Articolo di ricerca

Identificazione bioinformatica dei biomarcatori candidati associati alla parodontite nelle cellule staminali del legamento parodontale trattate con citochine

DOI:

10.3791/68863

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31 marzo 2026

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1Department of Periodontology and Oral Mucosa, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, 2Department of Preventive dentistry, Heilongjiang Provincial Stomatological Disease Prevention and Treatment Hospital, 3Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University

In questo articolo

Sommario

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L'attuale studio mira a esplorare geni disregolati tramite analisi bioinformatica nelle cellule staminali parodontali trattate con citochine. ERC2-IT1 alzata e EPB41L4A-AS1 sottoregolata sono state identificate come molecole chiave in queste cellule, che potrebbero fungere da biomarcatori potenzialmente associati alla parodontite.

Abstract

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L'obiettivo principale dell'attuale studio era indagare il potenziale meccanismo molecolare alla base delle cellule staminali parodontali indotte dalle citochine (PDLSC). I dati dei microarray dal dataset GSE260558 sono stati recuperati dal database gene expression omnibus (GEO). Dopo la normalizzazione, sono stati identificati i geni disregolati. Successivamente, i diversi mRNA espressi (DE-mRNA) sono stati sottoposti ad analisi di arricchimento dell'ontologia genica (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Successivamente, i geni hub sono stati selezionati sulla base della rete di interazione proteina-proteina (PPI). Infine, le reti regolatorie competitive dell'RNA endogeno (ceRNA) contenenti geni hub sono state stabilite utilizzando il sito ENCORI. Un totale di 739 lncRNA (DE-lncRNA) espressi diversi e 809 mRNA espressi diversi (DE-mRNA) sono stati identificati utilizzando il pacchetto limma nel linguaggio di programmazione R. Successivamente, le analisi GO e KEGG hanno dimostrato che i DE-mRNA erano strettamente associati all'infiammazione e alla formazione della matrice extracellulare nei PDLSC trattati con citochine. È stata costruita una rete di interazione proteina-proteina (PPI) per i DE-mRNA, e i geni hub sono stati ottenuti valutando il grado. Sono stati sottoposti uno screening totale di 12 geni hub con regolazione al rialzo e 12 geni hub a ridimensionamento. Questi geni hub a aumento e a basso sono stati poi utilizzati per costruire rispettivamente una rete regolatoria del ceRNA. In queste reti, ERC2-IT1 con aumento e EPB41L4A-AS1 sotto regolazione rialzata sono stati considerati lncRNA chiave nella parodontite. In conclusione, l'analisi bioinformatica ha rivelato diversi geni chiave e una rete regolatoria del ceRNA che ha partecipato alla progressione dei PDLSC indotti da citochine. Sebbene questo studio abbia identificato diversi biomarcatori candidati correlati alla parodontite, è necessaria ulteriore validazione sperimentale su modelli animali o campioni clinici.

Introduzione

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Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, la parodontite è riconosciuta come la sesta malattia infiammatoria cronica più diffusa, ubiqua e irreversibile tra l'uomo 1,2. Nell'epoca attuale, colpisce quasi il 15% della popolazionemondiale 1,2,3. È stato riportato che la parodontite è fortemente correlata a una varietà di fattori come età, genere, pratiche di igiene orale, stato di fumatore, etnia, status socioeconomico inferiore e una serie di malattiesistemiche 2,3,4,5. La parodontite, che ha una prevalenza particolarmente elevata tra gli anziani, è patologicamente scatenata da alterazioni disbiotiche nel microbiota subgingivole che aderisce ai denti 6,7. Se non trattata, questa condizione porta infine alla distruzione ossea, al movimento dei denti e alla sfortunata perdita deidenti. Di conseguenza, è urgentemente necessaria una comprensione completa dei meccanismi molecolari alla base della parodontite e l'identificazione dei marcatori diagnostici della malattia.

La complessità strutturale e interattiva del tessuto parodontale è ampiamente considerata uno dei fattori significativi che contribuiscono alla notevole difficoltà riscontrata nel processo di rigenerazione parodontale 9,10. Tra la vasta gamma di cellule staminali mesenchimali (MSC) utilizzate per la rigenerazione parodontale, le cellule staminali del legamento parodontale (PDLSC) sono state ampiamente dimostrate come una fonte altamente affidabile per la formazione di nuove strutture simili al cemento nell'ambiente in vivo 11,12. Nei recenti studi preclinici condotti, il trattamento basato sui PDLSC ha mostrato risultati estremamente promettenti nel campo della rigenerazionetissutale 13,14. Rispetto al tessuto gengivale del paziente, l'analisi trascritomica dei PDLSC ha mostrato un orientamento funzionale più forte e un potenziale di trasformazioneterapeutica 13,14.

La tecnologia bioinformatica e i metodi di analisi bioinformatica permettono ai ricercatori di identificare potenziali processi biologici e associazioni con statistiche proteomica, genomica emetabolomica 15,16. Inoltre, la natura ad alto rendimento della tecnologia bioinformatica consente anche ai ricercatori di analizzare set di dati biologici su larga scala, come quelli generati dal sequenziamento di nuova generazione e dagli esperimenti di microarray17,18. Questa capacità consente l'identificazione di potenziali biomarcatori per la diagnosi e la prognosidella malattia 19,20. Ad esempio, una disintegrina e metalloproteinasi 28 (ADAM28) e un dominio simile alla disintegrina e metalloproteasi con motivi di trombospondina tipo I come 3 (ADAMTSL3) sono stati identificati come nuovi biomarcatori nei tessuti gengivali di pazienti con parodontite tramite un'analisi completa basata sulla tecnologiabioinformatica 21. Inoltre, diversi geni correlati alla ferroptosi, tra cui il coattivatore del recettore nucleare 4 (NCOA4), il trasportatore di soluti 1A5 (SLC1A5) e la proteina da shock termico B1 (HSPB1), sono stati riportati con un valore diagnostico migliore nella parodontite22. Tuttavia, il meccanismo molecolare della parodontite merita un'ulteriore esplorazione. Nel presente studio, i ricercatori si impegnano a utilizzare la tecnologia bioinformatica per indagare i geni hub nei PDLSC indotti da citochine e per individuare potenziali processi biologici e vie collegate alla parodontite. L'analisi bioinformatica dei PDLSC trattati con citochine cattura i programmi trascrizionali guidati dall'infiammazione rilevanti per la disfunzione della PDLSC, che affrontano il divario tra la disfunzione della PDLSC e la parodontite. Questi geni e vie fondamentali nelle PDLSC indotte da citochine offrono preziose intuizioni sui meccanismi unificati alla base della parodontite.

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Protocollo

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1. Dataset

Questa analisi utilizzava dati pubblici e non coinvolgeva soggetti umani o animali, in conformità con le linee guida etiche istituzionali e JoVE. Tutte le informazioni relative alle piattaforme utilizzate sono disponibili nella Tabella dei Materiali.

  1. Seleziona un totale di 6 campioni (GSM8119437, GSM8119438, GSM8119439, GSM8119440, GSM8119441 e GSM8119442) dal dataset GSE260558 (National Center of Biotechnology Information Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE260558) per l'analisi bioinformatica.
  2. In questi campioni, si coltura cellule staminali dei legamenti parodontali (PDLSC) in un mezzo normale o in un mezzo contenente citochine infiammatorie per 7 giorni.
  3. Estrarre l'RNA totale dalle PDLSC e sottoporlo a sequenziamento ad altaproduttività 23. Il processo di analisi bioinformatica è mostrato nella Figura 1.

2. Identificazione dei DEG

  1. Analizza i profili di espressione di lncRNA e mRNA utilizzando il software limma (versione: 3.46.0) come descrittoin precedenza 24.
  2. Eseguire confronti a coppie tra citochine e gruppi normali.
  3. Utilizzare la correzione del tasso di false scoperte (FDR) con un cutoff standard di < 0,05 per identificare geni espressi in modo significativamente differenziale. Utilizzare i valori p aggiustati (FDR) per controllare la proporzione di falsi positivi tra i risultati statisticamente significativi.
  4. Utilizzare un cutoff di P-value aggiustato di < 0,05 e una soglia di cambiamento di fold di > 1 per identificare lncRNA o mRNA significativamente disregolati.
  5. Presentare l'espressione genica differenziale nei grafici vulcanici (ggplot2: versione 3.4.1), generati utilizzando il software R (versione 4.0.4).
  6. Elenca i 10 principali lncRNA e mRNA disregolati nelle tabelle.

3. Analisi dell'arricchimento funzionale

  1. Esegui l'analisi di arricchimento GO dei DE-mRNA utilizzando il database online DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/).
    1. Invia i geni disregolati sul sito web e seleziona i termini GO, inclusi funzione molecolare (MF), processi biologici (BP) e componenti cellulari (CC), per eseguire l'analisi GO.
    2. Invia i geni disregolati al plugin Cytoscape (versione: 3.8.2) ClueGO [16]+ e all'app Cluepedia.
    3. Applicare la correzione di Benjamini-Hochberg per confronti multipli e impostare la soglia di significatività a un valore P corretto < 0,05.
    4. Scarica i risultati da Cytoscape. Classifica gli arricchimenti in ordine decrescente in base al valore P e presenta i primi 5 arricchimenti in ciascuna categoria.
  2. L'enciclopedia di geni e genomi di Kyoto (KEGG) è una preziosa risorsa di database per comprendere le funzioni e gli impatti di alto livello dei sistemi biologici (http://www.genome.jp/kegg/).
    1. Esegui l'analisi KEGG in modo simile scegliendo KEGG-PATHWAY sul sito web.
    2. Stabilisci la soglia di significatività a un valore P corretto < 0,05 e presenta i primi 10 arricchimenti in questo studio. Eseguite queste analisi di arricchimento secondo gli studi riportati 25,26.

4. Rete PPI

  1. Prevedere e costruire la rete di interazioni proteina-proteina (PPI) utilizzando lo strumento di ricerca per il recupero di geni interagenti (STRING, versione 12.0).
  2. Invia 318 mRNA al rialzo o 465 mRNA al ribasso sul sito web di STRING per costruire la rete PPI.
  3. Esporta i dati di interazione dalla rete PPI e invia i dati al software Cytoscape.
  4. Nascondi il singolo nodo nella rete PPI. Scarica la rete PPI presente in questo studio.
  5. Calcola le proprietà topologiche della rete, inclusa la distribuzione dei gradi, utilizzando l'app CentiScaPe, un plug-in di Cytoscape.
  6. Quantificare la topologia locale di ogni gene sommando il numero dei suoi geni adiacenti e contare le interazioni per un nodo dato.
  7. Classifica tutti i geni della rete PPI in ordine decrescente in base al loro grado di connettività.
  8. Seleziona i 12 geni più alti e i primi 12 più ribassati da questa lista classificata come geni hub.

5. rete regolatoria miRNA-mRNA

NOTA: Il database ENCORI (versione 12.0, https://rnasysu.com/encori/) è stato utilizzato per prevedere le associazioni regolatorie tra microRNA (miRNA) e DE-lncRNA (o geni hub).

  1. Presentare i geni hub al rialzo o al ribasso a ENCORI e stabilire il criterio di soglia del programma ≥5 in totale sei programmi, inclusi PITA, RNA22, miRmap, miRanda, PicTar e TargetScan, per l'analisi di previsione in ENCORI.
  2. Scarica i miRNA previsti e inviali a ENCORI per ottenere potenziali lncRNA.
  3. Scarica le LNRRA previste e identifica le LNCRNA sovrapposte tra il passo 5.2 e la Figura 2.
  4. Inviare i geni hub, i miRNA ottenuti nella sezione 5.1 e gli lncRNA ottenuti nel passo 5.3 al software Cytoscape (versione 3.4.0) per costruire la rete ceRNA.

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Risultati

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Identificazione dei DEG
Il software limma R è stato utilizzato per analizzare i profili di espressione differenziali di lncRNA e mRNA. Le differenze tra i due gruppi sono state determinate da un test t non accoppiato. Come mostrato nel diagramma del vulcano (Figura 2), sono stati identificati in totale 739 diversi lncRNA espressi (DE-lncRNA, valore p<0,05, |log2FC|>1). Tra questi DE-lncRNA, sono stati identificati 340 lncRNA al r...

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Discussione

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Le cellule staminali del legamento parodontale (PDLSC) sono considerate cellule chiave che svolgono un ruolo cruciale nella soppressione del danno parodontale sia nella fase di progressione che di recupero della parodontite32,33. Una notevole quantità di evidenze ha chiaramente dimostrato che l'incubazione in condizioni infiammatorie ha il potenziale di accelerare significativamente la senescenza deiPDLSC ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che in questo studio non ci sono interessi concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apprezziamo il sostegno del Secondo Ospedale Affiliato dell'Università Medica di Harbin, della Natural Science Foundation della Provincia di Heilongjiang (LH2023H037) e della National Natural Science Foundation (82201070).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RR Foundation for Statistical Computing4.0.4Ambiente open-source fondamentale per il calcolo statistico. Serve da base per tutte le analisi successive. Tipicamente utilizzato con RStudio.
LimmaComunità Bioconductor (Sviluppatore principale: Walter & Eliza Hall Institute)3.46.0Pacchetto specializzato per l'analisi dell'espressione differenziale di microarray e RNA-seq. 
CytoscapeConsorzio Cytoscape3.8.2Piattaforma open source per la visualizzazione della rete. Richiede un'installazione separata; supporta plugin come ClueGO e cytoHubba tramite App Store.
STRINGLaboratorio Europeo di Biologia Molecolare12Il più grande database al mondo per interazioni proteica-proteina (PPI) previste e conosciute. Accessibile tramite web o plugin Cytoscape; fornisce punteggi di fiducia.
ENCORIUniversità Sun Yat-sen3Database pubblico focalizzato sulle reti ceRNA (miRNA-mRNA-lncRNA).

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Trattamento con citochineanalisi bioinformaticaespressione genicageni differenzialmente espressiinterazione proteina proteinarete ceRNAarricchimento GOpathway KEGG

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