Generazione di co-colture di sferoidi epiteliali-fibroblasti umani normali fluttuanti

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo semplice e molto pratico ma affidabile per la co-coltivazione diretta di cellule epiteliali polmonari umane e fibroblasti senza fare affidamento su una matrice.

Abstract

I sistemi di coltura tridimensionali (3D) sono diventati sempre più popolari grazie alla loro capacità di riprodurre le proprietà e le architetture cellulari naturali, imitando così le strutture simili ai tessuti in vitro. Tra questi modelli, la coltura di aggregati cellulari sferici (i cosiddetti sferoidi) incorporati in una matrice extracellulare semisolida (ECM) rappresenta un modello avanzato di coltura cellulare quasi in vivo , in quanto consente diversi stati funzionali cellulari come risultato delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM, nonché dei gradienti di ossigeno e nutrienti. Poiché gli sferoidi sono tecnicamente meno impegnativi e relativamente economici da ottenere, sono spesso utilizzati nello screening dei farmaci e nei test di tossicità, consentendo uno screening ad alto contenuto per testare nuovi farmaci nella fase preclinica. A tale scopo, vengono prevalentemente ricreate le strutture 3D di vari tumori. Allo stesso tempo, Matrigel è attualmente una delle ECM più utilizzate ed è considerato il gold standard nella coltivazione di sferoidi e organoidi, sebbene si tratti di una matrice 3D basata su esperimenti sui topi, la cui estrazione - come i test sugli animali in generale - è associata a importanti preoccupazioni etiche. Qui, presentiamo un protocollo senza matrice per la co-coltivazione diretta di cellule epiteliali bronchiali umane e fibroblasti, che può essere considerato come un metodo di co-coltivazione ottimizzato, in particolare per quanto riguarda la comunicazione epitelio-fibroblasto e le interazioni all'interno dei rispettivi sferoidi, senza fare affidamento su una matrice di portatori (su base animale). Stabilendo queste co-colture di sferoidi epiteliali-fibroblastoidi fluttuanti come piattaforma in vitro orientata al paziente per modellare le normali tossicità tissutali (polmonari) degli approcci terapeutici contro il cancro, non solo si può ottenere una riduzione del numero di animali da esperimento, ma anche una sostituzione adeguata e significativa dei corrispondenti esperimenti sugli animali.

Introduzione

Le colture cellulari bidimensionali (2D), in cui le cellule monostrato piatte vengono coltivate, espanse e quindi piastrate per saggi di ricerca basati su cellule, rimangono un metodo semplice, conveniente, economico e ampiamente utilizzato per le procedure di screening preclinico standard ^1,2. Per studiare il crosstalk interattivo (paracrino) tra vari tipi di cellule in vitro, è possibile utilizzare un mezzo condizionato da un tipo di cellula per la stimolazione di un altro tipo di cellula. Inoltre, sono emersi vari metodi di co-coltura, ad esempio metodi indiretti, quando le cellule co-coltivate vengono fisicamente separate utilizzando una membrana microporosa. Questi "sistemi Transwell" includono un inserto (la membrana microporosa) che viene inserito in una tradizionale piastra di coltura cellulare 2D. Un tipo di cellula viene quindi seminato e coltivato sulla membrana, condividendo lo stesso terreno dell'altro tipo che cresce sul pozzo del compagno, consentendo così comunicazioni paracrine bidirezionali². I due tipi di cellule potrebbero anche essere seminati sui due lati della membrana, formando più di una co-coltura diretta da cellula a cellula, che è adatta per studiare i tessuti strutturati a barriera ^3,4.

Tuttavia, le risposte cellulari di questi sistemi di coltura cellulare 2D, anche avanzati, non sempre riflettono i risultati dei corrispondenti esperimenti sugli animali e persino degli studi clinici, il che è dovuto, tra l'altro, alla mancanza di segnalazione diretta tra i diversi tipi di cellule e quindi alla mancanza di organizzazioni cellulari simili in vivo. Pertanto, i sistemi di coltura tridimensionali (3D) sono diventati sempre più popolari a causa delle capacità delle caratteristiche e delle architetture cellulari naturali che imitano le strutture simili ai tessuti in vitro ^5,6. Tra questi modelli, la coltura di aggregati cellulari sferici, denominati sferoidi, incorporati in matrici extracellulari semisolide fornisce un modello di co-coltura cellulare più avanzato in cui è possibile ottenere diversi stati cellulari funzionali che seguono interazioni cellula-cellula e cellula-ECM, nonché gradienti di ossigeno e nutrizione⁷. Queste colture in vitro in vivo, più complesse, dovrebbero essere generate e mantenute omogenee per quanto riguarda le dimensioni dell'assemblaggio cellulare, promuovendo al contempo lo sviluppo e la differenziazione cellulare, pur essendo efficaci, rapide, coerenti e convenienti ^7,8.

Utilizzando le caratteristiche naturali di autoaggregazione e adesione, gli sferoidi (principalmente sferoidi tumorali) vengono solitamente generati utilizzando la tecnica della goccia sospesa ^9,10. Essendo una delle prime tecniche utilizzate per generare corpi embrionali, il saggio della goccia sospesa è diventato un metodo ampiamente utilizzato per generare numerosi sferoidi omogenei basati sui principi della gravità e della tensione superficiale prima dell'inclusione della ECM utilizzando Matrigel, il "gold standard" delle matrici extracellulari, sebbene sia basato sul topo. È stato fatto uno sforzo sostanziale per generare sferoidi in approcci privi di scaffold ^8,11. Ad esempio, gli sferoidi possono essere generati utilizzando una bottiglia di coltura cellulare con un agitatore, impedendo così la semina cellulare, il metodo più semplice per produrre sferoidi su larga scala¹².

La cosa più difficile nella complessazione delle colture cellulari e quindi nella creazione di un sistema fisiologicamente valido come le alternative in vitro in vivo nel proprio laboratorio sono i protocolli complessi con molti passaggi diversi (che devono ancora essere stabiliti). Ad esempio, la generazione di strutture cellulari prima utilizzando un metodo, la raccolta e poi l'incorporazione in una matrice, in particolare l'uso di matrici non facili da gestire, sono passaggi critici che richiedono una maggiore convinzione, prima che un metodo possa essere utilizzato di routine e in serie. Qui abbiamo utilizzato una piastra di attacco ultra-bassa in un formato a 96 pozzetti, che non consente praticamente alcun attacco cellulare alla coltura per stabilire sferoidi 3D complessi di cellule epiteliali polmonari e fibroblasti. Gli sferoidi risultanti si formano in modo altamente uniforme e piuttosto veloce entro 24 ore, il che accorcia la linea temporale sperimentale. La coltivazione prolungata e, quindi, la crescita e la differenziazione cellulare affidabili vengono effettuate nello stesso pozzetto per l'intero periodo, in modo che dopo la placcatura iniziale sia necessario sostituire solo il terreno per l'intero periodo di coltivazione. Pertanto, presentiamo un protocollo molto semplice, rapido e quindi altamente pratico per la generazione di sferoidi polmonari umani che replicano morfologicamente e funzionalmente l'epitelio delle vie aeree a livelli quasi fisiologici. Un altro vantaggio è che questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre cellule.

Protocollo

Tutte le fasi vengono eseguite in condizioni sterili (cappa di biosicurezza). Per le composizioni multimediali utilizzate in questo studio, fare riferimento alla Tabella 1.

1. Preparazione del materiale sperimentale

1. Coltura ed espansione di cellule epiteliali polmonari umane normali (HBEC3-KT) su piastre standard per colture cellulari in plastica (matracci T75) in normale terreno di crescita epiteliale utilizzando un incubatore standard¹³ (vedi Tabella 1).
   NOTA: Per una migliore crescita, il terreno può essere ulteriormente integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS).
2. Coltura di fibroblasti umani (HS-5) in RPMI Medium integrati con il 10% di siero fetale di vitello e penicillina/streptomicina^10,14 (vedi Tabella 1).
3. Preparare il terreno organoide polmonare ramificato (BLO-Medium) integrando DMEM/F12 con N-2, B27, penicillina-streptomicina, albumina sierica bovina, monotioglicerolo, acido ascorbico, KGF/FGF7, FGF10, ATRA e CHIR99021. (vedi Tabella 1 e Tabella dei materiali).
   NOTA: Si consiglia di preparare il terreno fresco, almeno con l'aggiunta di KGF/FGF7, FGF10, ATRA e CHIR99021. Se è necessario più terreno in un breve periodo di tempo, si consiglia solo un breve periodo di conservazione di pochi giorni (fino a 1 settimana) a 4 °C. In alternativa, è possibile utilizzare il terreno di differenziazione degli organoidi delle vie aeree PneumaCult, disponibile in commercio.

2. Preparazione di cellule epiteliali e fibroblasti

NOTA: Utilizzare entrambi i tipi di celle quando le celle raggiungono circa l'80% di confluenza. Preparare ogni tipo di cella separatamente.

1. Rimuovere ed eliminare il terreno di coltura.
2. Lavare le cellule risciacquando brevemente lo strato cellulare con 5 ml di PBS.
3. Tripsinizzare le cellule epiteliali aggiungendo 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,5%, seguita da una breve incubazione a 37 °C per 4-8 minuti.
4. Raccogliere cellule arrotondate e quasi staccate aggiungendo normali terreni di crescita o PBS integrati con FCS al 10% utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL.
5. Pipett il volume appropriato su e giù più volte nel pallone T75 (lungo la superficie di crescita) per separare ulteriormente i grumi cellulari e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
6. Raccogliere rispettivamente i fibroblasti HS5 utilizzando la tripsinizzazione TE a 37 °C per 3-5 minuti.
7. Pellettare ogni tipo di cellula (e quindi priva di tripsina) mediante centrifugazione (ad esempio, 300-400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente [RT]) e risospendere (sia le cellule epiteliali che i fibroblasti) in 1-2 mL di terreno di crescita epiteliale normale prima del conteggio.
8. Determinare il numero di cellule vitali utilizzando un volume appropriato di cellule risospese; ciascuno diluito 1/5 con colorante blu di tripano allo 0,4% in una camera di conteggio Neubauer al microscopio.

3. Generazione di colture 3D di sferoidi epiteliali-fibroblasti

1. Diluire il numero desiderato di cellule nel normale terreno di crescita epiteliale utilizzando una provetta da 15 mL. Calcola 2000 cellule epiteliali con 50 fibroblasti in 100 μL di terreno per ogni pozzetto delle piastre da 96 pozzetti. Il numero di cellule risultante adeguato per una piastra da 96 pozzetti è di 200.000 cellule HBEC e 5.000 fibroblasti HS5 in 10 mL di normale terreno di crescita epiteliale.
2. Miscelare delicatamente utilizzando pipette sierologiche sterili da 10 ml.
3. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio di reagenti sterile per una micropipetta multicanale.
4. Seminare le cellule in una piastra di fissaggio ultra-bassa trasferendo 100 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale (12 canali).
5. Incubare in condizioni standard di coltura cellulare a 37 °C e 5% di CO₂ in atmosfera umidificata.
   NOTA: La formazione di sferoidi viene valutata mediante un esame microscopico regolare utilizzando un microscopio invertito e fotografando gli sferoidi per ogni punto temporale desiderato.
6. Dopo 4 giorni, aggiungere 100 μL di BLO-Medium per pozzetto agli sferoidi generati.
7. Incubare ulteriormente in condizioni standard di coltura cellulare a 37 °C e 5% di CO₂ in atmosfera umidificata.

4. Esecuzione di un cambio regolare dei supporti

1. Dopo 7-8 giorni, eseguire un cambio regolare del supporto. Pertanto, posizionare la piastra con una leggera angolazione in modo che gli sferoidi affondino nella direzione di inclinazione in base alla gravità.
2. Aspirare il surnatante con attenzione e nel miglior modo possibile con un puntale per pipetta da 100-200 μl.
3. Riposizionare la piastra orizzontalmente e riempirla con 100-150 μl di terreno BLO per pozzetto (utilizzando una pipetta multicanale)
4. Incubare ulteriormente in condizioni standard di coltura cellulare a 37 °C e 5% di CO₂ in atmosfera umidificata o iniziare un esperimento/trattamento.
   NOTA: Gli sferoidi possono essere coltivati per periodi più lunghi (fino a 21 giorni). Quindi, un cambio medio completo deve essere effettuato almeno due volte a settimana.

5. Analisi a valle (raccolta di sferoidi)

1. Eseguire regolarmente esami microscopici e documentazione scattando foto in combinazione con misurazioni delle dimensioni degli sferoidi e calcoli del volume, consentendo infine la quantificazione della crescita degli sferoidi e delle potenziali alterazioni della crescita dopo i trattamenti.
2. Per l'imaging di cellule vive nei punti temporali desiderati, incubare gli sferoidi per altri 15 minuti con 1 μg/mL di Hoechst 33342 (o DAPI) per la colorazione dei nuclei e analizzarli al microscopio a fluorescenza.
3. La raccolta ha generato sferoidi nel punto temporale desiderato utilizzando una pipetta da 200 μl con l'uscita tagliata (mantenere sterile) per aumentare il diametro. Pertanto, aspirare anche il terreno contenente lo sferoide. Combina e raccogli gli sferoidi in una provetta da 2-5 mL. Dopo 2-5 minuti, quando gli sferoidi sono affondati a causa della gravità, rimuovere il surnatante e procedere all'analisi a valle.
4. Per la generazione di lisati proteici sferoidi interi, aggiungere direttamente un tampone di lisi ghiacciato (150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% sodio-desossicolato, 0,1% sodio-dodecilsolfato, 50 mmol/L Tris/HCl, pH 8, integrato con cocktail di inibitori della proteasi) alla provetta contenente gli sferoidi raccolti. Dopo due o tre cicli di congelamento e scongelamento, determinare il contenuto proteico dei lisati e procedere all'analisi a valle, ad esempio l'analisi Western blot¹⁵.
5. Per la generazione di lisati di RNA sferoidi interi, aggiungere direttamente il tampone di lisi dell'RNA alla provetta contenente gli sferoidi raccolti ed eseguire l'isolamento dell'RNA secondo le istruzioni del produttore del rispettivo kit di isolamento dell'RNA utilizzato.
6. Per l'immunoistochimica (IHC) e la colorazione in immunofluorescenza, seguire i passaggi 5.6.1-5.6.3.
   1. Trattare gli sferoidi raccolti con 1-2 mL di soluzione salina tamponata con paraformaldeide/fosfato al 4% (PBS) per 30 minuti e successivamente sottoporli a inclusione e sezionamento di paraffina (3-5 μm).
   2. Prima della colorazione immunofluorescente, preparare i campioni utilizzando una serie discendente di alcol e incubarli con una soluzione di recupero target. Successivamente, bloccare i vetrini con una soluzione bloccante (2% di siero di capra normale/PBS) per ridurre le interazioni aspecifiche e incubare gli anticorpi primari per una notte a 4 °C.
   3. Rilevare gli antigeni mediante anticorpi secondari marcati in fluorescenza. Controcolorare i nuclei con DAPI. Eseguire ulteriori colorazioni (ad es. kit di colorazione PAS) secondo i protocolli del produttore per la valutazione istologica.
7. Per le sospensioni a cella singola, seguire i passaggi 5.7.1 e 5.7.2.
   1. Risospendere gli sferoidi raccolti in 1-2 mL di TrypLE contenente 100 U/mL di DNasi I, seguiti da un'incubazione di 15 minuti a 37 °C. Arresta la digestione aggiungendo PBS contenente il 2-5% di FCS, 2 mM EDTA e DNAsi I.
   2. Far passare la soluzione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta conica fresca prima dell'analisi a valle (ad esempio, citometria a flusso o analisi di singole cellule).
8. Per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula, seguire i passaggi 5.8.1-5.8.3.
   1. Etichettare le diverse sospensioni unicellulari di interesse che rappresentano diversi punti temporali o trattamenti utilizzando un kit di multiplexing a singola cellula (umana) secondo le istruzioni del produttore.
   2. Combinare i campioni in seguito e caricarli su una corsia su una cartuccia a cella singola che punta a 10.000-40.000 celle.
   3. Recupera singole cellule, esegui la trascrizione inversa e la preparazione della libreria secondo le istruzioni del produttore e sequenzia l'RNA isolato.

Risultati

Questo semplice protocollo consente la co-coltivazione sferoidale senza matrice di cellule epiteliali bronchiali umane e fibroblasti in combinazione con placche di attacco ultra-basse (Figura 1A). Durante il processo di coltivazione, dagli sferoidi inizialmente generati si formano gradualmente sferoidi polmonari più complessi, con la generazione efficiente di diverse strutture epiteliali e fibroblastiche che rappresentano interazioni cellulari dirette, come rivelato dalle analisi morfologich...

Discussione

I modelli di coltura cellulare 3D sono stati proposti per colmare il divario tra le colture 2D e gli studi in vivo, poiché questo tipo di (co-)coltura imita meglio le proprietà fisiologiche, morfologiche e patologiche presenti in vivo perché sono presenti più interazioni cellula-cellula in vivo, interazioni cellula-ECM, risposte agli stimoli, espressione genica, espressione proteica e differenziazione^{17, 18}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pipette sierologiche sterili da 10 ml	ThermoFischer	170356N	Nunc pipette sierologiche sterili, o equivalente
15 mL in provetta conica	Corning	430052	o equivalente
37 ° C/ 5% CO2 umidificato
5 mL pipette sierologiche sterili	Pipette sierologiche sterili	ThermoFischer	170355N
provetta conica equivalente da 50 mL	Corning	CLS430829	o equivalente
ATRA (All-Trans Retinoic Acid)	StemCell Technologies	Cat#72262	50 nM
B-27 Supplement (50x),	ThermoFischer/Gibco	Cat#17504044	1x
BD Rhapsody WTA Amplification Kit	BD Bioscience	Cat#633801	utilizzare secondo le istruzioni del produttore
Armadio di biosicurezza Siero
bovino Albumina	Roche	Cat#BSAVHS-RO	0,4% (v/v)
Cell Strainer	Corning	352350	Falcon 70 µ m Filtro cellulare, bianco, sterile, confezionato singolarmente
	Centrifuga Eppendorf	https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001	ad es. Eppendorf Centrifuge 5804 - Centrifuga da banco
DMEM/F12	Invitrogen	Cat#11330-032	500 mL
DNasi I, senza RNasi (1  U/μ L)	ThermoFischer	Cat#EN0521	100 U/mL
EDTA (0,5 M), pH 8,0, senza RNasi	ThermoFischer	AM9260G	2 mM
Eppendorf Research plus Pipetta multicanale a 12 canali	Eppendorf		ad esempio, #3125000044 (10– 100 µ L) o #3125000060 (30– 300 µ L)
Siero fetale di vitello	ThermoFischer/Gibco	Cat#A5256701	10% (v/v)
HBEC3-KT	ATCC	CRL-4051	linea cellulare epiteliale polmonare normale umana
Soluzione di eparina (0,2%)	StemCell Technologies	Cat#7980	0,8 mL
Hoechst 33342	ThermoFischer	Gatto#H1399	1 µ g/mL
HS-5	ATCC	CRL-3611	fibroblasti stromali umani
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACF	StemCell Technologies	Cat#78173.1	10 ng/mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF	StemCell Technologies	Cat#78186.1	10 ng/mL
	BD Bioscience	Cat#633781	utilizzare secondo le istruzioni del produttore
Soluzione madre di idrocortisina	StemCell Technologies	Cat#7926	0,5 mL per 500 mL
Laduviglusib (CHIR-99021)	Biozol/Selleckchem	Cat#S1263	3 &; M
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich	Cat#A92902	50 µ g/mL
Microscopio	ZEISS
Monotioglicerina	Sigma-Aldrich	Cat#M6145	0.4 µ Supplemento M
N-2 (100x)	ThermoFischer/Gibco	Cat#17502048	1x
camera di conteggio Neubauer	Merck	BR718605	ad es. MARCA  camera di conteggio BLAUBRAND  Modello Neubauer
Siero di capra normale	ThermoFischer	Cat#31873	2 % (v/v) in PBS
NP-40	Merck/Millipore	Cat#492016	NP-40-Alternative, 1 %
PAS Staining Kit	Sigma Aldrich	Cat#1016460001	utilizzare secondo le istruzioni del produttore
PBS	ThermoFischer	Cat#10010023	1x
Penicillina-Streptomicina (10.000  U/mL), 100x	ThermoFischer/Gibco	Cat#15140122	1x
PFA	ThermoFischer	Cat#J61899. AK	Paraformaldeide, 4 % in PBS
PneumaCult Airway Organoid Differenziation Medium (ODM)	StemCell Technologies	Cat#05060	PneumaCult Airway Organoid Basal Medium (#05061, 360 mL) e PneumaCult Airway Organoid Differenziation Supplement* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus Medium	StemCell Technologies	Cat#5040	Kit composto da PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (#05041, 490 mL ) e PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL)
Cocktail di inibitori della proteasi	Merck/Roche	Cat#4693132001	1 compressa/10 mL
Kit Rhapsody cDNA	BD Bioscience	Cat#633773	utilizzare secondo le istruzioni del produttore
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer/Gibco	Cat#11875093	500 mL
Cloruro di sodio	Merck / Sigma-Aldrich	S9625	150 mmol / L
Citrato di sodio	Merck / Sigma-Aldrich	Cat#1613859-1G	0,10%
Desossicolato di sodio	Merck / Sigma-Aldrich	Cat#30970	0,50%
di sodio dodecil solfato	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#11667289001	0,10%
Serbatoio reagente sterile per micropipette multicanale (ad es. 60 ml)	ThermoFischer	9510037	o equivalente
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ck	Sarstedt (o facellitato)	83.3925.400 (o F202003)	piastra di fissaggio ultra-bassa
Tris/HCl	ThermoFischer	Cat#AM9855G	50 mmol/L , pH 8
Triton  X-100	Sigma-Aldrich	Gatto#X100-5ML	0.05 %
Trypan Blue Stain (0,4%)	ThermoFischer	Cat#15250061	1/5 (v/v) con NGM
TrypLE	ThermoFischer	Cat#12604013	1x
Tripsina-EDTA (0,5%)	ThermoFischer	Cat#15400054	0,05% Soluzione di tripsina-EDTA (TE) diluita asetticamente a 1X utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato (senza calcio e magnesio)
Reagente WST-1	CELLPRO-RO, Roche	Cat#5015944001	reagente per la proliferazione cellulare