Questo protocollo descrive in ovo xenotrapianto di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) B e T derivate da pazienti, che si verifica 4 giorni dopo l'iniezione.
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Articolo metodologico
Nell'Ovo Xenotrapianto di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) derivate da pazienti (PDX-ALL)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo studio introduce un metodo rapido, economico ed efficiente per lo xenotrapianto in ovo di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) derivate da pazienti, che comprende sia le linee di cellule B che quelle di cellule T. Utilizzando embrioni di pollo fecondati, abbiamo iniettato cellule B-ALL e T-ALL derivate da pazienti nel sistema vascolare degli embrioni 11 giorni dopo la fecondazione (11dpf). Sorprendentemente, quattro giorni dopo l'iniezione, le cellule leucemiche umane trapiantate hanno mostrato una significativa sopravvivenza, proliferazione e colonizzazione vascolare all'interno dell'embrione di pollo in via di sviluppo. A 15dpf, abbiamo rilevato un notevole aumento delle cellule CD10/CD19+ B-ALL e CD4/CD8+ T-ALL nei campioni di sangue dal sistema vascolare dell'embrione, confermando il successo dell'attecchimento. Questo sistema facilita una valutazione efficiente e riproducibile del comportamento delle cellule leucemiche in un organismo vivente senza i costi considerevoli e i vincoli etici associati ad altri modelli animali. Questo approccio rapido fornisce una piattaforma in vivo ad alto rendimento e biologicamente rilevante per la valutazione di potenziali composti terapeutici. Il sistema in ovo patient-derived xenograft (PDX)-ALL qui presentato offre uno strumento promettente per lo screening preclinico dei farmaci, gli studi meccanicistici e potenzialmente per gli approcci di medicina personalizzata nella ricerca sulla leucemia.
Introduzione
La membrana corioallantoidea del pulcino (CAM), inizia a prendere forma al 7° giorno dopo la fecondazione dopo l'incubazione ed è completa entro il 12° giorno. Il CAM è un modello in vivo adatto per l'angiogenesi1 e l'innesto di cellule tumorali 2,3,4,5,6,7,8,9,10, in particolare le cellule tumorali correlate al sangue 11, poiché è intrinsecamente immunodeficiente e ha una vascolarizzazione ben sviluppata. Inoltre, la CAM è anche un sistema desiderabile per studiare l'invasione e la metastasi tumorale in quanto trasporta una serie di proteine della matrice extracellulare, tra cui collagene, integrina αVβ3, fibronectina, laminina e metalloproteinasi della matrice-2 (MMP-2)10.
La leucemia linfoblastica acuta (ALL) è un tumore del midollo osseo e del sangue caratterizzato dal rapido aumento dei linfociti B e T immaturi. È il cancro pediatrico più diffuso e la prima causa di morte per cancro tra i bambini. La LLA è curabile nell'>85% dei bambini affetti, ma gli adulti e i neonati hanno tassi di guarigione considerevolmente più bassi e la LLA recidivante/refrattaria ha una sopravvivenza a 5 anni del <10%12. Pertanto, è urgentemente necessario sviluppare nuove strategie di trattamento per prevenire o fermare la LLA recidivante o refrattaria. Sebbene siano stati sviluppati numerosi modelli di xenotrapianto, come il topo e il ratto13, questi metodi richiedono molto tempo (ad esempio, mesi) e sono costosi e richiedono una regolamentazione etica completa. Per rispondere a un'esigenza clinica insoddisfatta di una nuova terapia per la LLA, è indispensabile sviluppare un modello animale riproducibile, efficiente in termini di tempo e costi, adatto per estendere il lavoro di base in vitro .
In questo studio, riportiamo il successo della creazione di un protocollo di xenotrapianto in ovo che produce in modo affidabile la colonizzazione vascolare 3D delle cellule B e T-ALL dei pazienti, che è potenzialmente utilizzato per la progettazione di una nuova terapia che potrebbe fermare la progressione della ALL e per lo sviluppo di uno strumento predittivo per l'esito e i rischi del trattamento ALL.
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Protocollo
Gli esperimenti sono stati eseguiti sulla base del protocollo approvato dal Comitato Etico dell'Università di Calgary (REB15-1143; dove è stato ottenuto il consenso informato da TUTTI i soggetti) e dal Comitato Etico per la Ricerca Sanitaria del Comitato per il Cancro dell'Alberta (HREBA. CC-17-0108_REN8). Sono stati inclusi nello studio i pazienti con LLA alla diagnosi (prima di iniziare qualsiasi terapia), che presentavano blasti circolanti (blasti non solo nel midollo ma anche nel sangue). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Incubazione delle uova
- Procurati uova di gallina fecondate. Ottieni ~10% in più di uova del necessario per considerare il numero di uova danneggiate durante la spedizione o la procedura di cracking.
- Conservare gli ovuli fecondati per un massimo di due settimane a 12 °C senza perdere vitalità.
- Trasferire le uova in un'incubatrice umidificata (~50%-60%) a 39 °C.
- Incubare le uova nell'incubatrice per 10dpf. Si noti che il giorno 1 inizia quando gli ovuli vengono trasferiti nell'incubatrice.
2. Isolamento di cellule di leucemia linfoblastica acuta da campioni di sangue di pazienti con LLA
- Isolare le cellule come descritto in precedenza 14,15.
- Raccogliere 10 mL di sangue periferico (o midollo) da pazienti con ALL B e T in provette eparinizzate.
- Trasferire i campioni di sangue in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml e diluire tre volte con 2 volumi di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 137 mM di NaCl, 2,7 mM di KCl, 10 mM di Na2HPO4 e 1,8 mM di KH2PO4.
- Sovrapporre 1 volume di campioni di sangue diluiti su 1 volume di terreno a gradiente di densità e centrifugare a temperatura ambiente senza freni a 300 x g per 30 minuti.
- Raccogliere lo strato di buffy coat di cellule mononucleate (MNC) dall'interfaccia e trasferirlo in una nuova provetta sterile da 15 mL utilizzando una pipetta sterile.
- Aggiungere 10 mL di 1x PBS e centrifugare a 300 x g per 5 minuti per rimuovere eventuali componenti del siero rimanenti (ripetere questo passaggio due volte).
- Aggiungere 2 mL di NH4Cl allo 0,8% al pellet cellulare, agitare delicatamente, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e centrifugare a 300 x g per 5 minuti per lisare i globuli rossi (se necessario, ripetere questo passaggio).
- Lavare le celle in 1x PBS come descritto al punto 2.6.
- Risospendere le cellule in RPMI 1640 contenente il 10% di FBS e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
- Valutare la vitalità cellulare utilizzando il test di esclusione del blu di tripano.
- Risospendere le cellule nel mezzo di congelamento (10% di DMSO in FBS), congelarle a -80 °C e conservarle in azoto liquido.
3. Amplificazione di lentivirus incompetenti alla replicazione di 2a generazione portatori di mCherry
- Il seme HEK293T cellule renali embrionali umane alla confluenza ~60%-70% in una piastra a 6 pozzetti contenente DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2.
- Cotrasfettare le cellule (1,5 x 106) con il trasferimento FUW-Luc-mCherry-puro, il packaging pCMVΔr8.91 e i vettori di busta pVSV-G con un rapporto di 3:2:1 utilizzando Lipofectamine 3000 per 2 giorni.
- Raccogliere il surnatante contenente lentivirus e filtrarlo con un filtro da 0,45 μm.
- Trasferire il surnatante virale chiarificato in provette da centrifuga, centrifugare a 20.000 x g per 2 ore a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μl di PBS o terreno privo di siero.
- Misurare la molteplicità dell'infezione (MOI) utilizzando il kit qPCR Lentivirus Titer.
4. Marcatura di linee cellulari ALL in continua crescita e cellule ALL derivate da pazienti con mCherry
- Piastra 1 x 106 cellule/mL di linee cellulari B-(SEM) e T-ALL (MOLT3)16,17 e cellule B- o T-ALL derivate da pazienti in piastre a 6 pozzetti contenenti RPMI 1640 + 10% FBS.
- Infettare le cellule con 300 μL di preparato lentivirale con un titolo virale di 3,47 x 106 UI/mL per ottenere un MOI di 1 per 1 x 106 cellule, mescolare delicatamente e incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 2 giorni.
- Aggiungere 1 μg/mL di puromicina al terreno di coltura per selezionare le cellule trasdotte stabilmente per 2 giorni.
- Visualizza le cellule marcate con mCherry con un microscopio a fluorescenza.
5. In-ovo xeno grafting
- Il giorno 10 (vedi sopra la sezione sull'incubazione delle uova), esamina la vascolarizzazione degli embrioni di pollo alla luce per valutare la vitalità dell'embrione. Quindi, lavare delicatamente le uova con etanolo al 70% per sterilizzare la superficie.
- Forare la cella d'aria delle uova per creare una piccola finestra (~2,0 cm di diametro) usando un trapano a mano.
- Sigillare con nastro adesivo trasparente e rimettere in un'incubatrice al 5% di CO2 .
- L'11° giorno, iniettare 1 x 10 cellule LLA marcate con7 mCherry nei vasi sanguigni degli embrioni in via di sviluppo utilizzando aghi da 34 G. Si noti che si è rivelato difficile confermare se TUTTE le cellule sono state iniettate in posizioni identiche in embrioni diversi perché l'apertura della finestra nelle stesse posizioni non è garantita.
- Sigillare le finestre con nastro adesivo trasparente, tornare all'incubatrice al 5% di CO2 e monitorare quotidianamente la vitalità dell'embrione.
- Il 15° giorno, sezionare i vasi sanguigni dagli embrioni, posizionarli su vetrini e fotografare gli xenotrapianti riusciti utilizzando un microscopio da dissezione dotato di capacità di fluorescenza.
NOTA: Oltre i 15dpf (poiché le piume coprono l'intero corpo e l'albume è quasi scomparso), è necessario eseguire l'immunoistochimica per valutare i cambiamenti nella proliferazione e nella colonizzazione di TUTTE le cellule nel sistema vascolare dell'embrione di pollo.
6. Citometria a flusso
- Il giorno 15, prelevare il sangue dal sistema vascolare dell'embrione di pollo utilizzando una siringa sterile con ago da 32 G, trasferirlo in una provetta sterile da 1,5 ml contenente eparina e centrifugare a 226 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante (plasma) e risospendere il pellet cellulare in 1x PBS contenente l'1% di BSA (albumina sierica bovina).
- Eseguire i passaggi 2.7 e 2.8 per lisare i globuli rossi.
- Etichettare le cellule B-ALL con anticorpi umani FITC-CD10 e PE-CD19 umani e le cellule T-ALL con anticorpi umani FITC-CD4 e PE-CD8 umani, rispettivamente, a 4 °C al buio per 30 minuti.
- Lavare due volte le cellule marcate con PBS contenente l'1% di BSA, centrifugare a 226 x g per 5 minuti a 4 °C, risospendere in 1x PBS e analizzare mediante citometria a flusso.
- Impostare le tensioni di diffusione diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC) rispettivamente a 400 V e 360 V. Regolare i guadagni del rivelatore per i canali FITC e PE rispettivamente a 450-500 V e 400-450 V.
NOTA: Strategia di gating: (a) light scatter gating (FSC vs. SSC): utilizzare FSC-A vs. SSC-A per identificare una popolazione con dispersione diretta intermedia (dimensione) e bassa dispersione laterale (granularità), che corrisponde alla regione dei linfoblasti. Si noti che questo passaggio aiuta a escludere detriti e cellule più granulari come monociti o granulociti; (b) selezione della canottiera (FSC-H vs. FSC-A): eseguire la discriminazione del doppietto mediante gating su FSC-H vs. FSC-A, che garantisce l'analisi solo degli eventi a singola cellula18. - Quantificare le cellule B-ALL CD10/CD19+ e le cellule T-ALL CD4/CD8+ contando gli eventi nel quadrante 2 (Q2; FITC/PE+) di FITC vs. Grafici PE18. Presente significa ± SEM di tre esperimenti indipendenti (n = 3).
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Risultati
Per determinare se l'attecchimento di cellule umane di ALL in embrioni di pollo in via di sviluppo ha avuto successo, sono stati amplificati i lentivirus incompetenti per la replicazione di 2a generazione portatori di mCherry e li hanno utilizzati per marcare le linee cellulari B- e T-ALL, rispettivamente SEM e MOLT316,17. Come mostrato nella Figura 1A, ~50% delle celle ALL B- (due pannelli in alto a sinistra) e T-(due pan...
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Discussione
Sono stati identificati tre passaggi critici durante lo xenotrapiantoin ovo per prevenire la contaminazione microbica e massimizzare la sopravvivenza degli embrioni di pollo: ad esempio, (1) sterilizzare la superficie del guscio d'uovo con etanolo al 70% prima di realizzare la finestra e (2) sigillare ermeticamente la finestra del guscio d'uovo con nastro adesivo per prevenire l'evaporazione del contenuto dell'embrione di pollo durante l'incubazione, e (3) l'uso dell'ago sottil...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Andrew Kung della Columbia University per aver fornito FUW-Luc-mCherry-puro. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del CIHR (PJT-174983) al KYL e dalla National Research Foundation of Korea (NRF; RS-2023-00284121) a KYL e M-YJ.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ferri da 34 g | BD Perisafe | ||
| Citometro a flusso Attune NxT | Thermo Fisher | ||
| BD Siringa Perisafe (32 G) | BD Perisafe | ||
| Albumina sierica bovina (BSA) | Millipore Sigma | Codice: A9647 | |
| Mezzo di congelamento cellulare | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12648010 | |
| Centrifuga (Allegra X-22R Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
| Guanti monouso | Royal Touch300 Guanti da esame in nitrile | ||
| Microscopio da dissezione | Leica MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Incubatrice per uova, Incubatrice rotante Vevitts 120 | Vixest Trading Co. | ||
| Alcol etilico (95%) | VWR Internazionale | BDH1158-4LP | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Soluzione di Ficoll (Ficoll?? Paque Plus) | MilliporeSigma | GE17-1440-02 | |
| Anticorpo FITC-CD10 | Santa Cruz Biotech | sc-46656 FITC | |
| Anticorpo FITC-CD4 | Santa Cruz Biotech | sc-19641 FITC | |
| Microscopio a fluorescenza | Leica Microsystems | ||
| Trapano a mano (Dremel3000) | Bosch | ||
| HEK293T | ATCC, VA, STATI UNITI | Codice CRL-3216 | |
| Emocitometro | VWR international, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina | Millipore Sigma | H3149 | |
| Provette eparinizzate | BD Vacutainer | BD 366480 | |
| Lipofectamina 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| Kit per titoli Multiplex Lentivirus (kit per titoli qPCR Lentivirus) | Abm | LV900 | |
| NH4Cl (Ammonio chloride_ | Millipore Sigma | Codice: A9434 | |
| Microscopio invertito Olympus IX71 | Olimpo | ||
| Anticorpo PE-CD19 | Santa Cruz Biotech | sc-19650 PE | |
| Anticorpo PE-CD8 | Santa Cruz Biotech | sc-1177 PE | |
| Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pipette (volume regolabile) | Eppendorf | ||
| Puromicina | Gibco, ThermoFisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Cellotape scozzese | 3M | ||
| Piastre sterili a 6 pozzetti | VWR international, Corning | 22250-140 | |
| Provette da centrifuga sterili | Axygen Inc, Corning | AXYMCT-150-C-S | |
| Palloni di coltura sterili (75T) | VWR Internazionale | 10062-872 | |
| Provette Falcon sterili (15 mL) | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Provette Falcon sterili (50 mL) | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| Filtro sterile (0,45 & micro; m filtro) | VWR Internazionale | 76778-974 | |
| Pinze sterili | VWR Internazionale | 82027-404 | |
| Vetrini sterili | VWR internazionale | 48300-031 | |
| Puntali per pipette sterili | VWR Internazionale | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Siringhe sterili | Siringa BD | 309628? | |
| Tripan Blu | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | T10282 |
Riferimenti
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