Articolo metodologico

Imaging ad alto plex con microscopia confocale spettrale per ridurre al minimo la fluorescenza tissutale non specifica

DOI:

10.3791/68644

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28 ottobre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1McMaster Immunology Research Centre, Department of Medicine, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 2Schroeder Allergy and Immunology Research Institute, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 3Carl Zeiss Canada MicroImaging, 4Division of Otolaryngology, Department of Surgery, McMaster University Medical Centre, McMaster University Medical Centre

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo sbiancamento iterativo spettrale estende la multiplexità (IBEX) si basa sulla tecnica IBEX di base aggiungendo il blocco dell'eparina per ridurre al minimo il legame non specifico e sfruttando il rilevamento spettrale con la miscelazione computazionale per sopprimere l'autofluorescenza. Questo approccio accelera l'acquisizione delle immagini riducendo al contempo le fonti di fondo, consentendo solide analisi proteomiche spaziali multi-round e ad alto parametro.

Abstract

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L'imaging altamente multiplexato consente lo studio di cellule funzionalmente diverse e delle loro nicchie all'interno dei loro ambienti tissutali nativi. Lo sbiancamento iterativo estende la multiplexità (IBEX) è una tecnica di immunomarcatura ciclica e inattivazione dei fluorofori che consente di visualizzare più marcatori sulla stessa sezione di tessuto. Le immagini acquisite possono essere successivamente analizzate per acquisire dati di singole celle per definire i cluster di cellule, le loro localizzazioni e i tipi di cellule vicine. L'interpretazione di questi dati si basa sulla capacità di distinguere le espressioni dei veri marcatori dalle fonti di fondo inerenti alla microscopia a fluorescenza. Spectral IBEX, un adattamento del protocollo IBEX, integra il rilevamento confocale spettrale con l'unmixing computazionale e incorpora il blocco dell'eparina per ridurre il legame off-target basato sulla carica. Questa combinazione migliora il rapporto segnale/fondo, sopprime l'autofluorescenza tissutale e riduce al minimo il sanguinamento, riducendo al contempo il tempo di acquisizione rispetto all'imaging confocale multitraccia convenzionale. L'applicazione al tessuto polipo nasale umano, un modello caratterizzato da un alto contenuto di eosinofili e da una forte autofluorescenza, ha dimostrato l'imaging affidabile di 26 marcatori nei compartimenti strutturali, immunitari e dello stato cellulare in sei cicli di imaging. Il flusso di lavoro risultante genera informazioni proteomiche ad alta dimensione e spazialmente risolte che catturano l'architettura complessa dei tessuti e le nicchie cellulari. Insieme, questo approccio ottimizzato fornisce una strategia robusta e ampiamente applicabile per l'imaging multiplexato, particolarmente adatta ai tessuti in cui l'autofluorescenza e la colorazione non specifica limitano gli approcci convenzionali.

Introduzione

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I tessuti sono costituiti da un insieme diversificato di cellule con funzioni specializzate che si organizzano in strutture tridimensionali e, attraverso l'interazione, coordinano i processi biologici necessari per la vita. La patologia insorge quando le interruzioni della composizione cellulare o dell'architettura dei tessuti interferiscono con queste interazioni e compromettono l'omeostasi tissutale1. La conoscenza di come i numerosi tipi di cellule specializzate si localizzano e interagiscono all'interno dei nostri tessuti è necessaria per comprendere la biologia che è alla base della salute e della malattia umana.

I progressi nelle tecnologie di profilazione di singole cellule a livello trascrittomico, epigenomico e proteomico hanno scoperto un'eccezionale diversità di tipi cellulari specializzati. 2,3 Tecnologie come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e la citometria a flusso spettrale possono misurare il numero di parametri necessari per caratterizzare queste popolazioni eterogenee. Tuttavia, questi approcci mancano di informazioni spaziali, poiché le cellule devono essere dissociate dal loro ambiente tissutale nativo in sospensioni di singole cellule 4,5. Pertanto, sono stati identificati tipi di cellule associati a vari contesti patologici, ma le loro interazioni all'interno del tessuto e il loro contributo alla perpetuazione della malattia rimangono poco chiari.

Per affrontare alcune di queste limitazioni, sono state sviluppate diverse tecnologie spazio-omiche per catturare l'eterogeneità cellulare all'interno di un tessuto, preservando al contempo la posizione di ciascuna cellula6. Ad esempio, la trascrizione genica può essere misurata amplificando l'RNA in punti rasterizzati attraverso una sezione di tessuto (ad esempio, Visium) o utilizzando sonde di ibridazione dell'RNA mirate a un pannello di geni specifici che vengono visualizzati con una risoluzione di una singola cellula (ad esempio, Xenium)7,8. Questi metodi sono efficaci per tracciare i modelli trascrizionali e i meccanismi di regolazione all'interno dei tessuti. Tuttavia, i profili trascrizionali spesso sono scarsamente correlati con l'espressione proteica, che riflette più direttamente le capacità funzionali di una cellula9. L'espressione proteica può essere identificata utilizzando anticorpi specifici coniugati a fluorofori, che possono essere rilevati mediante microscopia a fluorescenza10,11. L'uso della microscopia a fluorescenza tradizionale può consentire l'imaging discreto di oltre sei di questi fluorofori coniugati con anticorpi. Tuttavia, i profili di eccitazione ed emissione sovrapposti di questi fluorofori determinano incertezza sull'origine del segnale di fluorescenza in un dato canale12.

Lo sbiancamento iterativo estende la multipleXity (IBEX) è un metodo di imaging ad alto contenuto sviluppato per superare questa limitazione della microscopia a fluorescenza 13,14,15. IBEX utilizza il boroidruro di litio (LiBH4) per inattivare chimicamente i fluorofori dopo l'imaging, consentendo di ricolorare lo stesso campione di tessuto con un successivo ciclo di anticorpi coniugati con fluorofori prima della ri-imaging. IBEX preserva l'integrità dei tessuti, consentendo a molti cicli di imaging di visualizzare un numero teoricamente illimitato di marcatori sulla stessa sezione di tessuto. L'allineamento computazionale delle immagini acquisite fornisce una caratterizzazione a livello omico con risoluzione di una singola cellula, preservando i dati spaziali per rivelare nicchie cellulari. Questi dati possono anche rivelare interazioni cellulari putative, anche se queste dovrebbero essere convalidate utilizzando altre tecniche16. IBEX è un metodo open source compatibile con i fluorofori disponibili in commercio ed è supportato da una comunità internazionale di ricercatori che hanno convalidato i reagenti e condiviso pubblicamente i dati per promuovere l'accessibilità, l'adozione rapida e la generazione di dati di alta qualità17,18.

In questo lavoro, è stato progettato un protocollo modificato di IBEX per superare due importanti sfide della tecnica: l'autofluorescenza tissutale e il legame non specifico di sonde anticorpali coniugate con fluorofori (collettivamente denominate background). L'autofluorescenza si verifica quando l'eccitazione di molecole fluorescenti endogene a un tessuto emette luce che si sovrappone al segnale desiderato ottenuto dai fluorofori coniugati con anticorpi 19,20. Il legame off-target o non specifico di anticorpi coniugati con fluorofori provoca la fluorescenza da cellule o strutture che non esprimono la proteina bersaglio21,22. Questi artefatti possono portare alla conclusione imprecisa che una cellula esprime un marcatore che non esprime veramente, complicando così le analisi computazionali e l'assegnazione accurata del tipo di cellula. Combinando la neutralizzazione della carica a base di eparina del segnale fuori bersaglio con l'acquisizione spettrale completa e l'unmixing computazionale, l'IBEX spettrale riduce notevolmente il bleed-through, migliora il rapporto segnale/sfondo (SBR) e dimezza il tempo di acquisizione per round.

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Protocollo

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I tessuti dei polipi nasali utilizzati in questo studio sono stati raccolti durante la chirurgia dei seni paranasali presso Hamilton Health Sciences con l'approvazione etica dell'Hamilton Integrated Research Ethics Board. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti.

1. Raccolta dei campioni

  1. Ottenere campioni durante le procedure di polipectomia di routine eseguite su pazienti con rinosinusite cronica. Dopo la rimozione chirurgica, posizionare i campioni in una fiala contenente soluzione fisiologica su ghiaccio per il trasporto ed elaborarli immediatamente per l'imaging per preservare l'integrità dei tessuti.

2. Preparazione del reagente

  1. Preparare la soluzione di fissazione e permeabilizzazione diluendo la soluzione di fissaggio e permeabilizzazione ottenuta a 1:4 in PBS. Preparare la soluzione di crioconservazione come saccarosio al 30% in PBS. Preparare il tampone di diluizione come 0,1% v/v Triton X-100 in PBS.
  2. Preparare il reagente in blocco BSA come albumina sierica bovina all'1% p/v in tampone di diluizione. Preparare il reagente blocco di eparina come sale sodico di eparina 10KU in 1 mL di PBS. Preparare il tampone di blocco mescolando il reagente a blocchi di eparina (1:50) con il reagente a blocchi Fc (1:100) nel reagente a blocchi BSA.
  3. Preparare la miscela colorante come anticorpo titolato a diluizioni appropriate in tampone bloccante. Preparare la soluzione sbiancante aggiungendo 10 mg di LiBH4 in 10 mL di acqua ultrapura.

3. Lavorazione e macroscopia dei tessuti

  1. Ispezionare i tessuti con un microscopio da dissezione (in genere con un ingrandimento di ~15x, anche se questo può variare a seconda del campione e del microscopio) e rimuovere il grasso e l'osso con una pinza e un bisturi. Per preservare al meglio il tessuto, utilizzare strumenti puliti, lavorare su una superficie fredda e bagnata e ridurre al minimo la durata della lavorazione.
  2. I tessuti grossolani > 0,5 cm di spessore in fette di 4-5 mm con un bisturi23. Immergere le fette nella soluzione di fissazione e permeabilizzazione e ruotarle a °C per 16 ore.
    NOTA: Il volume di questa soluzione e delle altre del passaggio 3.3 deve essere circa 20 volte il volume del campione, in una provetta di dimensioni adeguate.
  3. Spostare il fazzoletto nel PBS e risciacquare per 5 minuti. Immergere il tessuto nella soluzione di crioconservazione e incubare a °C per 16 ore. Non lavare dopo questo passaggio, poiché ciò reintrodurrebbe acqua nel tessuto.

4. Congelamento dei tessuti

  1. Etichettare una piastra a 6 pozzetti con i dettagli dell'esperimento e del campione sopra ogni pozzetto e metterla in un congelatore a -20 °C a raffreddare per almeno 20 minuti.
  2. Riempire un criomold di dimensioni adeguate con un composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT). Evita di creare bolle nell'OCT. Trascina le bolle più grandi sui bordi del criopoldo usando un ago o la punta di una pipetta.
    NOTA: Un criomold può essere realizzato utilizzando un foglio di alluminio avvolto attorno a una piccola fiala o tubo a fondo piatto.
  3. Rimuovere il tessuto dalla soluzione di crioconservazione. Tamponare delicatamente il fazzoletto su un panno privo di lanugine per rimuovere il liquido in eccesso, in quanto ciò può compromettere il congelamento.
  4. Riempire un becher da 250 ml con circa 100-150 ml di isopentano in una cappa aspirante e metterlo in una scatola di schiuma o in un refrigeratore parzialmente riempito di azoto liquido.
    NOTA: L'isopentano evapora se lasciato aperto per più di 2 ore; Utilizzare subito dopo l'apertura. L'isopentano facilita il congelamento uniforme e rapido del tessuto. L'isopentano può congelarsi lentamente nel tempo. Se si congela solido, rimuovere il becher dall'azoto liquido e lasciarlo scongelare. L'isopentano può essere versato in una bottiglia di vetro con tappo per essere riutilizzato fino a 5 volte. Il livello dell'isopentano deve essere superiore all'azoto liquido per evitare che il becher galleggi o si ribalti.
  5. Regolare l'orientamento del tessuto come desiderato all'interno dell'OCT con un microscopio da dissezione.
    NOTA: Per i tessuti dei polipi nasali, in genere orientiamo il campione lungo il suo asse lungo per ottenere sezioni simmetriche che catturano l'area della sezione trasversale più ampia possibile. Consultare i manuali di istologia per il tessuto di interesse per un orientamento ottimale dell'inclusione.
  6. Immergere il fondo del criomold nell'isopentano. Rimuovere il criomold dall'isopentano quando il centro del tessuto è completamente bianco e opaco. Evitare di immergere completamente il criostampo; Il blocco potrebbe rompersi, compromettendo il sezionamento.
  7. Estrarre delicatamente il blocco dal criopoldo esercitando una pressione sul retro e posizionarlo nella piastra pre-raffreddata a 6 pozzetti a -20 °C. Dopo aver congelato tutti i campioni, trasferire la piastra in un congelatore a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
    NOTA: Questo è un punto di pausa. I fazzoletti possono essere conservati a -80 °C per anni.

5. Preparazione dei vetrini e criosezione

  1. Pipettare 10-1 μL di adesivo di gelatina di allume di cromo sui vetrini; Stendere uniformemente e asciugare all'aria per 15 min. Per un'adesione ottimale, applicare l'adesivo in gelatina di allume di cromo sui vetri di copertura camerati 2x-3x, aggiungendo 5 μl per applicazione (totale 15 μl).
  2. Dopo l'asciugatura, mettere i vetrini in forno a 80 °C per 1 ora per garantire la completa asciugatura. Se si utilizza un vetro di copertura a camera, lasciarlo asciugare a 37 °C per una notte, poiché la plastica potrebbe sciogliersi a 80 °C.
    NOTA: Una volta che i vetrini sono rivestiti e asciugati, possono essere conservati a temperatura ambiente per giorni fino al momento dell'uso. Dovrebbero essere coperti per evitare la polvere.
  3. Trasferire i tessuti da -80 °C a -20 °C (o nel criostato alla temperatura di taglio) per equilibrarli e pre-raffreddare per 1 ora prima del sezionamento. Tagliare sezioni da 10-2 μm su un criostato24.
    1. In caso di sezionamento in un vetro di copertura a camera, prelevare delicatamente la sezione con una pinza dopo aver sollevato la piastra antirollio. Utilizzare un pennello per stenderlo sul vetro all'interno della camera. Premere il pollice sotto il campione sul fondo del vetro di copertura per fondere la sezione sul vetro.
  4. Asciugare i vetrini a 3 °C per 1 h o a temperatura ambiente per 24 h.
    NOTA: Se i vetrini vengono utilizzati immediatamente, possono essere conservati temporaneamente a temperatura ambiente in una scatola per vetrini per proteggerli dalla polvere durante la preparazione per la colorazione. Tuttavia, se non vengono utilizzati subito, conservarli a -80°C per preservare l'integrità del tessuto. Questo è un punto di pausa. Se i vetrini vengono conservati a -80 °C, il processo può essere messo in pausa qui.

6. Blocco e marcatura immunocorpale

  1. Disegna un cerchio sul vetro attorno al tessuto usando una penna PAP per creare una barriera idrofobica che contiene il liquido durante la colorazione o altri passaggi. Non disegnare sull'OCT, poiché l'inchiostro idrofobico si sbiadisce quando l'OCT si dissolve.
    NOTA: Questo passaggio non è necessario per il vetro di copertura a camera, poiché le pareti trattengono il liquido nel pozzetto.
  2. Aggiungere ~100 μL di PBS a ciascun tessuto e incubare per ~2 minuti a temperatura ambiente per reidratare i tessuti e lavare via l'OCT. Utilizzare ~1 mL di PBS per il vetro di copertura a camera.
    NOTA: Per evitare che il tessuto si sollevi dal vetro, non pipettare il liquido direttamente sul campione.
  3. Aspirare il PBS e aggiungere 100 μl di tampone bloccante. Incubare a temperatura ambiente in una camera di umidità coperta per 1 ora. Utilizzare ~400 μL di tampone di blocco per il vetro di copertura a camera.
  4. Aspirare il tampone bloccante e aggiungere 100 μl della miscela colorante. Incubare in una camera di umidità coperta, posta all'interno del frigorifero (4 °C) per una notte. Utilizzare ~400 μl della miscela colorante per il vetro di copertura a camera. Preparare sezioni colorate con uno solo dei fluorofori del pannello, e un controllo negativo senza macchie, per definire lo spettro dei fluorofori e l'autofluorescenza dei tessuti.
    NOTA: Le diluizioni degli anticorpi devono essere ottimizzate sperimentalmente titolando a 1:50, 1:100 e 1:200 o un'altra diluizione secondo necessità. Scegli la quantità minima di anticorpi che produrrà il segnale ottimale. Puntare a fare in modo che l'intensità di tutti gli anticorpi nel pannello sia approssimativamente equivalente per massimizzare l'efficacia di non miscelazione spettrale. Proteggere i campioni dalla luce oltre questo passaggio per ridurre al minimo il fotosbiancamento dei fluorofori.
  5. Aspirare la miscela colorante e lavare 3 volte con PBS (10 μL, 2 min ciascuno), aspirando il liquido tra un lavaggio e l'altro. Utilizzare ~1 mL di PBS per il vetro di copertura a camera.
  6. Aggiungere ~10 μL di materiale di montaggio a ciascuna sezione. Pipettare lentamente per evitare bolle d'aria che creeranno aberrazioni ottiche durante l'imaging. Aspirare le bolle che si formano utilizzando una pipetta. Per il vetro di copertura a camera, aggiungere 1 mL di terreno di montaggio a ciascun pozzetto.
    NOTA: I seguenti passaggi, 6.7 e 6.8, non sono necessari per il vetro di copertura a camera.
  7. Appoggiare delicatamente il vetro di copertura n. 1 da 22 mm x 50 mm sul campione.
    NOTA: Le bolle possono essere ridotte al minimo premendo con decisione un'estremità del vetro di copertura sul mezzo di montaggio e lasciando che il vetro cada sul campione, distribuendo uniformemente il fluido. Lo spessore del vetro di copertura deve corrispondere alle specifiche della lente dell'obiettivo (ad esempio, vetrino coprioggetti #1.5 per la maggior parte degli obiettivi ad alta apertura numerica). Se la lente dell'obiettivo è dotata di un collare di correzione, assicurarsi che sia regolato sulla dimensione corretta del vetrino coprioggetti. L'uso di uno spessore o di un'impostazione del collare errati può causare aberrazione sferica e produrre immagini sfocate o distorte.
  8. Capovolgere la diapositiva e premere delicatamente su un panno privo di lanugine per espellere il mezzo di montaggio in eccesso.
    NOTA: Evitare di spingere verso il basso con troppa forza sul carrello. Una forza eccessiva può danneggiare o deformare il tessuto, il che potrebbe influire sull'allineamento tra i cicli di imaging.

7. Configurazione e imaging del microscopio

NOTA: Questo protocollo si riferisce specificamente a ZEISS LSM980 e ad altri sistemi ZEISS. Questi passaggi possono essere diversi in altri sistemi. Due flussi di lavoro sono dettagliati: confocale tradizionale + unmixing (acquisizione multitraccia con unmixing spettrale computazionale post hoc), che può essere utilizzato quando non è disponibile un rivelatore spettrale, ma che ha tempi di acquisizione più lunghi e un po' di bleed-through residuo; e il rilevamento spettrale completo (acquisizione spettrale a passaggio singolo, 34 canali), il nostro metodo preferito, poiché fornisce il miglior SBR, diafonia vicina allo zero e tempi di imaging più rapidi.

  1. Microscopia confocale tradizionale
    1. Accendere il sistema del microscopio (inclusi laser, rilevatori e computer) circa 30 minuti prima dell'imaging.
    2. Nella schermata di controllo del microscopio raggiungibile facendo clic su Microscopio > obiettivi, selezionare la lente dell'obiettivo appropriata (ad es. 20x 0,8 NA) e pulirla con un panno sicuro per le lenti, se necessario.
    3. Montare il campione in modo sicuro sul tavolino. Tentare di allineare il vetro o coprire la camera del vetro contro lo stesso angolo/estremità del supporto del carrello per facilitare l'allineamento X-Y di giri consecutivi. Questo dipenderà dal supporto installato.
    4. Mettere a fuoco il campione utilizzando gli oculari sull'illuminazione GFP, YFP o RFP, quindi passare alla scheda Acquisizione sullo schermo del computer.
      NOTA: Non utilizzare il filtro DAPI quando si mette a fuoco il campione utilizzando gli oculari perché l'esposizione della macchia DAPI alla luce UV (utilizzando il cubo filtro DAPI) ne causerà la fotoconversione in una molecola fluorescente verde (Figura supplementare 1A).
    5. Configura tracce di imaging che riducono al minimo la sovrapposizione e l'eccitazione laser incrociata (la Tabella supplementare 1, la Tabella supplementare 2 riporta le impostazioni di acquisizione per gli esperimenti di microscopia confocale tradizionale mostrati qui).
      NOTA: Le combinazioni ideali prevedono picchi di eccitazione ed emissione distinti, come DAPI o AF488 insieme ad AF594, AF647 o AF700.
      1. Assegna il laser o i laser di eccitazione ottimali per ogni traccia. Regola la dimensione del foro stenopeico su 1 AU o unità Airy per ogni traccia per un sezionamento ottico ottimale.
      2. Regolare separatamente l'intervallo di lunghezze d'onda di acquisizione per ciascun rivelatore sintonizzabile nella traccia, in base ai fluorofori per la traccia.
      3. Regolare le impostazioni di potenza del laser e guadagno del rivelatore per massimizzare l'SBR. Assicurarsi che pochissimi pixel, se presenti, raggiungano l'intensità massima.
        NOTA: Per evitare il fotosbiancamento e/o la sovraesposizione dei rilevatori, mantenere la potenza del laser il più bassa possibile. Ottimizza le diluizioni degli anticorpi in modo da rilevare un segnale forte sopra il fondo.
    6. Premere il pulsante della modalità di scansione continua per visualizzare in anteprima il campione e impostare i parametri di scansione (velocità di scansione, risoluzione e media se necessario).
      NOTA: Per le tessere piccole e per ridurre al minimo lo sfondo, si consiglia un tempo di permanenza compreso tra 0,2 e 0,3 μs, con 1-2 cicli di media. Per massimizzare la velocità preservando la segmentazione e la risoluzione di una singola cella, utilizzare la massima velocità di scansione senza media e una dimensione dei pixel di 0,2-0 μm/pixel. Ad esempio, l'imaging a 2048 x 2048 pixel per riquadro con un obiettivo 20x/0,80 NA produce 0,20 μm/pixel su un campo di 424,26 x 424,2 μm2.
    7. Esegui scansioni di prova per ogni traccia per verificare la presenza di diafonia o smarginamento.
      1. Sul vetrino colorato con tutti i marcatori, in modalità di scansione continua, avviare ciascun laser a bassa potenza e sollevarlo solo fino a quando il marcatore è chiaramente visibile senza saturazione (utilizzare l'indicatore LUT/saturazione).
        NOTA: Se possibile, si consiglia di utilizzare un campione replicato o una regione indesiderata per ottimizzare le impostazioni del microscopio prima di eseguire l'imaging del campione sperimentale. Ciò è particolarmente importante quando si colora con DAPI (per evitare il rischio di fotoconversione) o fluorofori che fotosbiancano rapidamente (ad esempio, PE).
      2. Passa al controllo a colorazione singola per quel fluoroforo. Regola la potenza del laser e il guadagno del rivelatore in modo che il segnale sia luminoso e insaturo.
      3. Sullo stesso vetrino con una sola colorazione, eseguire la scansione di tutti gli altri canali di rilevamento. Se l'intensità fuori canale supera lo sfondo, restringere la finestra di rilevamento e/o ridurre l'eccitazione/guadagno.
      4. Ripetere 7.1.7.1-7.1.7.2 per ogni fluoroforo. Dopo ogni regolazione, controllare brevemente le macchie precedentemente ottimizzate per mantenere le intensità comparabili, soprattutto per i marcatori che co-localizzano.
    8. Abilita la funzione Riquadri e definisci una regione di acquisizione dei riquadri.
      1. Ottimizza la messa a fuoco per la regione di acquisizione delle tessere al centro del tessuto. Trova una caratteristica unica (un insieme di celle in una certa disposizione) come riferimento per l'allineamento nei cicli successivi.
    9. Abilita la funzione Z-stack e vai alla scheda Z-stack. Vai alla scheda Centro. Impostate il numero di sezioni nello stack Z su almeno 6, con un intervallo di almeno 1 μm tra le sezioni. Quindi, fare clic sul pulsante Centra per posizionare il punto AF corrente (determinato nel passaggio 6.1.8.1) come sezione centrale della pila.
    10. Fai clic sul pulsante Avvia esperimento per iniziare ad acquisire le immagini. Salva le impostazioni di acquisizione ed esegui il backup dei dati dell'immagine facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla miniatura dell'immagine e selezionando Salva con nome. Quindi, scegli la posizione del file e assegna un nome all'immagine.
    11. Separa l'immagine utilizzando le stesse impostazioni ottimizzate dall'acquisizione della regione piastrellata, cattura uno Snap da ciascun controllo con colorazione singola per ottenere lo spettro del segnale reale e dal controllo non colorato per catturare lo sfondo/autofluorescenza, preparato al passaggio 6.4.
      1. Queste immagini vengono utilizzate per l'unmixing spettrale; Non selezionare il segnale reale da campioni multiplexati. Confermare che la regione selezionata rappresenti veramente il segnale assicurandosi prima che l'intensità/morfologia sia assente o equivalente al fondo nel controllo non colorato e quindi abbinando la localizzazione attesa del marcatore (ad esempio, membrana vs nucleare vs modelli citoplasmatici vs secreti).
      2. Apri l'immagine di snap. Fare clic sulla scheda Unmixing . Utilizza uno degli strumenti di selezione della regione nella scheda Strumenti di dismix per disegnare un ROI attorno al segnale positivo (apparirà uno spettro di quella regione). Ripetere l'operazione per ogni immagine istantanea di ciascun fluoroforo per creare spettri di riferimento per la dismiscelazione.
        1. Confrontare questo spettro con lo spettro teorico del fluoroforo per assicurarsi che la regione selezionata sia rappresentativa del segnale reale. Assegna un nome allo spettro in base a ciascun fluoroforo e salvalo nel database spettrale.
          NOTA: Uno spettro per l'autofluorescenza può essere identificato e trattato come un fluoroforo separato per separarlo da altri segnali. Una volta completata l'ottimizzazione del pannello, non è necessaria l'acquisizione di nuovi riferimenti, in quanto è possibile riutilizzare le stesse impostazioni purché si utilizzi lo stesso protocollo e lo stesso tipo di tessuto.
      3. Carica l'immagine affiancata e vai allo strumento di dismiscelazione. Utilizzare il pulsante + per aggiungere gli spettri di riferimento per ciascun fluoroforo all'elenco di demiscelazione, quindi fare clic sul pulsante Linear unmixing (Unmixing lineare ).
    12. Salvare l'immagine non miscelata per un'analisi successiva.
      NOTA: L'output è un'immagine a più porzioni con un canale per ogni marcatore. L'esperimento può essere messo in pausa qui prima di continuare.
    13. Acquisire l'immagine di riferimento dell'ombreggiatura
      1. Utilizzando la stessa identica impostazione utilizzata per l'immagine del campione, acquisire un'immagine di un vetrino di calibrazione DAPI. Salvare l'immagine, quindi estrarre solo il canale DAPI da utilizzare come riferimento per l'ombreggiatura. L'output è un'immagine a campo piatto (Figura 1B supplementare).
        NOTA: Non è necessario acquisire un'immagine di riferimento per ogni campione. Finché si utilizza lo stesso strumento con le stesse impostazioni, il riferimento deve essere lo stesso. Non è necessario questo riferimento se le immagini acquisite non presentano artefatti di ombreggiatura, come mostrato nella Figura 1C supplementare.
  2. Microscopia confocale spettrale
    1. Accendere il sistema del microscopio (inclusi laser, rilevatori e computer). Selezionare l'obiettivo appropriato (ad es. 20x 0,8 NA o qualsiasi altro obiettivo) e pulirlo se necessario.
    2. Montare il campione in modo sicuro sul tavolino. Assicurarsi che il vetrino coprioggetti sia rivolto verso l'obiettivo.
    3. Mettere a fuoco il campione utilizzando il campo chiaro o DIC, quindi passare alla modalità di fluorescenza. Configurare l'acquisizione spettrale. La Tabella 3 supplementare riporta le impostazioni di acquisizione per gli esperimenti di microscopia confocale spettrale mostrati qui.
      1. Assegna i laser corretti.
        NOTA: Alcuni laser possono eccitare più fluorofori. Quindi, potrebbe non essere necessario avere un laser unico per ogni fluoroforo.
      2. Selezionare un divisore di raggio appropriato per le linee laser utilizzate. Consentire a tutti i rilevatori di catturare la maggior parte possibile dello spettro. Regolare la dimensione del foro stenopeico su 1 UA per un sezionamento ottico ottimale.
    4. Ottimizza l'impostazione del laser
      1. Utilizzando una sezione macchiata con tutti i pennarelli, avviare la modalità di scansione continua con laser a bassa potenza. Regolare l'intensità per ciascun laser fino a quando i marcatori possono essere identificati con un buon SBR.
        NOTA: Sebbene ciò non consenta una regolazione precisa per i fluorofori spettralmente sovrapposti, contribuirà a ridurre al minimo il numero di volte in cui i vetrini colorati singolarmente devono essere accesi al microscopio.
      2. Usa sezioni a colorazione singola per regolare con precisione le intensità del laser per ogni fluoroforo. Passa iterativamente dalle sezioni a macchia singola alla sezione con tutti i marcatori fino a quando il segnale di ciascun marcatore può essere visualizzato senza sovrasaturazione.
        NOTA: Ogni volta che viene regolata un'impostazione di intensità o guadagno del laser, rivisitare i vetrini a macchia singola precedentemente ottimizzati per garantire che il segnale rimanga ottimale. Per unmixare al meglio, i livelli di intensità del segnale dovrebbero essere il più simili possibile tra i marcatori, in particolare tra i marcatori che colocalizzano. Se possibile, si consiglia di utilizzare un campione replicato o una regione indesiderata per ottimizzare le impostazioni del microscopio prima di eseguire l'imaging del campione sperimentale. Ciò è particolarmente importante quando si colora con DAPI (per evitare il rischio di fotoconversione) o fluorofori che fotosbiancano rapidamente (ad esempio, PE).
    5. Eseguire i passaggi 7.1.8 - 7.1.14.

8. Rimozione del vetrino coprioggetto (vale solo per i vetrini, non per il vetro di copertura a camera)

  1. Immergere il vetrino nel PBS e lasciare che il vetrino coprioggetti si stacchi. Non tentare di forzare il vetrino coprioggetti, poiché ciò potrebbe deformare il tessuto, causando problemi di allineamento nei successivi cicli di imaging o il completo distacco dal vetrino. Utilizzare un contenitore abbastanza grande da contenere il vetrino e assicurarsi che possa essere completamente immerso nel PBS.

9. Sbiancamento e ciclismo con fluorofori

  1. Solo per il vetro di copertura a camera: aspirare quanto più terreno di montaggio possibile utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto.
    NOTA: Inclinare la camera lateralmente può facilitare l'aspirazione.
  2. Lavare 3 volte con ~1 mL (vetro di copertura a camera) o ~100 μL (vetrini) di PBS per 2 minuti fino a quando il terreno di montaggio non viene rimosso completamente.
  3. Preparare la soluzione sbiancante nella cappa aspirante. Pesare 10 mg di LiBH4 direttamente in un becher asciutto utilizzando una micro spatola. Aggiungere con cautela 10 mL di acqua ultrapura direttamente nel becher contenente LiBH4 e mescolare fino a completa dissoluzione per ottenere la soluzione sbiancante.
    NOTA: Prepararsi immediatamente prima dell'uso per la massima reattività.
    ATTENZIONE: LiBH4 è estremamente infiammabile, quindi questo passaggio richiede estrema cura: assicurarsi che la cappa sia utilizzata correttamente (ad esempio, anta ad altezza adeguata, DPI adeguati, ecc.) e lavorare solo con <10 mg di LiBH4 alla volta. Assicurarsi che il bicchiere sia completamente asciutto prima di aggiungere LiBH4: in caso contrario, si può provocare un incendio.
  4. Aggiungere ~100 μL di soluzione sbiancante, utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, a ciascuna sezione di tessuto e incubare a temperatura ambiente nella cappa aspirante per 15 minuti. Utilizzare 2 mL di soluzione sbiancante per i vetrini della camera.
  5. Se si sbiancano i coloranti BV (ad es. BV421, BV510, ecc.), spostare con cautela il pozzetto su un microscopio a epifluorescenza. Seleziona il filtro DAPI, metti a fuoco il campione e illuminalo a piena potenza.
    1. Usa l'obiettivo 5x per un campo di illuminazione più ampio. Abbassare il livello il più in basso possibile per evitare danni agli obiettivi e all'alloggiamento.
  6. Decantare la soluzione di LiBH4 dal pozzetto utilizzando una pipetta di vetro Pasteur e aggiungerla nuovamente al becher della soluzione di LiBH4 .
    NOTA: Questo è ora un rifiuto LiBH4; La soluzione non può essere conservata per un uso futuro.
  7. Lavare i vetrini 3 volte con il tampone di diluizione e incubare per ~3 minuti. Il volume totale è di 2 mL per i vetrini da camera.
  8. Aggiungere la miscela di anticorpi e colorare come da protocollo normale (Passaggi 6.3 - 6.8).
  9. Aggiungere 2N H2SO4 goccia a goccia al LiBH4 di scarico nella cappa, mescolando regolarmente.
    ATTENZIONE: LiBH4 bolle in modo aggressivo. Queste bolle sono gas H2 che viene rilasciato dal LiBH4; H2 è molto infiammabile, quindi prestare la massima attenzione in questo passaggio e aggiungere H2SO4 molto lentamente.
  10. Versarlo in un sottofondo assorbente quando la soluzione non bolle più. Sciacquare il becher con acqua ultrapura e versarlo nel sottopanno assorbente.
    ATTENZIONE: Mettere il sottoassorbente in un sacchetto per prodotti chimici/rischio biologico, fissarlo e smaltirlo secondo le linee guida locali sui rischi chimici.

10. Elaborazione post-acquisizione delle immagini

  1. Aprire l'immagine di riferimento (dal passaggio 7.1.14) nel software Zen facendo clic su File > Apri > Seleziona immagine di riferimento.
    NOTA: Le fasi di elaborazione delle immagini post-acquisizione possono essere eseguite in alternativa in pacchetti software open source. (ad esempio, ImageJ).
  2. Per ottimizzare la gamma dinamica, regolare la luminosità e il contrasto fare clic su Elaborazione > intensità > contrasto, Allunga contrasto > Auto > Applica.
  3. Per modificare il tipo di pixel a 32 bit, fare clic su Elaborazione >immagine > Converti tipo di pixel > 32 bit (mobile).
  4. Normalizzare l'immagine di riferimento facendo clic su Elaborazione > Intensità > Normalizza (pixel saturi = 0%) > Applica.
  5. Smussare l'immagine di riferimento facendo clic su Elaborazione > Arrotonda > Gaussiana > inserire il raggio (ad esempio, 2-5 px) > Applica (Figura 1B supplementare).
    NOTA: Ottimizza il raggio di sfocatura gaussiana provando valori diversi. Per conoscere la corretta divisione dei valori (Calcolatore di immagini di > di processo), l'immagine di riferimento grezza per l'immagine elaborata e l'immagine risultante deve avere un'intensità uniforme (tutti i pixel hanno approssimativamente lo stesso valore).
  6. Aprire l'immagine a più tessere da correggere facendo clic su File > Apri > selezionare l'immagine a più tessere.
  7. Applicare la correzione delle unioni e delle ombreggiature utilizzando il riferimento elaborato facendo clic su Elaborazione > Cucitura con i seguenti parametri.
    1. Seleziona la casella di fusione. Seleziona la casella di ombreggiatura corretta e dal menu a discesa scegli l'immagine di riferimento elaborata (passaggio 10.5). Mantieni invariati tutti gli altri parametri.
      NOTA: Potrebbe essere necessario regolare i parametri per ottenere i migliori risultati.
    2. Nel menu Input/Output, scegliere l'immagine multi-tile come input e il riferimento di ombreggiatura come riferimento.
    3. Premi il pulsante Applica in alto e verrà generata una nuova immagine con cuciture e ombreggiature corrette (Figura 1D supplementare).
      NOTA: La correzione dell'unione (Figura supplementare 1I-J) è necessaria per garantire l'accuratezza dell'allineamento dell'immagine nelle fasi successive del processo.
    4. Salvare l'immagine corretta facendo clic su File > Salva > Seleziona cartella.

11. Allineamento dell'immagine

  1. Converti le immagini elaborate da qualsiasi formato in cui si trovino (.czs, .tif, ecc.) al formato Imaris utilizzando lo strumento Imaris File Converter.
    NOTA: Lo strumento può essere scaricato e installato seguendo le istruzioni su questo sito Web (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter).
  2. Avvia lo strumento di registrazione delle estensioni Imaris per registrare (allineare) le immagini di tutti i round in un'unica immagine con tutti i canali.
    NOTA: Per installare lo strumento e allineare correttamente le immagini, seguire le istruzioni sul seguente sito Web (https://github.com/niaid/imaris_extensions).
  3. Fare clic sul pulsante Estensioni Imaris . Selezionare SimpleITK Utilities > esportare le impostazioni del canale in CSV.
  4. Fare clic su Sfoglia, individuare un'immagine .ims (da uno dei round), selezionarla e fare clic su Apri.
  5. Fai clic su Esporta e scegli una posizione in cui salvare il file CSV. Inserisci un nome e fai clic su Salva.
  6. Apri il file CSV salvato e verifica che i nomi dei canali siano corretti. Modificare se necessario.
  7. Se vengono apportate modifiche, vai su Imaris Extensions > SimpleITK Utilities > Configura in batch le impostazioni del canale.
    NOTA: questo passaggio non è necessario se non sono state apportate modifiche nel passaggio precedente.
  8. Fare clic su Sfoglia, accedere al file CSV, selezionarlo e fare clic su Apri. Fare clic su Avanti, quindi su Sfoglia di nuovo per selezionare la stessa immagine .ims e fare clic su Apri.
  9. Fare clic su Configura per applicare le modifiche. Ripetere i passaggi 11.3-11.8 per tutte le immagini di round diversi.
  10. Una volta che i canali sono stati denominati correttamente, vai su Estensioni di Imaris > Algoritmi SimpleITK > Registrazione affine di Z-Stacks utilizzando un canale comune.
  11. Fate clic su Sfoglia (Browse), individuate la cartella contenente tutti i round, selezionate tutte le immagini e fate clic su Apri (Open).
  12. Fare clic su Avanti, selezionare il canale di registrazione (canale fiduciale). Per questo protocollo, è stato utilizzato il canale DAPI. Quindi scegli l'immagine fissa.
    NOTA: Scegli un canale/marcatore che rimanga costante tra i round e sia resistente agli agenti chimici o al fotosbiancamento (ad esempio, coloranti nucleari come DAPI). Quindi scegli l'immagine fissa.
  13. Fare clic su Impostazioni di registrazione avanzate, selezionare tutte le caselle tranne Maschera automatica e impostare Gaussian smoothing sigma su 5.0.
  14. Fare clic su Fine, quindi su Registra per eseguire l'allineamento. Una volta completata la registrazione, fare clic su Ricampiona e salva immagine combinata.
  15. Dopo il ricampionamento, selezionare il canale fiduciale e fare clic su Calcola correlazione. I file di output includono un'immagine output.ims allineata, due PDF che mostrano la qualità dell'allineamento prima e dopo la registrazione, un file JSON contenente le impostazioni utilizzate per la registrazione e un file TXT con il registro dell'intero processo.

12. Allineamento dell'immagine

  1. Segmentare celle/oggetti utilizzando CellPose (v2.5)25
  2. Per ogni set di dati con colorazione singola, generare una maschera di segmentazione dal canale di rilevamento del marcatore (Esempio: per la colorazione singola CD20, generare la maschera dal canale di rilevamento AF488 (il canale previsto per CD20)).
  3. Applicare la maschera di segmentazione del passaggio 2 a tutti i canali dello stesso set di dati (nell'esempio CD20, la maschera derivata da AF488 viene applicata ad AF488 per misurare il segnale reale e a tutti gli altri canali di rilevamento per misurare il bleed-through).
  4. Estrai le intensità e le aree per oggetto in Python utilizzando scikit-image (regionprops_table) e NumPy.
  5. Rapporto segnale/sfondo (SBR)
    1. Calcola l'intensità media dell'oggetto su tutti i ROI segmentati nel canale di rilevamento previsto per il marcatore.
    2. Definisci l'intensità dello sfondo come l'intensità media di tutti i pixel al di fuori delle ROI nello stesso campo visivo, escludendo la spaziatura interna con valore zero o i pixel fuori limite.
      Calcola SBR come:
      figure-protocol-1
    3. Visualizza le distribuzioni SBR con i grafici a violino, mostrando i valori per oggetto come punti (o valori per campo dove indicato).
  6. Quantificazione del sanguinamento
    1. Per ogni canale non previsto, calcola il bleed-through (%) utilizzando le stesse ROI della maschera nel passaggio 12.2:
      figure-protocol-2
    2. NOTA: le entrate diagonali sono uguali al 100%, poiché nel canale previsto di un'immagine a macchia singola, il numeratore e il denominatore sono identici (il vero segnale del marcatore misurato nel proprio canale).

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Due sfide fondamentali affrontate dalle tecniche di imaging in immunofluorescenza sono il legame non specifico delle sonde anticorpali coniugate con fluoroforo e l'autofluorescenza tissutale. Questo protocollo è progettato per aiutare a distinguere un segnale reale dal fondo per ottimizzare le tecniche di immunofluorescenza multiplexata.

Il blocco dell'eparina riduce il legame non specif...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spectral IBEX, un adattamento del protocollo IBEX, affronta con successo due questioni chiave nell'imaging in immunofluorescenza: il legame non specifico e l'autofluorescenza. Il trattamento di tessuti altamente eosinofili con eparina e l'utilizzo della miscelazione spettrale per eliminare l'autofluorescenza e la sovrapposizione spettrale tra i canali hanno aumentato significativamente il rilevamento del vero segnale sopra il fondo. L'acquisizione di tutti i marcatori in un unico passagg...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JFEK, MJ ricevono finanziamenti da ALK Abello A/S. JFEK riceve commissioni di consulenza da Merida Biosciences.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo i dottori Andrea Radtke e Ziv Yaniv per il loro supporto durante l'onboarding e l'iterazione di IBEX. Ringraziamo i dottori João Bronze de Firmino e Mouhanad Babi per il supporto alla microscopia e la risoluzione dei problemi, e il Centre for Advanced Light Microscopy di McMaster per l'accesso ai loro microscopi. Ringraziamo Tina Walker, Jianping Wen e Rangana Talpe Guruge per il supporto tecnico. Questo lavoro è supportato da una sovvenzione per la ricerca sulle allergie alimentari peer-reviewed finanziata congiuntamente dal CIHR Institute of Infection and Immunity (CIHR-III), CIHR Institute of Circulatory and Respiratory Health (CIHR-ICRH) e dalla Canadian Allergy, Asthma and Immunology Foundation (CAAIF). Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes of Health Research (PJT-198169; JFEK), JP Bickell Foundation Medical Research Grant (JFEK), Canadian Allergy Asthma and Immunology Foundation (JFEK, MJ), Canadian Society of Allergy and Clinical Immunology (VO, MJ), Schroeder Foundation (JFEK, SW, MJ), Food Allergy Canada (JFEK, SW, MJ), ALK Abello A/S (JFEK, MJ), Zych Family (SW, MJ), Buckrell Family (JFEK), Ontario Graduate Scholarship (SD) e il Bachelor of Health Sciences Program presso la McMaster University (VO).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di acido solforico 2N (H2SO4)N/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
Becher da 500 mLN/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
Piastra a 6 pozziN/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
BCL-6 - Alexa Fluor 647BD in Biologia561525Fattore di diluizione 1:100
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization KitBD in Biologia554722
Microscopio da banco per dissezioneN/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
Albumina Sirica Bovina (BSA)SIGMA-ALDRICHA4503
CD11c - Alexa Fluor 700BD in Biologia561352Fattore di diluizione 1:100
CD138/Syndecan-1 - PEBioLegend356503Fattore di diluizione 1:200
CD20 - Alexa Fluor 488Invitrogen53020282Fattore di diluizione 1:100
CD21 - Alexa Fluor 532NovusBioNBP2-60733AF532Fattore di diluizione 1:100
CD23 - PEBioLegend338507Fattore di diluizione 1:200
CD3 - iFluor 594AAT Bioquest100320C0Fattore di diluizione 1:100
CD31 - Alexa Fluor 700BioLegend303134Fattore di diluizione 1:100
CD34 - iFluor 594AAT Bioquest103400C0Fattore di diluizione 1:100
CD38 - Alexa Fluor 700BioLegend303523Fattore di diluizione 1:100
CD4 - Alexa Fluor 647BioLegend300520Fattore di diluizione 1:100
CD45 - Alexa Fluor 532ThermoFisher Scientific58045942Fattore di diluizione 1:100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647BioLegend353113Fattore di diluizione 1:100
Adesivo cromo allume-gelatinaOfferta di nuovi arrivati1033A
CryomoldFisher Scientific NC9511236Inoltre, il Catalogo No.50-465-347 per campioni più grandi
Slide di calibrazione DAPIAgar ScientificAG2273
Soluzione DAPI, 1 mg/mLThermoFisher Scientific62248Fattore di diluizione 1:3000
E-cadherin/CD324 - Alexa Fluor 647BioLegend147307Fattore di diluizione 1:100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594BioLegend324228Fattore di diluizione 1:100
Tubi Eppendorf/FalconN/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
PinzaN/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
FoxP3 - eFluor 660ThermoFisher Scientific50577382Fattore di diluizione 1:100
Lamelli di microscopio sminacciatoScienza ChimicaGEW45-2575-W
GL7 - Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific53590282Fattore di diluizione 1:100
Sale sodio eparinicoSIGMA-ALDRICHH339310KU
HLA-DR - PENovusBioNB100-77855PEFattore di diluizione 1:200
Human TruStain FcX (Soluzione bloccante dei recettori Fc)BioLegend422302Fattore di diluizione 1:100
Camera di umiditàN/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
Secchio di ghiaccio con coperchioN/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
IgD - Alexa Fluor 488BioLegend348215Fattore di diluizione 1:100
IL4Ra/CD124 - PEBioLegend144803Fattore di diluizione 1:200
Convertitore di file ImarisStrumenti OXFORDN/ACopertura di qualsiasi formato di file immagine in formato .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)
Isopentano (2-metilbutano)N/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
Ki-67 - Alexa Fluor 488BD in Biologia558616Fattore di diluizione 1:100
Kimberly-Clark Kimberly-Clark Kimtech Science Professional Kimwipes Delicati Tergicristalli per Compiti, 1-StrataScienza Kimtech06-666
Pinze grandi (cioè lunghe 25 cm)N/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
Azoto liquidoN/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
Boroidriduro di litio (LiBH4)SIGMA-ALDRICH222356
MECA-79 - Alexa Fluor 488Invitrogen53603680Fattore di diluizione 1:100
Copertura vetrata per microscopio Vetro n.1 22x50 mmFisher Scientific 12-542A
Acqua Milli-QN/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
MUC2 - Alexa Fluor 488NovusBioNB120-11197AF488Fattore di diluizione 1:100
Vetro di copertura a camera Nunc Lab-TekThermoFisher Scientific155380
PAP pennaabcamAB2601
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)N/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
BisturiN/AN/AQualsiasi cosa sia disponibile/usata in laboratorio
Estensioni SimpleITK ImarisN/AN/ASoftware utilizzato per allineare immagini di diversi giri (https://github.com/niaid/imaris_extensions)
SucrosioSIGMA-ALDRICHS0389
Composto Tissue-Tek O.C.T.Sakura Finetek USA4583
Triton X-100SIGMA-ALDRICHX100
Zeiss LSM 980Microscopia ZEISSN/AIl sistema di imaging utilizzato in questo studio
Zen BlueMicroscopia ZEISSN/AIl software utilizzato per l'elaborazione delle immagini post-acquisizione

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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