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Articolo metodologico

Valutazione della funzione ventricolare destra in modelli sperimentali di ipertensione arteriosa polmonare

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DOI:

10.3791/68248

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27 giugno 2025

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1Laboratory of Pulmonary Investigation, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de Janeiro

In questo articolo

Sommario

La presentazione di metodi dettagliati per la valutazione della funzione del ventricolo destro migliorerà la qualità e l'affidabilità della ricerca sull'ipertensione polmonare, offrendo un solido quadro per studi futuri e migliorando la riproducibilità tra diversi laboratori.

Abstract

L'ipertensione polmonare (PH) è una condizione cronica associata a una ridotta sopravvivenza, il che la rende un'area critica di ricerca. I modelli sperimentali di PH hanno migliorato significativamente la nostra comprensione della sua fisiopatologia e facilitato la progettazione di piccoli studi osservazionali e clinici. Tuttavia, è fondamentale stabilire metodologie standardizzate per garantire la comparabilità tra diversi studi sperimentali e gruppi di ricerca. La standardizzazione non solo migliora la riproducibilità, ma favorisce anche la collaborazione tra i team di ricerca.

In questo video, delineiamo i passaggi metodologici necessari per analizzare accuratamente i parametri funzionali dell'PH. Questi includono la valutazione ecocardiografica, la puntura invasiva del ventricolo destro (RV) e il calcolo dell'indice di Fulton. Per quanto riguarda l'ecocardiografia, vengono presentati in dettaglio la misurazione del tempo di accelerazione arteriosa polmonare e del rapporto tra il tempo di eiezione polmonare, nonché il calcolo della gittata ventricolare destra. Per quanto riguarda le misurazioni invasive, vengono descritte le procedure essenziali, tra cui i protocolli di anestesia, il posizionamento ottimale degli animali, l'impostazione della ventilazione meccanica, l'apertura precisa della parete toracica, la visualizzazione del RV e le tecniche di puntura del RV.

Viene spiegata in dettaglio la metodologia per la dissezione ventricolare (indice di Fulton), così come il calcolo del rapporto RV/ventricolo sinistro più setto, corretto per il peso corporeo dell'animale. Riteniamo che fornire una presentazione dettagliata di questi metodi migliorerà la qualità e l'affidabilità della ricerca sull'PH, offrendo un solido quadro per studi futuri e migliorando la riproducibilità tra diversi laboratori.

Introduzione

Un'adeguata misurazione funzionale della funzione del ventricolo destro (RV) nei piccoli animali è diventata essenziale dopo l'aumento degli studi che utilizzano modelli animali nelle scienze respiratorie e cardiovascolari. Esistono diversi modelli animali di ipertensione polmonare (PH), che utilizzano monocrotalina1, ipossia2 o Sugen + ipossia3. Sono serviti bene per svelare nuovi percorsi fisiopatologici 1,4 e studiare nuovi potenziali trattamenti farmacologici5 e non farmacologici6 per l'PH. Tuttavia, nonostante l'agente eziologico che porta al fenotipo PH, c'è preoccupazione riguardo alla misurazione funzionale delle prestazioni del ventricolo destro, principalmente perché la funzione del ventricolo destro di solito (1) è l'esito primario adottato dagli studi preclinici7; (2) sono disponibili diversi tipi di apparecchiature per eseguire l'ecocardiografia e la puntura invasiva della camera RV; (3) sono richieste competenze in anestesia e alcune conoscenze sulla ventilazione meccanica invasiva nei piccoli animali, nonché il riconoscimento di una finestra adeguata per la valutazione del ventricolo destro.

Secondo le 3R degli studi preclinici (sostituzione, riduzione e perfezionamento), la riduzione è allineata per espandere i metodi che aiutano a ottenere livelli comparabili di informazioni, aumentando la riproducibilità8. Pertanto, il numero di animali sarà ridotto nella ricerca principalmente a seguito di strategie quali un'appropriata progettazione sperimentale, una corretta valutazione statistica e la condivisione di pratiche e conoscenze. Nel presente studio metodologico, vengono presentate tre diverse tecniche dopo l'induzione della PAH (Figura 1). Il primo è la misurazione non invasiva della funzione del ventricolo destro mediante ecocardiografia transtoracica. Le immagini sono ottenute da viste dell'asse parasternale lungo e corto. Il diametro del tratto di uscita del ventricolo destro, il tempo di accelerazione polmonare (PAT) e il tempo di eiezione polmonare (PET) vengono valutati utilizzando un Doppler a onde pulsate. Il rapporto PAT/PET viene calcolato e utilizzato come indice indiretto dell'ipertensione arteriosa polmonare (PAH)9,10. Il secondo è la puntura invasiva del ventricolare. Di solito, viene utilizzato un sistema di acquisizione dati fisiologico, che registra continuamente su un computer che esegue un software personalizzato. La pressione sistolica ventricolare destra invasiva (RVSP) e la pressione arteriosa polmonare media sono spesso utilizzate come esiti primari in diversi studi7. Il terzo è l'indice di ipertrofia ventricolare destra, chiamato anche indice di Fulton11, che è il rapporto tra il RV e il ventricolo sinistro (LV) più il peso del setto interventricolare (S) (RV/LV + S), corretto per il peso corporeo dell'animale. La presentazione di metodi dettagliati per la valutazione della funzione RV migliorerà la qualità e l'affidabilità della ricerca sull'PH, offrendo un solido quadro per studi futuri e migliorando la riproducibilità tra diversi laboratori.

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Figura 1: Diagramma di flusso. Illustrazione riassuntiva dei protocolli descritti in questo articolo. Abbreviazioni: ECHO = ecocardiografia; LV = ventricolo sinistro; PAH = ipertensione arteriosa polmonare; RV = ventricolo destro; RVH = ipertrofia ventricolare destra; RVSP = pressione sistolica del ventricolo destro; S = setto interventricolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico per l'Uso degli Animali (CEUA) dell'Università Federale di Rio de Janeiro con il numero di processo 043/22. Tutte le procedure sono state conformi ai Principi della cura degli animali da laboratorio e alla Guida dell'Accademia Nazionale delle Scienze degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Lo studio ha seguito le linee guida ARRIVE11.

1. Preparazione animale e protocollo sperimentale

  1. Calcolare il numero di animali come riportato in precedenza12.
    NOTA: Tenendo conto che le differenze in RVSP tra CTRL e PAH hanno raggiunto una dimensione dell'effetto di d = 3,95, assumendo un rapporto di dimensione del campione di 1 e una potenza statistica (1-β = 0,8) per identificare differenze significative (α = 0,05), in questo protocollo erano necessari tre animali per gruppo.
  2. Randomizzare (sei) ratti Wistar maschi (220 ± 10 g) per ricevere un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di monocrotalina (60 mg/kg; Gruppo PAH, n = 3) o soluzione salina (1 mL/kg; Gruppo CTRL, n = 3).
  3. Il giorno 28, misurare i parametri cardiovascolari e sopprimere gli animali mediante dissanguamento attraverso una transezione dell'aorta addominale.

2. Ecocardiografia

  1. Configurazione del sistema di elettrocardiografia
    1. Verificare che il cavo di alimentazione sia collegato correttamente al dispositivo e alla presa. Premere il pulsante POWER sul pannello di controllo per alcuni secondi fino all'avvio del sistema.
    2. Assicurarsi che il trasduttore sia collegato correttamente.
    3. Selezionare PAZIENTE dal database per registrare l'ID dell'animale per avviare la procedura.
    4. Spegnere il trasduttore premendo il pulsante di congelamento (figure-protocol-1) sul pannello di controllo mentre si prepara l'animale per preservare la vita utile del dispositivo.
  2. Procedura di elettrocardiogramma
    1. Configurare la macchina per anestesia con isoflurano al 2,5% e scarico di ossigeno di 1 L/min.
    2. Metti l'animale nella camera della macchina per anestesia. Una volta che l'animale è sedato, posizionarlo in posizione supina, fissare la parte superiore delle zampe al tavolo operatorio con del nastro adesivo e attaccare la maschera della maschera della macchina per anestesia al muso dell'animale. Per evitare di svegliare l'animale, assicurarsi di cambiare il pulsante di commutazione della macchina per anestesia da CAMERA a MASCHERA.
      1. Valutare il livello di anestesia valutando il diametro, la posizione e la risposta alla luce della pupilla; posizione della membrana nittitante; e movimento in risposta alla stimolazione della coda. Iniziare gli esperimenti quando le risposte a uno stimolo acustico (battito di mani), così come la stimolazione dei baffi e la risposta del morsetto della coda, sono assenti13.
    3. Utilizzare una garza con detersivo e acqua per bagnare il pelo sul petto dell'animale anestetizzato. Rasa il pelo dal petto dell'animale con una lama di rasoio attaccata al forcipe Kelly. Applicare una generosa quantità di gel conduttivo sul petto dell'animale.
    4. Premere il pulsante 2D sul pannello di controllo.
    5. Posizionare il trasduttore tra il terzo e il quinto spazio intercostale per acquisire l'asse corto. Dirigere il trasduttore verso la spalla sinistra dell'animale (angolo di 90° rispetto allo sterno), catturando un'immagine in sezione trasversale a livello della base del cuore, che consente la visualizzazione del ventricolo destro, della valvola aortica, della valvola polmonare e dell'atrio sinistro (Figura 2A).
    6. Premere il pulsante di blocco (figure-protocol-2) sul pannello di controllo per bloccare l'immagine e premere il pulsante di salvataggio (figure-protocol-3) sul pannello di controllo per salvare l'immagine.
    7. Quando viene trovato l'angolo corretto, rimanere in quella posizione e premere il pulsante dell'onda pulsata (PW) sul pannello di controllo per ottenere la modalità Doppler spettrale a onde pulsate (Figura 2B).
    8. Utilizzare la trackball sul pannello di controllo per spostare il cursore giallo (sinistra o destra/su o giù) su uno schermo e posizionarlo sopra la valvola polmonare.
    9. Premere il pulsante cinque (5) sul pannello di controllo per ottenere la curva del flusso sanguigno attraverso la valvola polmonare.
      PASSAGGIO CRITICO: Per ottenere una buona immagine, assicurati che la curva sia intensamente bianca e che l'acustica sia forte e chiara.
    10. Posizionare il trasduttore tra il terzo e il quinto spazio intercostale per acquisire l'asse lungo. Dirigere il trasduttore verso la spalla destra dell'animale (angolo di 45°-60° rispetto allo sterno), acquisendo un'immagine della sezione longitudinale, che consente la visualizzazione del ventricolo sinistro, del ventricolo destro, dell'atrio sinistro, della valvola mitrale e della valvola aortica (Figura 2C).
    11. Premere il pulsante di blocco (figure-protocol-4) sul pannello di controllo per bloccare l'immagine e premere il pulsante di salvataggio (figure-protocol-5) sul pannello di controllo per salvare l'immagine.
    12. Premere il pulsante TERMINA ESAME sul pannello di controllo per terminare l'esperimento e salvare le immagini nel database dei pazienti.
  3. Analisi dei dati
    1. Configurazione del sistema di elettrocardiografia:
      1. Verificare che il cavo di alimentazione sia collegato correttamente al dispositivo e alla presa. Premere il pulsante POWER per alcuni secondi fino all'avvio del sistema.
      2. Seleziona CERCA su una schermata e scegli il rispettivo ID animale dal database per avviare l'analisi.
      3. Premere il pulsante SONOVIEW sul pannello di controllo. Fare clic una volta all'interno dell'immagine su uno schermo per avviare l'analisi.
        NOTA: L'immagine è delimitata da una linea tratteggiata. Questa linea deve essere continua dopo aver fatto clic per avviare l'analisi.
      4. Utilizzando la trackball, selezionare l'immagine dell'asse corto in modalità Doppler spettrale a onde pulsate nell'angolo destro dello schermo.
      5. Premere il pulsante della calcolatrice (figure-protocol-6) sul pannello di controllo e selezionare il parametro frequenza cardiaca (FC) su una schermata. Utilizzando la trackball, posizionare la linea del cursore da un picco all'altro di due curve. Fallo tre volte per ottenere il valore medio.
      6. Premere il pulsante della calcolatrice (figure-protocol-7) sul pannello di controllo; selezionare il parametro valvola polmonare (PV) e successivamente il parametro tempo di accelerazione della valvola polmonare (PV AccT/ET) su una schermata. Utilizzando la trackball, posizionare la linea del cursore dall'inizio al picco della curva. Quindi, posiziona la linea dall'inizio alla fine della stessa curva. Eseguire questa operazione tre volte per ottenere il valore medio (Figura 3A).
      7. Salvare i dati premendo il pulsante di salvataggio (figure-protocol-8) sul pannello di controllo.
      8. Utilizzando la trackball, selezionare l'immagine dell'asse lungo nell'angolo destro dello schermo.
      9. Premere il pulsante calcolatrice (figure-protocol-9) sul pannello di controllo; selezionare il parametro tratto di efflusso ventricolare destro (RVOT) e successivamente il parametro diametro del tratto di efflusso ventricolare destro (RVOT DIAM) su una schermata. Utilizzando la trackball, posizionare il cursore da una parete del camper all'altra parete. Eseguire questa operazione tre volte per ottenere il valore medio (Figura 3B).
      10. Salvare le immagini con i dati premendo il pulsante di salvataggio (figure-protocol-10) sul pannello di controllo.
      11. Trasferire le immagini sul disco rigido esterno. Selezionare CERCA su una schermata e il rispettivo ID animale dal database. Seleziona ESPORTA su una schermata e scegli il disco rigido esterno.

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Figura 2: Finestra parasternale dell'ecocardiografia transtoracica. Immagine schematica della posizione del trasduttore per l'acquisizione di immagini in sezione trasversale e un'immagine rappresentativa dell'asse corto in (A) modalità 2D e (B) modalità Doppler spettrale a onde pulsate e (C) asse lungo. Abbreviazioni: Ao = aorta; AV = valvola aortica; CTRL = controllo; LA = atrio sinistro; LV = ventricolo sinistro; MV = valvola mitrale; PAH = ipertensione arteriosa polmonare; RA = atrio destro; RV = ventricolo destro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Analisi dei dati dell'ecocardiografia transtoracica. (A) Immagine rappresentativa della posizione della linea tratteggiata per il calcolo del rapporto PAT/PET e (B) Immagine rappresentativa della posizione del connettore per analizzare il diametro di deflusso del ventricolo destro. Abbreviazioni: FC = frequenza cardiaca; PAT = tempo di accelerazione dell'arteria polmonare; PET = tempo di eiezione polmonare; PV AccT = tempo di accelerazione della valvola polmonare; PV ET = tempo di espulsione della valvola polmonare; PV AccT/ET = rapporto tra il tempo di accelerazione della valvola polmonare e il tempo di eiezione della valvola polmonare; RVOT Diam = diametro del tratto di efflusso ventricolare destro; Area RVOT = area del tratto di efflusso ventricolare destro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Pressione sistolica ventricolare destra

  1. Preparazione della pressione sistolica del ventricolo destro
    1. Ventilatore meccanico: Impostare sul ventilatore meccanico i seguenti parametri: Frazione di ossigeno inspirato (FiO 2 ), 21%; volume corrente, 8 mL/kg; frequenza respiratoria, 70 bpm; e pressione positiva di fine espirazione (PEEP), 3 cmH2O.
    2. Monitor e trasduttore di segnale: collegare il set di vene del cuoio capelluto da 19 G utilizzato per la puntura a un monitor in modo che la pressione possa essere visualizzata.
    3. Procedura di azzeramento del trasduttore di pressione del registratore fisiologico multicanale:
      1. Collegare il trasduttore di pressione al cavo emodinamico appropriato e al canale del monitor multiparametrico.
      2. Allineare sia il trasduttore di pressione che la punta terminale della vena del cuoio capelluto a un'altezza simile a quella del torace dell'animale.
      3. Premere il pulsante zero nella schermata multiparametrica. Spostare la vena del cuoio capelluto collegata al trasduttore di pressione verso l'alto e verso il basso e verificare se i valori aumentano e diminuiscono, rispettivamente.
        PASSAGGIO CRITICO: Il set di vene del cuoio capelluto deve essere riempito con soluzione salina eparinizzata per garantire una corretta trasmissione del segnale. Evitare bolle d'aria nella linea per evitare interferenze di segnale.
    4. Procedura di calibrazione del trasduttore di pressione del registratore fisiologico multicanale: Utilizzando uno sfigmomanometro esterno e analogico, verificare se la pressione applicata nel trasduttore di pressione è simile a quella osservata sullo schermo del monitor del multipametro. In caso contrario, regolare il guadagno del canale.
    5. Per un computer con un sistema di acquisizione dedicato aperto, impostare il software:
      1. Aprire il programma e fare clic su DataAcquisitionSystem sullo schermo. Si apre la finestra in cui è possibile monitorare il segnale di pressione.
      2. In questa finestra, fai clic sulla freccia bianca su uno schermo nell'angolo in alto a sinistra.
      3. Apparirà un pop-up che richiede la configurazione; fare clic su OK.
      4. Nella nuova finestra, vai su Canale fisico e fai clic su Sfoglia.
      5. Utilizzando il pulsante CTRL su una tastiera, selezionare tutti i canali tranne 'ai7' e fare clic su OK.
      6. Sotto Physical Channel (Canale fisico), vedere Input Terminal Configuration (Configurazione terminale di input impostata come predefinita). Utilizzare le frecce laterali per modificarlo in RSE, quindi fare clic su OK.
      7. Si aprirà una nuova finestra in cui è possibile controllare l'acquisizione del segnale e calibrare la linea di base. Premere Carica configurazione, selezionare il file di configurazione appropriato, quindi premere Carica segnali sul lato destro della finestra.
      8. Attendere 5-10 secondi affinché il segnale appaia sullo schermo. Una volta visibile, fare clic su Segnale 0, selezionare Segnale 6, quindi fare clic su Zero Baseline.
      9. Passare alla directory dei file e scegliere il percorso in cui verranno salvati i dati durante l'esperimento. Fai clic su Cartella corrente nell'angolo in basso a destra.
      10. Ora che tutti i parametri sono impostati nel software, fare clic su OK. Tornare alla finestra principale del programma e fare clic su Acquisisci. Il programma avvierà l'acquisizione del segnale.
      11. Nell'angolo in basso a destra, selezionare il segnale in base alla configurazione (segnale 6).
        NOTA: Assicurarsi che il segnale sul monitor del computer corrisponda al segnale sul monitor del trasduttore e fluttui quando si sposta il set di vene del cuoio capelluto. In caso contrario, risolvere i problemi di trasmissione del segnale prima di procedere.
  2. Procedura di pressione sistolica del ventricolo destro
    1. Dopo l'ecocardiografia, somministrare una combinazione i.p. di 87,5 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilazina per anestetizzare l'animale.
    2. Una volta che l'animale è sedato, somministrare 400 μL di lidocaina per via sottocutanea (s.c.) nella regione tracheale.
  3. Tracheostomia
    1. Una volta che l'animale è sedato, posizionarlo in posizione supina e fissare la parte superiore delle zampe con del nastro adesivo al tavolo operatorio su una fonte di calore per mantenere la temperatura corporea (ad esempio, un tavolo chirurgico riscaldato).
    2. Pulire la zona della gola con alcool al 70%. Quindi, utilizzare una garza con detersivo e acqua per bagnare il pelo sulla gola dell'animale anestetizzato. Rasa il pelo dalla gola dell'animale con una lama di rasoio attaccata al forcipe Kelly.
    3. Fai un'incisione nella pelle usando una pinza per tessuti con denti e forbici.
    4. Esporre la trachea ritraendo la ghiandola sottomascellare e sezionando senza mezzi termini i muscoli circostanti utilizzando una pinza per tessuti con denti e una pinza Kelly curva.
    5. Passare con cautela una linea di sutura sotto la trachea usando una pinza Kelly curva.
    6. Usando le estremità libere della linea di sutura, sollevare delicatamente la trachea per una migliore visualizzazione e praticare un piccolo taglio tra due anelli di cartilagine usando una lama di bisturi. Fai attenzione agli anelli di cartilagine per evitare di tagliare la laringe.
    7. Inserire delicatamente la cannula tracheostomica con la punta smussata rivolta verso il basso e, dopo il corretto posizionamento, ruotare verso l'alto, avanzando di circa cinque anelli ma non più in profondità.
      NOTA: Se la cannula tracheostomica contiene muco, è necessario espirarla con una siringa prima di collegarla al ventilatore meccanico.
    8. Fissare la cannula con la linea di sutura, assicurandosi che rimanga in posizione.
    9. Somministrare 2 mg/kg di bromuro di pancuronio per paralizzare i muscoli dell'animale.
      NOTA: Il bromuro di pancuronio può essere iniettato per via endovenosa attraverso un catetere della vena caudale o per via intraperitoneale.
    10. Collegare l'animale al ventilatore meccanico, testato e configurato in modalità di ventilazione a volume controllato.
    11. Con l'animale tracheostomizzato e collegato al ventilatore meccanico, procedere all'esposizione del cuore.
  4. Cateterismo
    1. Pulisci la zona del torace con alcol al 70%. Quindi, utilizzare una garza con detersivo e acqua per bagnare il pelo sul petto dell'animale anestetizzato. Rasa il pelo dal petto dell'animale con una lama di rasoio attaccata al forcipe Kelly.
    2. Per aprire la cavità toracica, praticare un'incisione nella pelle dalla base del processo xifoideo, fermandosi a circa 0,5 cm sotto il sito della tracheostomia.
    3. Tagliare i muscoli intercostali interni ed esterni per esporre le costole e lo sterno.
    4. Esponi il cuore tagliando lo sterno con le forbici e usa le pinze Kelly per tenere ciascun lato della cavità toracica per un migliore accesso al camper.
      NOTA: Tagliare sempre lungo lo sterno per ridurre al minimo il sanguinamento eccessivo, che potrebbe compromettere la visibilità.
    5. Il cuore è coperto dal pericardio. Rimuovere questa sottile membrana usando una pinza in modo che le camere cardiache possano essere differenziate.
    6. Ora che l'animale è stato tracheosttomizzato, collegato al ventilatore e il cuore è esposto, procedere con la puntura ventricolare destra.
    7. Assicurarsi che il computer sia acceso, che LabView sia aperto e che la linea di base sia configurata per l'acquisizione del segnale prima di valutare l'RVSP. Localizzare il RV, utilizzando come riferimento il ramo interventricolare delle arterie coronarie. Questo ramo è visibile e indica la posizione del setto interventricolare, che separa i ventricoli destro e sinistro.
    8. Nel software, verificare che l'acquisizione del segnale sia iniziata. Fai clic sul pulsante Salva su una schermata e inserisci l'ID dell'animale.
    9. Utilizzando il set di vene del cuoio capelluto da 19 G riempite di soluzione salina eparinizzato, pungere leggermente sopra il punto di riferimento, assicurandosi che l'ago non sia inserito troppo in profondità.
      PASSAGGIO CRITICO: L'inserimento eccessivo dell'ago potrebbe perforare il ventricolo sinistro, producendo pressioni non correlate all'arteria polmonare.
    10. Verificare l'accuratezza della puntura mediante i valori di pressione ottenuti: RVSP negli animali di controllo, 10-20 mmHg; RVSP in animali con ipertensione arteriosa polmonare, fino a 60 mmHg; la pressione acquisita >80 mmHg indica che probabilmente la cannula ha raggiunto il ventricolo sinistro (Figura 4B).
    11. Registra almeno 10 picchi d'onda di pressione stabili per garantire l'affidabilità dei dati.
    12. Al termine dell'acquisizione del segnale, somministrare eparina all'animale per il prelievo di sangue mediante puntura del ventricolo sinistro o della vena cava addominale utilizzando una siringa eparinizzata.
      NOTA: L'eparina può essere iniettata per via endovenosa attraverso un catetere della vena caudale o direttamente nel ventricolo sinistro.
    13. Dopo il prelievo di sangue, sopprimere l'animale per dissanguamento tagliando la vena cava addominale e procedere con il prelievo di organi per ulteriori analisi.
    14. Salvare il segnale nella directory dei file scelta all'inizio dell'esperimento. Trasferisci le immagini sul disco rigido esterno selezionando i file nella cartella del computer e copia/incolla i file .bin su un disco rigido esterno.

4. Analisi dei dati

NOTA: Controllare il codice di routine utilizzato in MATLAB per analizzare il segnale del trasduttore per RVSP (File supplementare 1). È stato sviluppato sulla base delle esigenze di questo progetto di ricerca.

  1. Apri il programma, fai clic sul pulsante Incolla (figure-protocol-13) nella schermata MATLAB e seleziona il file sul disco rigido interno del computer che contiene il codice appropriato.
  2. Nell'angolo sinistro della schermata MATLAB, osservare l'elenco dei file che contengono i codici per ciascun canale riconosciuto dal trasduttore.
  3. Scegliere il codice per la configurazione del canale scelto all'inizio dell'esperimento per rilevare il segnale (canale 6).
  4. Premere il pulsante Esegui (figure-protocol-14) e selezionare il file .bin sul disco rigido esterno da analizzare.
    PASSAGGIO CRITICO: Nell'angolo in basso a destra, modifica il tipo di archivio da Tutti i file MATLAB a Tutti i file, altrimenti i file .bin non verranno visualizzati.
  5. Seleziona l'area migliore della curva facendo clic una volta all'inizio e una volta alla fine. L'area migliore è quella con le curve più omogenee, con picchi e depressioni visivamente uguali (Figura 4A).
  6. Selezionare 10 s della curva facendo clic una volta all'inizio (0 s) e una volta alla fine (10 s) (Figura 4A).
    NOTA: L'asse X rappresenta il tempo in secondi e l'asse Y rappresenta la pressione in mmHg.
  7. Regolare la linea di base sottraendo il valore minimo più basso nella finestra di comando e premendo INVIO sulla tastiera. Il software genera automaticamente tutti i dati (Figura 4A).
  8. Osservare i dati presentati in due colonne; Il primo è l'ora del picco e il secondo è il valore del picco (pressione).
    NOTA: Le curve ottenute dalla puntura rappresentano le pressioni sistolica (picco) e diastolica (depressione) del ventricolo destro. L'analisi MATLAB presenta entrambi i valori.
  9. Copia e incolla i dati della pressione sistolica in un file .txt ed elimina i valori riferiti al tempo.
  10. Cambia tutti i punti in virgole nel file .txt per poter ottenere la media.
  11. Selezionare 10 valori di pressione di picco e calcolarne la media.

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Figura 4: Analisi dei dati della pressione sistolica del ventricolo destro. (A) Immagini rappresentative dei passaggi per selezionare le aree della curva durante l'analisi. (B) L'esempio di una curva mostra un picco di circa 80 mmHg, indicando che la puntura era abbastanza profonda da raggiungere il ventricolo sinistro. Dopo essersi tirato indietro dolcemente, ha raggiunto la cavità del ventricolo destro. È possibile vedere nella curva che appare al primo passo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Indice di ipertrofia ventricolare destra

  1. Procedimento
    1. All'inizio del protocollo sperimentale, misurare il peso corporeo dell'animale.
    2. Dopo aver misurato l'RVSP, sopprimere l'animale mediante dissanguamento e rimuovere gli organi dalla cavità toracica in blocco per separare il cuore dell'animale soppresso.
    3. Sezionare i vasi alla base del cuore (aorta, arteria polmonare, vena cava e vene polmonari).
      PASSAGGIO CRITICO: Fare attenzione a evitare di sezionare i padiglioni auricolari destro e sinistro.
    4. Asciugare il cuore con una garza e registrare il peso del cuore intero secco misurato sulla bilancia di precisione.
    5. Seziona gli atri sinistro e destro e scartali.
    6. Separare il RV dal LV associato alla S.
    7. Asciugare ogni componente, sezionare con una garza e registrare il peso del RV e del LV + S misurato separatamente sulla bilancia di precisione.
  2. Analisi dei dati
    1. Calcolare l'indice di ipertrofia ventricolare destra come indice di Fulton, che consente di valutare l'ipertrofia ventricolare destra confrontando il peso della parete libera del ventricolo destro con il peso delle pareti del ventricolo sinistro + S corretto dal peso corporeo:
      figure-protocol-16
      NOTA: Indice di Fulton negli animali di controllo, fino a 0,4 mg; Indice di Fulton negli animali con PAH, >0,4 mg.

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Risultati

Per le analisi statistiche, ogni variabile è stata testata per la normalità e la varianza utilizzando il test di Shapiro-Wilk. I dati sono presentati come medie ± deviazione standard. Il test t non appiato è stato utilizzato per confrontare le concentrazioni di particelle nei gruppi di controllo (CTRL) e ipertensione arteriosa polmonare (PAH) (p<0,05).

Alterazioni ecocardiografiche nel modello animale di PAH
La Figura 4 mostra che ...

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Discussione

La PAH è una malattia progressiva caratterizzata da un eccessivo rimodellamento vascolare, che promuove un aumento della resistenza vascolare polmonare, con conseguente aumento del postcarico RV14. Di conseguenza, la RVSP rappresenta una variabile funzionale che è direttamente correlata alla gravità della PAH15. Nel tempo, la risposta adattativa del ventricolo destro è l'ipertrofia concentrica compensatoria (misurata dall'indice di Fulton)<...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano André Benedito da Silva per il supporto negli esperimenti, Verônica Cristina dos Santos Lima per la cura degli animali e Lorna O'Brien per la revisione della grammatica inglese. Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione statale per la ricerca di Rio de Janeiro (FAPERJ E-26/202.766/2018, E-26/010.001488/2019).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagents
Alcohol 70%MontenegroALC70-001
Gel conduttivoMercorCG-002
Soluzione salina (NaCl 0,9%)BioPharmaSAL-009
Instruments
19 G setdi vene del cuoio capellutoDescarpackSVS-19G
Pinze kelly curveABC instrumentos cirurgicosCKF-003
Kelly forcipeABC instrumentos cirurgicosKF-004
Aghi (18, 22 e 26 G)DescarpackNDL-MIX
Piastra di PetriGlassLabPD-150
Lama di rasoioABC instrumentos cirurgicosRB-005
BisturiABC instrumentos cirurgicosSC-006
ForbiciABC instrumentos cirurgicosSCIS-007
Linea di suturaABC instrumentos cirurgicosSUT-008
Siringhe (1, 3 e 5 mL)DescarpackSYR-135
Cannula per tracheostomiaMedTechTC-010
PinzettaABC instrumentos cirurgicosTWZ-011<
strong>Farmaci
Dextroketamine cloridrato 5%Cristá liaDXT-00587,5 mg/kg intraperitoneale
Isoflurano 1 mL/mL 240 mLCristá liaISO-240Soluzione per inalazione al 2,5%
Lidocaina cloridrato 1%Cristá liaLID-001400 µ L sottocutaneo localmente
MonocrotalinaSigma-AldrichC240160 mg/kg intraperitoneale
Pancuronio bromuro 2 mg/mLCristá liaPAN-0022 mg/kg eparina sodica per via endovenosa
5000 UI/mLCristá liaHEP-5000diluito 1:4 in 1 mL
Xilazina cloridrato 2%SyntecXYL-00212,5 mg/kg intraperitoneale
Equipment
GraphPad Prism 9GraphPad Software, IncGP9
Monitor veterinario multiparametrico in rete LifeWindow 9xDigicare Animal HealthLW9x
Software LabViewNational Instruments, Corp.LV-2019
MATLAB R2019a (Versione) softwareThe MathWorks, Inc.MATLAB-2019
Monitor e trasduttore di segnaleMedTechMST-015
Bilancia di precisioneSartoriusPS-020
R540 Mouse & Macchina per anestesia animale per rattiRWD Life Schience Co., LTDR540-ANA
ScalaOhausSCL-025
Servo-i ventilatore meccanico...Getinge ABSERVO-IFiO2 = 21%; volume corrente = 8 ml/kg, frequenza respiratoria = 70 bpm e PEEP = 3 cmH2O
Software SonoViewSONOTEC Ultraschallsensorik Halle GmbHSV-2020
UGEO HM70A system Samsung Eletrô nica da Amazô nia LTDAHM70A
G*Power 3.1.9.7Università di Dü sseldorf, Germaniagpower

Riferimenti

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