Method Article

Comprensione dei cambiamenti nella morfologia mitocondriale attraverso micrografie a fluorescenza dinamiche e tridimensionali

DOI:

10.3791/68478

⸱

August 15th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Stellenbosch University, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo il localizzatore di eventi mitocondriali (MEL), un plugin di ImageJ utile per quantificare i cambiamenti tridimensionali nell'attività di fissione e fusione mitocondriale nel tempo. Descriviamo anche una pipeline di elaborazione delle immagini utile per la pulizia delle micrografie prima dell'analisi in ImageJ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I mitocondri sono organelli altamente dinamici che sono vitali per la sopravvivenza di qualsiasi animale, sottoposti a regolari eventi di fissione e fusione in risposta alle esigenze o agli stress dell'ospite, portando al costante rimodellamento della rete mitocondriale. Per questo motivo, essere in grado di valutare la rete mitocondriale in tre dimensioni, oltre che nel tempo, offre un vantaggio nella comprensione di come il sistema risponde a fattori come lo stress o l'intervento farmaceutico. L'imaging a fluorescenza delle reti mitocondriali delle cellule consente di visualizzare e monitorare questi cambiamenti. Tuttavia, la rete mitocondriale è spesso descritta come una struttura bidimensionale e statica definita da metriche non standardizzate. Pertanto, abbiamo deciso di descrivere una pipeline che consente all'utente di preparare le proprie immagini per il localizzatore di eventi mitocondriali (MEL), uno strumento plug-in di ImageJ che rileva gli eventi di fissione e fusione nella rete mitocondriale nel tempo e in modo tridimensionale, offrendo così informazioni sui cambiamenti dinamici che questa rete subisce. Inoltre, descriviamo i benefici della comprensione della fissione e della fusione alla luce dei cambiamenti nella conta mitocondriale e dei cambiamenti morfologici.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I mitocondri sono organelli altamente dinamici presenti in tutte le cellule eucariotiche, che forniscono loro energia e ne regolano il metabolismo. Pertanto, i mitocondri si trovano al crocevia tra morte cellulare e sopravvivenza. I mitocondri hanno dimostrato di essere essenziali per una varietà di processi, che vanno dall'acidificazione lisosomiale e l'azione motoria molecolare alla contrazione muscolare e all'attivazione delle sinapsi 1,2.

I mitocondri subiscono regolari eventi di fissione e fusione per mantenere una rete mitocondriale che produce in modo efficiente ATP in risposta alla domanda metabolica e allo stress della cellula. Infatti, è stato dimostrato che i mitocondri subiscono la fissione per facilitare la mitofagia, la rimozione selettiva dei frammenti mitocondriali. Quindi, nel sistema cellulare rimangono solo i mitocondri che respirano attivamente e non sono depolarizzati 3,4. La fusione, tuttavia, avviene come mezzo per aumentare l'output di ATP della rete nel caso in cui vi sia un aumento del fabbisogno 5,6. Inoltre, sia la fissione che la fusione hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nella partizione e nella protezione del DNA mitocondriale 7,8. Va notato che l'estensione della fissione e della fusione richiede un attento controllo omeostatico per garantire una rete mitocondriale sana, poiché è stato dimostrato che una quantità eccessiva o insufficiente di entrambi i processi è dannosa.

È stato dimostrato che un'eccessiva fissione porta a una rete mitocondriale frammentata con conseguente diminuzione dei livelli di ATP nella malattia di Alzheimer, nella malattia di Parkinson e nelle taupatie 9,10,11, e bassi livelli di fissione possono portare ad un accumulo di mitocondri depolarizzati, portando a sintomi simili alla malattia di Parkinson12. È noto che l'iperfusione della rete si verifica durante i periodi di stress per aumentare la produzione di ATP. Tuttavia, è stato dimostrato che la presenza in questo stato per periodi di tempo prolungati aumenta i livelli di ROS e l'attività dell'autofagia, con conseguente insorgenza della morte cellulare 9,12.

Diventa chiaro, quindi, che la comprensione dello stato della rete mitocondriale offre intuizioni chiave per comprendere lo stato della cellula, e quindi dell'organismo. L'evidente importanza di comprendere la rete mitocondriale nel contesto della salute e della malattia, la sua capacità di subire eventi di fissione e fusione e il loro impatto sulla salute cellulare è ciò che ha motivato lo sviluppo di questo protocollo e degli strumenti di analisi associati. In particolare, gli strumenti che consentono la caratterizzazione delle dinamiche mitocondriali sono in gran parte limitati e scarsamente descritti in letteratura.

La morfologia mitocondriale è tipicamente determinata utilizzando la microscopia confocale seguita dall'analisi computazionale, che richiede che le micrografie grezze subiscano un certo grado di elaborazione per migliorarne la qualità per la valutazione, poiché ciò descrive al meglio l'organizzazione mitocondriale. In questo modo, gli utenti possono determinare molti risultati morfometrici della rete mitocondriale, come il conteggio, il volume, la lunghezza e il rapporto di aspetto 13,14,15. Gli utenti possono utilizzare micrografie 2D o 3D per le valutazioni morfologiche, sebbene l'analisi 3D offra una maggiore precisione e comprensione poiché la rete mitocondriale è costituita da strutture 3D. Ai fini dell'analisi della fissione e della fusione, si consiglia l'uso di micrografie con asse z in quanto ciò compensa al meglio la tridimensionalità della rete mitocondriale16.

Molti studi prevedono la categorizzazione dei mitocondri in stati frammentati, filamentosi o intermedi come mezzo per descrivere la rete 16,17. L'analisi 3D è particolarmente vantaggiosa a causa delle diverse forme che i mitocondri assumono nella cellula. L'aggiunta di tridimensionalità al proprio studio conferisce sicurezza, in particolare alla conta mitocondriale, poiché è probabile che i mitocondri si muovano verso l'alto o verso il basso lungo un asse z. MEL è un plug-in ImageJ che dipende dalle immagini acquisite in 3D18. Qui, abbiamo utilizzato cellule neuronali ippocampali di topo GT1-7 colorate con TMRE e Hoechst per visualizzare la rete mitocondriale e il nucleo della cellula. Le cellule sono state quindi posizionate attraverso una pipeline di pre-elaborazione per migliorare la qualità delle micrografie in preparazione per l'analisi delle immagini.

Sono state rese disponibili molte tecniche che consentono di determinare la morfologia mitocondriale sulla base di metriche statiche. Pochi includono attività di fissione e fusione e consentono di catturare quantitativamente il comportamento dinamico dei mitocondri 13,19,20,21. Qui descriveremo un protocollo per il miglioramento dell'immagine prima della determinazione delle caratteristiche della rete, con particolare attenzione alla fissione mitocondriale e all'attività di fusione. Dimostreremo come questa tecnica possa integrare i metodi precedentemente pubblicati per determinare la morfologia mitocondriale.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Trattamento cellulare e acquisizione al microscopio

  1. Coltura di cellule GT1-7 in 8 piastre in camera in DMEM integrate con il 10% di FBS e l'1% di Penstrep (terreno completo). Lasciare che le cellule si attacchino per una notte e poi trattare con 2,5 mM di metformina cloridrato a base di DMEM con il 10% di FBS per 72 ore, assicurandosi di sostituire il terreno ogni 24 ore. Co-trattare le cellule con 10 μM di CCCP 6 ore prima dell'imaging e 400 nM di Bafilomicina A1 (Baf) 4 ore prima dell'imaging.
    NOTA: Questo può essere fatto con qualsiasi linea cellulare eucariotica di scelta.
  2. Prima dell'imaging, preparare un cocktail di terreni completi preriscaldati contenenti 5 nM di Hoechst e 100 nM di TMRE.
  3. Sostituire il terreno di trattamento cellulare con il cocktail di imaging e attendere 10 minuti di incubazione prima dell'imaging.
    NOTA: A causa dell'attività dinamica dei mitocondri, le cellule devono essere visualizzate utilizzando un microscopio con una camera di incubazione impostata a 37 °C e 5% di CO2.

2. Imaging

  1. Celle immagine con ingrandimento 100x con 1,4 NA.
  2. Regolare la potenza del laser in modo che la potenza sia sufficientemente bassa da evitare il fotosbiancamento, ~2%. Assicurarsi che la velocità di scansione sia elevata. Cattura immagini con risoluzione 512 x 512.
  3. Impostare gli intervalli Z-slice tra incrementi di 0,25 μm. Per seguire questo protocollo, visualizza le celle in modo che siano costituite da 10 Z-stack. Acquisisci cinque intervalli di tempo senza alcun intervallo tra l'acquisizione di uno Z-stack.
    NOTA: Una volta ottimizzato, questo protocollo non deve essere regolato tra gruppi di trattamento o gruppi di esperimenti, poiché le macro qui elencate richiedono che il protocollo di imaging sia standardizzato su tutte le cellule.

3. Valutazione computazionale

NOTA: tutte le elaborazioni successive sono state eseguite utilizzando ImageJ v1.53t. Il plugin MEL, così come i moduli di supporto, si trovano all'indirizzo https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin, mentre tutte le macro utilizzate si trovano all'indirizzo https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections.

  1. Preparazione dell'immagine
    1. Aprite il file raw in ImageJ.
    2. Per ritagliare più celle da una singola micrografia, iniziare duplicando l'immagine fino al numero di singole celle da analizzare.
    3. Utilizzare lo strumento di sincronizzazione delle finestre, lo strumento di disegno a mano libera e la regolazione del colore per disegnare un'area di interesse attorno a una cella di interesse in cui sono presenti più celle in un campo visivo (Figura S1 supplementare).
    4. Fare clic su Modifica | Fuori è chiaro.
    5. Dividi i canali rosso e blu l'uno dall'altro e salva il canale mitocondriale come . Tiff.
  2. Generazione e deconvoluzione della funzione di diffusione dei punti
    1. Per generare una funzione di diffusione dei punti (PSF), utilizzare il plug-in PSF generator utilizzando le informazioni del micrografo incorporate. Vai a Plugin | PSF Generator per aprire il plugin. Inoltre, vai su Immagine | Mostra informazioni... oppure premere I per aprire le informazioni sull'immagine e scorrere fino in fondo. Utilizzando la dimensione e la profondità del voxel, dalla casella delle informazioni dello spettacolo, modifica la dimensione dei pixel XY a 166,1 nm e il passo Z a 200 nm. Cambia la lunghezza d'onda a 568 nm, la dimensione XYZ in modo che corrisponda a una risoluzione dell'immagine di 512 x 512 e uno Z-stack di 10 Z-slice (Figura S2 supplementare).
    2. Vai a Plugin | Macro | Modifica | Deconvolution_time_lapse_mine.ijm macro.
    3. Modificare le linee di input e output e premere Esegui (Figura supplementare S3).
  3. Miglioramento del contrasto dell'immagine e sfocatura
    1. Vai a Plugin | Macro | Modifica | Preprocessing.ijm.
    2. All'interno delle macro Preprocessing.ijm , utilizzare una sottrazione di sfondo con un raggio della sfera rotante pari a 6. Imposta Sigma Filter Plus in modo che il raggio sia uguale a 1, i pixel utilizzati siano uguali a 2 e la frazione minima di pixel sia uguale a 0,2, con il plug-in che è outlier-aware. Regolare le impostazioni CLAHE in modo che la dimensione del blocco sia 64; impostare i contenitori dell'istogramma su 256, la pendenza massima su 2,5 e la gamma su 0,8.
      NOTA: tutte queste impostazioni sono state ottimizzate per i nostri set di dati e i valori devono essere ottimizzati per set di dati alternativi prima di essere applicati. Il filtro Sigma viene applicato per levigare l'immagine e fondere efficacemente i pixel vicini per garantire strutture coerenti. Il contrasto locale viene applicato per aumentare il contrasto tra i pixel chiari e scuri e, insieme a un cambiamento nella gamma, migliora la presenza delle strutture mitocondriali riducendo al minimo i pixel di sfondo.
    3. Modificare la riga di input nella cartella contenente le micrografie che hanno subito la deconvoluzione (Figura supplementare S4).
    4. Fare clic su Esegui.
  4. Soglia delle immagini
    NOTA: Sebbene gli utenti possano utilizzare qualsiasi strumento di soglia che scelgano, consigliamo il plug-in di soglia adattivo di Qingzong Tseng (https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold).
    1. Aprire un file di interesse che è stato modificato dalle macro Preprocessed.ijm in ImageJ.
    2. Vai su Plugin | adaptiveThr.
    3. Imposta la soglia locale su Media ponderata e la dimensione del blocco di pixel in base alle preferenze dell'utente.
      NOTA: La dimensione del blocco di pixel deve essere mantenuta coerente tra le cellule, poiché questo valore influisce sulle valutazioni dimensionali mitocondriali come il volume o le proporzioni.
    4. Per ottimizzare il tempo, fai clic su anteprima e regola la dimensione del blocco in modo tale che il maggior numero possibile di mitocondri sia incluso in modo chiaro. Regola anche il valore di sottrazione per ogni cella per eliminare lo sfondo non necessario. Salva i file della micrografia nelle cartelle associate al valore di sottrazione (Figura supplementare S5).
      NOTA: le macro di Threshold.ijm includono un filtro di dimensione per eliminare le particelle più piccole.
    5. Seleziona i plugin | Macro | Modifica | Soglia.ijm.
    6. Modificare le righe input_path e output_path, nonché blockSize e sottrarre righe nello script delle macro (Figura S6 supplementare).
    7. Fare clic su Esegui.
  5. Rilevamento di eventi di fissione e fusione da parte del plug-in MEL (Mitocondrial Event Localizer)
    NOTA: MEL è progettato per elaborare una sequenza time-lapse di z-stack costituita da un singolo canale, salvato come un singolo Tiff alla volta. Sebbene ciò possa essere fatto modificando la riga di input con il file Tiff di interesse, dimostreremo anche un metodo per elaborare più file Tiff contemporaneamente utilizzando la funzione di concatenazione in ImageJ.
    1. Apri fino a 10 micrografie a soglia che appartengono alle stesse condizioni di trattamento.
      NOTA: Le micrografie devono avere lo stesso numero di z-slice affinché funzioni.
    2. Vai all'immagine | Pile |Strumenti | Concatena e premi Ok.
    3. Per rimuovere i piccoli puncta rimanenti lasciati dalla soglia, vai su Plugin | Filtri di immagini integrati | Rimuovi i valori anomali. Utilizzare l'anteprima per impostare le dimensioni X e Y per rimuovere i frammenti necessari.
    4. Salvare il file concatenato come Tiff.
    5. Vai a Plugin | Macro | Modifica | Quicktest_new.ijm e modificare i percorsi di input e output in base alle esigenze (Figura S7 supplementare).
      NOTA: Una volta completato, nella cartella di output verrà trovata una cartella chiamata "MEL_results" con tutti i risultati MEL. Questi sono mostrati come eventi di fissione e fusione rilevati in ogni punto temporale, e l'ultimo punto temporale dovrebbe sempre essere rimosso a causa del modo in cui MEL funziona18.

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Results

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Selezione delle celle appropriate
Gli utenti devono essere consapevoli del fatto che la rete mitocondriale cambia a seconda dello stato mitotico della cellula. Se il nucleo appare a forma di manubrio o di U, o se c'è uno spazio vicino al nucleo con una mancanza di segnale di fluorescenza, allora questo potrebbe indicare che la cellula si sta avvicinando alla mitosi. In questo stato, è probabile che i mitocondri subiscano una fissione a causa della divisione cellulare e non a causa dell'intervento di t...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sebbene esista un numero crescente di approcci per descrivere la morfologia mitocondriale, sono disponibili tecniche limitate per catturare adeguatamente la dinamica mitocondriale in modo quantitativo. Inoltre, va notato che la morfologia della rete mitocondriale e i meccanismi che governano questa morfologia sono di varia natura. Ciò si traduce in reti che sono collegate alle esigenze della cellula, che vanno da una formazione ramificata per una maggiore produzione di energia a regioni ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata finanziata dall'Università di Stellenbosch, in Sudafrica, dal South African Medical Research Council (SAMRC) e dalla National Research Foundation (NRF) del Sud Africa, nonché dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8 piatti da cameraThermoFisher#Z734853
Soglia regolatahttps://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
Bafilomicina A1Laboratori LKT#B0026
Clorofenilidrazone cianuro di carbonile (CCCP)Merck#C2759
Microscopio confocaleCarl Zeiss AGPiattaforma a super risoluzione LSM780 ELYRA PS.1
Eagle Medium modificato di Dulbecco (DMEM)ThermoFisher#341956062
Siero fetale bovino (FBS)Sigma-Aldrich#F0679
Collegamento Githubhttps://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad Prisma v7.06
Celle GT1-7ATCCCodice: SCC116
HoecshtSigma-AldrichH6024
ImageJ v1.53tFigi
Macrohttps://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
MetforminaFarmacopea EuropeaM06050000
Penicillina/streptomicina (PenStrep)Sigma-Aldrich#P4333
T25sBio-Smart Scientifico#70025
TMREThermoFisher#T669
TripsinaSigma-Aldrich#T4049

References

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