Articolo metodologico

Rilevamento di alterazioni mirabili nel carcinoma polmonare non a piccole cellule utilizzando il sequenziamento di nuova generazione

DOI:

10.3791/69091

⸱

10 ottobre 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di sequenziamento di nuova generazione automatizzato e accreditato ISO15189 per rilevare alterazioni genomiche mirabili in tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina per carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC).

Abstract

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Il successo della terapia mirata nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) dipende dall'identificazione precisa delle alterazioni driver, tra cui mutazioni, fusioni geniche e amplificazioni. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è emerso come uno strumento diagnostico molecolare completo, in grado di rilevare aberrazioni genomiche sia note che nuove, fornendo un supporto fondamentale per il trattamento personalizzato del NSCLC. Tuttavia, l'NGS rimane un metodo complesso e tecnicamente impegnativo. Nonostante la sua adozione diffusa, l'NGS deve ancora affrontare alcune sfide, tra cui la complessità tecnica e i tempi di consegna prolungati. Qui viene introdotto il flusso di lavoro NGS certificato ISO15189 implementato nel laboratorio clinico. Il protocollo standardizzato comprendeva la valutazione della cellularità tumorale (≥20%), l'estrazione del DNA da tessuti inclusi in paraffina (FFPE) fissati in formalina (input di DNA ≥ 50 ng), la preparazione automatizzata della libreria e l'analisi bioinformatica. Integrando rigorose misure di controllo qualità (QC) in ogni fase, il flusso di lavoro garantisce un'elevata affidabilità dei dati. Inoltre, l'innovazione chiave nel flusso di lavoro è stata l'automazione della costruzione della libreria NGS. Il sistema automatizzato di costruzione della libreria NGS includeva la riparazione finale, l'A-tailing, la legatura dell'adattatore, la cattura dell'ibridazione e la purificazione, riducendo efficacemente l'errore umano, migliorando la riproducibilità sperimentale, riducendo il tempo di utilizzo e migliorando così l'efficienza. Insieme, l'esperienza dimostra che un rigoroso controllo qualità e la preparazione automatizzata delle librerie sono essenziali per mantenere l'accuratezza e la scalabilità nei test clinici NGS. Questo approccio ottimizzato non solo garantisce la conformità agli standard ISO15189, ma supporta anche la crescente domanda di oncologia di precisione nella gestione del NSCLC.

Introduzione

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Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rappresenta il 75%-85% di tutti i casi di carcinoma polmonare, rappresentando sia una priorità clinica che una sfida terapeutica 1,2,3. Negli ultimi anni, con il successo dello sviluppo e dell'applicazione clinica di farmaci a bersaglio molecolare come gli inibitori della tirosin-chinasi del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR-TKI), il trattamento del NSCLC avanzato è entrato nell'era delle terapie di precisione personalizzate 4,5,6. La terapia mirata offre un'efficacia precisa, un'elevata specificità ed effetti collaterali minimi 7,8. Questo cambiamento nel trattamento ha contemporaneamente aumentato la domanda di tecnologie diagnostiche molecolari.

Attualmente, i test completi mirati al tumore sono diventati una componente indispensabile della pratica clinica che può aiutare a chiarire profili di mutazione genetica accurati e quindi fornisce una base affidabile per il successivo uso mirato di farmaci, il monitoraggio della resistenza ai farmaci e la valutazione della prognosi per i pazienti. In particolare, i test multigenici basati su NGS, che sfruttano i vantaggi tecnici ad alto rendimento e ad alta sensibilità, sono già stati raccomandati per applicazioni cliniche 9,10,11,12.

Rispetto alle tradizionali tecniche di diagnostica molecolare, l'NGS dimostra vantaggi rivoluzionari. Il vantaggio principale di NGS risiede nella sua elevata capacità di produzione. Consente il rilevamento simultaneo di più geni, comprese le alterazioni genetiche note e sconosciute13,14. Nel frattempo, NGS ottiene test completi in un'unica corsa, riducendo relativamente i costi, il consumo di campioni e i tempi di esecuzione dei test15,16. Alla luce di questi vantaggi, l'NGS è stato sempre più applicato nella pratica clinica. Tuttavia, i processi dell'NGS sono complessi, tra cui la valutazione della cellularità del tumore, l'estrazione dell'acido nucleico, la preparazione automatizzata della libreria e l'analisi bioinformatica. La qualità dell'elaborazione iniziale del campione influisce direttamente sulle prestazioni delle successive analisi bioinformatiche17. In particolare, la preparazione delle librerie prevede una serie di passaggi per convertire i campioni di acido nucleico grezzo in librerie standardizzate compatibili con gli strumenti di sequenziamento. La preparazione della libreria include la frammentazione, la riparazione dell'estremità, la legatura dell'adattatore e l'amplificazione PCR18. Questo complesso processo introduce spesso vari pregiudizi tecnici: ad esempio, la frammentazione può portare alla sottorappresentazione delle regioni eterocromatiniche; la preferenza della ligasi per il substrato durante la legatura dell'adattatore può comportare la perdita di alcune sequenze; e l'amplificazione della PCR tende a causare una copertura non uniforme nelle regioni con contenuto di GC estremo19. Questi pregiudizi sistemici non solo riducono la qualità dei dati di sequenziamento, ma possono anche portare a conclusioni errate nelle successive analisi bioinformatiche. Pertanto, stabilire un rigoroso sistema di controllo qualità è essenziale per garantire l'affidabilità e la coerenza dei risultati sperimentali.

Per affrontare queste sfide tecniche di lunga data, il laboratorio ha adottato un sistema NGS completamente automatizzato. Il sistema è progettato per ridurre i tempi di elaborazione manuale e diminuire i tempi di consegna complessivi. Incorpora protocolli programmabili per garantire sia la flessibilità operativa che la precisione di elaborazione, utilizzando al contempo moduli e unità integrati per ridurre al minimo i potenziali distorsioni tecniche in ogni fase. Inoltre, questa soluzione automatizzata non solo migliora la riproducibilità e la produttività della preparazione della libreria, ma, cosa più importante, garantisce che i dati di sequenziamento riflettano in modo più accurato la composizione molecolare dei campioni originali. Qui, il laboratorio vorrebbe introdurre il sistema attraverso il rilevamento delle alterazioni del driver utilizzando NGS basato sul DNA.

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Protocollo

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Il protocollo ha ricevuto una deroga IRB per i campioni d'archivio anonimizzati.

1. Fasi preliminari al collaudo e controllo qualità

  1. Registrare le informazioni sui campioni nel sistema di gestione delle informazioni di laboratorio (Tabella 1). Compila il modulo di consenso informato per il test di mutazione genetica.
  2. Ricevi il campione NSCLC FFPE. Assicurarsi che il campione utilizzato per il test sia un campione di tessuto di paraffina che è stato conservato per non più di 2 anni. Assicurarsi che i campioni siano elaborati e conservati secondo metodi patologici standard.
    NOTA: Questo studio si concentra principalmente sul flusso di lavoro metodologico, piuttosto che condurre un'analisi clinica su larga scala. Pertanto, non è stato fissato alcun requisito specifico per il numero di campioni per questa fase della ricerca.
  3. Tagliare sezioni utilizzando lame per microtomo usa e getta. Sostituire lame, pinze e microprovette da 1,5 ml tra i campioni per evitare la contaminazione incrociata ed evitare l'introduzione di contaminanti derivati dall'operatore (ad es. capelli, cellule della pelle, saliva).
    NOTA: Campione di grandi dimensioni (≥ 0,5 cm x 0,5 cm) 6-10 μL, cinque fogli; campioni di piccole dimensioni (< 0,5 cm x 0,5 cm) e campioni di puntura, 6-10 μL, 10 fogli.
  4. Eseguire la colorazione di routine con ematossilina-eosina (HE) per valutare il contenuto delle cellule tumorali.
  5. Selezionare i campioni contenenti il ≥20% di cellule tumorali maligne per l'analisi a valle. Il contenuto del tumore viene valutato dai patologi su vetrini colorati HE20.
    NOTA: Se il contenuto del tumore è inferiore al 20%, sotto la guida delle regioni tumorali contrassegnate sul vetrino HE, raschiare l'area del tessuto tumorale corrispondente. Questo processo consente di ottenere l'arricchimento del tessuto tumorale rimuovendo efficacemente i componenti non neoplastici circostanti, aumentando così significativamente la percentuale di cellule tumorali nel materiale raccolto.
  6. Eseguire l'estrazione dell'acido nucleico utilizzando un sistema di purificazione automatizzato come descritto di seguito.
    1. Sezionare il blocco FFPE utilizzando un microtomo per ottenere un nastro. Inserire il nastro in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Trasferire il nastro nella posizione di ingresso del campione designata sullo strumento di estrazione automatizzata.
    2. Utilizzare uno strumento di estrazione automatica con un kit di estrazione automatica e sostituire il pipettaggio manuale con un sistema di estrazione automatica dell'acido nucleico a biglie magnetiche.
      NOTA: L'automazione di questa fase aiuta a garantire l'estrazione automatica per garantire una produzione di DNA riproducibile e ad alta precisione per le applicazioni NGS a valle.
    3. Fare riferimento alle istruzioni del purificatore di acido nucleico completamente automatico e del reagente di estrazione dell'acido nucleico per estrarre l'acido nucleico.
    4. Quindi, selezionare il programma C1102, scegliere il tempo di incubazione del dewaxing del campione a 16 ore e il volume di eluizione a 100 μl.
      NOTA: Se la soluzione di DNA estratta non viene testata immediatamente, deve essere conservata a -20 °C per non più di 6 mesi.
  7. Valutare la qualità degli acidi nucleici (Tabella 2) come descritto di seguito.
    1. Utilizzare l'elettroforesi su gel di agarosio per determinare la dimensione del frammento di DNA. Utilizzate Agilent2100 e altri sistemi di analisi per elettroforesi capillare microfluidica per campioni a basso input.
    2. Sciogliere 1 g di agarosio in 100 mL di soluzione di TAE. Scaldare il composto a bagnomaria fino a renderlo trasparente. Raffreddare la soluzione a circa 60 °C.
    3. Collegare all'elettrodo positivo (rosso) sullo strumento per elettroforesi. Eseguire il polo negativo (nero) alla tensione 180 V, funzionare per 15 min21,22.
    4. In base ai risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio, classificare le dimensioni dei frammenti in quattro livelli (A-D; Tabella 3), e selezionare l'acido nucleico dei livelli A-C per le operazioni successive.
    5. Utilizzare la spettrofotometria per verificare la purezza. Assicurarsi che un OD260/OD280 > 1.8; OD260/OD230 > 2.0 per indicare i livelli accettabili di contaminante23,24.
    6. Utilizzare il kit di rilevamento (Tabella dei materiali) basato su coloranti fluorescenti specifici per la sequenza per il test fluorimetrico per misurare con precisione la concentrazione di DNA.
    7. Aggiungere 1 μL di DNA da testare a 199 μL di soluzione di lavoro, quindi mescolare, centrifugare brevemente e misurarne la concentrazione utilizzando un fluorimetro (Tabella dei materiali).

2. Preparazione della libreria e controllo qualità (Figura 1)

  1. Preparare il DNA genomico dei frammenti utilizzando gli ultrasuoni (Tabella dei materiali) come descritto di seguito.
    1. Miscelare 200 ng di DNA genomico in 50 μL di tampone Tris-EDTA (TE) basso. Quindi, conservare la provetta in un rack per campioni pre-raffreddato (8 °C).
    2. Impostare i parametri dello strumento in base alla Tabella 4. Quindi avvia la frammentazione.
    3. Utilizzare l'elettroforesi su gel di agarosio per verificare l'effetto di frammentazione. Questo passaggio genera frammenti di DNA con estremità danneggiate che richiedono la riparazione dell'estremità per trasformarli in estremità smussate per i passaggi successivi.
  2. Eseguire la riparazione finale e l'aggiunta di A a 3' come descritto di seguito.
    1. Ripara le estremità danneggiate del DNA FFPE con enzimi per formare estremità piatte, garantendo 3'-OH e 5'-P. Aggiungi A alle estremità appiattite a doppio filamento da 3'.
    2. Preparare la miscela ERA aggiungendo 7 μl di tampone di riparazione finale e 3 μl di enzima di riparazione finale, scorrere delicatamente e manualmente 3x-5x e centrifugare per 1-3 s.
    3. Aggiungere la miscela ERA a 50 μl di campione di DNA rotto, mescolare delicatamente e centrifugare per 1-3 s.
    4. Inserirlo nello strumento PCR e selezionare il programma ERA (20 °C per 30 min; 65 °C per 30 min; 4 °C Hold; Coperchio 85 °C). Eseguire l'operazione successiva entro 2 ore.
  3. Eseguire la legatura dell'adattatore come descritto di seguito.
    1. Preparare la miscela LIG del sistema di reazione aggiungendo 30 μl di tampone di legatura, 10 μl di DNA ligasi e 10 μl di adattatore per DNA. Quindi, muovere leggermente manualmente 3x-5x e centrifugare per 1-3 s.
    2. Aggiungere 50 μl di miscela LIG ai 60 μl di prodotto del passaggio precedente, mescolare delicatamente, quindi centrifugare per 1-3 s.
    3. Mettere la miscela in uno strumento PCR, quindi selezionare il programma LIG (20 °C per 15 min senza riscaldare il coperchio; 70 °C per 10 min (coperchio riscaldante); 4 °C Hold; Coperchio 85 °C).
  4. Eseguire la purificazione delle microsfere magnetiche.
    1. Prelevare 1,5 mL di una provetta da centrifuga a basso adsorbimento e aggiungere 88 μL di microsfere magnetiche omogeneizzate e 110 μL di prodotto legato con adattatore. Agitare e mescolare bene, quindi incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
    2. Centrifugare immediatamente il campione incubato per 1-3 s e posizionare la provetta da centrifuga su un rack magnetico. Attendere che la soluzione si chiarisca (circa 3-5 minuti).
    3. Con il tubo fissato al magnete, aprire il tappo e aspirare con cura il surnatante chiarito utilizzando una pipetta senza disturbare il pellet di perline.
    4. Tenere la provetta sul magnete e aggiungere 300 μL di etanolo al 75% appena preparato in ciascuna provetta.
    5. Attendere 1 minuto per consentire alle perline magnetiche di depositarsi completamente. Ruotare lentamente la provetta da centrifuga orizzontalmente una volta per assorbire l'etanolo.
    6. Ripetere i passaggi 2.4.4 e 2.4.5 una volta, per un totale di 2x.
    7. Eseguire la centrifugazione istantanea per 1-3 s, rimettere la provetta nel rack magnetico e attendere 30 s. Utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali residui di etanolo e tenere aperto il coperchio della provetta.
    8. Asciugare le perline magnetiche a temperatura ambiente per 2 minuti fino a quando la superficie delle perline appare opaca e non presenta crepe.
    9. Eluire il prodotto di legatura con 28 μL di tampone di eluizione (EB).
      NOTA: Le perle magnetiche devono essere bilanciate a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima dell'uso.
  5. Amplificare e purificare la pre-libreria come descritto di seguito.
    1. Preparare la premiscela del sistema di reazione aggiungendo 10 μL di tampone PCR, 10 μL di primer PCR, 1,5 μL di miscela dNTP, 1 μL di enzima PCR. Picchiettare delicatamente manualmente 3x-5x e centrifugare per 1-3 s.
    2. Aggiungere 22,5 μl di premiscela a 27,5 μl di prodotto purificato della fase precedente, mescolare delicatamente, quindi centrifugare per 1-3 s.
    3. Selezionare il programma PRE: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 cicli; 72 °C 2 min; 4 °C Mantenimento; Coperchio 105 °C.
    4. Al termine del programma PCR, eseguire la purificazione delle microsfere magnetiche utilizzando etanolo al 75% appena preparato. Eluire il prodotto con 18 μl di EB.
  6. Acquisire l'ibrido come descritto di seguito.
    1. Preparare il sistema di reazione A aggiungendo 15 μl di pre-libreria e 4 μl di miscela bloccante.
    2. Posizionare su PCR ed eseguire il programma PCR HYB (95 °C per 5 min; 65 °C Hold; Coperchio 105 °C).
    3. Preparare la miscela HYB del sistema di reazione B aggiungendo 10 μL di tampone di ibridazione, 0,5 μL di bloccante dell'inibitore della RNasi e 1 μL di sonda. Agitare delicatamente 3x-5x e centrifugare per 1-3 s.
      NOTA: Il nome della sonda è LCOO1 e i geni della sonda includono EGFR, KRAS, BRAF, ALK, ECC.
    4. Quando la temperatura dello strumento PCR scende a 65 °C, aggiungere 11,5 μl di miscela HYB al sistema di reazione A, mescolare delicatamente, quindi coprire il coperchio dello strumento PCR e continuare l'incubazione per 16-24 ore.
    5. Incubare il tampone di lavaggio 2 in una provetta conica da 15 mL con un riscaldatore metallico a 65 °C alla dose di 600 μl per campione.
    6. Recuperare le microsfere magnetiche SCB, capovolgere e mescolare 5 volte, vorticare per 10 s ed equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti. Agitare per 10 s, trasferire 25 μl in una provetta da centrifuga a basso adsorbimento da 1,5 mL, posizionare su un rack magnetico per 3 minuti e scartare il surnatante.
    7. Aggiungere 200 μl di tampone di lavaggio delle perle alle microsfere magnetiche SCB da 25 μl, agitare e mescolare per 3 s, centrifugare momentaneamente per 1-3 s, lasciare riposare sul rack magnetico per 3 minuti ed eliminare il surnatante.
    8. Ripetere il passaggio 2.6.7 2 volte, per un totale di tre volte.
    9. Aggiungere 200 μL di tampone di lavaggio delle perle alle microsfere magnetiche, vorticare e mescolare per 3 s, risospendere per un uso successivo.
    10. Trasferire circa 30 μl del campione ibrido in microsfere magnetiche SCB risospese, agitare e mescolare, posizionare su un miscelatore rotante, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti e centrifugare per 1-3 s.
    11. Posizionare la provetta della miscela su una griglia magnetica per 3 minuti, quindi aspirare circa 230 μl di surnatante. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio 1, agitare per 5 s, posizionare su un miscelatore rotante, quindi incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Centrifuga istantanea per 1-3 s.
    12. Posizionare la provetta della miscela di campioni di perle magnetiche su una griglia magnetica e lasciarla riposare per 3 minuti. Quindi, aspirare circa 500 μL di surnatante e liquido residuo.
    13. Preriscaldare 150 μl di tampone di lavaggio da 2 a 65 °C, agitare per 10 s, porre su un miscelatore a temperatura costante, agitare e incubare a 65 °C per 10 minuti a una velocità di 600 giri/min. Eseguire la centrifugazione istantanea per 1-3 s, posizionare su un supporto magnetico per 3 minuti e aspirare circa 150 μl di surnatante e liquido residuo.
    14. Ripetere il passaggio 2.6.13 3 volte, per un totale di quattro volte.
    15. Centrifugare istantaneamente per 1-3 s per rimuovere eventuali residui di liquido dalla provetta del campione. Aggiungere 20 μl di EB, mescolare su e giù 8x-10x, mescolare bene e mettere su ghiaccio per un uso successivo.
  7. Preparazione e purificazione della biblioteca finale.
    1. Preparare la miscela POST del sistema di reazione aggiungendo 25 μl di miscela di amplificazione, 5 μl di indice e 20 μl di libreria di microsfere magnetiche. Picchiettare delicatamente 3x-5x e centrifugare per 1-3 s. Mescolare delicatamente, centrifugare per 1-3 s.
    2. Scegli il programma POST: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 cicli; 72 °C 10 min; 4 °C Mantenimento; Coperchio 105 °C.
    3. Al termine del programma PCR, eseguire la purificazione delle microsfere magnetiche utilizzando etanolo al 75% appena preparato. Eluire la libreria finale con 20 μL di EB.

3. Preparazione della libreria completamente automatizzata (Tabella 5)

  1. Premere il pulsante di accensione per attivare il sistema e attendere l'inizializzazione. Passare a Impostazioni programma e selezionare Esegui protocollo, quindi selezionare Protocollo: Burning Rock HS.
  2. Impostare i parametri QC aliquote come Tipo di campione: DNA di alta qualità; Importo in ingresso (ng): 50; Cicli pre PCR: 12; Cicli post PCR: 12. Fare clic su ESEGUI.
  3. Inserire la cartuccia del reagente preconfezionata nell'apposito slot (convalida automaticamente il posizionamento e lo stato del reagente).
  4. Dopo aver caricato i campioni, premere Start per far funzionare il sistema in modo autonomo. Osservare gli indicatori LED per monitorare i progressi.
  5. Al termine del programma, fare clic su OK e il programma trasferirà automaticamente la libreria finale nel tubo della libreria, finalizzando la preparazione della libreria.

4. Sequenziamento e controllo qualità

  1. Eseguire la quantificazione della libreria e il controllo qualità come descritto di seguito.
    1. Misura la concentrazione della pre-libreria e della libreria totale utilizzando la fluorimetria.
    2. Rileva le dimensioni del frammento della libreria. Utilizzare un kit per valutare la dimensione del frammento della libreria e la presenza di adattatori (Tabella dei materiali).
      NOTA: Se la libreria finale contiene dimeri di primer, è necessario aggiungere un'ulteriore fase di purificazione prima di miscelare i campioni sulla macchina. Lo standard qualificato per l'inserimento di frammenti è ≥ 150 bp e l'efficienza di cattura prevista è ≥ 40%.
    3. Diluire la libreria di sequenziamento a 1,6 pM e 1300 μL per le operazioni di sequenziamento.
  2. Eseguire il sequenziamento del monitoraggio dell'ambiente come descritto di seguito.
    1. Controlla l'ambiente di sequenziamento, inclusa la temperatura interna (19-25 °C), l'umidità interna (20%-80%).
    2. QC completo dei dati di uscita dello strumento, inclusa la base superiore a Q30 e il filtro di passaggio della densità del cluster (PF).

5. Sequenziamento, analisi dei dati e controllo qualità

  1. Eseguire l'elaborazione dei dati grezzi e la profilazione molecolare come descritto di seguito.
    1. Utilizzare Burrows-Wheeler Aligner (versione 0.7.10) per allineare i dati di sequenziamento a hg19.
    2. Esegui l'allineamento locale, l'ottimizzazione, la marcatura di duplicazione e la chiamata delle varianti utilizzando Genome Analysis Tool Kit (versione 3.2) e Vardict (versione 1.5.1).
    3. Filtra le varianti utilizzando la pipeline fpfilter VarScan (versione 2.4.3) e rimuovi i loci con profondità inferiori a 50. Classificare ed escludere le varianti con frequenza di popolazione superiore allo 0,1% nei database ExAC, 1000 genomi, dbSNP o ESP6500SI-V2 come polimorfismi a singolo nucleotide (SNP).
    4. Annotare le varianti rimanenti utilizzando SnpEff (versione 3.6).
    5. Analizza le varianti strutturali (SV), inclusi i grandi riarrangiamenti genomici (LGR), utilizzando MarkSV (strumento di algoritmo Burning Rock). Analizza le varianti del numero di copie (CNV) in base alla profondità dei dati di copertura degli intervalli di acquisizione.
    6. Dati di copertura corretti per le distorsioni di sequenziamento derivanti dal contenuto di guanina-citosina e dal design della sonda.
  2. Valutare la qualità del campione, tra cui la profondità media, la profondità mediana, la profondità unica, la dimensione dell'inserto, la complessità della lib, la copertura, il rapporto Q30 e il rapporto di correlazione del campione accoppiato come descritto in25.
  3. Per la generazione di report, verificare la versione e i parametri della pipeline per completare la revisione bioinformatica. Utilizzare le linee guida pertinenti per valutare la patogenicità delle mutazioni26,27. Pubblicare il rapporto finale.

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Risultati

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Utilizzando un flusso di lavoro automatizzato per l'analisi NGS con rigorosi controlli di qualità, il laboratorio ha eseguito una profilazione genomica completa dei campioni di NSCLC. Il flusso di lavoro di rilevamento ottimizzato (Figura 2) ha identificato in modo affidabile diverse alterazioni genomiche clinicamente perseguibili in campioni tumorali rappresentativi (Figura 3).

I risultati del sequen...

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Discussione

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Ogni rapporto NGS qualificato è alla base di un processo rigoroso, che rimane complesso e dispendioso in termini di tempo28. Per affrontare questi problemi, il laboratorio ha sviluppato un sistema NGS completamente automatizzato. Questa operazione riduce significativamente l'intervento manuale, minimizza gli errori sperimentali e accorcia sostanzialmente i tempi di consegna. Pertanto, questo sistema ha fornito una strategia più affidabile ed efficiente per l'NGS, ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato supportato da sovvenzioni della Beijing Natural Science Foundation della Repubblica popolare cinese (7252122), della Beijing Xisike Clinical Oncology Research Foundation della Repubblica popolare cinese (Y-HS202402-0021), del Residency Training Teaching Research Fund of Cancer Hospital, dell'Accademia cinese delle scienze mediche e del Peking Union Medical College (E2025004) e del National High Level Hospital Clinical Research Funding (2025-LYZX-R-B03).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
  Agilent  Kit di DNA ad Alta Sensibilità  Agilent5067-4626Per l'uso con the  Sistema Bioanalizzatore Agilent 2100
  Kit di reagenti Agilent DNA 1000  Agilent5067-1504Per l'uso con the  Sistema Bioanalizzatore Agilent 2100
Bioanalizzatore Agilent 2100AgilentG2939AValuta la dimensione del frammento della libreria e la presenza di adattatori. 
Concert Strumento di purificazione completamente automatica degli acidi nucleiciCONCERTOMC1002Utilizzato per l'estrazione del DNA
Equalbit 1 e volte; Kit di analisi HS dsDNAVazymeEQ121-02-AAPer l'uso con the  Fluorometro Qubit 3.0
Kit di rilevamento combinato delle mutazioni umane EGRR/KRAS/BRAF/ALKRoccia in fiammeBR-LC00102Costruzione della biblioteca
Magnis BRTecnologie AgilentG7595AAPreparazione automatizzata della libreria NGS
Ultrasonicatore a fuoco ME220Covaris500396ultrasonicazione
NanoDrop One/OneCThermo FisherND-ONE-WRilevamento spettrofotometrico UV visibile a lunghezza d'onda completa
NextSeq 550DxIllumina20005715sequenza
NSQ 500/550 Alta Uscita KT v2.5(300CYS)Illumina20024908Per l'uso con il NextSeq 550Dx
Reagente di estrazione degli acidi nucleiciCONCERTORC1102Utilizzato per l'estrazione del DNA
Fluorometro Qubit 3.0VitaQ33216Utilizzato per il rilevamento di concentrazioni di acidi nucleici o biblioteche
Kit di test HS per Qubit dsDNAVitaQ32851Per l'uso con the  Fluorometro Qubit 3.0

Riferimenti

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