Un test delle preferenze olfattive per misurare i pregiudizi edonistici olfattivi in modelli murini di depressione

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo di un test di preferenza olfattiva che consente la valutazione dei pregiudizi olfattivi negativi verso gli stimoli olfattivi sia appetitivi che avversi in modelli murini di depressione.

Abstract

La depressione è la causa più grande della disabilità in tutto il mondo, colpendo 280 milioni di persone all'anno. Oltre alla riduzione dell'attività e della motivazione, è stato dimostrato che la depressione è associata a un bias negativo di valenza: i pazienti trovano meno piacevoli gli stimoli sensoriali neutri e positivi e più sgradevoli quelli negativi rispetto agli individui sani. In particolare, il bias edonistico olfattivo può rappresentare un marcatore di stato della malattia nei pazienti e può essere facilmente misurato in modelli murini. Tuttavia, ci sono pochissimi test sugli animali per misurare il pregiudizio emotivo in modo traslazionale. Qui proponiamo un protocollo per una valutazione affidabile dell'attribuzione di valenza odorosa di topi di controllo e depressivi-simili attraverso l'esplorazione di odoranti associati a vari valori edonici. Utilizzando questo test di preferenza olfattiva e diverse letture comportamentali, confermiamo un pregiudizio olfattivo negativo verso stimoli sia appetitivi che avversivi in due distinti modelli murini di depressione. È importante sottolineare che questo metodo è applicabile sia agli individui maschili che a quelli femminili. Infine, questo protocollo consente molteplici adattamenti per migliorare la valutazione della risposta emotiva e può essere facilmente combinato con strumenti classici per il monitoraggio in tempo reale dell'attività neuronale.

Introduzione

La depressione è un grave disturbo dell'umore e una delle principali cause di disabilità in tutto il mondo. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, circa 280 milioni di persone, ovvero il 4% della popolazione, soffrono di depressione. È il 50% più comune tra le donne che tra gli uomini e l'epidemia di COVID-19 ha aumentato del 25% la prevalenza dei disturbi depressivi nel primo anno della pandemia (Organizzazione Mondiale della Sanità, 2022). Inoltre, circa un terzo dei pazienti non risponde alle terapie antidepressive classiche, ci vogliono settimane per osservare gli effetti antidepressivi e la fisiopatologia dei disturbi dell'umore rimane in gran parte sconosciuta.

Sulla base del DSM-5¹, una diagnosi di depressione si basa su diversi sintomi, tra cui umore depresso, perdita di interesse o piacere, variazione di peso significativa, rallentamento fisico e psicologico, affaticamento, sentimenti di inutilità, difficoltà di concentrazione e pensieri ricorrenti di morte. Studi clinici hanno anche dimostrato che i disturbi dell'umore si accompagnano ad alterazioni sensoriali: i pazienti depressi trovano gli stimoli sensoriali meno piacevoli rispetto ai soggetti di controllo ^2,3,4.

La "valenza" edonistica si riferisce al grado in cui qualcosa è piacevole (valenza positiva) o avversiva (valenza negativa). L'assegnazione della valenza a uno stimolo può innescare un comportamento adattato, incluso l'approccio o l'evitamento⁵. È interessante notare che questo processo è altamente conservato tra le specie, dagli insetti all'uomo⁶. La depressione è quindi associata a una distorsione negativa della valenza. Tuttavia, la diagnosi clinica si basa ancora poco sulle valutazioni dei bias sensoriali.

Tra le modalità sensoriali, l'olfatto è particolarmente interessante in quanto gli input olfattivi bypassano in gran parte i relè talamici e proiettano al sistema limbico nei mammiferi, compreso l'uomo. Da un punto di vista evolutivo, questo sistema ha dimostrato di essere fondamentale nella codifica di un insieme di risposte primarie agli stimoli ambientali 7,8,9,10,11,12. Oltre a questi circuiti neurali condivisi, gli studi clinici rivelano una relazione bilaterale tra olfatto e depressione, con pazienti depressi che sperimentano alterazioni olfattive e disturbi olfattivi che causano sintomi depressivi¹³. Inoltre, la funzione olfattiva viene recuperata nei pazienti depressi dopo farmaci o terapia 14,15,16,17. Questi risultati suggeriscono che i deficit olfattivi potrebbero essere un biomarcatore di stato (stato delle manifestazioni cliniche nei pazienti) piuttosto che un tratto (proprietà che svolgono un ruolo antecedente, possibilmente causale, nella fisiopatologia del disturbo psichiatrico e possono quindi essere utilizzate per una diagnosi precoce e pre-sintomatica) per la malattia¹⁸. Di conseguenza, una migliore e più ampia comprensione di come la modalità olfattiva è alterata nella depressione potrebbe aprire la strada a nuovi strumenti terapeutici per la diagnosi e l'individuazione della risposta al trattamento.

Pertanto, la valutazione del bias edonistico olfattivo nei modelli di depressione sarebbe di particolare interesse, sia per valutare il fenotipo depressivo-simile indotto sia come strumento per indagare i meccanismi neurali alla base di questi cambiamenti nell'assegnazione della valenza. Studi precedenti hanno già utilizzato approcci comportamentali per valutare l'assegnazione della valenza dell'odore nei topi. Tuttavia, questi test presentano diversi avvertimenti: richiedono dispositivi sofisticati¹⁹ che coinvolgono principalmente scatole chiuse da un coperchio 19,20,21, implicano un contatto fisico costante con la soluzione di odore^20,21,22 e/o provocano tempi di esplorazione degli odori molto brevi 21,22,23. Ciò rende questi saggi incompatibili con gli strumenti classici di monitoraggio in tempo reale dell'attività neuronale che richiedono durate di campionamento più lunghe nei topi legati.

Inoltre, Malkesman et al. hanno già sviluppato il Female Urine Sniffing Test (FUST) per monitorare l'attività di ricerca della ricompensa nei roditori misurando l'indagine olfattiva di topi maschi esposti all'urina di topo femmina²⁴. Tuttavia, questo test valuta solo la risposta comportamentale a un particolare stimolo positivo di natura sociale e con tempi di interazione brevi. Inoltre, questo test è stato progettato esclusivamente per i roditori maschi, sebbene la depressione sia due volte più diffusa tra le donne che tra gli uomini.

Per superare tutte queste limitazioni, abbiamo sviluppato un test di preferenza olfattiva (OPT) adattato da Bigot et ^al.14, in cui sia i topi maschi che le femmine possono essere esposti a una grande varietà di odori neutri, positivi e negativi al fine di valutare con precisione la risposta edonistica nel contesto della depressione. La scelta degli odori può basarsi su precedenti pubblicazioni ^14,25, ma questo test consente anche di esplorare nuovi stimoli sociali, nutrizionali, legati alle infezioni, utilizzando sia componenti naturali che miscele chimiche monomolecolari o appositamente progettate.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali e di cura degli animali hanno seguito le linee guida nazionali ed europee (2010/63/UE) e sono state approvate dal Ministero della Ricerca francese (APAFiS: #16380-2018080217358599_v1; APAFIS #51636-2024101718013761_v4). I topi maschi e femmine C57BL/6JRj (modello UCMS) e i topi maschi C57BL/6NTac (modello CORT) (8 settimane di età) sono stati alloggiati socialmente (4-5 topi per gabbia) e mantenuti in condizioni standard (23 ± 1 °C; umidità 40%) con un ciclo luce/buio di 14/10 ore (luci accese alle 7 del mattino) con cibo e acqua ad libitum.

1. L'impostazione sperimentale

1. Installazione dell'arena
   1. Prepara l'allestimento sperimentale, che consiste in un'arena a due compartimenti (45 cm × 50 cm × 25 cm) realizzata con pareti in plexiglas grigio e pavimento bianco. Dividi i due scomparti (25 cm × 45 cm) da una parete in plexiglas grigio (37 cm × 25 cm).
   2. Posizionare una capsula di Petri forata (60 mm × 15 mm con 7 fori di 5 mm di diametro) sul fondo della parete da ogni scomparto.
   3. Fissare verticalmente le piastre di Petri alla parete utilizzando un adesivo biadesivo o un adesivo sensibile alla pressione (ad es. Blu-tack).
   4. Posiziona una telecamera in cima all'arena per registrare il comportamento degli animali (2 m sopra l'arena) e seguire automaticamente i loro movimenti durante l'esperimento.
2. Scelta degli odori
   1. Prima dell'esperimento, scegli un elenco di odori con valenza neutra, positiva e negativa che verranno testati (vedi Tabella 1 per esempi).
   2. Verificare che tutti gli odori scelti abbiano una pressione di vapore simile. Inoltre, valutare la diffusione in tutta l'arena per alcuni odori con un rivelatore a fotoionizzazione (PID)²⁶.
   3. Testa ogni odore in un giorno separato.
      NOTA: Si consiglia di pianificare prima l'uso di odori neutri, poi di quelli appetitivi e di terminare con gli odori avversi per ridurre al minimo gli effetti dell'esplorazione da un giorno all'altro. Questo ordine riduce al minimo gli effetti del carry-over da un giorno di test all'altro. In alternativa, si potrebbe utilizzare una presentazione casuale, ma tutti i gruppi sperimentali devono essere testati con la stessa sequenza di odori.
3. Progettazione di gruppi sperimentali
   1. Dividere i topi in almeno due gruppi sperimentali: topi di controllo e topi che subiranno il modello di depressione. Ospita gli animali dello stesso gruppo nelle stesse gabbie.
      ATTENZIONE: Ogni gruppo sperimentale dovrebbe contenere almeno circa 7-8 individui per ottenere la significatività statistica. Le gabbie devono essere localizzate nelle vicinanze della stalla per ridurre al minimo l'effetto gabbia.
   2. Indurre un fenotipo depressivo in gruppi di topi rilevanti utilizzando il modello di depressione di scelta.
      NOTA: La descrizione dei protocolli per indurre comportamenti simili alla depressione nei topi va oltre lo scopo di questo articolo. Tuttavia, questo studio presenta esperimenti che utilizzano due diversi modelli (l'Unpredictable Chronic Mild Stress [UCMS] e il Corticosterone [CORT])^27,28 come risultati rappresentativi per questo test di preferenza olfattiva. In breve, il modello UCMS si basa sull'esposizione a una varietà di diversi fattori di stress ambientale per diverse settimane, mentre il modello CORT consiste nella somministrazione cronica di corticosterone disciolto nell'acqua potabile dei topi (circa 5 mg/kg/giorno a seconda di quanto bevono i topi).

2. Fase di assuefazione

1. Assuefazione generale e manipolazione
   1. All'arrivo, lasciare i topi indisturbati per 1 settimana senza alcun cambio di lettiera. Aggiungi materiale di cotone supplementare e un igloo nella gabbia per ridurre lo stress.
   2. Dopo 1 settimana, maneggiare delicatamente tutti i topi ogni giorno per 3-4 giorni e abituarli alla manipolazione della coppa, preferibilmente nella sala sperimentale.
2. Condizioni sperimentali del test
   1. Trasferisci il mouse nella sala prove comportamentali 30 minuti prima dell'inizio dell'esperimento.
      NOTA: Idealmente, la stanza comportamentale dovrebbe includere due parti separate che consentano agli animali di stare in una parte mentre il topo testato si esibisce nell'altra.
   2. Fare attenzione che le condizioni standard dell'abitazione siano mantenute (23 ± 1 °C; umidità 40%) e che non ci siano suoni, luci o odori fastidiosi nella stanza.
   3. Utilizzando un luxmetro, imposta l'illuminazione a circa 40 lux nell'arena. Assicurarsi che l'illuminazione sia omogenea nell'arena.
3. Assuefazione all'arena
   1. Aggiungere una carta da filtro pulita (42,5 mm) in entrambe le piastre di Petri (60 mm × 15 mm).
   2. Usa del nastro adesivo trasparente per attaccare il coperchio della capsula di Petri al suo fondo (perché sarà posizionato verticalmente).
   3. Il primo giorno, posiziona delicatamente tutti i topi della stessa gabbia di alloggiamento insieme nell'arena per 10 minuti per ridurre la neofobia.
      ATTENZIONE: Posizionare sempre i topi nell'arena maneggiando la tazza per evitare lo stress dovuto al sollevamento per la coda.
   4. Il giorno successivo, introduci ogni topo individualmente nell'arena, proprio tra i due scomparti, e registra il comportamento per 10 minuti.
   5. Ripetere per 2-3 giorni di seguito.
4. Criterio di esplorazione
   1. Definisci le due aree (25 cm 15 cm) in cui sono state posizionate le piastre di Petri e misura il tempo che ogni animale trascorre in ciascuna zona.
   2. Calcola la media di queste misure attraverso tutti i singoli passaggi di assuefazione.
   3. Se il tempo medio trascorso in ciascuna delle zone è superiore a 50 s, il criterio è soddisfatto. In caso contrario, ripetere le sessioni di assuefazione fino a raggiungere il criterio, oppure escludere l'animale dall'analisi.
      NOTA: È possibile eseguire un massimo di due sessioni di assuefazione al giorno (mattina e pomeriggio).

3. Fase di collaudo

1. Preparazione dell'odore
   1. Il giorno del test, preparare l'odore con la corretta diluizione sotto una cappa chimica. Diluire l'odore in olio minerale o acqua distillata, a seconda della struttura chimica. Per evitare la contaminazione, conservare l'olio minerale in una stanza separata e ventilata, lontano dagli odori.
      NOTA: Si consiglia l'uso di una nuova bottiglia di olio minerale quando si inizia un nuovo esperimento.
   2. Conservare la soluzione odorizzante in una fiala di vetro. Evitare contenitori di tubi di plastica che potrebbero aggiungere contaminazione da odori.
   3. Poco prima di eseguire il test su ciascun topo, raccogliere 200 μl della soluzione odorosa con una micropipetta utilizzando i puntali filtranti e posizionarli sulla carta da filtro in una delle due piastre di Petri.
   4. Lasciare intatta l'altra carta da filtro nella seconda capsula di Petri.
   5. Trasferisci le piastre di Petri nella sala prove e fissale verticalmente alla parete dell'arena.
      ATTENZIONE: Non preparare e gettare via le soluzioni odorizzanti nella sala sperimentale per evitare la contaminazione degli odori. Cambiare regolarmente i guanti durante l'esperimento. Se si sospetta che i guanti possano essere contaminati durante la manipolazione degli odori, cambiarli prima di afferrare i topi per il test.
2. Test comportamentale
   1. Posiziona ogni mouse individualmente nell'arena, proprio tra i due scomparti.
   2. Registrare per 10 min.
   3. Rimuovi il mouse dall'arena.
   4. Rimuovere la capsula di Petri odore.
   5. Pulisci l'arena con una soluzione disinfettante (ad es. etanolo al 70%) e asciugala.
   6. Butta via la carta da filtro e ripeti la preparazione degli odori per il prossimo topo.
   7. Idealmente, prova solo un odore al giorno. Utilizzare preferenzialmente prima gli odori neutri, poi gli odori positivi e infine gli odori negativi (vedi Figura 1).
      ATTENZIONE: Condurre sia le fasi di assuefazione che quelle di test approssimativamente alla stessa ora del giorno durante i giorni dell'esperimento (idealmente tra le 9 e le 15). Se il numero di animali richiede un periodo di tempo più lungo, prestare attenzione a testare diversi gruppi sperimentali in modo alternato per evitare qualsiasi distorsione diurna. Se maschi e femmine devono essere testati nello stesso esperimento, preferire testare un sesso dopo l'altro.
      NOTA: Utilizzare piastre di Petri pulite ogni giorno del test per evitare la contaminazione degli odori. Da notare che le piastre di Petri perforate possono essere riutilizzate per diversi esperimenti dopo un'adeguata pulizia e decontaminazione degli odori.

4. Analisi dei dati

1. Monitoraggio del comportamento
   1. Utilizza un programma di tracciamento automatico per registrare la posizione del mouse durante i test.
   2. Definire zone separate nell'arena per l'analisi (vedere la Figura 1):
      1. Definisci una "zona di odore" (25 cm × 15 cm), l'area in cui viene posizionata la piastra di Petri con la carta da filtro imbevuta dell'odore (cioè l'area più vicina all'odore che rappresenta circa un terzo del compartimento superficiale).
      2. Definire una "zona di controllo" (25 cm × 15 cm), simmetrica alla "zona dell'odore", ma senza alcun odore aggiunto nella capsula di Petri.
      3. Definisci una "zona dietro l'odore" (25 cm × 30 cm), cioè il resto dello scomparto è dove è posizionata la capsula di Petri per gli odori.
      4. Definire una "zona dietro il controllo" (25 cm × 30 cm), simmetrica alla "zona dietro il controllo", costituita dal resto del vano antiodore.
         NOTA: Il tracciamento del punto centrale del corpo del topo è sufficiente per analizzare la preferenza olfattiva dell'animale. Tuttavia, tracciare il naso di ciascun topo in modo specifico può illustrare in modo più preciso l'indagine olfattiva da parte dell'animale.
2. Letture della risposta edonica
   1. Utilizzando il tracciamento automatico, raccogli le seguenti informazioni per ogni mouse e ogni giorno del test, comprese le fasi di assuefazione:
      1. Registra la distanza totale percorsa nell'arena (m).
      2. Registra il tempo trascorso in ogni zona dell'arena.
      3. Registra il numero di ingressi in ogni zona dell'arena.
   2. Utilizzare la distanza totale percorsa per valutare i principali effetti locomotori.
   3. Per valutare le differenze nelle preferenze olfattive nei confronti dei vari odori, utilizzare le letture principali:
      1. Usa il tempo trascorso nella zona degli odori.
      2. Utilizzare il numero di voci nella zona degli odori.
      3. Utilizzare un indice di preferenza, calcolato come il tempo trascorso nella zona dell'odore normalizzato al tempo trascorso in questa zona durante l'assuefazione (la normalizzazione viene eseguita sui topi di tutti i gruppi). La media si riferisce alla media aritmetica del tempo trascorso nella zona dell'odore e sd si riferisce alla sua deviazione standard.
         
      4. Utilizzare un indice di esplorazione degli odori, calcolato come la media dei valori normalizzati della distanza percorsa, del tempo trascorso nella zona degli odori e del numero di voci nella zona degli odori, come segue:
         
         
         NOTA: Questo indice di preferenza può essere adattato se necessario, ad esempio confrontando i tempi trascorsi nella zona di odore rispetto a quella di controllo. Se i gruppi mostrano differenze significative nella loro esplorazione della "zona dell'odore" durante l'assuefazione, la normalizzazione può essere eseguita solo rispetto al gruppo di controllo, piuttosto che a tutti i gruppi combinati.
   4. Rappresentare visivamente queste letture per topi di controllo e simili alla depressione come media ± errore standard della media (SEM).
   5. Utilizzare l'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) a misure ripetute seguita da test post hoc (qui test della differenza meno significativa di Fisher non corretta) per tenere conto sia dei gruppi sperimentali, degli odori (fattore di misura ripetuto) e dei fattori di effetto dell'interazione. Il fattore di interazione indica se le differenze tra i gruppi sono coerenti in tutti gli odori presentati.
   6. Verificare la normalità e l'omoschedasticità utilizzando test adattati (test di Shapiro-Wilk, test di Bartlett). La significatività statistica è stata fissata a *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Risultati

Per verificare che i topi depressivi presentino un bias olfattivo negativo^14,29 e che possa essere misurato in modo affidabile utilizzando il protocollo del test di preferenza olfattiva che descriviamo qui, abbiamo valutato la risposta edonica a diversi odori in due distinti modelli murini di depressione.

In primo luogo, abbiamo utilizzato un modello murino di stress cronico lieve imprevedibile (UCMS) della durata di 4 settimane adattato da²⁸ (vedi File supplementare 1 per il protocollo dettagliato) per indurre un fenotipo depressivo in giovani topi femmina C57BL/6JRj (Figura 2A, B). Queste femmine di topo sono state testate nel test di preferenza olfattiva con urina di topo maschio (MU, pura) come odore appetitoso e 2,4,5-trimetiltiazolo (TMT, 5% in olio minerale) come odore avverso. In media, ogni topo ha trascorso almeno 50 secondi sia nella zona di "controllo" che in quella di "odore" durante l'assuefazione, soddisfacendo il criterio (Figura 2C). Tuttavia, attraverso l'assuefazione, i topi UCMS hanno trascorso molto più tempo nella "zona di controllo" rispetto ai controlli, ma poiché non vi è alcuna differenza significativa per quanto riguarda la zona in cui verrà aggiunto l'odore, questa differenza può essere ignorata. Per quanto riguarda la distanza, i topi di controllo si sono mossi significativamente di più rispetto all'UCMS quando esposti a MU, ma non durante l'assuefazione o in presenza di TMT (Figura 2D). Infine, tutte le letture della risposta edonica (tempo trascorso nella zona dell'odore, numero di ingressi nella zona dell'odore e indice di preferenza) mostrano differenze significative o una tendenza statistica tra le femmine di controllo e UCMS (Figura 2E-G). Questo effetto è visibile anche attraverso l'indice globale di esplorazione degli odori, che è una misura combinata della risposta edonica e locomotoria (Figura 2H). Coerentemente, ogni lettura dimostra quindi un pregiudizio edonistico negativo in risposta a stimoli olfattivi sia appetitivi che avversivi. È interessante notare che il punteggio di emotività, che è calcolato come valore normalizzato del fenotipo ansioso e depressivo sulla base di un'ampia batteria di test comportamentali¹⁴, è correlato positivamente con l'indice di esplorazione degli odori sia di MU che di TMT (Figura 2I), mostrando una relazione tra la risposta comportamentale agli odori positivi e negativi e il fenotipo ansioso e depressivo.

In secondo luogo, questa volta abbiamo utilizzato lo stesso protocollo UCMS per indurre un fenotipo depressivo nei topi maschi. Durante il test delle preferenze olfattive, questi topi sono stati esposti all'urina di topo femmina (FU, pura), che è appetitiva, e al TMT come in precedenza, come odore negativo (Figura 3A, B). Non vi è alcuna differenza nel tempo trascorso nelle quattro zone durante l'assuefazione, né nella distanza percorsa attraverso il test (Figura 3C, D). Il tempo trascorso nella zona dell'odore mostra una riduzione significativa dell'esplorazione di FU e TMT nell'UCMS rispetto ai controlli (Figura 3E). Inoltre, i topi UCMS entrano significativamente meno nella zona dell'odore, o tendono a farlo, e presentano un indice di preferenza significativamente ridotto sia per FU che per TMT (Figura 3F, G), confermando un bias olfattivo negativo in uno stato depressivo-simile. Allo stesso modo, l'indice di esplorazione degli odori mostra una risposta comportamentale negativa a FU e TMT dei topi UCMS rispetto ai controlli (Figura 3H), che tendono ad essere correlati positivamente con il punteggio di emotività degli animali (Figura 3I).

In un terzo esperimento, abbiamo fatto ricorso a un altro modello di depressione che si basa sulla somministrazione cronica di corticosterone (CORT) nell'acqua potabile di topi maschi C57BL/6NTac, mentre i topi di controllo ricevono solo la soluzione del veicolo (Veh) (10% 2-idrossipropil-beta-ciclodestrina) ²⁷. Dopo quattro settimane di trattamento con CORT o Veh, i topi sono stati abituati per quattro giorni e poi esposti a un odore neutro (OCT: 2-trans ottenne, 1% in acqua), un odore positivo (PO: olio di arachidi) e un odore negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazolo, 5% in olio minerale) (Figura 4A, B). Attraverso l'assuefazione, non c'erano differenze tra Veh e CORT (Figura 4C). Tuttavia, entrambi i gruppi hanno trascorso molto più tempo nella "zona degli odori" rispetto alla "zona di controllo". Non ci sono differenze per la distanza percorsa, ad eccezione dell'odore positivo (PO) per il quale i topi Veh si sono mossi più del CORT (Figura 4D). È importante sottolineare che, come per i topi UCMS, il tempo trascorso nella zona dell'odore è stato significativamente ridotto per i topi CORT quando esposti a un odore neutro e appetitoso (Figura 4E). La riduzione dell'esplorazione degli odori è visibile anche attraverso una riduzione significativa o una tendenza a un numero inferiore di ingressi nella zona degli odori (Figura 4F). In questo caso, le differenze tra i gruppi vengono rivelate a seconda della lettura analizzata, probabilmente a causa delle limitazioni legate al numero di animali utilizzati e di un potenziale effetto pavimento causato dal basso tempo di esplorazione osservato dopo l'esposizione al TMT. Nel complesso, l'indice di preferenza è significativamente più basso nei topi CORT per tutti gli stimoli olfattivi rispetto a Veh (Figura 4H). Infine, l'indice di esplorazione degli odori per tutti gli odori è significativamente correlato con il punteggio di emotività degli animali (Figura 4I), dimostrando ancora una volta che questo test di preferenza olfattiva è uno strumento adatto per valutare il bias emotivo negativo in diversi modelli murini di depressione.

Infine, possiamo escludere la possibilità che le differenze osservate possano essere causate da una riduzione dell'attività locomotoria, piuttosto che da pregiudizi emotivi. Infatti, la locomozione non differisce tra i gruppi durante l'assuefazione quando si valuta la distanza totale percorsa (Figura 2D, Figura 3D, Figura 4D). Inoltre, sulla base dell'analisi statistica, anche una riduzione generale del coinvolgimento dei compiti o un effetto novità non possono spiegare questi pregiudizi. Infatti, abbiamo riscontrato un effetto significativo del fattore odoroso nell'analisi dell'indice di preferenza, senza alcuna interazione significativa tra gruppi sperimentali e odori. Questi risultati dimostrano che i topi depressivi svolgono effettivamente il compito e che la loro ridotta esplorazione è specifica per ogni segnale olfattivo.

Figura 1: Schema generale della sequenza temporale e impostazione del test di preferenza olfattiva. I topi si abituano per la prima volta all'arena. Il primo giorno di assuefazione, i topi della stessa gabbia di stabulazione vengono messi insieme per ridurre la neofobia. Il giorno successivo, vengono inseriti individualmente nell'arena. Dopo l'assuefazione, un odore viene aggiunto a una delle camere. Gli odori neutri vengono testati preferenzialmente per primi, seguiti dagli odori positivi e infine dagli odori negativi. Per l'analisi, l'arena può essere divisa in quattro diverse zone. Creato con Biorender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Bias olfattivo negativo in un modello murino femminile di depressione dell'UCMS. (A,B) Cronologia e gruppi sperimentali dello studio: I topi femmina di controllo e UCMS (Unpredictable Chronic Mild Stress) vengono testati nel Test di preferenza olfattiva con un odore positivo (MU: urina di topo maschio, pura) e negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazolo, 5% in olio minerale). Creato con Biorender. (C) I topi UCMS hanno trascorso in media molto più tempo nella "zona di controllo" e meno tempo nella "zona dietro l'odore" rispetto ai controlli durante l'assuefazione (Gruppo: F(1, 12) = 74,03, p < 0,0001; Zona: F(2,434, 29,21) = 7,688, p = 0,0012; Interazione: F(3, 36) = 5,148, p = 0,0046). (D) La distanza totale percorsa in UCMS quando esposta a MU, ma non per Habituation (Hab) e TMT (Gruppo: F(1, 12) = 4,664, p = 0,0518; Odore: F(1,871, 22,45) = 4,846, p = 0,0195; Interazione: F(2, 24) = 4,797, p = 0,0177). (E) I topi UCMS hanno trascorso molto meno tempo ad esplorare MU e TMT (Gruppo: F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Odore: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Interazione: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (F) I topi UCMS sono entrati meno della zona di odore o tendevano a (Gruppo: F(1, 12) = 9,279, p = 0,0102; Odore: F(1, 12) = 5,100, p = 0,0433; Interazione: F(1, 12) = 1,649, p = 0,2233). (G) L'indice di preferenza per MU e TMT è significativamente ridotto nei topi UCMS (Gruppo: F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Odore: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Interazione: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (H) L'indice di esplorazione degli odori per MU e TMT è significativamente ridotto nei topi UCMS (F(1, 12) = 14,71, p = 0,0024; Odore: F(1, 12) = 0, p > 0,9999; Interazione: F(1, 12) = 0,02630, p = 0,8739). (I) L'indice di esplorazione degli odori per MU e TMT è entrambi correlati positivamente con il punteggio di emotività degli animali (MU: Pearson R² = 0,4837, F(1,12) = 11,24, **p = 0,0058; TMT: Pearson R² = 0,5340, F(1,12) = 13,75, **p = 0,0030). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Bias olfattivo negativo in un modello murino maschile di depressione UCMS. (A,B) Cronologia e gruppi sperimentali dello studio: i topi maschi di controllo e UCMS sono testati nel test di preferenza olfattiva con un odore positivo (FU: urina di topo femmina, pura) e negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazolo, 5% in olio minerale). Creato con Biorender. (C) Non ci sono differenze in media nel tempo trascorso nelle diverse zone dell'arena attraverso l'abitudine (Gruppo: F(1, 13) = 3,921, p = 0,0693; Zoner = F(1,688, 21,94) = 34,57, p < 0,0001; Interazione: F(3, 39) = 0,7385, p = 0,5355). (D) Non ci sono differenze nella distanza totale percorsa tra i controlli e l'UCMS (Gruppo: F(1, 13) = 2,313, p = 0,1522; Odore: F(1,722, 22,38) = 1,746, p = 0,1998; Interazione: F(2, 26) = 0,8806, p = 0,4266). (E) Il tempo trascorso ad esplorare la zona dell'odore con FU e TMT è significativamente ridotto nei topi UCMS (Gruppo: F(1, 13) = 6,808, p = 0,0216; Odore: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Interazione: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753). (F) I topi UCMS sono entrati significativamente meno volte nella zona dell'odore per TMT e tendevano a farlo per FU (Gruppo: F(1, 13) = 6,572, p = 0,0236; Odore: F(1, 13) = 3,784, p = 0,0737; Interazione: F(1, 13) = 0,2145, p = 0,6509). (G) L'indice di preferenza dei topi UCMS è significativamente ridotto per FU e TMT (Gruppo: F(1,13 ) = 6,808, p = 0,0216; Odore: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Interazione: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753); (H) L'indice di esplorazione degli odori dell'UCMS è significativamente ridotto per entrambi gli odori (Gruppo: F(1, 13) = 12,42, p = 0,0037; Odore: F(1, 13) = 0,002580, p = 0,9603; Interazione: F(1, 13) = 0,5804, p = 0,4598). (I) L'indice di esplorazione degli odori per FU e TMT tende ad essere correlato positivamente con il punteggio di emotività degli animali (FU: Pearson R² = 0,2573, F(1, 13) = 4,504, p = 0,0536; TMT: Pearson R² = 0,2266, F(1, 13) = 3,809, p = 0,0729). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Bias olfattivo negativo in un modello murino maschio CORT di depressione. (A,B) Cronologia e gruppi sperimentali dello studio: I topi maschi Veh e CORT sono testati nel test di preferenza olfattiva con un odore neutro (OCT: trans-2-ottale, 1% in acqua), positivo (PO: olio di arachidi, puro) e negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazolo, 5% in olio minerale). Ai topi Veh e CORT vengono somministrati rispettivamente la soluzione Vehicle e Vehicle + Corticosterone durante l'intera durata dell'esperimento. Creato con Biorender. (C) Tempo medio trascorso nelle diverse zone dell'arena durante l'assuefazione (Gruppo: F(1, 10) = 0,07588, p = 0,7886; Zona: F(2,224, 22,24) = 6,939, p = 0,0036; Interazione: F(3, 30) = 0,7033, p = 0,5575). (D) Distanza totale percorsa durante la prova di assuefazione (Hab) e i diversi odori (Gruppo: F(1, 10) = 4,193, p = 0,0678; Odore: F(3, 30) = 11,80, p < 0,0001; Interazione: F(3, 30) = 1,489, p = 0,2375). (E) I topi CORT trascorrono meno tempo nella zona dell'odore rispetto a Veh per OCT e PO (Gruppo: F(1, 10) = 5,094, p = 0,0476; Odore: F(2, 20) = 28,87, p < 0,0001; Interazione: F(2, 20) = 3,841, p = 0,0388). (F) I topi CORT entrano meno volte nella zona dell'odore o tendeva rispetto a Veh (Gruppo: F(1, 10) = 6,832, p = 0,0259; Odore: F(2, 20) = 2,738, p = 0,0889; Interazione: F(2, 20) = 0,2902, p = 0,7512). (G) I qmice CORT mostrano un indice di preferenza più basso per OCT e PO (Gruppo: F(1, 10) = 5,895, p = 0,0356; Odore: F(2, 20) = 20,83, p < 0,0001; Interazione: F(2, 20) = 1,437, p = 0,2611). (H) L'indice di esplorazione degli odori è significativamente ridotto nei topi UCMS per tutti gli odori (Gruppo: F(1, 10) = 12,35, p = 0,0056; Odore: F(2, 20) = 0,04381, p = 0,9572; Interazione: F(2, 20) = 0,3622, p = 0,7006). (I) L'indice di esplorazione degli odori per ciascun odore è correlato positivamente con il punteggio di emotività degli animali (OCT: Pearson R² = 0,5601, F(1, 10) = 12,73, **p = 0,0051; PO: Pearson R² = 0,4495, F(1, 10) = 8,165, *p = 0,0170; TMT: Pearson R² = 0,5061, F(1, 10) = 10,25, **p = 0,0095). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome	Abbreviazione	Diluizione	Valenza
2,4,5-trimetiltiazolo	Catalogo TMT	5% in olio minerale	Negativo
2-trans-ottenali	OTTOBRE	1% in acqua	Neutrale
Urina di topo femmina	FU	Puro	Positivo
Urina di topo maschio	MU	Puro	Positivo
Olio di arachidi	PO	Puro	Positivo

Tabella 1: Esempi di odori con valenza neutra, positiva e negativa.

File supplementare 1: Protocollo per lo stress cronico lieve imprevedibile di 4 settimane. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Il pregiudizio emotivo negativo è una delle principali caratteristiche dei disturbi depressivi ed è di particolare interesse per comprendere meglio la fisiopatologia della malattia. È quindi cruciale sia includere la valutazione dei bias sensoriali in modelli preclinici per migliorare la caratterizzazione del fenotipo depressivo-simile sia indagare quali meccanismi biologici sono alla base dell'elaborazione emotiva e delle sue alterazioni in condizioni patologiche. Inoltre, l'olfatto è un senso di scelta per studiare i pregiudizi emotivi. Da una prospettiva traslazionale, è etologicamente rilevante valutare l'elaborazione emotiva sia nei topi che nell'uomo. Inoltre, i sistemi olfattivi ed emotivi sono altamente intrecciati e condividono strutture neuronali comuni durante l'evoluzione. Esiste una forte relazione reciproca tra l'olfatto alterato e la depressione¹⁰, che rende l'olfatto uno strumento promettente e potente da utilizzare per la diagnosi e la risposta al trattamento, nonché nella ricerca di base.

Qui, abbiamo sviluppato un protocollo per un test di preferenza olfattiva per valutare i pregiudizi emotivi olfattivi in due modelli murini di depressione. È importante sottolineare che questo metodo consente di valutare la risposta a una grande varietà di stimoli con valenza variabile, sia positiva che negativa, nonché a stimoli neutri che potrebbero essere modificati di valore in condizioni patologiche. Questi stimoli successivi non sono obbligatori per la validità del test, ma possono apportare interessanti informazioni aggiuntive all'esperimento. Questo test consente anche di valutare la scalabilità della risposta utilizzando diverse concentrazioni di odore. Valutare la risposta a stimoli con diversi valori edonistici e separare l'elaborazione emotiva positiva da quella negativa nel contesto della depressione è fondamentale. Infatti, i risultati preclinici indicano che il trattamento antidepressivo potrebbe non ripristinare uniformemente l'elaborazione olfattiva ugualmente positiva e negativa¹⁴. L'esplorazione spontanea di stimoli olfattivi appetitivi o avversivi intrinsecamente salienti previene anche i fattori confondenti da deficit cognitivi o motivazionali associati a stati depressivi^30,31. Pertanto, questo protocollo non richiede lunghe fasi di apprendimento, il che ha vantaggi tecnici. È importante notare che entrambi i modelli utilizzati in questo studio si basano su interventi effettuati in età adulta, quindi saranno necessari esperimenti futuri per valutare se questo protocollo è sensibile anche alla valutazione di altri fattori di rischio di depressione, comprese le avversità della prima infanzia.

È importante sottolineare che questo protocollo è applicabile sia agli individui maschili che a quelli femminili, il che è fondamentale in quanto le donne hanno il doppio delle probabilità di essere colpite dalla depressione rispetto agli uomini. Tuttavia, è probabile che gli uomini abbiano una diagnosi insufficiente di depressione a causa di aspettative sociali, vergogna o stigma, come esaminato in Shi et ^al.32. Tuttavia, la depressione sembra differire tra uomini e donne, in termini di sintomatologia (manifestazioni cliniche), eziologia (cause biologiche) e predittività del trattamento 33,34,35, ma molti modelli e test di depressione sono ancora principalmente progettati solo per soggetti maschili. Ad esempio, il test standard di sniffing delle urine femminili²⁴ utilizza un protocollo simile ma si basa su un segnale di odore sociale unico. Sebbene molto informativo, questo test si traduce in un breve tempo di esplorazione (30 s nei controlli) ed è principalmente adattato ai topi maschi poiché l'urina femminile non ha lo stesso significato etologico ed edonistico per entrambi i sessi. Infine, sembra che la risposta edonistica olfattiva sia sensibile al trattamento antidepressivo¹⁴, rendendo il nostro test uno strumento di scelta per caratterizzare in modo affidabile gli stati depressivi, sostituendo altri test controversi come il test di nuoto forzato 36,37,38.

È importante sottolineare che il test si traduce in tempi di esplorazione dello stimolo più lunghi (100-200 s) rispetto ai test precedentemente descritti 21,22,23. L'aumento della durata dell'esplorazione è particolarmente importante quando questo test è combinato con tecniche di monitoraggio in tempo reale dell'attività neuronale, ad esempio. Inoltre, questo test non richiede privazione di cibo/acqua, evitando fattori di confusione metabolica. Infine, questo test può essere eseguito durante il periodo di luce, riducendo i vincoli sperimentali (ciclo inverso, registrazioni all'infrarosso).

Tuttavia, per eseguire con successo questo protocollo, alcuni passaggi tecnici sono fondamentali. Innanzitutto, è fondamentale che gli esperimenti vengano eseguiti in un ambiente molto controllato e non stressante: l'illuminazione deve essere omogenea e non troppo intensa, e non devono esserci suoni o odori fastidiosi nella stanza. I topi possono essere testati nell'arena una volta al giorno e il test deve essere eseguito all'incirca alla stessa ora ogni giorno. Inoltre, si consiglia uno sperimentatore unico durante l'esecuzione di questi esperimenti per ridurre lo stress degli animali.

In secondo luogo, deve essere garantita un'esplorazione sufficiente dell'arena durante i giorni di assuefazione. Se un topo trascorre in media meno di 50 secondi in una qualsiasi delle zone in cui vengono posizionate le piastre di Petri durante l'assuefazione, è possibile aggiungere uno o due giorni supplementari di assuefazione prima di testare gli odori. Se il topo non sta ancora esplorando l'arena abbastanza a lungo, dovrebbe essere escluso dall'analisi. In caso di esplorazione iniziale dissimmetrica della "zona dell'odore" durante l'assuefazione tra gruppi sperimentali, il calcolo dell'indice di preferenza può essere adattato per correggere le distorsioni differenziali di preferenza spontanea, ad esempio normalizzando il tempo trascorso durante l'assuefazione rispetto a ciascun gruppo, o anche rispetto alla propria esplorazione durante l'assuefazione. In effetti, un'altra difficoltà può essere l'elevata variabilità tra i gruppi sperimentali. Se il problema si presenta, per limitare la variabilità intra-individuale, i topi possono essere testati per due giorni consecutivi con lo stesso odore. I risultati possono quindi essere mediati tra i due giorni. È importante sottolineare che il test consecutivo della risposta olfattiva non dovrebbe influenzare in modo significativo il comportamento esplorativo¹⁴.

Per quanto riguarda la preparazione degli odori, le soluzioni devono essere preparate in una stanza diversa da quella del test e gli sperimentatori devono essere consapevoli che la soluzione non si diffonde eccessivamente nella stanza comportamentale. Infine, le soluzioni devono essere preferibilmente preparate poco prima del test e conservate in una fiala di vetro inodore in modo che l'odore non svanisca o venga contaminato. Per alcuni odori come l'urina di topo maschio e femmina che sono presumibilmente molto appetibili, se i topi di controllo non presentano letture di esplorazione associate a valenza altamente positiva, la soluzione deve essere controllata. In particolare, l'urina di topo deve essere raccolta di fresco da topi giovani (massimo 5 mesi di età) poco prima del test (massimo 2-3 giorni prima) e conservata a 4 °C per preservarne le proprietà olfattive. Da notare che la raccolta da più giorni consecutivi dovrebbe prevenire gli effetti dovuti alle fasi del ciclo estrale nei topi femmina. Se necessario, l'urina può essere mantenuta a -20 °C per una conservazione a lungo termine, anche se questa procedura non è raccomandata in quanto riduce sensibilmente l'intensità dell'odore. Allo stesso modo, anche la piacevolezza percepita dell'olio di arachidi può essere variabile, ad esempio a seconda del lotto o della marca. È importante sottolineare che è possibile aggiungere due odori distinti o odori con concentrazioni diverse negli scomparti, invece della "zona di controllo" non odorizzante, per misurare la preferenza tra due soluzioni odorizzanti.

Infine, il test delle preferenze olfattive può essere adattato in vari modi per migliorarne il design e ampliarne le potenziali applicazioni. Infatti, oltre alla lettura motoria, la valutazione della risposta emotiva attraverso questo test potrebbe essere migliorata combinando diverse tecniche per misurare varie componenti delle emozioni⁶. Ad esempio, un microfono a ultrasuoni può essere posizionato accanto all'arena per registrare vocalizzazioni ultrasoniche, che possono essere emesse in risposta a determinati stimoli positivi e negativi^24,39. La temperatura corporea può anche essere monitorata utilizzando una telecamera a infrarossi o un trasmettitore di telemetria in tempo reale impiantabile 40,41,42. Alcuni di questi trasmettitori sono anche in grado di accedere alle frequenze cardiache e respiratorie 43,44,45. La combinazione di questi strumenti aiuterebbe a costruire una valutazione comportamentale più raffinata della risposta emotiva. Il test delle preferenze olfattive può anche essere facilmente abbinato ad altre tecniche per chiarire ulteriormente i meccanismi neuronali alla base della disregolazione emotiva, come l'optogenetica, la fotometria delle fibre o l'imaging dal vivo con mini-scope o le registrazioni elettrofisiologiche in vivo. Infine, questo protocollo può essere facilmente tradotto in clinica integrando la valutazione dei bias sensoriali e della risposta olfattiva edonica nella ricerca umana e anche come strumento diagnostico o di risposta al trattamento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2,4,5-trimetiltiazolo	Sigma-Aldrich	W332518-100G-K
2-trans ottanale	Sigma-Aldrich	52464-1ML
Blu-tack	UHU	N/A
Carta da filtro	Fisher Scientifico	11710125	42,5 millimetri
Fiala di vetro	DUTSCHER DOMINIQUE	958983
Olio minerale	Sigma-Aldrich	M5904-500ML
Noldus Ethovision	Noldus Ethovision	Versione 17.5	In alternativa, è possibile utilizzare Single Mouse Tracker nel software open source ICY o Deeplabcut
Petri	Falcone	351007	Piastra Petri da 60 mm x 15 mm con 7 fori su misura di 5 mm di diametro
Arena in plexiglas	Su misura	N/A	Arena in plexiglas di 45 cm x 50 cm x 25 cm divisa in due camere da una parete centrale di 37 cm x 25 cm.