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Articolo metodologico

Generazione di co-colture di sferoidi epiteliali-fibroblasti umani normali fluttuanti

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DOI:

10.3791/68440

⸱

3 luglio 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cell Biology (Cancer Research), Medical Faculty, University of Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo semplice e molto pratico ma affidabile per la co-coltivazione diretta di cellule epiteliali polmonari umane e fibroblasti senza fare affidamento su una matrice.

Abstract

I sistemi di coltura tridimensionali (3D) sono diventati sempre più popolari grazie alla loro capacità di riprodurre le proprietà e le architetture cellulari naturali, imitando così le strutture simili ai tessuti in vitro. Tra questi modelli, la coltura di aggregati cellulari sferici (i cosiddetti sferoidi) incorporati in una matrice extracellulare semisolida (ECM) rappresenta un modello avanzato di coltura cellulare quasi in vivo , in quanto consente diversi stati funzionali cellulari come risultato delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM, nonché dei gradienti di ossigeno e nutrienti. Poiché gli sferoidi sono tecnicamente meno impegnativi e relativamente economici da ottenere, sono spesso utilizzati nello screening dei farmaci e nei test di tossicità, consentendo uno screening ad alto contenuto per testare nuovi farmaci nella fase preclinica. A tale scopo, vengono prevalentemente ricreate le strutture 3D di vari tumori. Allo stesso tempo, Matrigel è attualmente una delle ECM più utilizzate ed è considerato il gold standard nella coltivazione di sferoidi e organoidi, sebbene si tratti di una matrice 3D basata su esperimenti sui topi, la cui estrazione - come i test sugli animali in generale - è associata a importanti preoccupazioni etiche. Qui, presentiamo un protocollo senza matrice per la co-coltivazione diretta di cellule epiteliali bronchiali umane e fibroblasti, che può essere considerato come un metodo di co-coltivazione ottimizzato, in particolare per quanto riguarda la comunicazione epitelio-fibroblasto e le interazioni all'interno dei rispettivi sferoidi, senza fare affidamento su una matrice di portatori (su base animale). Stabilendo queste co-colture di sferoidi epiteliali-fibroblastoidi fluttuanti come piattaforma in vitro orientata al paziente per modellare le normali tossicità tissutali (polmonari) degli approcci terapeutici contro il cancro, non solo si può ottenere una riduzione del numero di animali da esperimento, ma anche una sostituzione adeguata e significativa dei corrispondenti esperimenti sugli animali.

Introduzione

Le colture cellulari bidimensionali (2D), in cui le cellule monostrato piatte vengono coltivate, espanse e quindi piastrate per saggi di ricerca basati su cellule, rimangono un metodo semplice, conveniente, economico e ampiamente utilizzato per le procedure di screening preclinico standard 1,2. Per studiare il crosstalk interattivo (paracrino) tra vari tipi di cellule in vitro, è possibile utilizzare un mezzo condizionato da un tipo di cellula per la stimolazione di un altro tipo di cellula. Inoltre, sono emersi vari metodi di co-coltura, ad esempio metodi indiretti, quando le cellule co-coltivate vengono fisicamente separate utilizzando una membrana microporosa. Questi "sistemi Transwell" includono un inserto (la membrana microporosa) che viene inserito in una tradizionale piastra di coltura cellulare 2D. Un tipo di cellula viene quindi seminato e coltivato sulla membrana, condividendo lo stesso terreno dell'altro tipo che cresce sul pozzo del compagno, consentendo così comunicazioni paracrine bidirezionali2. I due tipi di cellule potrebbero anche essere seminati sui due lati della membrana, formando più di una co-coltura diretta da cellula a cellula, che è adatta per studiare i tessuti strutturati a barriera 3,4.

Tuttavia, le risposte cellulari di questi sistemi di coltura cellulare 2D, anche avanzati, non sempre riflettono i risultati dei corrispondenti esperimenti sugli animali e persino degli studi clinici, il che è dovuto, tra l'altro, alla mancanza di segnalazione diretta tra i diversi tipi di cellule e quindi alla mancanza di organizzazioni cellulari simili in vivo. Pertanto, i sistemi di coltura tridimensionali (3D) sono diventati sempre più popolari a causa delle capacità delle caratteristiche e delle architetture cellulari naturali che imitano le strutture simili ai tessuti in vitro 5,6. Tra questi modelli, la coltura di aggregati cellulari sferici, denominati sferoidi, incorporati in matrici extracellulari semisolide fornisce un modello di co-coltura cellulare più avanzato in cui è possibile ottenere diversi stati cellulari funzionali che seguono interazioni cellula-cellula e cellula-ECM, nonché gradienti di ossigeno e nutrizione7. Queste colture in vitro in vivo, più complesse, dovrebbero essere generate e mantenute omogenee per quanto riguarda le dimensioni dell'assemblaggio cellulare, promuovendo al contempo lo sviluppo e la differenziazione cellulare, pur essendo efficaci, rapide, coerenti e convenienti 7,8.

Utilizzando le caratteristiche naturali di autoaggregazione e adesione, gli sferoidi (principalmente sferoidi tumorali) vengono solitamente generati utilizzando la tecnica della goccia sospesa 9,10. Essendo una delle prime tecniche utilizzate per generare corpi embrionali, il saggio della goccia sospesa è diventato un metodo ampiamente utilizzato per generare numerosi sferoidi omogenei basati sui principi della gravità e della tensione superficiale prima dell'inclusione della ECM utilizzando Matrigel, il "gold standard" delle matrici extracellulari, sebbene sia basato sul topo. È stato fatto uno sforzo sostanziale per generare sferoidi in approcci privi di scaffold 8,11. Ad esempio, gli sferoidi possono essere generati utilizzando una bottiglia di coltura cellulare con un agitatore, impedendo così la semina cellulare, il metodo più semplice per produrre sferoidi su larga scala12.

La cosa più difficile nella complessazione delle colture cellulari e quindi nella creazione di un sistema fisiologicamente valido come le alternative in vitro in vivo nel proprio laboratorio sono i protocolli complessi con molti passaggi diversi (che devono ancora essere stabiliti). Ad esempio, la generazione di strutture cellulari prima utilizzando un metodo, la raccolta e poi l'incorporazione in una matrice, in particolare l'uso di matrici non facili da gestire, sono passaggi critici che richiedono una maggiore convinzione, prima che un metodo possa essere utilizzato di routine e in serie. Qui abbiamo utilizzato una piastra di attacco ultra-bassa in un formato a 96 pozzetti, che non consente praticamente alcun attacco cellulare alla coltura per stabilire sferoidi 3D complessi di cellule epiteliali polmonari e fibroblasti. Gli sferoidi risultanti si formano in modo altamente uniforme e piuttosto veloce entro 24 ore, il che accorcia la linea temporale sperimentale. La coltivazione prolungata e, quindi, la crescita e la differenziazione cellulare affidabili vengono effettuate nello stesso pozzetto per l'intero periodo, in modo che dopo la placcatura iniziale sia necessario sostituire solo il terreno per l'intero periodo di coltivazione. Pertanto, presentiamo un protocollo molto semplice, rapido e quindi altamente pratico per la generazione di sferoidi polmonari umani che replicano morfologicamente e funzionalmente l'epitelio delle vie aeree a livelli quasi fisiologici. Un altro vantaggio è che questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre cellule.

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Protocollo

Tutte le fasi vengono eseguite in condizioni sterili (cappa di biosicurezza). Per le composizioni multimediali utilizzate in questo studio, fare riferimento alla Tabella 1.

1. Preparazione del materiale sperimentale

  1. Coltura ed espansione di cellule epiteliali polmonari umane normali (HBEC3-KT) su piastre standard per colture cellulari in plastica (matracci T75) in normale terreno di crescita epiteliale utilizzando un incubatore standard13 (vedi Tabella 1).
    NOTA: Per una migliore crescita, il terreno può essere ulteriormente integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS).
  2. Coltura di fibroblasti umani (HS-5) in RPMI Medium integrati con il 10% di siero fetale di vitello e penicillina/streptomicina10,14 (vedi Tabella 1).
  3. Preparare il terreno organoide polmonare ramificato (BLO-Medium) integrando DMEM/F12 con N-2, B27, penicillina-streptomicina, albumina sierica bovina, monotioglicerolo, acido ascorbico, KGF/FGF7, FGF10, ATRA e CHIR99021. (vedi Tabella 1 e Tabella dei materiali).
    NOTA: Si consiglia di preparare il terreno fresco, almeno con l'aggiunta di KGF/FGF7, FGF10, ATRA e CHIR99021. Se è necessario più terreno in un breve periodo di tempo, si consiglia solo un breve periodo di conservazione di pochi giorni (fino a 1 settimana) a 4 °C. In alternativa, è possibile utilizzare il terreno di differenziazione degli organoidi delle vie aeree PneumaCult, disponibile in commercio.

2. Preparazione di cellule epiteliali e fibroblasti

NOTA: Utilizzare entrambi i tipi di celle quando le celle raggiungono circa l'80% di confluenza. Preparare ogni tipo di cella separatamente.

  1. Rimuovere ed eliminare il terreno di coltura.
  2. Lavare le cellule risciacquando brevemente lo strato cellulare con 5 ml di PBS.
  3. Tripsinizzare le cellule epiteliali aggiungendo 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,5%, seguita da una breve incubazione a 37 °C per 4-8 minuti.
  4. Raccogliere cellule arrotondate e quasi staccate aggiungendo normali terreni di crescita o PBS integrati con FCS al 10% utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL.
  5. Pipett il volume appropriato su e giù più volte nel pallone T75 (lungo la superficie di crescita) per separare ulteriormente i grumi cellulari e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
  6. Raccogliere rispettivamente i fibroblasti HS5 utilizzando la tripsinizzazione TE a 37 °C per 3-5 minuti.
  7. Pellettare ogni tipo di cellula (e quindi priva di tripsina) mediante centrifugazione (ad esempio, 300-400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente [RT]) e risospendere (sia le cellule epiteliali che i fibroblasti) in 1-2 mL di terreno di crescita epiteliale normale prima del conteggio.
  8. Determinare il numero di cellule vitali utilizzando un volume appropriato di cellule risospese; ciascuno diluito 1/5 con colorante blu di tripano allo 0,4% in una camera di conteggio Neubauer al microscopio.

3. Generazione di colture 3D di sferoidi epiteliali-fibroblasti

  1. Diluire il numero desiderato di cellule nel normale terreno di crescita epiteliale utilizzando una provetta da 15 mL. Calcola 2000 cellule epiteliali con 50 fibroblasti in 100 μL di terreno per ogni pozzetto delle piastre da 96 pozzetti. Il numero di cellule risultante adeguato per una piastra da 96 pozzetti è di 200.000 cellule HBEC e 5.000 fibroblasti HS5 in 10 mL di normale terreno di crescita epiteliale.
  2. Miscelare delicatamente utilizzando pipette sierologiche sterili da 10 ml.
  3. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio di reagenti sterile per una micropipetta multicanale.
  4. Seminare le cellule in una piastra di fissaggio ultra-bassa trasferendo 100 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale (12 canali).
  5. Incubare in condizioni standard di coltura cellulare a 37 °C e 5% di CO2 in atmosfera umidificata.
    NOTA: La formazione di sferoidi viene valutata mediante un esame microscopico regolare utilizzando un microscopio invertito e fotografando gli sferoidi per ogni punto temporale desiderato.
  6. Dopo 4 giorni, aggiungere 100 μL di BLO-Medium per pozzetto agli sferoidi generati.
  7. Incubare ulteriormente in condizioni standard di coltura cellulare a 37 °C e 5% di CO2 in atmosfera umidificata.

4. Esecuzione di un cambio regolare dei supporti

  1. Dopo 7-8 giorni, eseguire un cambio regolare del supporto. Pertanto, posizionare la piastra con una leggera angolazione in modo che gli sferoidi affondino nella direzione di inclinazione in base alla gravità.
  2. Aspirare il surnatante con attenzione e nel miglior modo possibile con un puntale per pipetta da 100-200 μl.
  3. Riposizionare la piastra orizzontalmente e riempirla con 100-150 μl di terreno BLO per pozzetto (utilizzando una pipetta multicanale)
  4. Incubare ulteriormente in condizioni standard di coltura cellulare a 37 °C e 5% di CO2 in atmosfera umidificata o iniziare un esperimento/trattamento.
    NOTA: Gli sferoidi possono essere coltivati per periodi più lunghi (fino a 21 giorni). Quindi, un cambio medio completo deve essere effettuato almeno due volte a settimana.

5. Analisi a valle (raccolta di sferoidi)

  1. Eseguire regolarmente esami microscopici e documentazione scattando foto in combinazione con misurazioni delle dimensioni degli sferoidi e calcoli del volume, consentendo infine la quantificazione della crescita degli sferoidi e delle potenziali alterazioni della crescita dopo i trattamenti.
  2. Per l'imaging di cellule vive nei punti temporali desiderati, incubare gli sferoidi per altri 15 minuti con 1 μg/mL di Hoechst 33342 (o DAPI) per la colorazione dei nuclei e analizzarli al microscopio a fluorescenza.
  3. La raccolta ha generato sferoidi nel punto temporale desiderato utilizzando una pipetta da 200 μl con l'uscita tagliata (mantenere sterile) per aumentare il diametro. Pertanto, aspirare anche il terreno contenente lo sferoide. Combina e raccogli gli sferoidi in una provetta da 2-5 mL. Dopo 2-5 minuti, quando gli sferoidi sono affondati a causa della gravità, rimuovere il surnatante e procedere all'analisi a valle.
  4. Per la generazione di lisati proteici sferoidi interi, aggiungere direttamente un tampone di lisi ghiacciato (150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% sodio-desossicolato, 0,1% sodio-dodecilsolfato, 50 mmol/L Tris/HCl, pH 8, integrato con cocktail di inibitori della proteasi) alla provetta contenente gli sferoidi raccolti. Dopo due o tre cicli di congelamento e scongelamento, determinare il contenuto proteico dei lisati e procedere all'analisi a valle, ad esempio l'analisi Western blot15.
  5. Per la generazione di lisati di RNA sferoidi interi, aggiungere direttamente il tampone di lisi dell'RNA alla provetta contenente gli sferoidi raccolti ed eseguire l'isolamento dell'RNA secondo le istruzioni del produttore del rispettivo kit di isolamento dell'RNA utilizzato.
  6. Per l'immunoistochimica (IHC) e la colorazione in immunofluorescenza, seguire i passaggi 5.6.1-5.6.3.
    1. Trattare gli sferoidi raccolti con 1-2 mL di soluzione salina tamponata con paraformaldeide/fosfato al 4% (PBS) per 30 minuti e successivamente sottoporli a inclusione e sezionamento di paraffina (3-5 μm).
    2. Prima della colorazione immunofluorescente, preparare i campioni utilizzando una serie discendente di alcol e incubarli con una soluzione di recupero target. Successivamente, bloccare i vetrini con una soluzione bloccante (2% di siero di capra normale/PBS) per ridurre le interazioni aspecifiche e incubare gli anticorpi primari per una notte a 4 °C.
    3. Rilevare gli antigeni mediante anticorpi secondari marcati in fluorescenza. Controcolorare i nuclei con DAPI. Eseguire ulteriori colorazioni (ad es. kit di colorazione PAS) secondo i protocolli del produttore per la valutazione istologica.
  7. Per le sospensioni a cella singola, seguire i passaggi 5.7.1 e 5.7.2.
    1. Risospendere gli sferoidi raccolti in 1-2 mL di TrypLE contenente 100 U/mL di DNasi I, seguiti da un'incubazione di 15 minuti a 37 °C. Arresta la digestione aggiungendo PBS contenente il 2-5% di FCS, 2 mM EDTA e DNAsi I.
    2. Far passare la soluzione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta conica fresca prima dell'analisi a valle (ad esempio, citometria a flusso o analisi di singole cellule).
  8. Per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula, seguire i passaggi 5.8.1-5.8.3.
    1. Etichettare le diverse sospensioni unicellulari di interesse che rappresentano diversi punti temporali o trattamenti utilizzando un kit di multiplexing a singola cellula (umana) secondo le istruzioni del produttore.
    2. Combinare i campioni in seguito e caricarli su una corsia su una cartuccia a cella singola che punta a 10.000-40.000 celle.
    3. Recupera singole cellule, esegui la trascrizione inversa e la preparazione della libreria secondo le istruzioni del produttore e sequenzia l'RNA isolato.

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Risultati

Questo semplice protocollo consente la co-coltivazione sferoidale senza matrice di cellule epiteliali bronchiali umane e fibroblasti in combinazione con placche di attacco ultra-basse (Figura 1A). Durante il processo di coltivazione, dagli sferoidi inizialmente generati si formano gradualmente sferoidi polmonari più complessi, con la generazione efficiente di diverse strutture epiteliali e fibroblastiche che rappresentano interazioni cellulari dirette, come rivelato dalle analisi morfologich...

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Discussione

I modelli di coltura cellulare 3D sono stati proposti per colmare il divario tra le colture 2D e gli studi in vivo, poiché questo tipo di (co-)coltura imita meglio le proprietà fisiologiche, morfologiche e patologiche presenti in vivo perché sono presenti più interazioni cellula-cellula in vivo, interazioni cellula-ECM, risposte agli stimoli, espressione genica, espressione proteica e differenziazione17, 18

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Dichiarazioni

Gli autori affermano che non ci sono conflitti di interesse personali o istituzionali.

Ringraziamenti

Ringraziamo Mohammed Benchellal, Eva Gau, Sabine Senkel e Olga Kruse per la loro eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero Federale dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF) (LuOrgNTT: 16LW0293 to D.K., SeniRad: 02NUK086C to V.J., D.K.) e dal DFG Research Training Group 2762.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pipette sierologiche sterili da 10 ml ThermoFischer170356NNunc pipette sierologiche sterili, o equivalente
15 mL in provetta conicaCorning430052o equivalente
37 ° C/ 5% CO2 umidificato 
5 mL pipette sierologiche sterili Pipette sierologiche steriliThermoFischer170355N
provetta conica equivalente da 50 mLCorningCLS430829o equivalente
ATRA (All-Trans Retinoic Acid)StemCell TechnologiesCat#7226250 nM
B-27 Supplement (50x), ThermoFischer/GibcoCat#175040441x
BD Rhapsody WTA Amplification KitBD BioscienceCat#633801utilizzare secondo le istruzioni del produttore
Armadio di biosicurezza Siero
bovino AlbuminaRocheCat#BSAVHS-RO0,4% (v/v)
Cell StrainerCorning352350Falcon 70 µ m Filtro cellulare, bianco, sterile, confezionato singolarmente
Centrifuga Eppendorfhttps://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001ad es. Eppendorf Centrifuge 5804 - Centrifuga da banco
DMEM/F12InvitrogenCat#11330-032500 mL
DNasi I, senza RNasi (1  U/μ L)ThermoFischerCat#EN0521100 U/mL 
EDTA (0,5 M), pH 8,0, senza RNasiThermoFischerAM9260G2 mM
Eppendorf Research plus Pipetta multicanale a 12 canali Eppendorfad esempio, #3125000044 (10– 100 µ L) o #3125000060 (30– 300 µ L)
Siero fetale di vitelloThermoFischer/GibcoCat#A525670110% (v/v)
HBEC3-KT ATCCCRL-4051linea cellulare epiteliale polmonare normale umana 
Soluzione di eparina (0,2%)StemCell TechnologiesCat#79800,8 mL
Hoechst 33342 ThermoFischerGatto#H13991 µ g/mL
HS-5 ATCCCRL-3611fibroblasti stromali umani
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACFStemCell TechnologiesCat#78173.110 ng/mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF StemCell TechnologiesCat#78186.110 ng/mL
BD BioscienceCat#633781utilizzare secondo le istruzioni del produttore
Soluzione madre di idrocortisina StemCell TechnologiesCat#79260,5 mL per 500 mL
Laduviglusib (CHIR-99021)Biozol/SelleckchemCat#S12633 &; M
Acido L-ascorbicoSigma-AldrichCat#A9290250 µ g/mL
MicroscopioZEISS
MonotioglicerinaSigma-AldrichCat#M61450.4 µ Supplemento M
N-2 (100x)ThermoFischer/GibcoCat#175020481x
camera di conteggio NeubauerMerckBR718605ad es. MARCA  camera di conteggio BLAUBRAND  Modello Neubauer
Siero di capra normaleThermoFischerCat#318732 % (v/v) in PBS
NP-40Merck/MilliporeCat#492016NP-40-Alternative, 1 %
PAS Staining KitSigma AldrichCat#1016460001utilizzare secondo le istruzioni del produttore
PBSThermoFischerCat#100100231x
Penicillina-Streptomicina (10.000  U/mL), 100xThermoFischer/GibcoCat#151401221x
PFAThermoFischerCat#J61899. AKParaformaldeide, 4 % in PBS
PneumaCult Airway Organoid Differenziation Medium (ODM)StemCell TechnologiesCat#05060PneumaCult Airway Organoid Basal Medium (#05061, 360 mL) e PneumaCult Airway Organoid Differenziation Supplement* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus MediumStemCell TechnologiesCat#5040Kit composto da PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (#05041, 490 mL ) e PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL)
Cocktail di inibitori della proteasiMerck/RocheCat#46931320011 compressa/10 mL
Kit Rhapsody cDNABD BioscienceCat#633773utilizzare secondo le istruzioni del produttore
RPMI 1640 MediumThermoFischer/GibcoCat#11875093500 mL
Cloruro di sodioMerck / Sigma-AldrichS9625150 mmol / L
Citrato di sodioMerck / Sigma-AldrichCat#1613859-1G0,10%
Desossicolato di sodioMerck / Sigma-AldrichCat#309700,50%
di sodio dodecil solfato Merck/Sigma-AldrichCat#116672890010,10%
Serbatoio reagente sterile per micropipette multicanale (ad es. 60 ml)ThermoFischer9510037o equivalente
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ckSarstedt (o facellitato)83.3925.400 (o F202003)piastra di fissaggio ultra-bassa
Tris/HClThermoFischerCat#AM9855G50 mmol/L , pH 8
Triton  X-100Sigma-AldrichGatto#X100-5ML0.05 % 
Trypan Blue Stain (0,4%)ThermoFischerCat#152500611/5 (v/v) con NGM
TrypLEThermoFischerCat#126040131x
Tripsina-EDTA (0,5%)ThermoFischerCat#154000540,05% Soluzione di tripsina-EDTA (TE) diluita asetticamente a 1X utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato (senza calcio e magnesio)
Reagente WST-1CELLPRO-RO, RocheCat#5015944001reagente per la proliferazione cellulare 
incubatore Nunc, o Kit multiplexing a singola cellula umana da

Riferimenti

  1. Rasouli, M., Safari, F. Principles of indirect co-culture method using Transwell. Methods Mol Biol. , (2024).
  2. Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng C. 107, 110264(2020).
  3. Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84 (6), 736-752 (2004).
  4. Huang, X., et al. Current advances in 3D dynamic cell culture systems. Gels. 8 (12), 829(2022).
  5. Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: progress so far and future prospects. Pharmaceutics. 15 (8), 926(2022).
  6. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  7. Baarsma, H. A., et al. Epithelial 3D-spheroids as a tool to study air pollutant-induced lung pathology. SLAS Discov. 27 (3), 185-190 (2022).
  8. Shah, D. D., Raghani, N. R., Chorawala, M. R., Singh, S., Prajapati, B. G. Harnessing three-dimensional (3D) cell culture models for pulmonary infections: state of the art and future directions. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 396 (11), 2861-2880 (2023).
  9. Ketteler, J., et al. Caveolin-1 regulates the ASMase/ceramide-mediated radiation response of endothelial cells in the context of tumor-stroma interactions. Cell Death Dis. 11 (4), 228(2020).
  10. Wittka, A., et al. Stromal fibroblasts counteract the caveolin-1-dependent radiation response of LNCaP prostate carcinoma cells. Front Oncol. 12, 802482(2022).
  11. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Matrix-free human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells to model lung injury. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 468(2024).
  12. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  13. Hansel, C., et al. Metformin protects against radiation-induced acute effects by limiting senescence of bronchial-epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (13), 7064(2021).
  14. Panic, A., et al. Progression-related loss of stromal caveolin 1 levels fosters the growth of human PC3 xenografts and mediates radiation resistance. Sci Rep. 7, 41138(2017).
  15. Sentek, H., Braun, A., Budeus, B., Klein, D. Non-small cell lung cancer cells and concomitant cancer therapy induce a resistance-promoting phenotype of tumor-associated mesenchymal stem cells. Front Oncol. 14, 1406268(2024).
  16. Steens, J., et al. Direct conversion of human fibroblasts into therapeutically active vascular wall-typical mesenchymal stem cells. Cell Mol Life Sci. 77 (17), 3401-3422 (2020).
  17. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  18. Arora, S., et al. Spheroids in cancer research: recent advances and opportunities. J Drug Deliv Sci Technol. 100, 106033(2024).
  19. Chen, S., et al. 3D co-culture of lung cancer cells with CAFs: An in vitro model system to study tumor progression. J Vis Exp. , e20235(2025).
  20. Hey, S., Linder, S. A macrophage-tumor spheroid co-invasion assay. JoVE. (215), (2025).
  21. Miranda, G., et al. Cost-effective 3D lung tissue spheroid as a model for SARS-CoV-2 infection and drug screening. Artif Organs. 48 (7), 723-733 (2024).
  22. Celis, T., Bullens, D. M. A., Hoet, P. H. M., Ghosh, M. Development and validation of a human bronchial epithelial spheroid model to study respiratory toxicity in vitro. Arch Toxicol. 98 (2), 493-505 (2024).
  23. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of normal human bronchial epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Sci Rep. 9 (1), 500(2019).
  24. Basil, M. C., et al. The cellular and physiological basis for lung repair and regeneration: past, present, and future. Cell Stem Cell. 26 (4), 482-502 (2020).
  25. Klein, D. Lung multipotent stem cells of mesenchymal nature: cellular basis, clinical relevance, and implications for stem cell therapy. Antioxid Redox Signal. 35 (3), 204-216 (2021).
  26. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. J Clin Invest. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  27. Shakir, S., Hackett, T. L., Mostaço-Guidolin, L. B. Bioengineering lungs: an overview of current methods, requirements, and challenges for constructing scaffolds. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1011800(2022).
  28. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Free-floating human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. , (2025).
  29. Li, C., et al. Establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids. JoVE. (181), e63684(2022).

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