Articolo metodologico

Analisi della rete di RNA endogeno competitiva nei ratti con occlusione dell'arteria cerebrale media basata sull'espressione di lncRNA, miRNA e mRNA

DOI:

10.3791/68876

⸱

7 ottobre 2025

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1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

In questo articolo

Sommario

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Questo studio ha utilizzato analisi bioinformatiche e validazione sperimentale per indagare sistematicamente i ruoli regolatori e i meccanismi sottostanti degli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) che funzionano come RNA endogeni competitivi (ceRNA) nell'ictus ischemico.

Abstract

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Questo studio si propone di indagare i ruoli regolatori e i meccanismi sottostanti degli lncRNA che agiscono come ceRNA nell'ictus ischemico. Sulla base dell'ipotesi del ceRNA, gli lncRNA, i miRNA e gli mRNA sono stati identificati come componenti di una rete regolatoria coinvolta nell'ictus. I lncRNA chiave della sottorete risultante sono stati selezionati per un'analisi dettagliata. L'analisi dell'arricchimento funzionale utilizzando l'ontologia genica e la mappatura dei percorsi attraverso l'Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto ha rivelato interazioni critiche all'interno della rete di ceRNA associati a lncRNA. I percorsi chiave, tra cui la segnalazione del calcio, la segnalazione della giunzione gap e l'interazione neuroattiva con il recettore del ligando, sono stati ulteriormente convalidati utilizzando l'analisi Western blot. La rete di ceRNA costruita comprendeva 334 lncRNA, miRNA e mRNA, con analisi di arricchimento funzionale che ne prevedeva i ruoli biologici. Tre lncRNA con un alto grado di centralità sono stati selezionati per costruire una sottorete rappresentativa di ceRNA. L'analisi Western blot ha rivelato che, rispetto al gruppo sham, i livelli di espressione delle proteine chiave - CaMKII, calmodulina, CX36, PKC, CX43, GRIA3, GABRA6 e NPY1R erano significativamente sottoregolati nel gruppo modello, mentre l'espressione di CaN era significativamente sovraregolata (P < 0,05). Questi risultati suggeriscono che gli lncRNA sono significativamente coinvolti nella patogenesi dell'ictus. In conclusione, gli lncRNA che agiscono come ceRNA svolgono un ruolo regolatore critico nella patogenesi dell'ictus ischemico.

Introduzione

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L'ictus ischemico, un disturbo neurologico prevalente, porta a danni cerebrali permanenti, disabilità a lungo termine o morte 1,2,3,4. I microRNA (miRNA o miR), gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) e gli RNA messaggeri (mRNA) formano reti regolatorie mediate dall'RNA 5,6,7,8. Queste molecole regolano le funzioni cellulari attraverso vari meccanismi complessi 9,10 sono sempre più riconosciute come contributori alla fisiopatologia dell'ictus ischemico. Tuttavia, nonostante la loro crescente associazione con la condizione, i ruoli precisi di questi RNA non codificanti rimangono poco chiari. Ulteriori indagini su nuovi RNA non codificanti sono essenziali per chiarire i meccanismi molecolari alla base dell'ictus ischemico.

Gli LncRNA agiscono come regolatori chiave dell'espressione genica durante l'inizio e la progressione di varie condizioni patologiche. Fungendo da RNA endogeni concorrenti (ceRNA), gli lncRNA si legano ai miRNA per esercitare effetti regolatori specifici11. Wei et al. riportano che lncRNA AK038897 agisce come un ceRNA prendendo di mira il miR-26a-5p, modulando così la proteina chinasi 1 associata alla morte (DAPK1) per esacerbare il danno da ischemia-riperfusione cerebrale12. Gli studi dimostrano che l'RNA lungo non codificante SNHG1 (lncRNA SNHG1) funziona come un ceRNA per regolare le malattie cerebrovascolari modulando la via di segnalazione HIF-1α/VEGF attraverso l'interazione con il miR-18a13. Ulteriori studi dimostrano che il gene 3 maternamente espresso a RNA lungo non codificante (lncRNA MEG3) modula l'apoptosi neuronale attraverso la cascata di segnalazione miR-21/PDCD414. Sebbene numerosi lncRNA, miRNA e mRNA siano stati identificati attraverso il sequenziamento ad alto rendimento o l'analisi di microarray, le funzioni di queste molecole nell'ictus rimangono poco chiare ed è urgentemente necessaria la creazione sistematica di reti regolatorie mediate dall'RNA.

Pertanto, questo studio mira a costruire una rete completa di lncRNA-miRNA-mRNA basata sull'ipotesi del ceRNA utilizzando dati raccolti in precedenza e ad analizzare sottoreti di ceRNA selezionate attraverso l'arricchimento dell'ontologia genica (GO) e dell'enciclopedia di geni e genomi di Kyoto (KEGG) per comprendere meglio le funzioni dell'lncRNA. I risultati potrebbero rivelare che diversi lncRNA funzionano come ceRNA, regolando potenzialmente specifici miRNA e i loro mRNA bersaglio. L'arricchimento di OB potrebbe evidenziare processi biologici chiave, come lo sviluppo cellulare, la trasduzione del segnale e la regolazione del ciclo cellulare, mentre l'arricchimento del percorso potrebbe rivelare il loro coinvolgimento nei percorsi correlati all'ictus, nelle risposte immunitarie e nel metabolismo. Questi risultati potrebbero evidenziare i potenziali ruoli degli lncRNA in diversi processi cellulari e meccanismi di malattia.

Nella ricerca sull'ictus ischemico vengono offerti diversi miglioramenti chiave rispetto ai metodi di analisi della rete di ceRNA esistenti, supportati da confronti con studi correlati: in primo luogo, integrare la convalida multilivello combinando la costruzione della rete con la verifica del percorso funzionale; a differenza di Li et al.15, che si concentra principalmente sulla profilazione bioinformatica di reti di ceRNA immuno-correlate utilizzando dati pubblici del trascrittoma, costruiscono una rete di ceRNA comprendente 334 lncRNA, miRNA e mRNA e convalidano le vie di segnalazione critiche (segnalazione del calcio, segnalazione della giunzione gap e interazione ligando-recettore neuroattiva) attraverso l'analisi Western blot, affrontando la limitazione dell'eccessivo affidamento sulle previsioni in silico come visto in Fan et al.16, che costruisce una rete di ceRNA associata a circRNA ma manca di validazione sperimentale delle vie a valle, e confermano la rilevanza funzionale della rete prevista quantificando l'espressione proteica (ad esempio, CaMKII, CX36, GRIA3) sia nel gruppo modello che nel gruppo sham; concentrarsi su lncRNA core con elevata importanza topologica, migliorando la specificità dei risultati; a differenza di Cheng et al.17, che costruisce una rete di ceRNA lncRNA-miRNA-mRNA con 3 lncRNA, 2 miRNA e 24 mRNA ma non dà priorità ai regolatori chiave, identifica 3 lncRNA con un alto grado di centralità per costruire una sottorete rappresentativa, assicurando che le intuizioni meccanicistiche siano ancorate ai nodi più influenti e migliorando l'interpretabilità rispetto a reti più ampie e meno focalizzate come quelle descritte in Li et al.18, che comprende 62 lncRNA ma manca di un'analisi mirata delle sottoreti; fornire parametri sperimentali dettagliati per migliorare la riproducibilità: utilizzare 500 ng-1 μg di RNA totale estratto da tessuti cerebrali (6 ratti per gruppo: 20 modelli MCAO e 20 controlli azionati da sham) per la preparazione della libreria, con numero di integrità dell'RNA (RIN) > 8.0 per garantire la qualità, un dettaglio non specificato in Wang et al.19, che convalida i biomarcatori circRNA ma omette le specifiche di input dell'RNA; impiegare ratti maschi SPF SD (220 ± 30 g) con MCAO, un modello ampiamente utilizzato, ma notare esplicitamente i suoi limiti, non replica completamente la complessità vascolare dell'ictus ischemico umano o le risposte immunitarie come evidenziato in Li et al. - e mitigare questo stratificando i ratti in base ai punteggi neurologici (1-3) per standardizzare la gravità dell'infarto; riconoscere i limiti dello studio: la rete di ceRNA potrebbe non catturare le modifiche post-traduzionali e la dimensione del campione per la convalida del Western blot (n = 6 per gruppo) potrebbe essere ampliata, con il lavoro futuro per includere coorti più ampie e analisi proteomiche per colmare queste lacune.

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Protocollo

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Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico Sperimentale dell'Università di Medicina Cinese di Anhui (numero di licenza: AHUCM-rats-2024006) e condotti in conformità con le linee guida istituzionali e gli standard di utilizzo degli animali di JoVE. In questo studio sono stati utilizzati quaranta ratti maschi SD di grado SPF (220 g ± 30 g). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Animali da esperimento

  1. Ospitare gli animali nel Centro Sperimentale Animale in condizioni sperimentali standard. Mantenere un ciclo luce/buio di 12 ore, cambiare la biancheria da letto ogni giorno e fornire libero accesso a cibo e acqua.
  2. Eutanasia degli animali alla fine dell'esperimento somministrando 150 mg/kg di pentobarbital sodico tramite iniezione intraperitoneale per indurre uno stato anestetico profondo (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Confermare l'anestesia profonda per l'assenza di risposta riflessiva al pizzicamento della zampa, monitorare la respirazione per garantire la completa perdita dei segni vitali e quindi procedere con la decapitazione.

2. Induzione del modello di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) nei ratti

  1. Indurre l'anestesia somministrando un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico all'1% alla dose di 40 mg/kg20 (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Valutare la profondità dell'anestesia utilizzando il pizzicamento delle dita dei piedi e i riflessi corneali.
    1. Monitorare continuamente la frequenza respiratoria e cardiaca durante tutta la procedura. Applicare un unguento oculare sterile a base di olio minerale subito dopo l'induzione dell'anestesia per la protezione degli occhi21.
  2. Una volta completamente anestetizzato, praticare un'incisione del collo sulla linea mediana ed esporre con cura l'arteria carotide comune destra (CCA), l'arteria carotide interna (ICA) e l'arteria carotide esterna (ECA). Sotto la visualizzazione diretta, utilizzare strumenti microchirurgici appropriati (ad es. pinze e forbici) per separare delicatamente il tessuto connettivo circostante ed esporre completamente ciascuna arteria.
    1. Dopo aver esposto le arterie, legare l'ECA e il CCA utilizzando suture chirurgiche. Legare nodi chirurgici sicuri per occludere il flusso sanguigno e ridurre al minimo il sanguinamento durante le procedure successive. Garantire una tensione adeguata per creare un campo stabile per l'inserimento della sutura.
    2. Praticare una piccola incisione nella biforcazione dell'ECA e dell'ICA utilizzando le forbici oftalmiche per prepararsi all'inserimento della sutura. Selezionare una sutura in nylon con un diametro di 0,25 mm e una lunghezza di 18 mm dalla punta dell'estremità arrotondata (a forma di sfera). Inserire la sutura attraverso il sito di incisione in corrispondenza della giunzione ECA-ICA e farla avanzare delicatamente lungo l'ICA fino a una profondità di circa 18,5 mm ± 0,5 mm per occludere l'arteria cerebrale media e indurre l'ischemia cerebrale focale.
    3. Fissare la sutura di nylon inserita al tessuto circostante o ai vasi sanguigni utilizzando suture chirurgiche per evitare lo spostamento. Dopo aver mantenuto l'MCAO per 2 ore, indurre lesioni da ischemia/riperfusione. Utilizzare una pinza chirurgica sottile per afferrare delicatamente la sutura di nylon e ritirarla lentamente di circa 5 mm per ripristinare parzialmente il flusso sanguigno cerebrale e indurre lesioni da riperfusione. Nel gruppo fittizio, legare solo l'arteria carotide senza inserire un embolo filettato22.
  3. Una settimana dopo il successo dell'istituzione del modello MCAO, anestetizzare profondamente i ratti. Una volta che non c'è risposta al pizzicamento della zampa, decapitare rapidamente e raccogliere il cervello. Sciacquare i tessuti cerebrali con soluzione fisiologica, quindi conservarli in frigorifero a -80 °C per la crioconservazione23.
  4. Punteggio della funzione neurologica
    1. Valutare la funzione neurologica utilizzando il metodo di punteggio Longa per determinare il successo del modello MCAO24. A 24 ore dalla riperfusione, valutare la funzione neurologica in ciascun ratto e assegnare un punteggio in base ai seguenti criteri: Punteggio 0: nessun deficit neurologico osservabile; Punteggio 1: flessione dell'arto anteriore sinistro durante la sospensione della coda, arto anteriore non completamente esteso; Punteggio 2: flessione dell'arto anteriore sinistro durante la sospensione della coda con resistenza marcatamente ridotta sul lato interessato (sinistro) quando posizionato su una superficie piana; Punteggio 3: uguale al punteggio 2, con l'aggiunta di movimenti circolari o di rotazione involontari durante il gattonamento; Punteggio 4: perdita di coscienza o morte entro 24 ore.
      NOTA: Un punteggio più alto indica un disturbo comportamentale più grave e una maggiore compromissione neurologica.
  5. Calcolare il volume dell'infarto cerebrale utilizzando la colorazione con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)
    1. Sezionare ogni cervello di ratto ex vivo lungo il piano coronale in cinque fette di uguale spessore. Assicurati che ogni fetta abbia uno spessore preciso di 2,0 mm ± 0,1 mm. Immergere completamente le sezioni in una soluzione colorante TTC al 2% (p/v) appena preparata.
      1. Avvolgere il contenitore di colorazione in un foglio di alluminio per proteggere la soluzione dalla luce e incubare i campioni in un incubatore a temperatura costante a 37 °C ± 0,5 °C per 30 minuti. Dopo la colorazione, osservare la colorazione rosso rosa nel tessuto cerebrale normale, mentre le aree infartuate ischemiche rimangono non colorate (bianche) a causa della perdita di attività della deidrogenasi.
    2. Trasferire le fette di cervello colorate con TTC in una soluzione di paraformaldeide al 4% (p/v) e fissarle a 4 °C per 24 ore per preservare la morfologia dei tessuti. Dopo il fissaggio, acquisire immagini digitali delle fette utilizzando un sistema di imaging ad alta risoluzione. Registra e archivia i dati 24 ore dopo la fissazione.
    3. Utilizzare il software ImageJ per quantificare il volume dell'infarto e il volume totale del tessuto cerebrale per ciascun gruppo di ratti dopo la colorazione TTC. Calcolare la percentuale corretta del volume dell'infarto utilizzando la seguente formula25:
      Volume corretto dell'infarto (%) = {[volume totale della lesione − (volume dell'emisfero sinistro − volume dell'emisfero destro)] / volume dell'emisfero destro} × 100%.
    4. Utilizza il software GraphPad Prism per visualizzare e analizzare statisticamente i volumi di infarto corretti tramite un t-test non accoppiato. Definisci la significatività statistica come P < 0,05.

3. Sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento

  1. Seleziona i tessuti cerebrali da tre ratti in ciascun gruppo. Rimuovere l'RNA ribosomiale (rRNA) dai campioni di RNA totali utilizzando il kit di rimozione dell'rRNA Ribo-Zero secondo le istruzioni del produttore.
    1. Costruisci librerie di DNA complementari (cDNA) utilizzando il kit di preparazione della libreria di RNA TruSeq seguendo il protocollo standard. Utilizza librerie di cDNA purificate per la generazione e il sequenziamento di cluster.
  2. Utilizzare i dati di base precedentemente generati26, che hanno fornito tutte le librerie di sequenziamento e i set di dati per questo studio, senza fare affidamento su librerie di nuova costruzione. Concentrare il lavoro attuale sull'analisi integrata della fusione di questi set di dati esistenti senza generare nuove librerie di RNA-seq o dati di sequenziamento.
    1. Confermare l'approvazione da parte dei comitati etici istituzionali competenti per lo studio precedente. Condurre un sequenziamento ad alto rendimento per valutare sistematicamente il profilo di espressione dei miRNA nei ratti con MCAO, aderendo ai protocolli standardizzati come precedentemente descritto27.
      NOTA: I dati di controllo qualità per la libreria di sequenziamento dell'RNA sono forniti nel File supplementare 1.

4. Analisi dell'espressione differenziale di RNA lunghi non codificanti, microRNA e RNA messaggeri

  1. Ottieni annotazioni per geni codificanti proteine, miRNA e lncRNA da Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html), miRBase (https://www.mirbase.org/) e NONCODE (http://www.noncode.org/), a seconda dei casi 28,29,30. Quantificare l'espressione genica utilizzando StringTie31 (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/).
    1. Assemblare le letture allineate di ogni campione in trascrittomi utilizzando l'assemblatore StringTie. Utilizza il modulo di unione StringTie per integrare gli assemblaggi del trascrittoma da tutti i campioni, generando un set unificato di trascrizioni coerenti in tutta la coorte. Utilizzare questo trascrittoma unito per stimare l'abbondanza del trascritto32.
    2. Eseguire la quantificazione di geni codificanti proteine e lncRNA applicando la normalizzazione della media trimmata dei valori M (TMM) e calcolando i frammenti per kilobase di trascrizione per milione di letture mappate (FPKM) per ogni trascritto33,34.
  2. Eseguire l'analisi dell'espressione differenziale utilizzando il pacchetto edgeR (https://bioconductor.org/) per identificare lncRNA (DEL), miRNA (DEMis) e mRNA (DEM) espressi in modo differenziale tra l'MCAO e i gruppi di controllo. Converti la matrice di conteggio grezzo filtrata in un oggetto edgeR DGEList. Stimare la dispersione comune e assegnare lo stesso valore di dispersione a ciascun gene o miRNA.
    1. Eseguire un test esatto per confrontare l'espressione genica tra i gruppi. Recupera la variazione di log 2 volte (log2FC), i conteggi log per milione (logCPM), i valori P e i valori P aggiustati per il tasso di false scoperte (FDR) per ciascun gene35 espresso in modo differenziale. Definisci la significatività statistica come P < 0,05 con una soglia di cambio di piega di |log2(FC)| > 1.

5. Predizione di bersagli di RNA non codificante lungo e RNA messaggero di microRNA differenzialmente espressi

  1. Recupera le sequenze di DEMis e DEL dai database appropriati. Utilizzare gli strumenti di previsione dell'interazione miRNA-lncRNA miRanda36 e RNAhybrid37 per identificare potenziali interazioni tra DEMis e DEL. Ottenere coppie di interazione miRNA-mRNA dal database miRWalk 3.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)38

6. Costruzione della rete regolatoria di RNA non codificante lungo - microRNA - RNA messaggero

  1. Costruire la rete di regolazione lncRNA-miRNA-mRNA basata sull'ipotesi ceRNA39,40.
    1. Calcola il coefficiente di correlazione di Pearson (PCC) tra DEL e DEM. Selezionare le coppie lncRNA-mRNA per ulteriori analisi se PCC > 0,99 e P < 0,01.
    2. Per ogni coppia lncRNA-mRNA co-espressa, identificare i miRNA condivisi che hanno come bersaglio entrambi i trascritti. Utilizzare questi miRNA condivisi per costruire la rete di co-espressione miRNA-mRNA-lncRNA.
    3. Utilizzare Cytoscape (https://cytoscape.org/) per costruire e visualizzare la rete di interazione lncRNA-miRNA-mRNA41,42. Segui questi passaggi:
      1. Utilizza il plug-in CytoNCA per calcolare la centralità tra (BC), la centralità di prossimità (CC) e la centralità di grado (DC) per ciascun nodo.
      2. Selezionare i geni con punteggi di centralità superiori ai valori mediani di tutte e tre le metriche per costruire la sottorete chiave finale.
      3. Utilizza il plug-in CytoHubba per identificare i primi 10 geni hub nella rete di interazione proteina-proteina ed estrarre i nodi chiave identificati nella fase 2.
      4. Calcola il grado del nodo per ogni componente della rete ceRNA.

7. Analisi di arricchimento funzionale

  1. Eseguire analisi di arricchimento delle vie GO e KEGG per indagare ulteriormente la funzione dell'RNA43. Utilizzare il pacchetto clusterProfiler (https://bioconductor.org/) per visualizzare i risultati dell'arricchimento44.

8. Analisi Western blot per rilevare i livelli di espressione di proteine chiave coinvolte nelle vie correlate a lncRNA - ceRNA

  1. In anestesia profonda, rimuovere rapidamente l'intero cervello. Dopo aver rimosso con cura le meningi e i vasi sanguigni, isolare il tessuto corticale nell'area infartuata del ratto45. Usa le forbici sottili per tagliare il fazzoletto in piccoli pezzi, assicurandoti che ogni pezzo pesi tra 50 mg e 100 mg. Trasferire i campioni di tessuto pesati in provette di omogeneizzazione pre-raffreddate.
    1. Preparare il tampone di lisi proteica con un rapporto in volume tra PMSF e tampone di lisi RIPA di 1:100 (concentrazione finale 1 mM PMSF). Aggiungere il tampone di lisi in un rapporto di 200 μl per 20 mg di tessuto. Omogeneizzare accuratamente i campioni utilizzando un omogeneizzatore di vetro sterilizzato a caldo fino a quando il tessuto non si rompe finemente.
    2. Incubare gli omogeneizzati su ghiaccio per 30 minuti, agitando delicatamente ogni 10 minuti per facilitare la lisi completa. Centrifugare i campioni a 28.656,6 × g per 15 minuti a 4 °C. Aspirare con cura il surnatante contenente proteine totali senza disturbare il pellet.
  2. Aggiungere 5× tampone di caricamento per elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) al campione proteico con un rapporto di 1:4 (1 volume di tampone da 5× per 4 volumi di campione proteico). Dopo la diluizione, la concentrazione di lavoro finale del tampone di caricamento SDS-PAGE è di 1×.
    1. Mescolare accuratamente e scaldare a bagnomaria bollente per 10 minuti per denaturare completamente le proteine. Lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente. Caricare 30 μg di ciascun campione nei pozzetti del gel SDS-PAGE.
    2. Eseguire l'elettroforesi in due fasi: applicare 80 V per 30 minuti per risolvere le proteine attraverso il gel di impilamento, quindi aumentare a 120 V per 1 ora per separare le proteine nel gel risolutivo.
  3. Preparare la carta da filtro pretagliata e le membrane in polivinilidene difluoruro (PVDF) in modo che corrispondano alle dimensioni del gel. Immergere la membrana in PVDF in metanolo per 3 minuti per attivarla. Immergere sia la membrana PVDF che la carta da filtro nel tampone di trasferimento per 5 minuti.
    1. Assemblare il sandwich di trasferimento nel seguente ordine (dall'alto verso il basso): piastra anodica, tre strati di carta da filtro, membrana PVDF, gel, tre strati di carta da filtro, piastra catodica. Garantire il corretto allineamento degli strati di gel, membrana e carta da filtro. Rimuovi tutte le bolle d'aria ad ogni passaggio per garantire un trasferimento uniforme.
  4. Immediatamente dopo il trasferimento delle proteine, sciacquare la membrana in PVDF nel tampone di lavaggio Western per 5 minuti per rimuovere il tampone di trasferimento residuo. Bloccare la membrana a temperatura ambiente per 2 ore agitando delicatamente nel tampone bloccante Western contenente il 5% di latte scremato in polvere, oppure utilizzare il 5% di BSA se si rilevano proteine fosforilate.
  5. Dopo il blocco, incubare la membrana con l'anticorpo primario (1:1000) a 4 °C per una notte agitando delicatamente. Il giorno seguente, incubare la membrana con l'anticorpo secondario (1:10.000) per 2 ore a temperatura ambiente.
  6. Eseguire il rilevamento chemiluminescente in una stanza buia per evitare interferenze luminose. Posizionare il lato proteico della membrana in PVDF al centro della piastra di esposizione nel sistema di imaging automatico.
    1. Mescolare volumi uguali di reagente ECL A e reagente ECL B in una provetta da centrifuga pulita immediatamente prima dell'uso. Applicare la soluzione ECL miscelata in modo uniforme sulla superficie della membrana per avviare la reazione luminescente.
    2. Dopo 1-2 minuti di incubazione a temperatura ambiente, rimuovere delicatamente il liquido in eccesso senza disturbare la superficie della membrana. Regolare i parametri di esposizione sul sistema di imaging in base all'intensità della luminescenza per ottimizzare l'acquisizione del segnale.

9. Analisi statistica

  1. Analizza i risultati del Western blot utilizzando il software ImageJ per quantificare i valori di grigio della banda. Utilizza GraphPad Prism per l'analisi statistica dei dati sperimentali. Esprimere tutti i dati come media ± deviazione standard (x ± SD). Valutare le differenze statistiche tra i gruppi utilizzando un test t non accoppiato.
    1. Inserire i dati dei due gruppi di campioni indipendenti nella tabella dati del software, con ogni gruppo corrispondente a una colonna separata e i campioni indipendenti l'uno dall'altro. Verifica la normalità selezionando "Test di normalità e simmetria" nella funzione "Analizza" e applicando il test di Shapiro-Wilk a entrambi i gruppi.
    2. Se P > 0,05 per entrambi i gruppi, considerare i dati normalmente distribuiti. Su questa base, selezionare Test t non abbinato in test t nella funzione Analizza per eseguire l'analisi. Definisci la significatività statistica come P < 0,05.

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Risultati

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I risultati sperimentali della verifica del tasso di successo di ciascun gruppo di modelli di ratto sono mostrati nella Figura 1. Dopo la modellazione, è stato eseguito il punteggio della funzione neurologica sui ratti (Figura 1A). Il gruppo modello ha mostrato gravi deficit neurologici e quelli con punteggi compresi tra 1 e 3 sono stati inclusi negli esperimenti successivi. Le figure 1B e C mostrano i risultati della colorazione TT...

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Discussione

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Per studiare i meccanismi molecolari alla base della patogenesi dell'ictus e identificare potenziali bersagli diagnostici e terapeutici, sono state condotte analisi di RNA-Seq e RNA-Seq piccolo (sRNA-Seq) su tessuti cerebrali di ratti dopo MCAO. Questo studio mira principalmente a indagare le complesse reti regolatorie che coinvolgono lncRNA, miRNA e mRNA. È stata condotta un'analisi completa dei set di dati RNA-Seq e sRNA-Seq provenienti da tessuti cerebrali di ratto indotti da MCAO per...

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Dichiarazioni

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Gli autori affermano che non ci sono interessi in competizione.

Ringraziamenti

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Questo manoscritto è stato supportato dal progetto di finanziamento dei candidati della riserva per leader accademici della provincia di Anhui (n. 2022H287), dal progetto chiave per la ricerca sanitaria provinciale di Anhui (riferimento: AHWJ2022a013), dal progetto chiave per la ricerca sulle scienze naturali dell'Anhui Provincial College (NO.2023AH050745) e dal progetto Outstanding Talents per l'igiene e la salute provinciale di Anhui (NO. ahsjhmypygc20230074).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione colorante TTC al 2% (p/v)Beijing Kangle Clone Biotechnology Co., Ltd.20230805Colorazione TTC
Soluzione di paraformaldeide al 4% (p/v)BeyotimeP0099Tessuto cerebrale fisso
40 ratti maschi SD di grado SPFHagzhou Ziyuan Laboratorio Allevamento Animale Co., LtdSCXK [zhe] 2024-0004animale da laboratorio
5% di latte scremato in polvereFigene scientificoPH1519WB
sistema di elettroforesi per agarosioBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYCP-44PWB
strumento di esposizione automaticaShanghai Peiqing Technology Co., Ltd.JS-M6PWB
Esposimetro automaticoShanghai Peiqing Technology Co., LTDJS-M6PWB
Fabbricatore di ghiaccio automaticoChangshu City Xueke Electric Appliance Co., LTDIMS-20WB
CalmodulinaAffinitàCodice 49B2443WB
CamKIIAffinitàCodice 14G0796WB
centrifugaHaimen Qilinbeier Instrument Manufacturing Co., Ltd.LX 300WB
pacchetto clusterProfilerBioconduttoreclusterProfiler_4.17analisi di arricchimento
CX36ZENBION24AP24WB
CX43ZENBIOM08NO01WB
Kit di chemiluminescenza ultrasensibile ECLBiosharpBL520BWB
Forno elettrico termostatico per l'essiccazione dell'ariaShanghai Sanfa Scientific Instrument Co., LTDDHG-9070WB
Apparecchio per elettroforesiFornitore verificato - Shanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)EPS300WB
apparecchio per elettroforesiShanghai Tanon Scienza & Technology Co., Ltd.EPS300WB
vasca per elettroforesiShanghai Tanon Scienza & Technology Co., Ltd.VE-180WB
GABRA6AffinitàCodice 46V5371WB
IgG anti-topo di capraZs-BIO142637WB
IgG anti-coniglio di capraZs-BIO139931WB
GRIA3AffinitàCodice 0C33051WB
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàAnhui Jiawen strumento equipment Co., LTDJW-3021HRWB
Sistema HiSeq 2500illumina/Sequenziamento ad alto rendimento dell'RNA
Software ImageJIstituti Nazionali di SanitàImmagineJ 1.54kColorazione TTC
Agitatore di riscaldamento magneticoCittà di Changzhou e fabbrica di strumentiJJ-79-1WB
MicropipettaGermania Eppendorf/WB
Microcentrifuga a temperatura normaleHaimen Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300LX300WB
NPY1RAffinitàCodice 2D38248WB
pipettaEppendorf0,5-10ulWB
PKCAffinitàCodice 17E3745WB
marcatore proteico precoloratoBiosharpBL712CWB
membrana in PVDFMilliporeIPVH00010WB
Kit di rimozione dell'rRNA Ribo-ZeroIllumina, San Diego, California, Stati Uniti/Estrazione dell'RNA
Lisato di RIPABiosharpBL504AWB
Pentobarbital sodioBeijing Think-Far Technology Co., Ltd.MERCKanestetico
strumento a membrana di trasferimentoShanghai Tanon Scienza & Technology Co., Ltd.VE-186WB
Apparato transmembranaFornitore verificato - Shanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)VE-186WB
β-actinaZs-BIO19AW0505WB

Riferimenti

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