multiplex). Impostate il tipo di immagine su Fluorescenza, mantenete tutte le altre impostazioni predefinite e fate clic su Importa.
   3. Se si utilizza QuPath, fare doppio clic sulla nuova immagine per aprire un'area di lavoro. Fare clic su File > Salva periodicamente per tenere traccia delle modifiche apportate al progetto. Attiva/disattiva le impostazioni di visibilità e visualizzazione dei marcatori utilizzando Luminosità e contrasto (icona a forma di mezzaluna) vicino al centro della barra degli strumenti.
      NOTA: Fare clic con il pulsante destro del mouse su un'immagine nell'elenco delle immagini per rinominarla. Questo sarà importante in seguito quando si visualizzeranno le classificazioni dei fenotipi.
2. Annotare l'intera sezione di tessuto, il compartimento intratumorale e il compartimento stromale.
   1. Utilizzare lo strumento pennello e/o bacchetta per disegnare un'annotazione attorno all'intera sezione di tessuto. Definire questa annotazione come Full_Tissue. Escludere la pelle sovrastante e/o le regioni che non devono essere analizzate. Per creare un'annotazione negativa e/o ridurre il limite dell'annotazione, tenere premuto il tasto Alt mentre si utilizza uno degli strumenti di annotazione.
   2. Duplicare l'annotazione completa del tessuto. Seleziona l'annotazione nella scheda Annotazioni, quindi vai su Oggetti > Annotazioni... > Duplica le annotazioni selezionate.
   3. Attiva il canale SOX10. Sull'annotazione duplicata, ridurre il limite dell'annotazione per acquisire il compartimento intratumorale utilizzando lo strumento Alt + pennello/bacchetta. Definisci questa annotazione come un tumore (Figura 2).
   4. Selezionando l'annotazione completa del tessuto, vai su Oggetti > Annotazioni... > Espandi le annotazioni. Definite il raggio di espansione come 1 μm e fate clic su Esegui (Run).
   5. Rinominare la nuova annotazione come Full_Tissue_Expansion. Selezionare l'annotazione del tumore, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Inserisci nella gerarchia.
   6. Riseleziona l'annotazione del tumore, vai su Oggetti > Annotazioni... > Fai l'inverso. Definire questa nuova annotazione come Stroma. Ripetere per tutte le sezioni di tessuto.
3. Esegui la segmentazione delle celle ed esporta i risultati.
   1. Vai alla scheda Immagine per trovare la larghezza e l'altezza in pixel dell'immagine (Figura 3A).
   2. Scarica l'estensione StarDist su https://github.com/qupath/qupath-extension-stardist/releases. Trascina il file qupath-extension-stardist-[version].jar nella finestra di QuPath, quindi fai clic sull'icona a forma di ingranaggio nell'angolo in alto a destra della finestra di QuPath. In Estensioni, definire la directory utente QuPath come percorso della cartella StarDist.
   3. Scaricare i file di script groovy di StarDist e il file del modello di StarDist da https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (gli script di StarDist sono stati originariamente organizzati da Akoya Biosciences).
   4. Per ogni sezione di tessuto, selezionare entrambe le annotazioni Tumore e Stroma (utilizzare Ctrl per selezionare più annotazioni). Nella barra delle impostazioni in alto, fai clic su Automatizza >editor di script per aprire l'interfaccia degli script. Aprire lo script di segmentazione delle celle StarDist appropriato (file groovy) che corrisponde alla dimensione in pixel dell'immagine. Quando viene richiesto di selezionare il file di segmentazione delle celle, aprire il file stardist_cell_seg_model.pb.
   5. Dopo la segmentazione delle celle, salvare l'immagine. Vai su Misura > Esporta misurazioni, quindi seleziona l'immagine o le immagini corrispondenti. Assegna il tipo di esportazione come Celle e Separatore come .csv, quindi scegli la posizione del file di output . Fai clic su Compila accanto a Colonne per includere le metriche di interesse. Le colonne importanti da esportare sono Immagine, ID oggetto, Padre, Centroide X, Centroide Y e Area del nucleo.
      NOTA: L'ID oggetto viene utilizzato nei passaggi successivi per rimappare le classificazioni all'immagine di immunofluorescenza multiplex nel software di analisi patologica digitale. La colonna Genitore indica il nome dell'annotazione a cui appartiene la cella. I dati X e Y vengono utilizzati per l'analisi spaziale.
   6. Per ogni marcatore di derivazione da utilizzare nel clustering/fenotipizzazione, selezionare un valore medio da esportare. Per i marcatori nucleari (ad esempio, SOX10 e FOXP3), esportare l'opzione Nucleus: Media. Per i marcatori citoplasmatici/membranosi (ad es. CD45, CD3, CD4), esportare l'opzione Citoplasma: Media.

6. Pre-elaborazione e normalizzazione dei dati in proteomica

1. Apri il file CSV esportato. Per ogni marcatore da utilizzare nel clustering/fenotipizzazione, troncare il nome dell'intestazione della colonna per includere solo il marcatore. Ad esempio, rinominare SOX10: Nucleus: Mean in SOX10 e CD3: Cytoplasma: Mean to CD3.
2. Installare la versione più recente di R e RStudio. Scaricare il file Marker Normalization.R da https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis ed eseguire lo script. Questo comporta innanzitutto il filtraggio delle cellule in base alle dimensioni nucleari.
3. Per ogni marcatore, viene quindi eseguita una normalizzazione min-max in modo che il valore MFI più basso nell'intervallo di espressione sia impostato su 0 e il valore MFI al 99,7^° percentile sia impostato su 1. Tutte le intensità superiori al 99,7^° percentile vengono tagliate a 1. Una volta completato, salva il nuovo file CSV generato con i dati normalizzati.

7. Clustering e fenotipizzazione

1. Scegliere un algoritmo per il clustering delle celle in base ai profili di espressione dei marcatori. Al https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis, vengono forniti script R per il clustering utilizzando Seurat v4.4¹⁵ e FlowSOM v2.13.9 (strumento di clustering e visualizzazione)¹⁶.
2. Fenotipo delle cellule in base ai profili di espressione dei marcatori chiave del lignaggio. Il protocollo qui presentato ha utilizzato 14 marcatori di linea per il clustering e la fenotipizzazione: SOX10, CD45, CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD11C, F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206, NK1.1 e CD31.
   1. Definisci le cellule tumorali come SOX10^hi. Definisci le cellule T CD4 come CD45^mod-hi/ CD4^hi/CD8^low/FOXP3^low. Definisci le cellule T CD8 come CD45^mod-hi/ CD8^hi/CD4^low. Definisci le Treg come CD45^mod-hi/CD4^hi/CD8^low/FOXP3^hi. Definisci le altre cellule T come CD45^mod-hi/CD3^hi/CD4^low/CD8^low.
   2. Definisci i macrofagi M1 come CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^hi/CD86^hi/CD163^low /CD206^low. Definisci i macrofagi M2 come CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^low/CD163^hi/CD206^low, CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^low/CD163^low/CD206^hi, o CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^low/CD163^hi/CD206^hi. Definisci gli altri macrofagi come CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^low/ CD163^low/CD206^low o CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^hi/CD163^hi/CD206^hi.
   3. Definisci le cellule dendritiche come CD45^mod-hi/CD11c^hi/CD86^mod-hi. Definisci le cellule NK come CD45^mod-hi/NK1.1^hi. Definisci altre cellule immunitarie come CD45^mod-hi che non soddisfano le condizioni descritte sopra. Definisci le cellule endoteliali come CD31^mod-hi. Rimuovere tutti gli altri profili di espressione.

8. Rimappatura delle classificazioni dei fenotipi ed esecuzione del controllo di qualità

1. Scarica lo script Remapping Classifications.groovy da https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (questo script è stato adattato da un post su https://forum.image.sc/ da petebankhead).
2. Apri il file CSV fenotipato e assicurati che tutte le etichette nella scheda Immagine corrispondano esattamente al nome del file immagine nel software di analisi patologica digitale che verrà utilizzato per la rimappatura. Per modificare rapidamente grandi quantità di etichette nel file CSV, utilizzare la funzione Sostituisci tutto.
3. Se si utilizza QuPath, eseguire il remapping delle classificazioni del file groovy facendo clic su Automatizza >editor di script.
4. Nella scheda Annotazioni, fare clic sui tre punti accanto al pulsante Impostazione automatica, quindi fare clic su Popola da oggetti esistenti > Tutte le classi (incluse le sottoclassi) > Sì.
5. Scorri verso il basso nell'elenco dei marcatori per visualizzare le diverse classificazioni dei fenotipi e regolare la combinazione di colori secondo necessità. Fare doppio clic su qualsiasi cella per visualizzarne il fenotipo (accanto al tag Classificazione) e il cluster (accanto al tag Nome). Controllare i campi visivi rappresentativi per determinare l'accuratezza delle assegnazioni dei fenotipi e rivedere la strategia di fenotipizzazione secondo necessità (Figura 3B).

9. Quantificazione della densità e analisi spaziale

1. Una volta completata la fenotipizzazione, ottieni le aree di annotazione nel software di analisi patologica digitale nella scheda Annotazioni. Converti i valori dell'area in mm², quindi dividi i conteggi per le aree di annotazione per calcolare le densità.
2. Scaricare lo script SPIAT Spatial Analysis.R da https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis ed eseguirlo. Raccogli dati sulle distanze minime medie (AMD), sulle composizioni dei quartieri e sui punteggi di miscelazione normalizzati (NMS).
3. Genera cifre nel software di analisi statistica per presentare i risultati. Quando si genera un'unica heatmap per le distanze minime medie delle condizioni di trattamento, calcolare la media dei risultati ottenuti da diverse sezioni di tessuto.

Results

Qui, presentiamo un protocollo per la progettazione di un pannello di anticorpi per il tessuto FFPE murino, l'esecuzione di imaging in immunofluorescenza multiplex e l'analisi di immagini per la quantificazione proteomica e le relazioni spaziali. Il pannello convalidato contiene 27 anticorpi che forniscono marcatori per la visualizzazione di cellule di melanoma (SOX10), leucociti (CD45), cellule T (CD3, CD4, CD8, FOXP3), cellule B (CD20), macrofagi e sottotipi (F4/80, CD68, CD86, CD163, C...

Discussion

Il successo dell'imaging dipende da un pannello di anticorpi ben progettato e convalidato. L'imaging multiplex in immunofluorescenza di campioni FFPE presenta sfide a causa dell'elevata autofluorescenza e della difficoltà di recuperare gli epitopi mascherati dall'inclusione di paraffina. Tuttavia, dato che FFPE offre diversi vantaggi rispetto ai campioni FF, è essenziale progettare e convalidare pannelli anticorpali FFPE. Il primo passo è finalizzare i cloni di anticorpi che mostrano seg...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% paraformaldeide (PFA)	Scienze della microscopia elettronica	PN# 15710	Richiesto durante il processo di colorazione dei tessuti
Filtro MWCO da 50kDa	Millipore	UFC505096	25 kDa e 100 kDa provocano un guasto
Codici a barre e reporter Akoya	Akoya Bioscienze	Vario	Ogni codice a barre può essere utilizzato per coniugare 50 ug di anticorpi liberi da vettore e viene fornito con due fiale di reporter
Kit di coniugazione anticorpale	Akoya Bioscienze	7000009	Un kit di coniugazione viene utilizzato per creare anticorpi coniugati con codice a barre personalizzati. Ogni kit contiene reagenti sufficienti per dieci coniugazioni. Il kit è composto da una scatola di sottokit conservata a 4 gradi C e una scatola del sottokit conservata a -20 °C. Il 4 ° Il sottokit C include la soluzione di blocco del filtro, la soluzione di riduzione 2, la soluzione di coniugazione, la soluzione di purificazione e la soluzione di conservazione degli anticorpi. Il -20 ° Il sottokit C include la soluzione di riduzione 1.
Beta2MG	Abcam	ab214769
CD11b	CST	#41028
CD11C	CST	#39143SF
CD163	CST	#68922BF
CD20	CST	#45839
CD206	CST	#87887
CD3	CST	#24581
CD31	CST	#92841
CD38	CST	#68336BF
CD4	Abcam	ab271945
CD45	CST	#98819
CD68	CST	#29176
CD8	Invitrogen	#14-0808-82
CD86	CST	#20018
Dimetilsolfossido	Avantor/VWR	BDH1115-4LP
EOMES	Abcam	ab222226
Provette per PCR Eppendorf	Eppendorf	E0030124286	Negozio richiesto 5 μ Anticorpo coniugato L per la conferma della coniugazione mediante elettroforesi su gel
Etanolo a prova di 200
F4/80	CST	# 25514
VolpeP3	CST	#72338
Gran-B	CST	#79903SF
Forno di riscaldamento
Camera di ibridazione			Usato per colorare i tessuti con un cocktail di anticorpi
Perossido di idrogeno	Sigma	#216763	Necessario per la preparazione della soluzione sbiancante
Pentola a pressione istantanea o camera di decloaking ARC	Pentola istantanea o Biocare Medical
Ki-67	Akoya Bioscienze
LAG3	CST	#80282BF
Motore LMP2	Abcam	ab243556
Metanolo
MHC-II	eBioscience	#14-5321-82
NK1.1	CST	#24395SF
Colorazione nucleare	Akoya Bioscienze	7000003
PDL1	CST	#85095
DNA spermatico di salmone, tranciato (10 mg/mL)	Invitrogen	AM9680	Può essere utilizzato come alternativa al reagente per il test (Akoya) durante la fase di preparazione della piastra reporter.
SOX-10	Abcam	ab245760
Kit di colorazione per PhenoCycler-Fusion	Akoya Bioscienze	7000017	Il kit di campioni PhenoCycler-Fusion include i tamponi e i reagenti necessari per la colorazione dei tessuti utilizzando anticorpi coniugati con codici a barre PhenoCycler, insieme a celle a flusso per l'imaging dell'intero vetrino. Ogni kit è sufficiente per 10 esperimenti con PhenoCycler-Fusion. Si compone di un sottokit memorizzato a 4 gradi C, un altro a -20 ° C, e una confezione di 10 celle a flusso mantenute a temperatura ambiente. Il sottokit memorizzato a 4 gradi C contiene il tampone di idratazione, il tampone di colorazione, il tampone di conservazione, il blocco N e il blocco J. Il sottokit memorizzato a -20 ° C contiene G Blocker, S Blocker e Reagente Fissativo.
Scommessa T	CST	#53753
TIM-3	CST	#72911
Acqua distillata UltraPure priva di DNasi/RNasi	Invitrogen	10977015	Necessario per sciogliere i codici a barre durante la coniugazione degli anticorpi