Articolo metodologico

Fabbricazione di una matrice cerebrale espandibile personalizzabile in tutte le fasi dello sviluppo

DOI:

10.3791/68638

⸱

20 febbraio 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Spinal Cord and Brain Injury Research Center, Department of Physiology, College of Medicine, University of Kentucky, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, University of Kentucky, 3Department of Neurosurgery, University of Kentucky

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un metodo innovativo per costruire matrici cerebrali espandibili in grado di tagliare le fette coronali o sagittali è descritto per l'applicazione ai maialini neonatali. Questo approccio economico utilizza lastre acriliche scolpite utilizzando modelli provenienti da modellatura cerebrale in gel di agarosio, si applica a più specie e consente l'espansione per consentire la crescita cerebrale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il crescente interesse nell'utilizzare i maialini appena nati come modello di studio per lo sviluppo neonatale e la patologia ha sollevato la necessità di una matrice cerebrale per acquisire con precisione le sezioni istologiche. Tuttavia, la rapida crescita del cervello neonatale limita l'utilità delle matrici disponibili commercialmente a una finestra di sviluppo ristretta. Pertanto, è stato sviluppato un metodo di costruzione della matrice cerebrale regolabile. Per prima cosa, un contenitore di vetro è stato posato su ghiaccio umido e uno strato di gel di agarosio al 4% è stato posato sul fondo. Successivamente, su questo strato veniva posto un cervello fissato con formol, che si inglobava con un gel di agarosio al 4%. Dopo che il gel si solidificò, il gel sopra il cervello veniva rimosso con cura e il cervello veniva estratto. La cavità è stata riempita con gel di agarosio al 4% e inchiostro indiano al 2%. Dopo la solidificazione, il blocco di gel veniva rimosso e tagliato nello spessore desiderato (2 mm o 5 mm) e nell'orientamento (coronale o sagittale) per stampare i modelli cerebrali su carta a squame. I modelli venivano copiati su una serie di lastre acriliche trasparenti (spessore 2 mm o 5 mm) e ritagliate di conseguenza con una sega a nastro. Infine, le piastre venivano assemblate e fissate con tre set di bulloni e dadi attraverso fori di allineamento preforati per costruire una matrice cerebrale personalizzata. La costruzione sia delle matrici coronali che sagittali è illustrata per un cervello di maiale neonatale al giorno 5 con passi di 2 mm e una matrice coronale per cervelli postnatali dal giorno 32 al 38 con passi di 5 mm. Aggiungendo o rimuovendo adeguate lastre acriliche, la matrice veniva adattata per adattarsi alle varie dimensioni dei cervelli di maialino. Così, viene introdotto nella comunità della ricerca neurologica un metodo semplice ed economico per personalizzare le matrici cerebrali di diverse dimensioni di animali di grandi dimensioni.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo sviluppo cerebrale dei maialini imita da vicino quello degliesseri umani 1,2,3,4. Pertanto, cresce l'interesse nell'uso dei maialini per studi preclinici su disturbi neuroevolutivi, malattie neonatali e pediatriche, e lesioni (Figura 1A,B)5,6,7,8,9,10. Come visto nella Figura 1, il maialino neonatale, come modello animale di grande dimensione, ha un cranio e un cervello più vicini a quelli di un feto umano prematuro (Figura 1A,B), mentre i teschi adulti di topo e ratto sono almeno due dimensioni più piccoli.

Tuttavia, ci sono sfide nell'uso di mammiferi di grandi dimensioni nella ricerca biomedica rispetto ai modelli murini più diffusi. I cervelli dei maialini neonatali crescono rapidamente nei primi 3 mesi dopo la nascita. Nelle prime 5 settimane di vita, il cervello del maialino quasi raddoppia di peso e triplica di volume (Figura 1C)4,11,12,13. Nel periodo che va da p5 a p38, la crescita cerebrale e lo sviluppo di giri e solci sono stati notevoli (Figura 1C). Il peso e il volume del cervello del maialino p5 erano di 29,5 g e 18,9 mL, mentre i due cervelli p32 erano rispettivamente di 51,4 e 52,6 g, e rispettivamente di 49,6 e 53,5 mL. A 38 giorni, il cervello è cresciuto fino a 53,7 g e 52,5 mL, rappresentando un aumento dell'80% di peso e del 170% di volume rispetto al p5. Questa rapida crescita del cervello del maiale neonatale rappresenta una sfida per una sezionamento istologico accurato dei cervelli di porcellini di diversa età, ceppi o sessi, utilizzando una sola matrice.

Le matrici cerebrali commerciali per maialini hanno un costo approssimativo da 1.000 a 3.600 dollari ciascuna e sono disponibili solo in un'unica misura, progettate per essere utilizzate per maialini di età pari o inferiore a 2 settimane. Sebbene ci siano alcune pubblicazioni che hanno utilizzato la tecnica della scansione 3D e della stampa 3D per creare varie matrici cerebrali per pesci zebra, topi euccelli 14,15,16, queste matrici sono su scala relativamente ridotta. Non esistono serie di risonanze magnetiche consolidate o un grafico dettagliato di crescita per il cervello dei maialini neonatali, specialmente per quelli di 2 settimane o meno numerosi. Pertanto, abbiamo creato diversi modelli di brain slice utilizzando cervelli raccolti tra il giorno 5 e il giorno 38, sulla base dei quali è stato stabilito un sistema di matrice cerebrale regolabile.

Questo protocollo descrive un metodo innovativo per stabilire modelli cerebrali neonatali per i maialini e sviluppare una costruzione personalizzabile di matrici cerebrali basata su piastre acriliche che può essere utilizzata per la sezionazione coronale o sagittale del cervello su uno spettro di dimensioni.

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Protocollo

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In questo articolo, i quattro cervelli di maialino sono stati raccolti e preparati per la colorazione istologica dopo l'eutanasia umana seguendo un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Kentucky per uno studio separato. Tutte le procedure sui soggetti animali sono state approvate e sono state adottate cure adeguate per minimizzare lo stress o il dolore associati ai trattamenti o all'eutanasia.

1. Animali

  1. Procurarsi quattro maialini maschi neonatali (giorni postnatali 4, p4) (peso corporeo 1,5-1,8 kg) con un background genetico del 62,5% Landrace, 25% Large White e 12,5% Yorkshire.
  2. Ospita gli animali insieme in una stanza dedicata in un porcile, con il supporto di una lampada riscaldante e un pavimento coperto da asciugamani. Nutrili ad libitum con sostituto del latte per la prima settimana e poi passa gradualmente al cibo a pellet a 2-3 settimane.
  3. Monitorare l'attività fisiologica e il peso corporeo ed eseguire scansioni magnetiche settimanali sotto anestesia isofluorana.
  4. Eutanasiare con overdose di pentobarbital e perfusere transcardicalmente con soluzione salina eparinizzata, seguita da formalina tamponata neutra al 10%.
  5. Disseziono il cervello dalcranio 17, fissate con formalina durante la notte, poi inserite il 30% di saccarosio in PBS per 3 giorni per la crioconservazione.

2. Modellaggio del gel di agarosio

  1. Immergi un contenitore di vetro in un secchio di ghiaccio umido fino alla sua metà altezza (Figura 2A).
  2. Usa una striscia di plastica resistente come rivestimento per il contenitore e assicurati che la parte inferiore e le pareti laterali siano completamente coperte, lasciando entrambe le estremità almeno 5 cm sopra il bordo superiore.
  3. Riscaldare 150 mL di PBS in un becher di vetro a 90 °C su una piastra riscaldante con un mescolatore magnetico e aggiungere e sciogliere gradualmente 6 g di agarosio per ottenere un gel di agarosio al 4% in PBS.
  4. Versare uno strato spesso 0,5-1 cm nel contenitore di vetro (Figura 2B) e aspettare che si solidifichi.
  5. Applica un sottile strato di olio minerale topicamente sul cervello (Figura 2C) e posiziona il cervello sullo strato di gel (Figura 2D).
  6. Lascia raffreddare la soluzione di agarosio a 50 °C. Immergere il cervello con gel di agarosio raffreddato (Figura 2E) e lasciarlo solidificare (Figura 2F), che generalmente richiede ~10 minuti su ghiaccio umido.
  7. Rimuovere con cura lo strato superiore di gel di agarosio sopra il cervello (Figura 2G) con una sonda chirurgica ed estrarre il cervello dallo stampo solidificato (Figura 2H,I).
  8. Riscalda 98 mL di PBS in un altro becher di vetro a 90 °C su una piastra riscaldante con un mescolatore magnetico, aggiungi 4 g di agarosio e 2 mL di inchiostro indiano, e lascia mescolare e mescolare bene. Versare il 4% di agarosio con il 2% di inchiostro indiano nella cavità lasciata dal cervello estratto (Figura 2J) fino a essere piena e lasciarlo solidificare sul ghiaccio umido per 15 minuti (Figura 2K).
  9. Utilizzando le parti sporgenti della striscia di plastica, solleva la striscia di plastica per rimuovere l'intero blocco di agarosio dal contenitore (Figura 2L).

3. Taglio a blocchi d'agarosio e copia di modelli su carta in scala

  1. Per proteggere la carta dall'umidità durante la procedura di affettazione, posiziona un foglio di carta in scaglie tra due lastre acriliche trasparenti spesse 0,76 mm (0,03") (Figura 3A) e posiziona la lastra laminata in carta-acrilico posizionata vicino al bordo del banco.
  2. Fissare i quadrati d'angolo al banco con le pinze in una posizione appropriata per mantenere in piedi due piastre acriliche spesse 5 mm e tenere saldamente il blocco di gel in mezzo con l'orientamento desiderato (sagittale nella Figura 3). Assicurati che il bordo di ogni piastra acrilica verticale sia allineato sulla stessa linea sulla carta a scala da usare come riferimento per il taglio del blocco di gel. Usa un peso per fissare il blocco gel all'estremità opposta rispetto a dove avverrà il taglio (Figura 3B).
  3. Usando la carta a scaglie sottostante come guida, sposta il blocco di gel in avanti da tra le lastre acriliche nel passaggio desiderato (2 mm o 5 mm), tieni la lama del microtomo con entrambe le mani e taglia la parte oltre il bordo anteriore della piastra acrilica (Figura 3B).
  4. Raccogli ogni fetta (Figura 3C), mettila su una carta a scala separata (Figura 3D), premi delicatamente la parte tinta con inchiostro indiano del calco sulla carta a scala per trasferire il contorno (Figura 3E), traccia il contorno dell'intera sezione gel con una penna, rimuovi la sezione gel e contorna la stampa con inchiostro indiano anch'essa con una penna (Figura 3F). Fai attenzione a mantenere coerente l'orientamento di ogni fetta e il modello copiato.
  5. Ripeti i passaggi 2.3 e 2.4 finché tutti i pezzi di gel non vengono copiati sulla carta a scala e numerati in sequenza. Ricontrolla le fette e le loro stampe (immagini rappresentative delle fette coronali e delle stampe nella Figura 3G,H).

4. Intaglio su lastre acriliche

  1. Taglia le scanalature sulla grande lastra acrilica con un coltello da taglio in plexiglass e spacca le placche grandi in pezzi da 10 x 8,5 cm.
    NOTA: Il numero totale di pezzi dipende dalla dimensione del cervello, dallo spessore desiderato della fetta e dall'orientamento per la fettatura. Generalmente, prepariamo 25 pezzi di piastre acriliche da 2 mm per una matrice coronale o sagittale per cervelli di maialini neonati e 15 pezzi di piastre da 5 mm per cervelli più grandi per una maggiore gestione.
  2. Punto di riferimento di tre fori di ancoraggio sulla piastra acrilica alle coordinate x, y misurate dall'angolo inferiore sinistro (in mm): (11, 42); (45, 15); e (88, 42).
  3. Fissa le piastre acriliche con il supporto di quadrati e morsetti agli angoli sulla piattaforma del trapano colonna. Forare tre fori di ancoraggio alle coordinate sopra menzionate con una punta a piastra acrilica (Figura 4A). Disegna una linea di colore sul lato destro di tutte le lastre per indicare l'orientamento.
  4. Rimuovi la pellicola protettiva dalla piastra acrilica e posizionala sopra il modello sulla carta a scala, allineando il bordo superiore della lastra acrilica alle linee superiori del modello copiato sulla carta a scaglia. Traccia il contorno del cervello sulla piastra acrilica con un pennarello permanente (Figura 4B). Etichetta la targa in modo sequenziale come nel modello.
  5. Taglia la piastra acrilica della sega a nastro lungo le linee del modello (Figura 4C). In alternativa, usa uno strumento rotativo con un kit di taglio multiuso e una punta per intaglio del legno per rimuovere le aree indesiderate.
  6. Lucidare il bordo tagliato con lo strumento rotativo con una punta abrasiva per levigare i bordi lasciati dallo strumento da taglio (Figura 4D).
  7. Ricontrolla i tagli sulle lastre acriliche rispetto al modello sulla carta a scala (Figura 4E). Rifinitura e lucida se necessario.
  8. Preassemblare la matrice impilando le piastre tagliate in ordine sequenziale e controllare l'allineamento delle lastre (Figura 4F).

5. Assemblaggio ed espansione della matrice cerebrale

  1. Posiziona tre rondelle tra le lastre di acrilico, ciascuna centrata su un foro di ancoraggio (Figura 5A). Incollarli intorno ai fori di ancoraggio con la supercolla sullo stesso lato di tutte le lastre acriliche per ridurre i tempi di assemblaggio (Figura 5A).
  2. Impila le piastre acriliche in sequenza, inserisci bulloni in acciaio inox attraverso ogni foro di ancoraggio per assemblare la matrice e stringi i dadi per fissarli (Figura 5A).
  3. Applica la lucidatura finale dei bordi tagliati che entreranno a contatto con i cervelli per lisciare le lastre.
  4. Codifica a colori la parte superiore della matrice per aiutare a identificare i passaggi durante il slicing. Colora alternativamente i bordi superiori delle lastre con nero, rosso e poi bianco per formare un modello. Ripeti questo passaggio finché tutte le tavole non saranno codificate a colori con lo stesso motivo (Figura 5).
  5. Per regolare la geometria o modificare la dimensione della cavità per adattarla meglio a determinati cervelli, rimuovere o aggiungere alcune lastre acriliche selezionate (Figura 5B) per adattarle a diverse dimensioni cerebrali, il che aumenta notevolmente la flessibilità di queste matrici e può far risparmiare materiali e sforzo.

6. Taglio coronale o sagittale del cervello

  1. Avvolgi un'estremità della lama criostatica ad alto profilo con nastro da laboratorio per almeno 2 cm di lunghezza per proteggere la mano dell'utente. Metti il cervello saldamente nella cavità della matrice. Tenendo l'estremità avvolta della lama, posizionare con cura la lama tra le lastre acriliche della matrice, poi tagliare il cervello in tagli coronali o sagittali con il cervello sostenuto e fissato dall'altra mano (Figura 6A,B).
    NOTA: Attenzione: 1) Poiché ciascuna parte del cervello ha texture diverse dopo la fissazione della formalina, bisogna prestare attenzione ad applicare una pressione uniforme sulla lama. 2) Inoltre, il cervello del maialino è grande, quindi è meglio usare un movimento di taglio per tagliare il cervello piuttosto che un movimento diretto di "spinta verso il basso". 3) È fondamentale mantenere il cervello ben integrato nella matrice con il supporto dell'altra mano durante il taglio per evitare inclinazioni o cambiamenti di orientamento. La pressione eccessiva sul cervello contro la matrice dovrebbe essere evitata in ogni momento.
  2. Metti tutte le fette in un piatto a 6 pozzi o in un vassoio in acciaio inox riempito di PBS. Disponi con cura le fette nella stessa orientazione (Figura 6C, D) e conserva o procedi secondo necessità.

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Risultati

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Un maialino è stato soppresso con overdose di pentobarbital all'età di p5. Gli altri tre animali hanno mostrato attività fisiologiche normali e un aumento di peso corporeo simile (raggiungendo 7,44-8,4 kg). Due maialini hanno ricevuto una risonanza magnetica settimanale sotto anestesia isoflurana fino all'eutanasia al p32. Il quarto maialino rimase ingenuo fino all'eutanasia a p38.

La somiglianza di dimensioni della testa tra maialino e feto umano può essere v...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta la metodologia per creare matrici cerebrali accessibili e facili da costruire che possono essere utilizzate per aiutare nel taglio del cervello del maialino o di qualsiasi altra specie di animali di grandi dimensioni nell'orientamento e nello spessore desiderati. È importante sottolineare che, a differenza delle matrici commerciali di "dimensioni fisse" che funzionano solo con un intervallo limitato di dimensioni cerebrali, questo approccio permette di regolare...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (NIH) #R21-NS114771 (K.E.S.), #R56-NS117587, #R01-EB028792, #R01-HD101508, #R21-HD091118, #R41-NS122722, #R42-MH135825 (G. Y.), American Heart Association (AHA) #16GRNT30820006 (G.Y.) e #14SDG20480186 (L.C.), e dall'Area Prioritaria di Ricerca in Neuroscienze dell'Università del Kentucky (L.C.). I maschi ingenui di maiali neonatali furono acquistati tramite la Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) presso il Swine Center del College of Agriculture dell'Università del Kentucky.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
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Sostituto del latte per diritto di nascita (Pipestone)PipestoneSKU  8229https://pipevet.com/birthright-baby-pig-milk-replacer
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Inchiostro indianoSpeedball SUPER NERO
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Nastro da laboratorioavantor76276-016
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Olio mineraleSigma-AldrichM8410-100ml
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Consiglio per lucidatura e levigatura20 pezzi di puntini per muva in carburo da 1/8"
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Piastra riscaldante a mescolamentoCorning100493-718
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Riferimenti

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