Induzione di una lieve ipertermia mirata in modelli di tumore murino attraverso la conversione fototermica della luce nel vicino infrarosso mediante nanobarre d'oro intratumorali

Sommario

Questo protocollo presenta le tecniche e la metodologia necessarie per la terapia ipertermica mirata in modelli di tumori solidi. L'approccio sfrutta la conversione fototermica della luce nel vicino infrarosso mediante nanobarre d'oro iniettate per via intratumorale per indurre un riscaldamento localizzato all'interno del microambiente tumorale.

Abstract

L'ipertermia lieve (42-48 °C) è una modalità terapeutica ben consolidata in grado di indurre la morte controllata delle cellule tumorali e stimolare le risposte immunitarie antitumorali. Tuttavia, fornire calore con precisione al tessuto tumorale risparmiando il tessuto sano circostante rimane una sfida significativa. I metodi tradizionali di ipertermia, come la perfusione isolata degli arti, richiedono procedure complesse e invasive e comportano un rischio sostanziale di tossicità locale e morbilità del paziente. Al contrario, la terapia fototermica che utilizza nanoparticelle d'oro attivate dalla luce del vicino infrarosso (NIR) è emersa come una strategia promettente e meno invasiva per ottenere l'ipertermia localizzata. I nanorod d'oro (GNR), in particolare, presentano proprietà ottiche regolabili e un'elevata efficienza di conversione fototermica, che li rendono candidati ideali per una precisa modulazione termica dei siti tumorali. Sebbene questa tecnica abbia mostrato notevoli promesse, soprattutto per i tumori superficiali e accessibili, la somministrazione riproducibile, il confinamento spaziale e la sicurezza rimangono aree attive di perfezionamento. In questo protocollo, presentiamo il nostro metodo convalidato e ottimizzato per ottenere un'ipertermia lieve localizzata utilizzando l'iniezione intratumorale di GNR biocompatibili seguita da un'esposizione laser NIR mirata di breve durata. Questo approccio consente un riscaldamento rapido e controllabile all'interno dell'intervallo terapeutico, promuovendo la morte immunogenica delle cellule tumorali e stimolando le risposte immunitarie innate, meccanismi particolarmente rilevanti per i tumori immunologicamente "freddi". Il monitoraggio della temperatura in tempo reale e la consegna locale garantiscono riproducibilità, sicurezza e minima esposizione sistemica. Questo protocollo semplificato offre una piattaforma solida e accessibile per gli studi preclinici, supportando sforzi più ampi per sfruttare l'ipertermia lieve nell'immunoterapia del cancro.

Introduzione

Rimangono sfide significative nel trattamento del cancro, tra cui la resistenza ai farmaci, l'evasione immunitaria e la tossicità fuori bersaglio, che minano il successo a lungo termine delle terapie convenzionali. Queste limitazioni hanno guidato lo sviluppo di strategie terapeutiche complementari progettate per superare i meccanismi di resistenza riducendo al minimo i danni collaterali ai tessuti sani. L'ipertermia lieve, definita come l'aumento della temperatura dei tessuti a 42-48 °C, è stata a lungo riconosciuta come un'efficace aggiunta alle terapie antitumorali standard¹. Storicamente, l'ipertermia lieve è stata utilizzata in combinazione con la chirurgia, la chemioterapia o la radioterapia per migliorare l'efficacia di queste terapie aumentando la perfusione tumorale, interrompendo l'architettura stromale e sensibilizzando le cellule maligne agli agenti citotossici¹. Più recentemente, con il crescente successo dell'immunoterapia in oncologia, c'è un crescente interesse a sfruttare il potenziale immunomodulatorio intrinseco dell'ipertermia lieve per migliorare le risposte immunitarie antitumorali ^1,2,3.

Nonostante i suoi benefici clinici dimostrati, l'applicazione più ampia dell'ipertermia tumorale rimane limitata a causa delle sfide nel raggiungere un riscaldamento localizzato, controllabile e riproducibile dei tumori, evitando danni tissutali fuori bersaglio⁴. Le attuali tecniche cliniche e sperimentali di ipertermia, come la perfusione regionale degli arti o gli approcci basati su nanoparticelle somministrate sistemicamente, spesso soffrono di precisione spaziale limitata, captazione variabile del tumore e potenziale di tossicità sistemica 2,5,6,7,8,9 . La terapia ipertermica mirata è una modalità emergente in questo campo del trattamento del cancro, progettata per elevare selettivamente le temperature tumorali riducendo al minimo i danni ai tessuti sani circostanti. Più specificamente, la somministrazione mirata di nanobarre d'oro (GNR) è un metodo promettente per superare gli attuali limiti della precisione e della tossicità dell'ipertermia tumorale lieve. I GNR sono particolarmente adatti per le applicazioni fototermiche grazie alla loro risonanza plasmonica di superficie sintonizzabile nella regione NIR, all'elevata efficienza di conversione fototermica e ai profili di biodistribuzione favorevoli rispetto ad altre nanostrutture d'oro^10,11. La loro reattività alle lunghezze d'onda NIR consente un efficiente assorbimento della luce e un riscaldamento localizzato anche nei tessuti più profondi, con danni minimi alle strutture circostanti. In quanto tali, i GNR possono fornire una migliore efficacia, targeting e sicurezza nelle terapie ipertermiche.

L'obiettivo di questo metodo è fornire un protocollo altamente efficiente, a bassa intensità di risorse e riproducibile per ottenere una lieve ipertermia mediata da nanobarre d'oro nei tumori solidi. Questa tecnica, denominata terapia ipertermica mirata (THT) mediata da GNR, affronta i limiti chiave degli approcci ipertermici convenzionali combinando l'iniezione diretta di GNR intratumorale con l'attivazione esterna della luce NIR. Ciò garantisce un'elevata concentrazione locale di nanoparticelle, migliorando la riproducibilità e la sicurezza, in particolare per i tumori piccoli o scarsamente vascolarizzati che potrebbero non accumulare in modo efficiente agenti erogati per via sistemica. Inoltre, l'impiego dell'iniezione intratumorale diretta di GNR seguita dall'esposizione alla luce del vicino infrarosso (NIR) garantisce un riscaldamento preciso, controllato e localizzato dei tumori, riducendo al minimo l'esposizione sistemica, la tossicità e gli effetti fuori bersaglio associati alle tecniche convenzionali di ipertermia regionale.

Molti tumori presentano meccanismi complessi e diversificati di fuga immunitaria, che consentono loro di resistere all'immunoterapia attraverso vari mezzi, in particolare attraverso una scarsa infiltrazione delle cellule immunitarie all'interno del microambiente tumorale ^2,4,5. L'ipertermia lieve offre una soluzione sinergica se utilizzata in combinazione con le immunoterapie. Oltre agli effetti citotossici diretti, l'ipertermia lieve induce preferenzialmente la morte cellulare immunogenica (ICD), portando al rilascio di antigeni associati al tumore (TAA) e di pattern molecolari associati al danno (DAMP)^1,2. Questi segnali attivano le vie immunitarie innate, migliorano la presentazione dell'antigene tumorale, promuovono la maturazione delle cellule dendritiche e migliorano il priming delle cellule T, aumentando in ultima analisi l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel microambiente tumorale ^1,6,12. Nei nostri modelli preclinici, questa tecnica THT mediata da GNR ha funzionato per attivare le risposte immunitarie locali e migliorare l'infiltrazione immunitaria tumorale¹³. Se combinata con la terapia intra-tumorale con interleuchina-2 (IL-2) o l'inibizione sistemica del checkpoint anti-PD1, questa tecnica THT mediata da GNR ha ulteriormente aumentato l'immunità antitumorale e ha superato la monoterapia da sola nei modelli di carcinoma mammario e melanoma¹³. Questi risultati sono coerenti con un crescente numero di prove a sostegno della sinergia tra ipertermia mediata da nanoparticelle e immunoterapia nei tumori solidi, tra cui il cancro al seno 14,15,16 e i tumori cerebrali^17,18. In breve, convertendo tumori immunologicamente 'freddi' in tumori 'caldi', il THT mediato da GNR può migliorare la risposta alle immunoterapie, inclusi gli inibitori del checkpoint ^1,2,12.

Il protocollo THT mediato da GNR qui presentato è a bassa intensità di risorse, tecnicamente semplice e ampiamente adattabile ai tumori sottocutanei o superficiali. Questa tecnica è particolarmente appropriata per i ricercatori che lavorano con modelli murini di tumori sottocutanei o superficiali, tra cui il melanoma e il cancro al seno. Tuttavia, con piccole modifiche, può essere esteso ad altri tipi di tumore e siti anatomici. Inoltre, questa tecnica offre una piattaforma versatile per l'integrazione dell'ipertermia spazialmente controllata negli studi preclinici sul cancro, in particolare quelli che studiano le strategie di potenziamento dell'immunoterapia e che cercano di esplorare l'ipertermia lieve per migliorare la risposta al trattamento o superare la resistenza ai trattamenti immunoterapici. Inoltre, le conoscenze e le attrezzature necessarie per l'implementazione di questa tecnica sono accessibili e adattabili a una varietà di contesti sanitari, migliorandone la fattibilità in un uso clinico più ampio³.

In questo manoscritto, forniamo istruzioni dettagliate passo dopo passo per l'implementazione del nostro protocollo THT mediato da GNR in modelli murini che utilizzano un sistema laser NIR operante a 860 nm. Il successo di questo protocollo dipende dall'efficiente attivazione dei tessuti profondi delle nanobarre d'oro utilizzando la lunghezza d'onda appropriata della luce nel vicino infrarosso. Evidenziamo anche le considerazioni procedurali per ottenere un dosaggio ipertermico lieve coerente, sicuro ed efficace nei modelli di tumore murino, come il monitoraggio accurato in tempo reale della temperatura interna del tumore durante tutta la procedura. Questo metodo si basa e riunisce aspetti degli approcci di ipertermia con nanoparticelle precedentemente riportati, offrendo un'alternativa completa, convalidata, altamente precisa e riproducibile per la ricerca preclinica sul cancro. Nel complesso, questo protocollo offre un metodo biologicamente sicuro, economico e a bassa tossicità per la somministrazione di ipertermia localizzata dal tumore, con un forte potenziale per migliorare l'efficacia delle immunoterapie antitumorali esistenti e ampliare l'utilità clinica dell'ipertermia in oncologia.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato universitario per gli animali da laboratorio dell'Università di Dalhousie secondo le linee guida del Canadian Council on Animal Care ethical standards. Sono state seguite tutte le linee guida internazionali, nazionali e istituzionali applicabili per la cura e l'uso degli animali. Consulta la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali utilizzati in questo protocollo.

1. Requisiti del laser e dell'impianto di trattamento

1. Accesso sicuro a un sistema laser completamente calibrato in grado di fornire luce a una lunghezza d'onda di 860 ± 10 nm con un'intensità fino a 4.000 mA. Assicurarsi che il sistema laser disponga di meccanismi di spegnimento adeguati.
   NOTA: In questo studio, abbiamo utilizzato un laser progettato su misura. Il modello utilizzato in questo protocollo è dotato di una chiave di abilitazione laser, di un pulsante di arresto di emergenza e di un ponticello di interblocco (il ponticello collegato può anche essere collegato a un interruttore di sicurezza utilizzato per la conformità alla sicurezza, ad esempio l'accesso alla porta di una sala laser di Classe 4).
2. Collegare una sonda di temperatura inserita e calibrata per il monitoraggio della temperatura intratumorale in grado di trasmettere i dati di temperatura in tempo reale tramite l'apposito software di registrazione della termocoppia.
3. Preparare una sala laser designata che soddisfi gli standard di sicurezza richiesti per la classe laser. Assicurarsi che ci sia un'area di lavoro libera, con una buona ventilazione, un'illuminazione adeguata e tutte le superfici riflettenti coperte. Limitare l'accesso alla stanza durante il funzionamento del laser per evitare l'esposizione involontaria. Assicurarsi che tutto il personale coinvolto nello studio sia completamente addestrato al funzionamento del laser e ai protocolli di sicurezza e indossi DPI e protezione per gli occhi adeguati.
4. Stabilire uno spazio di lavoro all'interno della sala laser che possa ospitare una macchina per anestesia nelle immediate vicinanze della configurazione del laser. Assicurarsi che il laser sia montato in modo sicuro, ma regolabile, con il soggetto sperimentale in grado di essere posizionato a circa 1-2 cm dalla sorgente del raggio laser per garantire un targeting accurato del sito del tumore.
5. Utilizzare una termocamera su un treppiede, posizionata per acquisire le letture della temperatura dalla superficie del soggetto, durante l'esposizione laser.

2. Coltura cellulare e inoculazione (iniezione di cellule tumorali)

1. Selezionare i modelli murini appropriati in base al tipo di tumore di interesse, seguendo tecniche standardizzate di preparazione e mantenimento delle colture cellulari di laboratorio. Per seguire questo protocollo, selezionare topi femmina BALB/c di 6-8 settimane per l'inoculazione del tumore CT26.
   NOTA: Possono essere utilizzati topi immunocompetenti o immunocompromessi di età e ceppi variabili, a seconda dei requisiti dello studio.
2. Coltura della linea cellulare tumorale CT26 in terreno RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS), 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 2 mM di glutammina. Mantenere le celle a 37 °C in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO₂. Rinnovare il terreno ogni 2-3 giorni e sottocoltivare le cellule con una confluenza del 70-80% utilizzando un rapporto di divisione da 1:4 a 1:10. Utilizzare le cellule all'interno dei primi passaggi (ad esempio, ≤10 passaggi) per garantire una crescita costante e un'efficienza di inoculazione. Espandere le colture secondo necessità per ottenere il numero richiesto di cellule per l'inoculazione.
   NOTA: Il numero di cellule necessarie per topo varia a seconda del modello, ad esempio, per il modello di cancro del colon-retto murino CT26, abbiamo richiesto 5 × 10⁵ cellule per topo.
3. Staccare le cellule aderenti utilizzando la tripsinizzazione e lavare 2x con 1x PBS sterile. Risospendere in una soluzione sterile 1x PBS per ottenere la concentrazione desiderata di 5 × 10⁶ cellule/mL. Conservare la sospensione cellulare in una provetta sterile da microcentrifuga da 2 mL su ghiaccio per un massimo di 1 ora prima dell'iniezione.
4. Prima dell'iniezione, anestetizzare i topi utilizzando una camera di induzione con isoflurano vaporizzato al 4% a una velocità di flusso di 0,8 L/min. Una volta anestetizzato, ridurre l'isoflurano al 2% e mantenere l'anestesia con un cono nasale durante la procedura di inoculazione. Confermare la profondità dell'anestesia utilizzando un test di pizzicamento delle dita dei piedi per garantire l'assenza di una risposta al dolore. Applicare lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza e ridurre al minimo i potenziali danni al laser.
5. Radere il sito di iniezione (ad es. il fianco sinistro per questo modello eterotopico CT26) utilizzando un rasoio elettrico e pulire l'area con una salvietta imbevuta di alcol per rimuovere i detriti e disinfettare la pelle. Pizzicare la pelle nel sito di iniezione e iniettare 100 μL di sospensione cellulare a 5 × 10-6 cellule/mL per via sottocutanea utilizzando un ago da 26 G e una siringa da 1 mL. Dopo l'iniezione, rimuovere il topo dal cono del naso e rimetterlo nella sua gabbia per il recupero su una coperta riscaldante per 1 ora.

3. Crescita e misurazione del tumore

1. Iniziare le misurazioni giornaliere del tumore, in genere a partire dal giorno 7 dopo l'iniezione, utilizzando un calibro per la misurazione del tumore. Misura le dimensioni del tumore su tre assi: larghezza, lunghezza e altezza e calcola i volumi tumorali utilizzando una formula del volume tumorale ellissoidale di π/6 × lunghezza × larghezza × altezza.
2. Pianificare l'inizio del THT mediato da GNR una volta che i tumori raggiungono un volume approssimativo di 50 mm³ (± 20 mm³).
   NOTA: Per il nostro modello CT26, questo volume tumorale è stato raggiunto tra i giorni 10 e 12 dopo l'iniezione delle cellule tumorali).
3. Prima del trattamento laser, assicurarsi che i topi vengano assegnati in modo casuale ai gruppi di controllo e di trattamento. Il gruppo di trattamento riceverà un'iniezione intratumorale di GNR seguita da esposizione laser; e il gruppo di controllo riceverà un'iniezione intratumorale di PBS (stesso volume dell'iniezione di GNR) invece di GNR, seguita da esposizione laser.

4. Conversione fototermica della luce NIR mediante GNR intratumorali

1. In una cappa di sicurezza biologica sterile, utilizzare una siringa da 0,3-1 ml con un ago da 31 G per prelevare il volume appropriato di GNR in base a ciascun volume tumorale.
2. Anestetizzare il topo allo stesso modo dell'iniezione di cellule tumorali (con un cono nasale che eroga isoflurano al 2% a una velocità di flusso di 0,8 L/min e confermare un'adeguata profondità di anestesia utilizzando il test di pizzicamento delle dita).
3. Una volta anestetizzato, ridurre l'isoflurano al 2% e posizionare il mouse in posizione prona sulla piattaforma laser mantenendo l'anestesia utilizzando un cono nasale. Applicare lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza e ridurre al minimo i potenziali danni al laser.
4. Radere il pelo in eccesso intorno al tumore, se necessario, per garantire l'esposizione della superficie della pelle al laser. Usa l'etanolo per disinfettare la superficie del tumore, rimuovendo eventuali peli/detriti.
   NOTA: In questo studio, abbiamo utilizzato GNR ottimizzati per l'assorbimento a 860 nm. Se si utilizza un prodotto GNR diverso da quello suggerito qui, assicurarsi che l'erogazione della lunghezza d'onda NIR del laser sia ottimizzata in base allo spettro di assorbimento del GNR.
5. Prima dell'esposizione al laser, iniettare i GNR per via intratumorale a una concentrazione di 1 μg/mm³ di volume tumorale. Se necessario, suddividere l'iniezione tra due siti intratumorali per garantire un'efficiente distribuzione dei GNR all'interno del tumore.
   NOTA: In questo video del protocollo, sono stati utilizzati GNR a una concentrazione di 2 μg/μL; pertanto, per un tumore di 50 mm³ , sono stati iniettati 25 μL di GNRs nel tumore. Assicurarsi di rimuovere eventuali GNR in eccesso sulla superficie della pelle dopo le rispettive iniezioni.
6. Per i topi del gruppo di controllo, somministrare un'iniezione intratumorale di PBS sterile del volume equivalente utilizzato per i gruppi di iniezione GNR (ad esempio, iniettare 25 μL di PBS nel caso di un tumore di 50 mm³).
7. Disinfettare la sonda di temperatura intratumorale con etanolo e inserirla delicatamente al centro della massa tumorale.
8. Applicare uno strato uniforme di gel di aloe vera di circa 5 mm di spessore sulla superficie del tumore per prevenire l'ulcerazione della pelle e ridurre al minimo il rischio di lesioni termiche durante il trattamento.
9. Assicurarsi che il laser sia regolato in modo da allinearsi direttamente sopra il centro del tumore. Utilizzare la tabella di ricerca dell'irradianza (Tabella 1) per determinare l'altezza del laser appropriata in base al diametro del raggio laser richiesto per coprire l'area della superficie del tumore. Ottimizza l'altezza del laser in base al diametro del tumore per garantire un'erogazione costante di energia.
   NOTA: Nel nostro esperimento, un tumore con un diametro di 1,3 cm richiedeva un'altezza laser di 1,5 cm).
10. Accendere il laser e la sorgente di raffreddamento elettrico (TEC) del thermos, quindi collegare il sistema laser alla fonte di alimentazione (adattato in base al protocollo del produttore). Accendere la fonte di raffreddamento elettrica del thermos; attendere che il LED blu si accenda e che la temperatura della sorgente TEC del laser si stabilizzi a 25 °C dopo 30 s.
11. Utilizzare la tabella di ricerca dell'irraggiamento (Tabella 1) per ottenere un irraggiamento target di 1 W/cm² ± 0,2 W/cm² regolando l'uscita di corrente del laser (ruotare la manopola della sorgente laser sul setpoint di corrente desiderato).
    NOTA: Nel nostro esperimento, un'altezza del laser di 1,5 cm, un diametro del fascio di 1,3 cm e la corrente laser di 1.800 mA hanno portato a un valore di irradianza di 0,82 W/cm², che è stato ottimizzato per questo modello di tumore.
    Da questo punto in poi, assicurarsi che tutte le persone nella sala operatoria laser indossino occhiali di sicurezza laser certificati per la lunghezza d'onda della luce utilizzata.
12. Installare la termocamera adiacente alla piattaforma laser, diretta verso il mouse, per monitorare la temperatura della superficie della pelle durante la procedura laser.
13. Sul software di registrazione della termocoppia, creare un nuovo file e fare clic sul pulsante di registrazione . Assicurarsi che il grafico interno della temperatura del tumore in funzione del tempo venga visualizzato in tempo reale.
14. Ruotare la chiave di sicurezza per abilitare l'uscita della sorgente laser. Iniziare la somministrazione del laser premendo verso il basso il pedale.
    NOTA: In questo protocollo, un controller Raspberry Pi è l'interfaccia interna tra il pedale e la sorgente laser.
15. Controllare e assicurarsi che il software del computer rilevi un aumento della temperatura del tumore una volta che il tumore iniettato con GNR è esposto al raggio laser.
    NOTA: La temperatura interna del tumore inizierà ad aumentare all'avvio del laser, impiegando da 15 s a 2 minuti per entrare nell'intervallo di ipertermia target di 42 °C, a seconda delle dimensioni e del tipo di modello di tumore.
16. Mantenere la temperatura interna del tumore nell'intervallo ipertermico (tra 42 °C e 48 °C) per 5 minuti interi. Monitorare continuamente la temperatura interna del tumore e, se si avvicina a 48 °C, togliere il piede dal pedale e lasciare che la temperatura scenda di nuovo. Cerca questo calo di temperatura in tempo reale sul grafico di visualizzazione della temperatura rispetto al tempo. Una volta che la temperatura interna del tumore è scesa a ~43 °C, riattivare la somministrazione laser premendo nuovamente il pedale. Continuare questo schema di attivazione/disattivazione del pedale laser per mantenere la temperatura interna del tumore nell'intervallo ipertermico appropriato per 5 minuti interi e monitorare il grafico di visualizzazione della temperatura rispetto al tempo.
    1. Se la temperatura del tumore scende al di sotto di 42 °C in qualsiasi momento durante il periodo di ipertermia di 5 minuti, aumentare il tempo di ipertermia per compensare il tempo perso. Ad esempio, se la temperatura scende al di sotto di 42 °C per 20 s, aggiungere 20 s alla fine dei 5 minuti iniziali. Alcuni tumori iniettati con GNR potrebbero non raggiungere i 48 °C e non sarà necessario il ciclo di accensione/spegnimento del laser.
       NOTA: Nei topi di controllo iniettati per via intratumorale con PBS, i tumori non raggiungeranno l'intervallo ipertermico. Se lo si desidera, il ciclo di accensione/spegnimento del laser per i topi di controllo dovrebbe seguire lo stesso schema stabilito per il gruppo trattato con GNR, nonostante la prevista mancanza di risposta ipertermica.
17. Durante il mantenimento dell'ipertermia tumorale, monitorare continuamente la temperatura superficiale della pelle per assicurarsi che rimanga al di sotto dei 50 °C. Indipendentemente dalla temperatura interna del tumore, se la temperatura della superficie della pelle raggiunge i 50 °C, spegnere il laser per consentire il raffreddamento. Se la temperatura interna non riesce a raggiungere l'intervallo ipertermico desiderato senza far superare i 50 °C della temperatura della pelle, ridurre la potenza del laser e/o applicare ulteriore aloe vera sul sito del tumore per aiutare a dissipare il calore. Dopo 5 minuti nell'intervallo ipertermico, rilasciare il pedale per interrompere la somministrazione del laser e lasciare che la temperatura interna del tumore scenda a ~37 °C e disattivare la chiave di sicurezza del laser.
    NOTA: È importante ridurre al minimo i danni alla pelle che potrebbero portare all'ulcerazione del tumore mantenendo la temperatura della pelle al di sotto di 50 °C¹⁹.
18. Monitorare la sonda interna della temperatura del tumore, in modo che la temperatura del tumore scenda a circa 37 °C. Rimuovere delicatamente la sonda di temperatura dal tumore e rimuovere il gel di aloe vera rimanente sulla superficie del tumore.
19. Rimuovere il topo dall'anestetico del cono nasale e monitorare l'eccitazione dell'animale prima di rimetterlo nella gabbia. Posizionare la gabbia parzialmente su un cuscinetto termico a 37 °C durante il periodo di recupero successivo alla procedura, consentendo ai topi di muoversi tra le aree più calde e quelle più fredde secondo necessità per regolare la temperatura corporea. Monitora ogni topo per garantire un ritorno al comportamento normale prima di riportarlo nella sua struttura abitativa.

Risultati

L'obiettivo di questo protocollo THT mediato da GNR è quello di riscaldare i tumori solidi in modo coerente e affidabile fino all'intervallo ipertermico lieve desiderato di 42-48 °C. I passaggi principali di questa procedura sono descritti nella Figura 1. Il successo di questo protocollo dipende dall'instaurazione e dal mantenimento di un'ipertermia lieve controllata e riproducibile all'interno di un determinato modello di tumore solido. I GNR utilizzati sono stati sintetizzati utilizzando un metodo brevettato senza CTAB, in cui il sale d'oro è stato ridotto in una soluzione tensioattiva brevettata per promuovere la crescita di cristalli a forma di bastoncello. Dopo la sintesi, i tensioattivi nativi sono stati in gran parte sostituiti con PEG a basso peso molecolare per migliorare la biocompatibilità. I GNR risultanti erano di dimensioni uniformi (51,1 ± 10,8 nm per 12,2 ± 1,9 nm), avevano una lunghezza d'onda di eccitazione ottimale di 860 ± 10 nm ed erano privi di endotossine rilevabili.

Per garantire un corretto riscaldamento del tumore e un accurato monitoraggio della temperatura, è necessario inserire una sonda di temperatura intratumorale al centro del tumore. Inoltre, è fondamentale monitorare la temperatura superficiale della pelle durante tutta la procedura utilizzando una termocamera. È possibile, soprattutto per i tumori di volume inferiore, che i GNR iniettati per via intratumorale possano diffondersi nello spazio peritumorale e/o sottocutaneo intorno al tumore. L'esposizione alla luce NIR può causare un riscaldamento della pelle superiore ai livelli fisiologici di base e, se la pelle raggiunge temperature superiori a livelli ipertermici lievi (superiori a 50 °C), ciò potrebbe causare danni alla pelle come croste e/o ulcerazioni¹⁹. L'applicazione di uno strato di gel di aloe vera sulla superficie del tumore è un importante passo precauzionale per aiutare a regolare la temperatura superficiale della pelle e prevenire danni termici durante l'esposizione al laser NIR. In ogni caso, si raccomanda di monitorare l'area trattata per segni di ulcerazione nelle 48 ore successive al THT. La Figura 2 illustra una rappresentazione visiva della configurazione suggerita per ottimizzare la gestione della temperatura del tumore, mostrando la posizione della sonda interna della temperatura del tumore e dello strato di gel di aloe vera in relazione alla sonda laser NIR.

Il successo relativo di questo protocollo sperimentale può essere determinato osservando il grafico interno della temperatura del tumore rispetto al tempo durante il funzionamento del laser. Per i topi iniettati per via intratumorale con GNR, si prevede che i tumori si riscaldino nell'intervallo ipertermico lieve (42-48 °C) entro 15-2 minuti. Una volta che la temperatura interna del tumore è entrata nell'intervallo ipertermico lieve, si prevede che si stabilizzi all'interno dell'intervallo appropriato o richieda un ciclo di accensione/spegnimento della somministrazione del laser per garantire che la temperatura interna del tumore non superi i 48 °C (come mostrato nella Figura 3A). Il mantenimento riuscito dell'ipertermia lieve per 5 minuti è considerato un risultato positivo. Per i topi iniettati per via intratumorale con PBS, non ci si aspetta che i tumori si riscaldino nell'intervallo ipertermico. L'esposizione alla luce NIR a una lunghezza d'onda di 860 nm non è sufficiente da sola a causare il riscaldamento dei tessuti nell'intervallo ipertermico lieve e si prevede che i tumori di controllo si stabilizzino intorno ai 39-40 °C. La Figura 3B mostra un grafico interno della temperatura del tumore rispetto al tempo tra i topi GNR e quelli di controllo (iniettati con PBS) durante la procedura di 5 minuti. Se un tumore iniettato con GNR non è in grado di raggiungere l'intervallo ipertermico dopo l'esposizione alla luce NIR o non è in grado di essere mantenuto nell'intervallo ipertermico appropriato per 5 minuti, questo è considerato un risultato negativo.

Un'ulteriore analisi a valle per determinare il successo di questo protocollo THT mediato da GNR comporta la misurazione delle variazioni del volume del tumore dopo la procedura. Il THT mediato da GNR, eseguito con successo, provoca la morte mirata delle cellule tumorali e l'attivazione di risposte immunitarie antitumorali, che portano alla regressione del tumore e alla riduzione del volume tumorale associata¹³. La Figura 4 mostra le variazioni del volume tumorale a seguito di THT mediato da GNR per due modelli di carcinoma murino del fianco sottocutaneo (B16-melanoma e CT26-modello di carcinoma colorettale eterotopico) e un modello di carcinoma murino del cuscinetto adiposo mammario (carcinoma mammario della mammella). In ciascun modello, è evidente una significativa riduzione del volume tumorale rispetto ai controlli 48-72 ore dopo la procedura THT mediata da GNR. Si prevede che la tempistica e l'entità della riduzione del volume tumorale dopo la procedura varieranno a seconda del ceppo murino e del modello di cancro. Oltre alla riduzione del tumore, abbiamo osservato una potente risposta immunitaria innata entro 48 ore di THT mediata da GNR, caratterizzata da un aumento dell'espressione di geni coinvolti nella via STING-cGAS e dall'upregolazione e attivazione di cellule dendritiche, macrofagi e cellule NK in entrambi i modelli B16F10 e 4T1¹³. In particolare, in un modello tumorale bilaterale 4T1, il THT abilitato alla GNR ha indotto una risposta immunitaria sistemica, come evidenziato dall'aumento dell'infiltrazione di cellule T CD8⁺ nei tumori controlaterali non trattati¹³. Questi risultati supportano ulteriormente il potenziale di questo approccio per suscitare sia effetti citotossici diretti che più ampi effetti antitumorali immunomodulatori.

Tabella 1: Tabella di ricerca dell'irraggiamento. Tabella che fornisce i valori di irraggiamento (W/cm²) per diverse impostazioni di uscita della corrente laser (mA) e distanze di lavoro (cm). La tabella viene utilizzata per determinare l'altezza del laser appropriata in base al diametro del raggio richiesto per coprire la superficie tumorale e per ottenere un irraggiamento target di 1 W/cm² ± 0,2 W/cm². I valori evidenziati in verde indicano livelli di irraggiamento ottimali vicini a 1 W/cm². Questa tabella di irraggiamento è specifica per il laser LDX ed è stata fornita dal produttore. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura 1: Schema grafico della procedura THT mediata da GNR. Metodologia della terapia ipertermica mirata mediata da oro-nanorod per tumori sottocutanei del fianco in un modello murino. Dopo l'instaurazione di un tumore palpabile (circa 50 mm³) e l'anestesia del topo, (1) iniettare i GNR per via intratumorale a una concentrazione di 1 μg/mm³, (2) inserire una sonda di temperatura intratumorale al centro della massa tumorale, (3) applicare uno strato di ~5 mm di gel di aloe vera sulla superficie del tumore, (4) iniziare la somministrazione del laser NIR e (5) mantenere la temperatura interna del tumore in un lieve intervallo ipertermico (42 °C-48 °C) per 5 minuti. Abbreviazioni: GNR = nanorod d'oro; THT = terapia ipertermica mirata; NIR = vicino infrarosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rappresentazione visiva dell'allestimento sperimentale. Un topo BALB/c portatore di un tumore colorettale eterotopico con una sonda di temperatura intratumorale inserita centralmente e uno strato topico di gel di aloe vera applicato direttamente sotto l'esposizione al raggio laser nel vicino infrarosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Grafici della temperatura interna in tempo reale. Profilo/i rappresentativo/i della temperatura interna del tumore nel tempo (in ms) registrato dalla sonda di temperatura interna durante l'esposizione del tumore al laser NIR. (A) On/off del modello di ciclo laser NIR in un topo iniettato con GNR necessario per mantenere la temperatura interna del tumore in un intervallo ipertermico lieve (42 °C-48 °C) per 5 minuti. Ciò evidenzia l'importanza di un attento monitoraggio della temperatura interna del tumore e del ciclo di somministrazione del laser per mantenere l'intervallo ipotermico durante tutta la procedura. (B) Differenza media nella temperatura interna del tumore tra topi iniettati con GNR (n = 15) e topi di controllo (iniettati con PBS) (n = 8) durante 5 minuti di esposizione al laser NIR. I tumori dei topi iniettati con PBS non si riscaldano in un intervallo di ipotermia lieve e si stabilizzano intorno ai 39-40 °C nonostante ricevano la stessa durata di esposizione al laser NIR del gruppo iniettato con GNR, i cui tumori raggiungono temperature ipertermiche di 42-48 °C. Abbreviazioni: GNR = nanorod d'oro; NIR = vicino infrarosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Grafici del volume tumorale seguendo il THT mediato da GNR. Il THT mediato da GNR induce una riduzione del volume tumorale in più modelli di cancro murino entro 48-72 ore dopo il trattamento. (A) Misurazioni del volume tumorale in un modello 4T1 (carcinoma mammario) dopo THT mediato da GNR (n= 24 PBS, n = 28 THT). (B) Misurazioni del volume tumorale nel modello B16-F10 (melanoma) dopo THT mediato da GNR (n = 19 PBS, n = 23 THT). (C) Misurazioni del volume tumorale in un modello CT26 (cancro del colon-retto) dopo THT mediato da GNR (n = 9 PBS, n = 9 THT). Una riduzione o un rallentamento della crescita del volume tumorale entro 48-72 ore dal trattamento è indicativa di un risultato positivo. I dati sul volume del tumore per il modello CT26 al punto temporale "24 ore prima" non sono uniti: i valori sono simili e si sovrappongono. Le barre di errore rappresentano SEM. * p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo
La progettazione e l'implementazione di questa tecnica THT mediata da GNR offre la capacità di condurre un riscaldamento mirato, accurato, a basso consumo di risorse e riproducibile di tumori solidi in vivo. Un vantaggio chiave di questo sistema risiede nella sua precisione spaziale e nel controllo termico, che consente un trattamento localizzato senza danneggiare i tessuti circostanti. Un passaggio fondamentale per il successo della conversione fototermica è garantire la compatibilità tra i GNR utilizzati e la sorgente di luce NIR. In questo studio, abbiamo utilizzato GNR ottimizzati per l'assorbimento a 860 nm. A questa lunghezza d'onda, la luce penetra efficacemente nei tessuti e il calore viene generato selettivamente nei tumori contenenti GNR, mentre il tessuto sano circostante rimane vicino alla temperatura fisiologica²⁰. Inoltre, quando si esegue questo protocollo, un monitoraggio accurato in tempo reale della temperatura interna del tumore è fondamentale per confermare che sia stato raggiunto un intervallo ipertermico lieve e che il trattamento venga somministrato in modo coerente. Il posizionamento di una sonda di temperatura intratumorale, come mostrato nella Figura 2, consente il monitoraggio in tempo reale della dose termica del tumore, come mostrato nella Figura 3B.

Risoluzione dei problemi della tecnica
A seconda del modello in vivo e del tipo di tumore, potrebbero essere necessarie lievi modifiche al protocollo per ottimizzare i risultati. Ad esempio, nei modelli di melanoma murino, cancro del colon-retto e cancro al seno citati nella Figura 4, abbiamo ottimizzato la concentrazione di volume del GNR al tumore a 1 μg/mm³. Abbiamo anche ottimizzato l'efficienza di questo protocollo conducendo l'esposizione al laser NIR direttamente dopo l'iniezione di GNR, poiché non sono state osservate differenze nell'efficacia del trattamento confrontando questa iniezione e i tempi di trattamento con intervalli più lunghi di 0,5, 1, 4, 18 o 24 ore. Per i modelli tumorali che differiscono dai nostri modelli in termini di fisiopatologia tumorale o localizzazione corporea, una diversa concentrazione di GNR, iniettata in un momento diverso, può essere ottimale per raggiungere e/o rimanere all'interno dell'intervallo ipertermico. Dopo questa procedura, è necessario eseguire misurazioni giornaliere del volume del tumore per registrare le variazioni del volume del tumore. La regressione del tumore entro 2-3 giorni è un indicatore positivo del successo del trattamento.

A causa della natura del protocollo laser, le ustioni e le ulcerazioni cutanee superficiali sono un potenziale fattore di rischio, in particolare nella pelle pigmentata o sensibile. A seconda del modello in vivo utilizzato, possono essere necessarie regolazioni dell'uscita della corrente laser per mantenere un equilibrio appropriato tra la superficie della pelle e la temperatura interna del tumore. Ad esempio, abbiamo scoperto che, a causa delle differenze nel contenuto di acqua e nel pigmento di melanina nella pelle²¹, i topi C57Bl/6 richiedono la somministrazione di laser NIR a una corrente inferiore rispetto ai topi BALB/c, per mantenere la temperatura della pelle al di sotto dei 50°C. Quando si modifica l'emissione di corrente laser, assicurarsi che l'altezza del laser sia regolata di conseguenza per mantenere un'irradianza target di 1 W/cm² ± 0,2 W/cm² pur coprendo la maggior parte della superficie tumorale con il diametro del raggio laser. In alternativa, l'applicazione di ulteriore gel di aloe vera può aiutare a ridurre la temperatura della pelle durante la procedura senza influire drasticamente sulla temperatura interna del tumore. Mantenere un'adeguata temperatura superficiale della pelle attraverso le modifiche necessarie è importante per ridurre al minimo il rischio di ulcerazione, che è stato osservato come un potenziale effetto collaterale di questo trattamento. Quando si apportano modifiche allo strato di gel di aloe vera, assicurarsi di interrompere momentaneamente la somministrazione del raggio laser NIR. Nei giorni successivi al protocollo laser, assicurarsi che i topi siano monitorati attentamente per potenziali ustioni e/o ulcerazioni.

Limitazioni del THT mediato da GNR
Uno dei principali problemi di sicurezza che deve essere affrontato durante l'esecuzione di questa procedura è l'uso di occhiali di sicurezza laser certificati per la lunghezza d'onda della luce utilizzata durante il funzionamento del laser. Il sistema laser dovrebbe includere funzioni di sicurezza integrate, come un interblocco con chiave, per evitare l'attivazione accidentale. Tuttavia, sono necessari dispositivi di protezione individuale aggiuntivi, in particolare occhiali di sicurezza laser adeguati, per proteggere dalla potenziale esposizione a raggi riflessi o diffusi. L'occhio è il più vulnerabile alle lesioni causate da un raggio laser, con le ustioni della retina che sono una delle principali preoccupazioni con i laser NIR²². Infine, tutto il personale che utilizza il laser deve avere una formazione adeguata.

Questo protocollo ha optato per l'iniezione intratumorale di GNR rispetto a un'iniezione sistemica per ridurre al minimo la tossicità del sistema, limitare la distribuzione di nanoparticelle in organi non bersaglio come fegato, milza e reni e migliorare l'accuratezza, l'efficacia e il profilo di sicurezza del trattamento ipertermico. Tuttavia, poiché questo protocollo richiede iniezioni intratumorali di GNR, può essere limitato nella sua capacità di indurre ipertermia in alcuni modelli tumorali. Finora, abbiamo dimostrato l'efficacia di questo metodo nei tumori del cuscinetto adiposo sottocutaneo e mammario, entrambi i quali risiedono vicino alla superficie della pelle e sono facilmente accessibili in termini di iniezione di GNR ed esposizione alla luce NIR. Possono sorgere difficoltà logistiche nel targeting di tumori che risiedono all'interno di cavità corporee, come il peritoneo, o quando si tenta di colpire i siti metastatici di un tumore primario. Una potenziale modifica a questo protocollo potrebbe comportare l'iniezione sistemica di GNR, a condizione che le nanoparticelle siano ingegnerizzate o modificate per garantire un accumulo efficiente nei siti tumorali prima dell'esposizione al NIR²³. Inoltre, è possibile che l'iniezione intratumorale di GNR possa provocare una distribuzione irregolare delle nanoparticelle nel tumore, influenzando l'uniformità del riscaldamento. Tuttavia, non si prevede che il riscaldamento non uniforme del tumore abbia un grande impatto sul grado di efficacia del trattamento, dato che l'esito primario di questo protocollo THT mediato da GNR è l'induzione dell'ICD per attivare l'immunità antitumorale. Infine, la lettura della temperatura intratumorale dipende dalla posizione della sonda di temperatura all'interno del tumore. La parte centrale del tumore è la posizione più ottimale per la sonda per riflettere accuratamente la temperatura media complessiva del tumore. Tuttavia, se è difficile garantire e/o confermare l'inserimento di una sonda centrale a causa delle dimensioni e/o della forma del tumore, potrebbe essere necessario registrare utilizzando due o più sonde di temperatura in posizioni diverse.

Importanza rispetto ai metodi esistenti
Questo manoscritto fornisce un protocollo completo, ottimizzato e riproducibile per la THT mediata da GNR in tumori solidi e superficialmente accessibili. Rispetto ad altri metodi di induzione dell'ipertermia, questa tecnica offre vantaggi distinti, vale a dire che richiede poche risorse, è spazialmente precisa e associata a una tossicità sistemica minima. Sebbene l'uso dei GNR per la fototerapia sia ben documentato, rimane una significativa variabilità in letteratura nel modo in cui questi protocolli vengono implementati. Gli elementi procedurali chiave come la durata dell'irradiazione NIR, la scelta degli strumenti di monitoraggio termico (sonde a termocoppia o termocamera), la preparazione della soluzione GNR e i metodi di iniezione GNR spesso variano da uno studio all'altro.

Ad esempio, altri metodi richiedevano dosi più lunghe (20 min)²⁴ o dosi multiple (4 x 15 min)²⁵ di esposizione NIR per ottenere risultati simili ai nostri. Inoltre, la maggior parte dei protocolli utilizza sonde a termocoppia o termocamere, ma raramente combina entrambi gli strumenti^26,27. Inoltre, le soluzioni GNR sono spesso preparate con CTAB 28,29,30 e il loro metodo di somministrazione varia tra le iniezioni sistemiche ^24,30 e le iniezioni intratumorali³¹, il che può influire sulla loro dispersione/localizzazione all'interno della TME. Pertanto, deve ancora essere stabilito un metodo completo e adattabile per il THT mediato da GNR che ottimizzi e migliori i protocolli attuali.

Il nostro protocollo affronta queste carenze integrando i componenti più efficaci e riproducibili della letteratura in un unico approccio standardizzato. Nello specifico, utilizziamo il doppio monitoraggio termico (sia termocoppia che termocamera) per garantire un'erogazione di calore precisa e sicura; impieghiamo l'iniezione intra-tumorale di GNR privi di CTAB per massimizzare la localizzazione del tumore e ridurre al minimo la tossicità; E incorporiamo l'uso del gel di aloe vera per proteggere dalle ustioni superficiali della pelle. Inoltre, i GNR utilizzati in questo protocollo sono ottimizzati per un'efficiente conversione fototermica a 860 nm NIR, consentendo il rapido raggiungimento di temperature ipertermiche miti in pochi secondi. Una volta raggiunto questo intervallo di temperatura, può essere mantenuto stabilmente per la durata del trattamento di 5 minuti, che abbiamo determinato essere sufficiente per indurre la morte cellulare immunogenica e l'attivazione immunitaria. La stessa lunghezza d'onda NIR di 860 nm fornisce anche un equilibrio favorevole tra profondità di penetrazione tissutale e sicurezza, migliorando ulteriormente la finestra terapeutica di questo metodo.

In sintesi, il nostro protocollo offre un'alternativa consolidata, convalidata e biologicamente efficace agli attuali approcci di ipertermia mediata da GNR e colma una lacuna critica nel campo fornendo un metodo completamente dettagliato e adattabile adatto alla ricerca preclinica sul cancro e allo sviluppo di terapie combinate.

Applicazioni future della tecnica
Infine, sebbene questo protocollo possa essere facilmente combinato con vari trattamenti antitumorali, è particolarmente adatto per migliorare l'efficacia delle immunoterapie, data la capacità intrinseca del THT di stimolare l'immunità antitumorale. Inducendo la morte cellulare immunogenica, promuovendo il rilascio di antigeni tumore-specifici e aumentando il numero di cellule immunitarie innate reclutate nel TME entro 48 ore dal trattamento, il THT mediato da GNR aiuta a "risensibilizzare" i tumori immunologicamente freddi alla rilevazione e all'attacco da parte del sistema immunitario¹³. Di conseguenza, questa tecnica può essere utilizzata per migliorare l'efficacia delle immunoterapie nel trattamento dei tumori che potrebbero aver precedentemente sviluppato resistenza, offrendo una potenziale strategia per superare le barriere al trattamento del cancro e la progressione della malattia¹³.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% tripsina	Thermo Fisher Scientifico	25200-056
10 ml di Stripette	Fisher Scientifico	7200574
Provetta Falcon da 15 mL	Corning	352095
Siringa da 1 ml	BD Bioscienze	3331431
Ferri da 28 g	BD Bioscienze	1298811
Linea cellulare per carcinoma mammario 4T1	Collezione di cultura dei tipi americani	Codice CRL-2539
5 ml di Stripette	Fisher Scientifico	7200573
Provetta Falcon da 50 mL	Fisher Scientifico	14-432-22
70% Etanolo	Alcoli commerciali	36195
Gel di aloe vera	Marchio Life	57800985495
Linea cellulare di melanoma B16-F10	Collezione di cultura dei tipi americani	Codice CRL-6475
Biorender	BioRender	N/A
Armadio Bisafety	Nuaire	N/A
Occhiali di sicurezza laser di classe 4	Visione laser	F22. P5P18.5000	Abbiamo utilizzato un telaio P22 con un filtro P5P18
Incubatore CO2 (37 ° C, 5% CO2)	Nuaire	N/A
Corning 1-200 & micro; L Pipetta a cremagliera universale Suggerimenti	Corning	4865
Pipetta filtrata Corning  Punte, 30 & micro; L	Fisher Scientifico	07-200-265
Linea cellulare colorettale murina CT26	Collezione di cultura dei tipi americani	Codice CRL-2638
DPBS	Thermo Fisher Scientifico	10010-049
Provette Eppendorf	Thermo Fisher Scientifico	3451
Topi femmina BALB/c	Charles River Laboratories (Montreal, Canada)	028
Femmina C57Bl/6	Charles River Laboratories (Montreal, Canada)	027
Siero fetale bovino	Thermo Fisher scientific invitrogen	12483020
GNR	Sona Nanotech Inc	N/A
Sonda di temperatura intra-tumorale	OMEGA	HYP1-30-1/2-T-G-60-SMP-M	Sonda a termocoppia modello HYP-1
IsoTip 1000 µ L Pipetta filtrata universale Suggerimenti	Corning	4809
Laser LDX (Modello: LDX- 3520-860-HHLFC)	Minnetronix	N/A	Corrente laser con set point massimo a 4600 mA
Optixcare Lubrificante per gli occhi	Aventix	N/A
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientifico	15140148
Prisma 10.6.0	Blocco grafico	N/A
RPMI 1640 Medio	Thermo Fisher Scientifico	11875119
Software per registratore di dati a termocoppia TC-08	Tecnologia Pico	PicoLog V5.25.3
Termocamera	HIKmicro	EA-1086922
Piastra per coltura tissutale 100 x 20 mm	Fisher Scientifico	877222
Soluzione di Trypan Blue 0,4%	Thermo Fisher Scientifico	15250061
Calibro di misurazione del tumore	Giles scientificMitutoyo corporation	500-321