Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Summary

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Abstract

Nella ricerca sulla patogenesi del diabete mellito post-acuto pancreatite (PPDM-A), la comunicazione bidirezionale anomala tra le cellule acine pancreatiche (PAC) e le cellule degli isolotti è un punto centrale. Tuttavia, le linee cellulari immortalate non possono replicare condizioni fisiopatologiche, rendendo cruciale l'estrazione di cellule primarie di alta qualità. I metodi attuali per estrarre isolotti primari dai topi si basano principalmente sulla perfusione pancreatica in vivo tramite canulazione dei dotti biliari, che presenta un'elevata barriera tecnica e non è favorevole all'operazione da parte di ricercatori senza esperienza.

Questo studio modificò il metodo, eliminando la necessità di perfusioni complesse in vivo . I topi C57BL/6J di grado SPF (6-8 settimane) sono stati anestetizzati ed eutanasiati, seguiti dall'isolamento pancreastico. Il pancreas è stato digerito in vitro con collagenasi P; isolotti primari furono separati tramite centrifugazione a gradiente di densità di Ficoll, e le cellule acinar furono ottenute tramite filtrazione con setaccio cellulare e centrifugazione. La vitalità e la funzione cellulare sono state valutate utilizzando la colorazione di calcina/propidio ioduro (Calceina/PI), il test di secrezione di insulina stimolata dal glucosio e la rilevazione dell'attività dell'amilasi.

I risultati hanno mostrato che il metodo modificato era facile da usare: la resa per topo era di (120 ± 5) isolotti primari e 1,6-1,95 × 10⁷ celle acinar; I tassi di vitalità degli isolotti e delle cellule acinar erano rispettivamente (97,52 ± 0,16%) e (96,55 ± 0,95%). Inoltre, gli isolotti mostravano una normale capacità di secrezione di insulina e le cellule acinar erano sensibili alla stimolazione della ceruleina. Questo metodo è semplice e affidabile, fornendo un quadro praticabile per studiare le interazioni pancreo-endocrine e PPDM-A. Tuttavia, presenta delle limitazioni, come un'applicazione non validata nei ratti.

Introduction

La pancreatite acuta (AP) può disturbare la funzione endocrina pancreatica attraverso molteplici percorsi, come la lesione parenchimatosa pancreatica e le cascate infiammatorie, inducendo così la pancreatite acuta (diabete mellito post-acuto) (PPDM-A^)1,2. Attualmente, la patogenesi centrale della PPDM-A rimane poco chiara, e una comunicazione bidirezionale anomala tra i compartimenti endocrino ed esocrino del pancreas è un focus chiave^{di ricerca 3}. Sebbene le linee cellulari β immortalate esistenti (ad esempio INS-1, MIN6) siano strumenti comunemente utilizzati per modelli di cellule diabetiche in vitro, la loro natura di origine tumoreale porta a differenze significative rispetto alle normali cellule primarie degli isolotti in termini di risposta al glucosio ed eterogeneità cellulare. Di conseguenza, non possono replicare veramente lo stato fisiopatologico nel microambiente della pancreatite^{acuta 4,5}. Pertanto, ottenere isolotti primari di alta qualità e cellule acinar è diventato la base tecnica fondamentale per chiarire il meccanismo della loro interazione.

I metodi attuali per isolare gli isolotti primari dai topi si basano principalmente sulla tecnologia di cannulazione dei dotti, che prevede la localizzazione e la cannulazione precise del dotto biliare per iniettare la soluzione di collagenasi nel parenchima pancreatico per una perfusione in^{vivo 6,7}. Tuttavia, per l'isolamento degli isolotti primari da topi neonatali, Huang et ^al.8 hanno ottenuto ottimi risultati utilizzando la digestione in vitro senza perfusione pancreatica in vivo. Sulla base dell'esperienza pratica del nostro team di ricerca, eseguire la perfusione pancreatica ottimale tramite la canulazione dei dotti biliari è difficile da realizzare rapidamente ed efficacemente senza una formazione specializzata. Ispirato dal metodo per isolare isolotti primari da topi neonati, il nostro team ha modificato il protocollo di estrazione per renderlo più semplice e accessibile ai ricercatori senza esperienza in perfusione. Questo approccio modificato offre anche un'alternativa più semplice per isolare isolotti primari da topi giovani o da quelli con dotti biliari delicati. Inoltre, questo metodo offre vantaggi sia nell'efficienza di isolamento (quantità) sia nella purezza (qualità) degli isolotti e delle cellule acinar. Permette ai ricercatori di condurre esperimenti nello stesso contesto patologico e fisiologico, facilitando un'analisi approfondita del meccanismo di interazione tra isolotti e cellule acinare.

Il metodo richiede un rigoroso controllo del tempo di digestione pancreatica; Tritare il pancreas prima della digestione è anche un passaggio cruciale. Inoltre, bisogna prestare attenzione all'intensità della dispersione meccanica del tessuto pancreatico dopo la digestione. Questi fattori influenzano tutti la quantità e la qualità degli isolotti isolati e delle cellule acinarie. Questo metodo non è stato convalidato nei ratti e al momento non può essere ampliato per la produzione.

Protocol

Le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal Comitato Etico o dal Comitato Etico del Centro per Animali da Laboratorio dell'Ospedale Changhai (Numero di Approvazione: CHEC (A.E)-2025-026). I topi C57BL/6J di grado SPF (6-8 settimane, con un peso 18-25 g, maschi o femmine, n = 3) sono stati mantenuti in un ciclo di 12 ore chiaro/scuro con libero accesso a cibo (dieta di mantenimento) e acqua.

Gli oggetti taglienti di scarto come siringhe e aghi devono essere raccolti nei contenitori dedicati al laboratorio e smaltiti da enti professionali qualificati. In conformità con le Linee Guida per la Condotta Etica nella Cura e l'Uso degli Animali Non Umani nella Ricerca, le carcasse dei topi devono essere poste nel congelatore dedicato al laboratorio e incenerite da enti professionali.

1. Preparazione dei reagenti

NOTA: Soluzioni come il mezzo a gradiente di densità sterile devono essere raccolte nel "Chemical Waste Collection Drum" del laboratorio. Tutti i rifiuti chimici devono essere smaltiti da enti professionali qualificati come organizzato dal laboratorio.

1. Preparazione della soluzione di collagenasi P
   1. In un tubo centrifugo da 50 mL, si pesano sequencialmente 25 mg di collagenasi P, 42 mg di cloruro di calcio anidro e 0,02 g di inibitore della tripsina. Aggiungi 45,5 mL di Soluzione Salata Bilanciata di Hank e 500 μL di soluzione HEPES, poi vortice fino a disciolto. Sterilizza la soluzione tramite filtrazione attraverso un filtro da 0,22 μm e trasferisci la soluzione filtrata in un nuovo tubo centrifuga sterile da 50 mL. Questo produce una soluzione di collagenasi P da 0,5 mg/mL, che viene utilizzata per la successiva digestione del tessuto pancreatico.
2. Trattamento della soluzione a gradiente di densità sterile
   1. Filtrare la soluzione del gradiente di densità sterile attraverso un filtro da 0,22 μm per la sterilizzazione, poi trasferirla in un nuovo tubo centrifuga sterile da 50 mL. Etichetta chiaramente le informazioni sulla soluzione e conservale a 4 °C per un uso successivo. D'ora in poi, viene chiamata "Ficoll".
3. Preparazione del buffer di stop e del mezzo completo
   1. Aggiungere il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di soluzione di penicillina-streptomicina al mezzo DMEM a vuoto e al mezzo RPMI-1640, rispettivamente, per preparare il mezzo completo DMEM e il mezzo completo RPMI-1640 (che funge anche da buffer di stop per la digestione pancreatica). Etichetta chiaramente le informazioni sulla soluzione e conserva a 4 °C per un uso successivo.
4. Preparazione di soluzioni di glucosio con diverse concentrazioni
   1. In un tubo centrifuga da 50 mL, aggiungere 50 mL di tampone bicarbonato Krebs-Ringer HEPES (KRBH) e 0,25 g di albumina sieroica bovina (BSA)-V per preparare una soluzione di KRBH contenente lo 0,5% di BSA. Poi, in 28,33 mL della soluzione di KRBH contenente 0,5% di BSA, aggiungere 168 μL di glucosio (1 M) e 1,5 mL di soluzione di cloruro di calcio (50 mM) per preparare una soluzione di glucosio da 5,6 mM. In 9,28 mL della soluzione di KRBH contenente 0,5% di BSA, aggiungere 220 μL di glucosio (1 M) e 500 μL di soluzione di cloruro di calcio (50 mM) per preparare una soluzione di glucosio da 22 mM.

2. Isolamento degli isolotti pancreatici e delle cellule acinari pancreatiche (PAV)

NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sottoposti a sterilizzazione tramite autoclave.

1. Aggiungi la soluzione salina bilanciata di Hank e la soluzione di collagenasi P al piatto a 12 pozzetti. E aggiungere 3 mL di soluzione di collagenasi P a un tubo centrifuga da 50 mL per la digestione successiva.
   NOTA: Aggiungi 2 mL di Soluzione Salata Bilanciata di Hank in tre pozzi e 2 mL di soluzione di collagenasi P in un pozzo.
2. Pesare e anestetizzare il topo con iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo all'1,25% a una dose di 0,025 mL/g prima dell'intervento, controllare lo stato anestetico pizzicando il cuscinetto del topo: la profondità dell'anestesia è determinata da una diminuzione graduale della frequenza respiratoria e dall'assenza di risposta al pizzicamento dei cuscinetti del piede. Una volta confermata l'anestesia profonda, si sopporta i topi tramite lussazione cervicale. Immergi i topi in etanolo al 75% per 5 minuti per la disinfezione, poi trasferiscili in un armadietto di biosicurezza per l'isolamento pancreatico.
   NOTA: Il tribromoetanolo (1,25%) viene fornito come soluzione pre-preparata all'acquisto; Non è necessaria alcuna preparazione manuale. I ricercatori devono indossare guanti e mascherine durante tutto l'esperimento. Se durante l'iniezione di tribromoetanolo all'1,25% si verifica contatto con la pelle residua, pulisci immediatamente il residuo con etanolo anidro, risciacqua con acqua corrente per 5 minuti e applica la crema idratante per alleviare la secchezza. Non sono coinvolte sostanze chimiche corrosive in questo studio. I reagenti chimici di scarto, come il tribromoetanolo all'1,25%, devono essere raccolti in contenitori sigillati dedicati etichettati come "Rifiuti Chimici Pericolosi".
3. Fai un'incisione addominale a forma di "V" per aprire la cavità addominale del topo. L'organo linfoide rosso scuro nella regione ipocondriaca sinistra è la milza, mentre l'organo bianco attaccato alla milza è il pancreas. Eseguire con attenzione una dissezione smussata del pancreas lungo il bordo inferiore dello stomaco e la giunzione pancreaticoduodenale.
4. Lavare il tessuto pancreasico isolato nella Soluzione Salata Equilibrata di Hank e rimuovere gli attacchi mesenterici residui, la milza e il tessuto adiposo peripancreatico.
5. Sposta il pancreas preprocessato su una piastra a 12 pozzetti contenente 2 mL di soluzione di P di collagenasi. Tieni il pancreas fermo con una pinzetta usando la mano sinistra e usa una siringa da 1 mL con la mano destra per iniettare una soluzione di collagenasi P nel parenchima pancreatico finché il tessuto pancreatico non appare traslucido ed edematoso.
   NOTA: Il volume della soluzione di P di collagenasi per la perfusione è di 600-800 μL.
6. Taglia rapidamente il pancreas in pezzi di tessuto da 1-2 mm³ con forbici chirurgiche.
   NOTA: La dimensione dei pezzi di tessuto è approssimativamente pari al diametro interno di una punta standard di pipetta da 200 μL.
7. Taglia la punta distale di 1-1,5 cm di una punta di pipetta da 1 mL (per ingrandire l'apertura) e usa questa punta modificata per trasferire i pezzi di tessuto pancreatico insieme a 2 mL di soluzione di collagenasi P in un tubo centrifugo da 50 mL precaricato con 3 mL di soluzione di collagenasi P.
8. Incubare il tubo della centrifuga in un bagno d'acqua a 37 °C per 12 minuti, scuotendo delicatamente il tubo ogni 5-6 minuti durante questo periodo.
   NOTA: Lo scopo di scuotere il tubo della centrifuga è garantire un pieno contatto tra il tessuto pancreatico e la soluzione di P di collagenasi.
9. Aggiungere 10 mL di mezzo intero RPMI-1640 per terminare l'effetto digestivo della soluzione di collagenasi P.
10. Pipetta ripetutamente la pellet con una pipetta Pasteur da 5 mL (15-20 tratti su e giù) finché non rimangono più grandi grumi tissutali evidenti.
11. Aggiungere 10 mL di mezzo completo RPMI-1640, poi centrifugare a 180 × g per 2 minuti a 4 °C, e scartare il sovrandante.
12. Sospendere il pallino con 20 mL di medium completo RPMI-1640. Filtrare la sospensione attraverso un setaccio da 40 rete, poi centrifugare a 180 × g per 2 minuti a 4 °C.
13. Scartare delicatamente il sovrantante, aggiungere 20 mL di soluzione Ficoll per risospendere il pellet e aggiungere lentamente 15 mL di mezzo completo RPMI-1640.
    NOTA: A questo punto si può osservare un'interfaccia liquido chiara.
14. Centrifuga delicatamente a 640 × g per 20 minuti a 25 °C.
    NOTA: Evitare violenti tremori durante la centrifugazione per evitare interruzioni dell'interfaccia.
15. Rimuovere con attenzione il tubo della centrifuga e aspirare lo strato superiore di mezzo rosso usando una pipetta Pasteur da 5 mL. Successivamente, aspirare con cura il liquido contenente gli isolotti all'interfaccia dello strato liquido e trasferirlo in un nuovo tubo centrifuga da 50 mL. Aggiungere 20 mL di mezzo completo RPMI-1640, centrifugare a 180 × g per 2 minuti a 4 °C e eliminare il sovrantante.
16. Risospendere il pellet con 20 mL di mezzo completo RPMI-1640, centrifugare a 180 × g per 2 minuti a 4 °C e scartare il sovrantante.
17. Sospensa il pellet con 10 mL di mezzo completo RPMI-1640 e trasferiscilo in un piatto di coltura cellulare da 60 mm.
18. Sotto un microscopio biologico rovesciato (ingrandimento 100x), scegliere manualmente gli isolotti usando una pipetta da 20 μL. Trasferire gli isolotti selezionati su una piastra di coltura cellulare da 24 pozzi precaricata con 500 μL di mezzo completo RPMI-1640 per pozzo.
19. Scartare lo strato di soluzione di Ficoll, risospendere il pellet (dal passo 2.15) con 10 mL di mezzo completo DMEM, filtrare attraverso un filtro per celle da 100 μm, centrifugare a 180 × g per 2 minuti a 4 °C e scartare il sovrantante.
20. Sospendere il pellet con 10 mL di mezzo completo DMEM, centrifugare a 180 × g per 2 minuti a 4 °C e scartare il sovrantantante. Successivamente, risospendere il pellet con 5 mL di mezzo completo DMEM per gli esperimenti successivi.

3. Rilevamento della vitalità degli isolotti pancreatici e delle cellule acinari

1. Trasferire gli isolotti isolati e un numero appropriato di cellule acinar su piastre di coltura cellulare a 12 pozzi/24 pozzi contenenti rispettivamente 1 mL di mezzo completo RPMI-1640 e 1 mL di mezzo completo DMEM. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 °C e 5% di cellule CO₂ per 15 minuti per farle equilibrare.
2. Centrifugare le piastre di coltura cellulare da 12 pozzi e 24 pozzi a 180 × g per 30 secondi a 25 °C. Nel frattempo, preparare il reagente di colorazione secondo le istruzioni del kit di dosaggio per la vitalità e citotossicità delle cellule di calceina/propidio ioduro (Calcein/PI) (proteggerlo dalla luce durante la preparazione).
3. Scartare delicatamente il mezzo, lavare le isolotte e le cellule acinar una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), poi centrifugare nelle stesse condizioni del passo 3.2.
4. Scartare il PBS e risospendere gli isolotti e le cellule acinar con il reagente di colorazione preparato. Avvolgi la piastra di coltura con carta stagnola di alluminio (per proteggerla dalla luce) e incuba in un incubatore a 37 °C e 5% di cellule CO₂ per 30 minuti.
5. In un ambiente protetto dalla luce, cattura immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza (ingrandimento 100x) ed esegui un'analisi di vitalità cellulare tramite ImageJ.

4. Analisi dell'amilasi acinar

1. Seminare le cellule acinar in una piastra a 12 pozzi con una densità di 1,5 × 10⁶ cellule per pozzo con 1 mL di mezzo. Impostare le cellule di controllo (Ctrl) e stimolate dalla ceruleina (10 nM, 20 nM, 50 nM; etichettate come C10, C20, C50). Dopo 30 minuti di stimolazione, raccogliere i sopranattivi per la rilevazione dell'attività dell'amilasi secondo le istruzioni del produttore.

5. Saggio di rilascio dell'insulina stimolata dal glucosio

1. Semina 10 isolotti per pozzo in una piastra a 24 pozzi. Stabilizzare gli isolotti nel mezzo RPMI-1640 completo per 2 ore, poi scartare il mezzo.
2. Incubare gli isolotti in 1 mL di soluzione di glucosio da 5,6 mM per 1 ora. Raccogli il soprantantante dopo.
3. Lava gli isolotti con il buffer KRBH. Successivamente, incubare gli isolotti in una soluzione di glucosio da 22 mM per 1 ora e raccogliere nuovamente il soprantantante.
4. Rilevare le concentrazioni di insulina nei due soprantanti (dalle condizioni a basso e alto livello di glucosio) utilizzando un kit ELISA Mouse INS (Insulina). Calcola l'indice di insulina stimolata dal glucosio (GSI):
   GSI = Concentrazione di insulina in mezzo ad alto contenuto di glucosio / Concentrazione di insulina in un mezzo a basso contenuto di glucosio

Results

Dopo la centrifugazione a gradiente di densità della soluzione di Ficoll, sono stati osservati isolotti vicino all'interfaccia tra lo strato liquido trasparente e incolore e il mezzo, con i PAC presenti come sedimento sul fondo del tubo (Figura 1).

Al microscopio ottico, gli isolotti erano tipicamente rotondi o ovali e di colore marrone dorato, con una resa stabile di (120 ± 5) isolotti per topo (Figura 2A,B). I PAC appena isolati erano sferici e principalmente distribuiti in gruppi (3-8 cellule acinar per cluster). Le estremità apicali delle cellule acinari erano di colore più scuro, con granuli di zimogeno chiaramente visibili; non sono stati osservati granuli o strutture vescicolari intorno alle cellule, e il fondo della soluzione era limpido. La resa delle cellule acinar variava da 1,6 a 1,95 × 10⁷ cellule per topo [(1,77 × 10⁷) ± (1,75 × 10⁶)] (Figura 2C,D).

I risultati della colorazione di calceina/PI di isolotti e cellule acinar sono mostrati nella Figura 3A: le cellule colorate con calceina (verde) rappresentavano la maggioranza, mentre le cellule colorate con PI (rosso) erano rare. L'analisi quantitativa delle immagini di colorazione viva/morta è stata effettuata utilizzando ImageJ. I risultati hanno mostrato che i tassi di vitalità degli isolotti isolati e delle cellule acinar erano rispettivamente (97,52 ± 0,16%) e (96,55 ± 0,95%) (Figura 3B).

L'attività dell'amilasi basale delle cellule acinari pancreatiche isolate era di (0,79 ± 0,01) U/mL. Dopo la stimolazione con la caeruleina a concentrazioni di 10 nM, 20 nM e 50 nM, le attività amilasi delle cellule acinar erano rispettivamente (1,45 ± 0,03) U/mL, (1,65 ± 0,05) U/mL e (1,39 ± 0,02) U/mL. I risultati unidirezionali dell'ANOVA hanno indicato che, rispetto al gruppo di controllo (Ctrl), tutti i gruppi stimolati dalla ceruleina hanno mostrato differenze significative nell'attività dell'amilasi (tutti i P < 0,001). Inoltre, è stata osservata una differenza significativa nell'attività dell'amilasi tra i gruppi ceruleina a 20 nM e quelli a 10 nM (P < 0,001) (Figura 4A).

Quando stimolata con una soluzione di glucosio di 5,6 mM, la secrezione di insulina degli isolotti isolati era (0,27 ± 0,04) ng/mL/isolotta/h. Quando stimolata con una soluzione di glucosio da 22 mM, la secrezione di insulina degli isolotti isolati era (0,94 ± 0,04) ng/mL/isolotto/h, con un GSI di 3,44. I risultati indicano che gli isolotti isolati mostrano una risposta tipica ed efficace alla secrezione di insulina durante la stimolazione con soluzioni di glucosio a diverse concentrazioni (Figura 4B).

I membri del nostro team di ricerca hanno osservato che la quantità e la qualità degli isolotti isolati e delle cellule acinar sono strettamente legate al tempo di digestione, che richiede un controllo rigoroso durante il funzionamento ed è meno influenzato da operatori diversi. Nel frattempo, le fluttuazioni di resa e vitalità sono strettamente correlate alla completa dissezione del pancreas e alla separazione meccanica del tessuto pancreatico, che richiede attenzione durante il funzionamento.

Figura 1: Risultati della centrifugazione a gradiente di densità di soluzione di Ficoll. Lo strato dell'isolotto si trova all'interfaccia tra lo strato liquido trasparente incolore e il mezzo di coltura. Il precipitato sul fondo del tubo della centrifuga è costituito da PAC. Abbreviazione: PAC: cellule acinari pancreatiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Caratteristiche morfologiche e quantitative degli isolotti e dei PAC. (A) Morfologia degli isolotti isolati dal tessuto pancreatico del topo. Barra della scala = 100 μm. (B) Analisi quantitativa del numero di isolotti isolati dal tessuto pancreatico del topo (n = 3). (C) Morfologia dei PAC isolati dal tessuto pancreatico del topo. Barra della scala = 100 μm. (D) Analisi quantitativa del numero di PAC isolati dal tessuto pancreasico del topo (n = 3). Tutti i dati sono stati espressi come media ± SD. Abbreviazione: PAC: cellule acinari pancreatiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Valutazione della vitalità di isolotti e PAC. (A) Colorazione con fluorescenza di iodio di calceina/propidio per valutare la vitalità di isolotti e PAC. Verde: cellule vive. Rosso: celle morte. Barra di scala = 100 μm. (B) Analisi quantitativa della vitalità di isolotti e PAC (n = 3). Tutti i dati sono stati espressi come media ± SD. Abbreviazioni: PAC: cellule acinari pancreatiche; PI = iodio di propidio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Valutazione dell'attività amilasi dei PAC e capacità di secrezione di insulina negli isolotti. (A) Attività amilasi dei PAC sotto stimolazione con diverse concentrazioni di ceruleina (Ctrl: gruppo di controllo; C10, C20 e C50: Le concentrazioni di ceruleina erano 10 nM, 20 nM e 50 nM (n = 3). (B) Analisi quantitativa delle concentrazioni di secrezione di insulina stimolata dal glucosio (n = 3). Tutti i dati sono stati espressi come media ± SD. ***P < 0,001. Abbreviazioni: GSI = Indice di insulina stimolata dal glucosio; PAC: cellule acinari pancreatiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Negli ultimi anni, il diabete mellito post-pancreatite (PPDM) ha ricevuto ampia attenzione ^1,9,10. Indagare i meccanismi molecolari con cui i PAC influenzano la secrezione dell'ormone isolotto nel contesto della PA è di grande importanza.

La patogenesi dell'AP è principalmente associata all'eccessiva attivazione degli enzimi pancreatici nelle cellule acinari, che porta all'autodigestione del tessuto^{pancreatico 11,12}. Sebbene siano attualmente disponibili linee cellulari come AR42J, 266-6 (linee acinari) e MIN6, INS-1 (linee β-cellulari), questi modelli cellulari in vitro non possono replicare pienamente la complessità fisiologica delle cellule acinari primarie e degli^{isolotti 4,5}. Pertanto, isolare le cellule acine primarie e gli isolotti è fondamentale per studi approfonditi sull'interazione tra i compartimenti esocrino e endocrino del pancreas. Attualmente, i metodi per l'isolamento degli isolotti sono ben consolidati; tuttavia, la maggior parte non soddisfa le esigenze di ricerca per studiare l'interazione tra isolotti e cellule acinari^{pancreatiche 6,7,8}.

Questo protocollo sperimentale ottimizza la procedura di perfusione pancreasica, abbassando la barriera tecnica e consentendo così ai ricercatori senza formazione specializzata nella canulazione dei dotti biliari di condurre esperimenti. Nel frattempo, garantisce la quantità e la qualità degli isolotti isolati e delle cellule acinar, fornendo un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari del topo e delle cellule acinari primarie del pancreas.

Sebbene questo metodo semplifichi il processo di isolamento degli isolini, i passaggi chiave richiedono comunque un controllo rigoroso per garantire elevati rendimenti e una separazione efficace degli isolotti e delle cellule acinari pancreatiche. Questi passaggi includono un'adeguata perfusione pancreatica, una corretta interruzione dei tessuti (assicurando una minacciatura accurata), la digestione pancreatica (controllo preciso del tempo di digestione e la scuotimento manuale durante la digestione) e la pipettatura meccanica (controllo del numero e dell'intensità delle carattate). Prima della selezione degli isolini, gli isolotti sospesi devono essere stabilizzati in un incubatore cellulare per circa 10 minuti per facilitare una raccolta più efficiente degli isolini.

È importante notare che durante la perfusione pancreatica, si ottengono risultati migliori quando vengono iniettate vescicole di liquido più limpide; L'intero tessuto pancreatico dovrebbe essere completamente perfuso, ma il tempo di perfusione dovrebbe essere controllato entro 1-2 minuti. Se viene rilevata una bassa vitalità cellulare, si aggiusta il tempo di contatto tra tessuto pancreatico e collagenasi P (inclusi il tempo di perfusione e il tempo di digestione a bagno d'acqua). Inoltre, prestare attenzione ai danni meccanici durante l'isolamento—ad esempio, evitare una forza eccessiva quando si disperde il tessuto pancreatico. La tecnica asettica deve essere mantenuta durante l'isolamento degli isolotti e delle cellule acinar per prevenire la contaminazione. I reagenti preparati devono essere filtrati attraverso un filtro da 0,22 μm. Il processo di isolamento dovrebbe essere eseguito in un armadietto di biosicurezza, e tutti gli strumenti e i consumabili utilizzati durante l'isolamento devono essere sterili. I due mezzi completi preparati contengono anche una soluzione di penicillina-estreptomicina all'1%.

Per l'anestesia del topo: fissa la pelle del collo del topo con il pollice e l'indice sinistri e sostieni l'addome con l'anulare e il mignolo (mantenendo una postura con la testa in basso e l'addome verso l'alto per esporre la cavità addominale). Tenere la siringa con la mano destra, inserirla a un angolo di 30° nella pelle della parte bassa sinistra dell'addome del topo (1 cm dall'inguine e 0,5 cm dalla linea mediana), iniettare lentamente l'anestetico e premere il sito di iniezione con un cotton fioc sterile per 10 secondi dopo il ritiro dell'ago per evitare perdite di farmaci. Sopporta il topo solo per lussazione cervicale una volta che è completamente anestetizzato.

Se pungi da un ago contaminato (esposto al sangue o tessuti del topo) o morso da un topo, stringi immediatamente l'area intorno alla ferita al lavandino più vicino (stringi dalla parte prossimale a quella distale della ferita per espellere una piccola quantità di sangue), risciacqua la ferita continuamente con acqua corrente per 15 minuti, poi disinfettala con etanolo al 75% o povidone-iodio allo 0,5%.

I risultati degli saggi sull'attività dell'amilasi delle cellule acinari hanno mostrato che le cellule acinari pancreatiche isolate avevano un basso livello di attivazione basale ed erano sensibili alla stimolazione della ceruleina: l'attività dell'amilasi è aumentata gradualmente con l'aumento della concentrazione di ceruleina, ha raggiunto il livello più alto a 20 nM di ceruleina e è diminuita leggermente quando la concentrazione di ceruleina era di 50 nM. I risultati del saggio sulla secrezione di insulina stimolata dal glucosio hanno mostrato che gli isolotti isolati hanno mostrato una risposta tipica ed efficace alla secrezione insulinica durante la stimolazione con soluzioni di glucosio a diverse concentrazioni. Questi risultati indicano che le cellule acinar e gli isolotti estratti da questo protocollo sono adatti per successivi esperimenti in vitro .

La procedura di isolamento delle isole e delle cellule acinari di questo protocollo sperimentale è facile da gestire. I risultati sperimentali mostrano che gli isolotti e le cellule acinar isolate tramite questo protocollo mostrano eccellenti quantità e vitalità. Inoltre, diversi membri del nostro team hanno validato questo protocollo usando più mouse; I risultati della validazione indicano che ha una buona riproducibilità, dati affidabili e fluttuazioni minime nella resa cellulare. Tuttavia, questo protocollo presenta anche alcune limitazioni. Sebbene dipenda poco dalle competenze tecniche dell'operatore, richiede comunque che l'operatore abbia conoscenze di base dell'anatomia del topo per dissezionare completamente il pancreas del topo: questo è un prerequisito per l'intero processo di isolamento. Se si isolano i tessuti pancreatici di più topi contemporaneamente, la quantità di soluzione di P di collagenasi e altri reagenti deve essere regolata di conseguenza. Inoltre, non è raccomandata l'isolamento simultaneo da più di due topi: la differenza di tempo tra la lavorazione dei tessuti pancreatici di diversi topi durante la dissezione, la perfusione e la triturazione influenzerà il tempo di contatto tra tessuto pancreatico e collagenasi P, compromettendo così l'efficienza e la vitalità dell'isolamento cellulare. Pertanto, la sua applicazione su larga scala potrebbe essere limitata. Inoltre, questo protocollo non è stato convalidato nei ratti. Se si isolano isolotti e cellule acinar dai ratti, il dosaggio di alcuni reagenti e il tempo di digestione potrebbero richiedere ulteriori aggiustamenti.

In conclusione, questo protocollo sperimentale fornisce un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari del topo e delle cellule acinari pancreatiche primarie. È più adatto per ricercatori inesperti a effettuare isolamento di isolotti e cellule acinari, offrendo al contempo un quadro sperimentale pratico per studi in vitro sulle interazioni esocrino-endocrine pancreatiche.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 & mu; Filtro M	Millex	SLGPR33RB	Filtra la soluzione preparata di P di collagenasi
0,25 M Cloruro di calcio (sterile)	Beyotime	ST365	Via di segnalazione dipendente dal calcio per l'attivazione della secrezione di insulina
1 ml di siringa	Jierui	10084692516405	Usato per la perfusione di P della collagenasi nel tessuto pancreatico.
Soluzione di tribromoetanolo all'1,25%	Beijing Yosida Biotechnology Co., Ltd.	JT0781	Anestesia
Tubo centrifuga da 1,5 mL	Eppendorf	30121589	Raccogli il soprandanzante della cella per centrifugarlo e conservarlo.
1x Hank' Soluzione salina bilanciata	Biosharp	BL561A	Prepara la soluzione di collagenasi P e risciacqua il tessuto pancreatico
Piastra di coltura cellulare a 12 pozzi	SARSTEDT	83.3921	Tenere il tessuto pancreatico e l'acinar estratto dalla coltura
Tubo centrifugo da 15 mL	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	CT-002-15A	Tenere le soluzioni durante l'esperimento
Placca di coltura cellulare a 24 pozzi	SARSTEDT	83.3922	Cultura degli isolotti estratti
40-mesh  Setaccio	Strumenti Weidan	N/A	Filtra il tessuto pancreatico
Pipetta Pasteur da 5 mL	Biosharp	BS-XG-03L	Pipette di liquidi e disturbo fisico del tessuto pancreatico
Tubo centrifuga da 50 mL	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	CT-002-50A	Tenere le soluzioni durante l'esperimento, contenere tessuti e centrifugare
Vasi di coltura cellulare da 60 mm	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	12211	Contenitore per contenere un mezzo di coltura contenente isolotti per una facile raccolta
Soluzione di etanolo al 75%	HYNAUT	N/A	Immergi i topi per la disinfezione.
Adobe Photoshop 2023	Adobe Inc.	N/A	Genera immagini.
Centrifuga Beckman Allegra X-12/X-12R	BECKMAN	Allegra X-12/X-12R	Centrifuga
Albumina sierica bovina (BSA)-V	Solarbio	A8020	Mantieni la normale funzione fisiologica degli isolotti e usa (it/this) per preparare soluzioni di glucosio a diverse concentrazioni.
Mouse C57BL/6J, grado SPF, 6 e linea; 8 settimane, peso 18 e linea; 25 g	Centro degli Animali da Laboratorio dell'Università Medica Navale
Kit per il test di viabilità e citotossicità delle cellule di calceina/PI	Beyotime	C2015L	Rilevare la vitalità cellulare e la citotossicità delle cellule animali basandosi sulla colorazione a doppia fluorescenza di cellule vitali e morte con Calcein-AM (Calcein AM) e Propidium ioduro (PI) simultaneamente.
Cloruro di calcio (anidro)	Sangon Biotech	10043-52-4	Prepara la soluzione di collagenasi P
Filtro cellulare (100 e mu; m)	Biosharp	BS-100-XBS	Filtraggio delle cellule acinar
Collagenasi P	Sigma	11213857001	Digestione del tessuto pancreatico
Soluzione D-(+)-Glucosio (20%, sterile)	Beyotime	ST491	Stimola la secrezione di insulina dagli isolotti.
DMEM base (1x) (Dulbecco' s Eagle Medium modificato)	Gibco	C11995500BT	Coltivazione delle cellule acinar
Siero fetale bovino (FBS)	Biowest	S140B-500	Prepara il mezzo di coltura
Soluzione sterile PREMIUM Ficoll-Paque	Cytiva	17544203	Mezzo del gradiente di densità per la stratificazione del gradiente di densità
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software, LLC	N/A	Generare immagini ed eseguire analisi statistiche.
Soluzione HEPES (1 M)	Biosharp	BL1061A	Prepara la soluzione di collagenasi P
Centrifuga ad alta velocità/refrigerata	Sigma	3K15	Centrifuga
ImageJ	Laboratorio Nazionale di Salute per la Strumentazione Ottica e Computazionale (LOCI)	N/A	Analizza le immagini di fluorescenza cellulare e calcola la vitalità cellulare.
Microscopio biologico invertito	Leica	N/A	Osserva la morfologia cellulare e seleziona gli isolotti.
Microscopio a fluorescenza invertita	OLYMPUS	IX73	Osserva i segnali fluorescenti cellulari e cattura immagini fluorescenti.
Buffer bicarbonato di Krebs-Ringer HEPES	LEAGENE	CZ0103	Mantieni la normale funzione fisiologica degli isolotti e usa (it/this) per preparare soluzioni di glucosio a diverse concentrazioni.
Kit ELISA INS (Insulina) del Topo	Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.	EM0260	Rileva il livello di secrezione di insulina negli isolotti.
Pinza oftalmica (10 cm, curva con uncino)	Dispositivi Medici Qingyi	N/A	Assisti nella dissezione
Pinza oftalmica (10 cm, dritta con il dente)	Dispositivi Medici Qingyi	N/A	Assistere nella dissezione, nella separazione improvvisa del tessuto pancreatico e nell'estrazione del tessuto pancreatico
Soluzione di estreptomicina con penicillina	Gibco	15140-122	Prepara il mezzo di coltura per prevenire la contaminazione
RPMI-1640 medio,	KeyGEN BioTECH	KGL1501-500	Interrompi la soluzione digestiva P della collagenasi e coltiva gli isolotti
Inibitore della tripsina da Glycine max (soia)	Sigma	T6522	Prepara la soluzione di collagenasi P
Forbici chirurgiche (10 cm, dritta)	Dispositivi Medici Qingyi	N/A	Assistenza anatomica e taglio del tessuto pancreatico in piccoli pezzi
Bagno d'acqua	OAICLAB	OW-HF	Mantieni la temperatura di digestione.
Kit per il saggio sull'attività di α-amilasi e β-amilasi	Elabscience	E-BC-K006-M	Rilevare i livelli di amilasi secreta dalle cellule acinar in condizioni diverse