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Articolo metodologico

Definizione di modelli in vitro di coltura dei gangli della radice dorsale: approcci complementari per lo studio del crosstalk cancro-nervo

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DOI:

10.3791/68552

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11 luglio 2025

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1Division of Cancer Biology and Genetics, Sinclair Cancer Research Institute, and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Laboratory of Mutagenesis and Oncogenetics, Department of General Biology - Center for Biological Science, State University of Londrina

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive i metodi per stabilire colture intere e dissociate di gangli della radice dorsale di topo (DRG) e il loro utilizzo per valutare le interazioni tumore-nervo.

Abstract

Il contributo del sistema nervoso al microambiente tumorale e l'importanza dell'invasione neurale come via per la diffusione del cancro sono sempre più riconosciuti. Le interazioni delle cellule tumorali con i neuroni possono promuovere la loro invasione intorno e nei nervi, una caratteristica di molti tumori con scarsi risultati clinici. I modelli in vitro per studiare le interazioni reciproche tra neuroni e cellule tumorali forniscono strumenti preziosi per comprendere la diffusione del cancro e identificare approcci per mitigarla.

Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento dei gangli della radice dorsale murina (DRG) e la creazione di colture monostrato sia intere che dissociate che possono essere utilizzate per visualizzare la morfologia dei neuroni e la crescita dei neuriti nel tempo. I DRG interi montati in Matrigel conservano l'architettura nervosa e le risposte agli stimoli in un ambiente eterogeneo più simile al nervo in vivo , mentre le colture nervose dissociate consentono di valutare più da vicino le interazioni dirette cellula-cellula. Una volta stabilite le colture DRG, le cellule tumorali possono essere aggiunte per generare co-colture che possono essere utilizzate per visualizzare i cambiamenti nella crescita dei neuriti e nella morfologia dei nervi in risposta alle cellule tumorali. È possibile valutare la crescita o la motilità delle cellule tumorali in risposta a segnali derivati dai nervi nel tempo o in condizioni di stimolazione o inibizione della crescita, nonché visualizzare gli effetti del contatto diretto tra le cellule tumorali e le estensioni nervose.

Poiché entrambi i modelli di co-coltura possono essere generati simultaneamente, questo protocollo fornisce una visione più completa dell'impatto delle interazioni cancro-neurone e facilita il confronto delle condizioni di trattamento e l'integrazione delle informazioni a livello cellulare e degli interi gangli. Questo protocollo faciliterà lo studio delle interazioni nervo-tumore e può essere utilizzato per un'ampia gamma di applicazioni, tra cui studi di segnalazione cellulare, screening farmacologico o studio dell'eterogeneità dell'ambiente tumore-nervo e dei meccanismi di disseminazione tumorale lungo i nervi.

Introduzione

La disseminazione tumorale, attraverso l'invasione locale e le metastasi regionali o a distanza, è la causa primaria di morte correlata al cancro. Sebbene la ricerca si sia concentrata sulle vie di diffusione vascolari o linfatiche, l'invasione neurale delle cellule tumorali è frequentemente osservata in molti tumori solidi, tra cui i tumori del pancreas 1,2, della prostata 3, della testa e del collo 4, della mammella5 e del colon-retto6. Negli ultimi anni, numerosi studi hanno evidenziato il ruolo emergente dei nervi nel promuovere la crescita e la progressione del tumore e, come vie di disseminazione, guidando lo sviluppo delle metastasi 7,8. In questo contesto, le neuroscienze del cancro sono emerse come un campo di ricerca di primo piano, offrendo nuove prospettive in oncologia chiarendo le interazioni tra le cellule tumorali e i componenti fondamentali del sistema nervoso periferico (SNP) che possono contribuire a questi processi 8,9.

Il SNP è costituito sia dai nervi periferici che dai gangli, che sono strutture eterogenee composte da diversi tipi di cellule, tra cui neuroni di varie dimensioni e funzioni, cellule di Schwann e altre cellule gliali, fibroblasti, macrofagi, mastociti, melanociti e cellule endoteliali vascolari che formano il sistema vascolare locale10. Il PNS è un componente critico del microambiente tumorale (TME) e la comunicazione reciproca tra le cellule tumorali e i nervi, sia direttamente attraverso il contatto fisico che indirettamente attraverso il rilascio di fattori neurotrofici, neurotrasmettitori, fattori di crescita e altri segnali, può facilitare l'invasione neurale e promuovere fenotipi più aggressivi8.

I modelli in vitro possono essere utilizzati per caratterizzare i processi che contribuiscono al mantenimento e alla riparazione dei nervi e sono sempre più utilizzati per esaminare le interazioni cellulari tra nervi e cellule tumorali11,12. Un modello in vitro frequentemente utilizzato prevede l'estrazione di gangli della radice dorsale (DRG) di topo co-coltivati con cellule tumorali11. Questi modelli utilizzano spesso colture monostrato bidimensionali (2D) di cellule DRG dissociate per studiare la biologia neuronale in vitro e sono stati utilizzati per modellare le interazioni cellulari nel PNS13,14. Tuttavia, le colture 2D mancano della complessità del microambiente nervoso e rappresentano scarsamente la sua architettura in vivo. Supporti interi tridimensionali (3D) di neuroni periferici o gangli offrono un'alternativa che ricapitola più efficacemente la fisiologia dei nervi periferici per rappresentare le interazioni nervo-ambiente in modo più olistico 15,16,17,18. Tuttavia, l'eterogeneità di questo modello limita la capacità di visualizzare o quantificare le interazioni cellula-cellula e questi modelli sono più efficaci per osservare le risposte complessive dei nervi periferici che per esplorare specifiche interazioni cellulari e risposte meccanicistiche agli stimoli. Pertanto, è chiaro che le colture neuronali dissociate e a montatura intera sono complementari e che la valutazione di modelli 2D e 3D in parallelo è ottimale per valutare sia gli effetti complessivi che le risposte delle singole cellule agli stimoli.

Questo protocollo descrive i metodi per generare colture nervose complementari dissociate (2D) e a montaggio intero (3D) che possono essere utilizzate per valutare le interazioni tra nervo e cellule tumorali sia a livello cellulare che tissutale, fornendo una visione più completa di queste interazioni rispetto ai metodi che utilizzano un solo tipo di coltura 1,13. Questi modelli possono essere utilizzati per visualizzare e valutare i processi cellulari, tra cui la morfologia delle cellule nervose e la crescita dei neuriti, nonché le risposte delle cellule tumorali agli agenti chemiotattici secreti dai nervi, come i fattori neurotrofici, e il crosstalk tra neuroni sensoriali e cellule tumorali. Consente inoltre l'esplorazione di potenziali interazioni tra le cellule tumorali e altri componenti del microambiente neurale, come le cellule immunitarie, i fibroblasti e la glia. Evidenziamo l'applicazione di questi modelli per studiare le interazioni nervo-cellule tumorali nel tempo, visualizzate mediante colorazione di cellule vive o immunofluorescenza, come esempi di approcci per valutare o quantificare le interazioni e le risposte cellulari. Insieme, i risultati generati dall'uso di questi metodi possono migliorare la nostra comprensione di come il sistema nervoso promuove la crescita e la diffusione del cancro, aiutandoci a sviluppare strategie per colpire questi meccanismi.

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Protocollo

Tutto il lavoro sui topi è stato esaminato e approvato dall'Ufficio del Comitato per la cura degli animali dell'Università della Queen's University (numero di protocollo 2524). Gli animali sono stati mantenuti e sottoposti a eutanasia per la raccolta dei tessuti in conformità con le linee guida etiche del Canadian Council on Animal Care e del National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction on Animals in Research (Regno Unito). In questo protocollo, abbiamo utilizzato tessuto isolato da animali C57BL/6, ma abbiamo anche utilizzato con successo altri genotipi, tra cui gli animali KO per Rag2IL2Rγc. Le sezioni 1-6 possono essere eseguite in un ambiente pulito su un banco da laboratorio sterilizzato in superficie (vedi Figura 1), mentre le sezioni 7-9 devono essere eseguite in una cabina di sicurezza biologica. Per una migliore comprensione, sono state create rappresentazioni schematiche dei passaggi menzionati (Figura 1).

1. Preparazione delle soluzioni madre

  1. Preparare la soluzione di papaina e la soluzione di collagenasi IV/dispasi II. Sciogliere la papaina in PBS sterile (soluzione salina tamponata con fosfato) a una concentrazione di 30 U/mL; conservare in aliquote da 1 mL a -20 °C. Sciogliere la collagenasi di tipo IV a 1,25 mg/mL e la dispasi II a 2,5 mg/mL in PBS. Conservare in aliquote da 1 mL a -20 °C.
  2. Preparare terreni di coltura neurobasali (F12) integrati con integratore di B27 al 2% (50 volte la soluzione madre), il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina (Pen-Streptomicina) (100 volte la soluzione madre).
  3. Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con penicillina-streptomicina all'1% (100x soluzione madre).
    NOTA: Per supportare la sopravvivenza e l'attaccamento iniziale delle cellule, i terreni F12 integrati con il 10% di FBS vengono utilizzati per migliorare l'insediamento delle colture. Tuttavia, l'FBS promuove anche la proliferazione di cellule non neuronali, compresi i fibroblasti. Condizioni di terreni ridotti o privi di siero (ad esempio, F12 integrato solo con B27) possono essere utilizzate per ridurre al minimo la crescita di cellule non neuronali nella coltura DRG e nella co-coltura del cancro, ma possono influenzare la sopravvivenza, in particolare delle colture di neuroni dissociati. Anche i terreni privi di siero dovrebbero essere presi in considerazione quando si raccolgono terreni condizionati con DRG per valutarne gli effetti sul comportamento delle cellule tumorali.

2. Preparazione dei reagenti e dei materiali per la dissezione dei DRG (Figura 1A)

  1. Strumenti chirurgici in autoclave. Sterilizzare in superficie il microscopio da dissezione con etanolo al 70% e posizionarlo su un banco pulito.
  2. Aggiungere 6-8 ml di HBSS-Pen-Strep (passaggio 1.3) a due piastre di coltura da 10 cm e posizionare sul ghiaccio.
    NOTA: Queste placche verranno utilizzate per raccogliere le colonne vertebrali dopo la dissezione. A seconda del numero di midollo spinale da sezionare, potrebbero essere necessarie placche aggiuntive.
  3. Aggiungere 8-10 ml di HBSS-Pen-Strep a una provetta conica da 15 ml e posizionare sul ghiaccio.
  4. Aggiungere 3 ml di HBSS-Pen-Strep a una piastra di coltura di 3 cm e posizionare sul ghiaccio.
    NOTA: La provetta da 15 mL preparata nella fase 2.3 verrà utilizzata per raccogliere i DRG per la dissociazione, mentre la piastra di coltura da 3 cm (fase 2.4) verrà utilizzata per raccogliere i DRG per il modello a montatura intera.

3. Preparazione di reagenti e materiali per la coltura DRG a montaggio intero

NOTA: Alcuni passaggi di questa sezione potrebbero richiedere una preparazione notturna. Sebbene qualsiasi tipo di piastra per colture tissutali possa essere utilizzata per le colture DRG, i volumi e le istruzioni di questo protocollo sono stati ottimizzati per i vetrini con fondo in vetro a 8 pozzetti, che hanno fornito una qualità di imaging ottimale per le nostre analisi. Tenere sempre il vetrino con fondo in vetro a 8 pozzetti, i puntali delle pipette e il Matrigel sul ghiaccio.

  1. Scongelare la soluzione di Matrigel a 4 °C per una notte (o almeno 3 ore) prima dell'uso. Assicurati di tenere Matrigel sempre coperto di ghiaccio.
  2. Raffreddare i puntali delle pipette e il vetrino inferiore in vetro a 8 pozzetti a -20 °C durante la notte per ridurre al minimo l'adesione di Matrigel ai puntali e prevenire la polimerizzazione prematura di Matrigel nella piastra.
  3. Riscaldare il fluido integrato (passaggio 1.2) a 37 °C a bagnomaria.

4. Preparazione di reagenti e materiali per la coltura dissociata di DRG

  1. Scongelare la soluzione di papaina e la soluzione di collagenasi IV/dispasi II (fase 1.1) in un bagno d'acqua a 37 °C fino al momento dell'uso.
    NOTA: Per ogni topo sezionato, utilizzare 1 aliquota (1 ml) di soluzione di papaina e collagenasi IV/dispasi II.
  2. Terreni di coltura integrati a caldo (passaggio 1.2).

5. Prelievo della colonna vertebrale (Figura 1B) e sezionamento dei DRG (Figura 1C)

  1. Eutanasia di topi di 4-8 settimane mediante sovradosaggio di isoflurano seguito da lussazione cervicale. Stendere l'animale soppresso sull'addome e radergli il pelo, concentrandosi sull'area sopra la colonna vertebrale (Figura 1B, passaggi 1,2).
  2. Spruzzare la parte posteriore dell'animale con etanolo al 70% e rimuovere il pelo sciolto, strofinandolo con carta assorbente dalla coda al cranio per evitare che il pelo contamini la dissezione.
  3. Utilizzando le forbici sterilizzate, praticare un'incisione diritta lungo la superficie dorsale rasata, dalla coda al cranio. Ritrarre la pelle su entrambi i lati dell'incisione utilizzando una pinza smussata per esporre la colonna vertebrale (Figura 1B, passaggio 3).
  4. Usando un paio di pinze e forbici nuove per prevenire la contaminazione con il pelo, praticare un'incisione orizzontale alla base (estremità della coda) della colonna vertebrale (Figura 1B, passaggio 4).
  5. Praticare due incisioni longitudinali parallele su ciascun lato della colonna vertebrale per rilasciarla. Utilizzare una pinza per sollevare delicatamente la colonna vertebrale per rimuovere il tessuto connettivo circostante (Figura 1B, passaggio 5).
  6. Per rilasciare completamente la colonna vertebrale, praticare un'incisione nella parte superiore della colonna vertebrale (prossimale al cranio). Trasferire la colonna vertebrale nelle piastre prerefrigerate da 10 cm contenenti HBSS-Pen-Strep su ghiaccio (passaggio 2.2) (Figura 1C, passaggio 6).
    NOTA: È conveniente raccogliere tutte le colonne vertebrali nella stessa piastra da 10 cm e spostare le singole colonne una alla volta su una piastra separata per ulteriori fasi di dissezione.

6. Sezionamento dei gangli della radice dorsale (DRG)

  1. Utilizzando le forbici a molla, rimuovere qualsiasi residuo di tessuto connettivo attorno alla colonna vertebrale, esponendo le vertebre (Figura 1C, passaggio 7). Ciò consente una visualizzazione più chiara della vertebra e facilita il taglio lungo la linea mediana. Raccogliere le colonne rifilate in una piastra fresca e preraffreddata da 10 cm (passaggio 2.2).
  2. Uno alla volta, trasferire il midollo spinale tagliato sul tavolino del microscopio per la dissezione. Dividere con cura la colonna vertebrale sul piano sagittale utilizzando le forbici a molla (Figura 1D, passaggio 8).
  3. Utilizzando una pinza a punta fine, rimuovere il midollo spinale dalla colonna vertebrale, esponendo i DRG bilateralmente lungo le radici dei nervi spinali (Figura 1D, passaggio 9).
    NOTA: È necessario prestare particolare attenzione in questo passaggio poiché i DRG possono essere rimossi con il midollo spinale se viene maneggiato in modo troppo brusco.
  4. Tagliare i nervi spinali con le forbici a molla e rimuovere il tessuto connettivo attorno ai DRG (Figura 1D, passaggio 10).
    NOTA: La rimozione del tessuto connettivo in questa fase riduce al minimo i detriti nelle colture DRG.
  5. Usando una pinza a punta fine, tirare delicatamente il DRG per estrarlo dalla radice dorsale. Per la coltura dell'intera montatura, posizionare i DRG nella piastra da 3 cm (preparata al punto 2.4) (Figura 1D, passaggio 11). Raggruppare i DRG rimanenti in una provetta conica da 15 mL (preparata al punto 2.3) da utilizzare per la dissociazione.
    NOTA: Mantenere le piastre e le provette sul ghiaccio durante tutto il processo di dissezione.
  6. Ripetere i passaggi da 6.4 a 6.5 fino a quando tutti i DRG non sono stati estratti. Ripetere tutti i passaggi precedenti per eventuali colonne vertebrali aggiuntive.
    NOTA: I topi hanno 30-31 paia di DRG a seconda del ceppo, il che consentirà la raccolta di un massimo di 60 DRG da ciascun animale. Se si raccolgono DRG solo dalla parte lombare del midollo spinale, è possibile estrarre 10 DRG. L'utilizzo di DRG dello stesso animale per stabilire entrambi i modelli di coltura riduce la variabilità intra-sperimentale e garantisce risultati coerenti e comparabili tra esperimenti complementari.
    NOTA: Tutte le fasi successive all'estrazione dei DRG devono essere eseguite in una cappa di sicurezza biologica.

7. Cultura DRG a montaggio intero (Figura 2)

  1. Utilizzando puntali preraffreddati (passaggio 3.2), pipettare 2 μl di Matrigel refrigerato per formare una gocciolina in ciascun pozzetto di un vetrino inferiore a 8 pozzetti posizionato su ghiaccio (Figura 2A, passaggio 1). Per evitare che Matrigel polimerizzi prematuramente prima di aggiungere il DRG, pipettare solo una singola goccia alla volta. Per evitare di graffiare la superficie del vetrino, posizionare il vetrino in una piastra di 10 cm prima di metterlo sul ghiaccio.
  2. Utilizzando una pinza a punta fine, trasferire un DRG su una piastra asciutta e spostarlo delicatamente per rimuovere l'eccesso di HBSS, prevenendo un'ulteriore diluizione del Matrigel quando si aggiunge il DRG alla gocciolina di Matrigel. Trasferire il DRG nella goccia Matrigel (Figura 2A, passaggio 2).
    NOTA: Utilizzare una pinza a punta fine per spingere delicatamente il DRG nella gocciolina Matrigel, assicurandosi che il DRG sia completamente immerso e posizionato centralmente all'interno della gocciolina.
  3. Ripetere i passaggi da 7.1 a 7.2 per ogni DRG aggiunto a una gocciolina Matrigel.
  4. Incubare il vetrino con fondo a 8 pozzetti a 37 °C per 5 minuti in un incubatore umidificato per consentire la polimerizzazione del Matrigel (Figura 2A, fase 3).
  5. Aggiungere con cautela 200 μl di terreno di coltura caldo integrato a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C con CO2 al 5% (Figura 2B, fase 4). Sostituire i terreni con nuovi terreni di coltura integrati ogni 72 ore.
  6. Monitorare il DRG utilizzando la microscopia a campo chiaro per valutarne la vitalità e la crescita neuronale ogni 24 ore (Figura 2C e Figura 3).
    NOTA: La vitalità può essere indicata da un aumento della lunghezza e della densità dei neuriti. Le immagini possono essere acquisite nel tempo per dimostrare lo sviluppo delle estensioni cellulari DRG (Figura 3).

8. Cultura DRG dissociata (Figura 4)

NOTA: Qualsiasi piastra multipozzetto può essere utilizzata per seminare i neuroni DRG dissociati. Tuttavia, in questo protocollo, sono stati utilizzati vetrini con fondo di vetro a 8 pozzetti perché fornivano una migliore confluenza cellulare e una migliore qualità di imaging per le analisi di immunofluorescenza.

  1. Rivestimento di piastre di coltura con collagene
    1. Preparare una soluzione di lavoro da 50 μg/mL di collagene I acidificato in HCl sterile 0,01 M in una cappa di sicurezza biologica.
    2. Pipettare 100 μL di soluzione di collagene I in ciascun pozzetto del vetrino inferiore a 8 pozzetti. Inclinare e ruotare delicatamente il vetrino per assicurarsi che la soluzione di collagene copra uniformemente l'intera superficie inferiore di ciascun pozzetto. Incubare il vetrino a 37 °C in un incubatore umidificato per 1 ora per garantire la polimerizzazione del collagene I.
      NOTA: Durante il periodo di incubazione, procedere con i passaggi 8.2 e 8.3.
    3. Dopo l'incubazione, pipettare delicatamente l'eventuale soluzione residua di collagene I non polimerizzato da ciascun pozzetto. Sciacquare ogni pozzetto con 100 μL di PBS. Pipettare il PBS in eccesso, lasciando un sottile strato residuo per evitare che il collagene si secchi.
      NOTA: Il vetrino con fondo in vetro a 8 pozzetti può rimanere nella cabina di sicurezza biologica fino a quando i DRG dissociati non sono pronti per la fase di semina.
  2. Digestione enzimatica
    1. Centrifugare delicatamente la provetta da 15 mL contenente i DRG estratti (passaggio 6.5) per 5 minuti a 200 × g a temperatura ambiente per pellettare i DRG. Rimuovere delicatamente l'HBSS utilizzando una pipetta.
    2. Sciacquare i DRG in un mezzo integrato preriscaldato, picchiettando delicatamente il tubo per assicurarsi che tutto il contenuto venga lavato e centrifugare per 5 minuti a 200 × g per pellettare i DRG.
    3. Pipettare il terreno e aggiungere 1 mL di soluzione di papaina (Figura 4A, passaggio 1). Mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a 37 °C in un incubatore per colture tissutali. Agitare delicatamente il tubo per agitarlo ogni 5 minuti.
    4. Dopo 20 minuti, aggiungere 4,5 ml di terreno integrato e mescolare delicatamente per neutralizzare la papaina. Centrifugare la provetta per 5 minuti a 400 × g per pellettare DRG. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta.
    5. Aggiungere 1 mL di soluzione di Collagenasi IV/Dispasi II e incubare per 20 minuti a 37 °C nell'incubatore. Agitare delicatamente il tubo ogni 5 minuti (Figura 4A, passaggio 1).
    6. Dopo 20 minuti, aggiungere 4,5 ml di terreno integrato e mescolare delicatamente per neutralizzare la soluzione di Collagenasi IV/Dispasi II. Centrifugare la provetta per 5 minuti a 400 × g per pellettare DRG. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta.
    7. Aggiungere 2 mL di terreno integrato e aggiungere DNasi I a una concentrazione finale di 0,2 mg/mL. A questo punto, i DRG vengono digeriti a fondo e possono apparire come un grumo sciolto (Figura 4A, passaggio 2).
  3. Dissociazione meccanica
    1. Triturare delicatamente il DRG, pipettandolo su e giù 4-5 volte utilizzando un puntale per pipetta con filtro da 1000 μl (Figura 4A, fase 2).
    2. Eseguire una seconda fase di triturazione utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl 4-5x. Dopo questo passaggio, il campione appare torbido con alcuni grumi visibili di tessuto rimanenti (Figura 4A, passaggio 2).
    3. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta conica da 50 mL. Sciacquare gradualmente il filtro con 10 ml di terreno per garantire la completa filtrazione delle cellule attraverso il filtro (Figura 4A, passaggio 3).
    4. Centrifugare la provetta per 5 minuti a 1.000 × g in celle a pellet. Rimuovere il terreno dal pellet e risospendere in 500 μl di terreno integrato (Figura 4A, passaggio 4).
    5. Rimuovere eventuali residui di PBS dai pozzetti del vetrino inferiore a 8 pozzetti. Distribuire la sospensione DRG dissociata tra i pozzetti rivestiti di collagene. Incubare i vetrini a 37 °C in un incubatore umidificato con CO2 al 5%. Aggiungere altri terreni secondo necessità e sostituirli con terreni di coltura freschi e integrati ogni 48 ore (Figura 4B, passaggio 5).
      NOTA: Le cellule dissociate da DRG possono essere contate utilizzando un emocitometro o una camera di conteggio delle cellule e la colorazione con blu di tripano per garantire un numero costante di cellule per pozzetto. Per questo protocollo, in ciascun pozzetto sono state seminate circa 1 × 105 cellule.
    6. Monitorare le cellule derivate da DRG utilizzando la microscopia in campo chiaro per valutare la vitalità e la crescita neuronale (Figura 4C e Figura 5).
      NOTA: I neuroni appaiono come corpi cellulari arrotondati con bordi definiti e possono impiegare 24 ore o più per aderire, mentre le cellule non neuronali in genere si depositano prima dei neuroni. Una certa crescita di neuriti può essere osservata dopo 24 ore e aumenta nel tempo fino a 7 giorni in coltura. Le cellule derivate da DRG dissociate e il DRG a montatura intera vengono preincubati per 72 ore prima di aggiungere cellule tumorali e stabilire co-colture.

9. Preparazione di sospensioni di cellule tumorali e creazione di co-colture

NOTA: Possono essere utilizzate cellule tumorali aderenti di molti tipi. I terreni di crescita e il numero di cellule per le co-colture dipenderanno dalla linea cellulare. Si consiglia di eseguire test preliminari prima dell'esperimento per determinare i tempi di raccolta delle cellule e i numeri ottimali di semina delle cellule. Il protocollo qui descritto si basava sull'uso di linee cellulari di cancro al pancreas umano PanC1 e MiaPaCa2 e di linee cellulari di cancro alla prostata DU-145.

  1. Lavare le cellule con terreni privi di siero e tripsinizzarle per circa 3 minuti con 2 mL di tripsina/piastra da 10 cm.
  2. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 6 mL di terreno integrato e pipettare delicatamente su e giù per garantire una sospensione a singola cellula. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e una colorazione blu di tripano.
  3. Sospendere le cellule tumorali a una concentrazione di 2 × 105 cellule/mL in terreno integrato (fase 1.2).
    NOTA: La densità cellulare ottimale può variare a seconda delle dimensioni della cellula, del tempo di raddoppio e della durata della co-coltura e può essere regolata secondo necessità.
  4. Co-coltura di DRG a montaggio intero e cellule tumorali (Figura 6B)
    1. Aspirare il terreno dall'intera montatura DRG nelle guide con fondo in vetro a 8 pozzetti.
    2. Pipettare delicatamente 200 μl di sospensione di cellule tumorali (passaggio 9.3) sopra la gocciolina Matrigel contenente l'intero DRG della montatura.
      NOTA: Ciò garantisce una distribuzione uniforme delle cellule tumorali attorno alla gocciolina. Fare attenzione a non disturbare la gocciolina Matrigel con il puntale della pipetta.
    3. Incubare il vetrino di co-coltura in un incubatore umidificato a 37 °C con CO2 al 5%. Rinfrescare quotidianamente il terreno lavandolo una volta con 200 μL di terreno integrato riscaldato, quindi aggiungendo 300 μL di terreno integrato a ciascun pozzetto.
      NOTA: Aspirare delicatamente il terreno utilizzando una pipetta per evitare di disturbare la co-coltura di DRG-cellule tumorali. Nel corso del tempo, man mano che le co-culture diventano più complesse e organizzate, diventano anche più suscettibili ai disturbi che possono influire sulle interazioni cellulari e sull'integrità della co-cultura.
    4. Monitorare la co-coltura utilizzando un microscopio a campo chiaro o a fluorescenza a intervalli di 24 ore per valutare il comportamento delle cellule tumorali e le interazioni neuronali (Figura 6B).
      NOTA: La frequenza di osservazione può essere regolata in base alla sequenza temporale sperimentale e alle interazioni cellulari di interesse.
  5. DRG dissociato e co-coltura di cellule tumorali (Figura 6C)
    1. Aspirare i terreni dalle colture dissociate nel vetrino con fondo di vetro a 8 pozzetti.
    2. Distribuire delicatamente 200 μl della sospensione di cellule tumorali (passaggio 9.3) in ciascun pozzetto. Seguire le stesse fasi di incubazione, rinfresco dei terreni e monitoraggio descritte per le co-colture a montatura intera (passaggi 9.4.3 e 9.4.4).
      NOTA: Per una migliore visualizzazione dei processi cellulari e delle interazioni cellula-neurone tumorale, è possibile aggiungere alla coltura tracciatori cellulari fluorescenti, seguendo il protocollo del produttore.

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Risultati

Il nostro protocollo descrive l'isolamento di cellule primarie di topo derivate da DRG e la creazione di due modelli di coltura complementari: DRG dissociato e colture di DRG montate intere, che ci consentono di studiare le interazioni nervo-cellula tumorale a diversi livelli di complessità. Un vantaggio chiave di questo protocollo è che entrambi i tipi di coltura possono essere generati utilizzando DRG isolati dallo stesso animale, il che riduce al minimo la variabilità inter-animale e i...

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Discussione

Il protocollo qui presentato descrive metodi migliorati per stabilire colture nervose primarie DRG 2D e 3D e la loro applicazione in co-coltura con cellule tumorali. Questo protocollo avanza rispetto ai metodi precedenti stabilendo i due modelli in parallelo. Poiché i modelli 2D e 3D vengono stabiliti contemporaneamente, utilizzando nervi primari isolati dagli stessi animali, la variazione interanimale e intersperimentale è ridotta al minimo e i dati di entrambi i modelli possono essere ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni operative degli Istituti canadesi per la ricerca sanitaria (PJT-178274) (LMM), da una borsa di studio per laureati dell'Ontario (LCBO) e da una borsa di studio del Coordinamento per il miglioramento del personale dell'istruzione superiore - Brasile (CAPES) - Codice finanziario 001 (ERP). LMM è titolare della cattedra Bracken in Genetica e Medicina Molecolare presso la Queen's University. Alcune immagini sono state generate in parte utilizzando Biorender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tools
70 µ m Filtro cellulareProgene71-229483-ULTUtilizzato per la sospensione di celle filtranti
Vetrini con fondo in vetro a 8 pozzettiIBidi, Monaco di Baviera, Germania80807
Dumont #5 - Pinze finiStrumenti di Fine Science, Città Foster, Stati Uniti11254-20
Pinze Dumont #5Strumenti di Fine Science, Città Foster, Stati Uniti11252-20
Forbici finiStrumenti di Fine Science, Città Foster, Stati Uniti91460-11
Pinza modelloStrumenti di Fine Science, Città Foster, Stati Uniti91121-12
Forbici a mollaStrumenti di Fine Science, Città Foster, Stati Uniti91500-09
Reagenti
1x soluzione salina tamponata con fosfatoSigma, St. Louis, Stati UnitiD8662-500MLUtilizzato per sciogliere gli enzimi
Supplemento B-27 (50x)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti17504044Utilizzato al 2% di concentrazione in mezzi F12
Collagene bovino di tipo ICorning Incorporated, New York, Stati Uniti354231Utilizzato per il rivestimento di lastre, soluzione di lavoro 50 & micro; g/mL in 0,01 M HCl
Collagenasi di tipo IVSigma-Aldrich, St. Louis, Stati UnitiC4-BIOCSciogliere in PBS a 1,25 mg/mL, aliquota, conservare a -20 ° C
Applicazione IIRoche, Basilea, Svizzera4942078001Sciogliere in PBS a 2,5 mg/mL, aliquota, conservare a -20 ° C
DNasi IRoche, Basilea, Svizzera.11284932001Aggiunto alla concentrazione finale di  0,2 mg/mL durante la dissociazione
Siero fetale bovino (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, Stati UnitiF1051Utilizzato al 10% di concentrazione in mezzi F12
HBSS (Soluzione salina bilanciata di Hank)Sigma, St. Louis, Stati UnitiH6648-500MLPreparato con l'1% di penicillina-streptomicina
Fattore di crescita Matrigel ridottoCorning Incorporated, New York, Stati Uniti356231Scongelare a 4 gradi C per una notte, conservare in ghiaccio
Miscela di nutrienti F-12 ProsciuttoSigma-Aldrich, St. Louis, Stati UnitiN6658-500MLTerreno basale per la preparazione di terreni di coltura integrati
PapainaRoche, Basilea, Svizzera.10108014001Sciogliere in PBS a 30 U/mL, aliquota, conservare a -20 gradi C
Penicillina-Streptomicina (100x)Sigma-Aldrich, St. Louis, Stati UnitiP4333-100MLUtilizzato all'1% di concentrazione nei fluidi
Soluzione blu di TrypanSigma-Aldrich, St. Louis, Stati UnitiT8154-100MLPer valutare la vitalità cellulare
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti12605-028Per la raccolta di cellule tumorali
Anticorpi
Anticorpo β-Tubulina IIIAbcam (Cambridge, Regno Unito)AB15568Diluizione 1:200
Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati UnitiA-11008Diluizione 1:2000
Alexa Fluor 594Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati UnitiCodice A-21442Diluizione 1:2000
Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati UnitiA-21245Diluizione 1:2000
Anticorpo NeuNSigma-Aldrich, St. Louis, Stati UnitiVisualizzazione MAB377Diluizione 1:100
Fluorescent Coloranti & Sonde
Reagente ActinGreen 488 ReadyProbes (falloidina)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati UnitiR37110Diluizione 1:40
CellTrace Calceina Rosso-ArancioThermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati UnitiCodice C34851Cell tracker utilizzato per visualizzare i neuroni al microscopio a fluorescenza
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati UnitiH3570Diluizione 1:5000

Riferimenti

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