Method Article

Sistema di rilevamento molecolare integrato basato su PCR per il rilevamento simultaneo di quattro parassiti intestinali zoonotici da più fonti

DOI:

10.3791/69180

⸱

October 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare quattro parassiti intestinali zoonotici da più fonti contemporaneamente basato su una combinazione di un sistema di rilevamento molecolare integrato basato sulla reazione a catena della polimerasi (PCR).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie infettive sono fattori critici che influenzano la salute umana, lo sviluppo economico e la stabilità sociale. Tra queste, le malattie parassitarie zoonotiche intestinali sono diventate sempre più al centro dell'attenzione globale come malattie infettive emergenti e riemergenti, in particolare Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis e Giardia. Sono stati pubblicati solo pochi studi sull'epidemiologia dei parassiti di cui sopra, accompagnati da problemi come bersagli di rilevamento singoli, bassi tassi di rilevamento e alti tassi di rilevamento mancati. Questo studio mira a stabilire un sistema integrato di rilevamento molecolare basato su una combinazione di test PCR per il rilevamento simultaneo dei suddetti quattro parassiti zoonotici intestinali in campioni raccolti da topi selvatici, animali da compagnia e bestiame (bovini e ovini), al fine di fornire un supporto tecnico efficiente per il rilevamento di routine dei parassiti in molteplici scenari, comprese le interfacce animale-ambiente in particolare nelle strutture di sorveglianza locali.

In questo studio, prendendo come test primario la rilevazione di Enterocytozoon bieneusi nelle feci di 95 topi selvatici e 30 cani e gatti (25 da gatti e 5 da cani), quando sono stati utilizzati due set di primer per amplificare il gene ITS, i risultati positivi di ciascuna PCR sono stati esattamente gli stessi (5,26%), ma la combinazione di 2 set di test di reazione a catena della polimerasi (PCR) ha prodotto un tasso di positività più elevato (6,32%) per Enterocytozoon bieneusi. Per Giardia, 9 campioni positivi sono stati rilevati utilizzando il gene beta-giardina (BG), mentre nessun positivo è stato rilevato utilizzando i geni della glutammato deidrogenasi (GDH) e della trioso fosfato isomerasi (TPI). I risultati di cui sopra hanno dimostrato che una combinazione di test PCR per più segmenti genetici target ha migliorato la capacità di rilevamento di agenti patogeni designati, rispetto a qualsiasi singolo test PCR. Le sequenze target sono state confermate dal sequenziamento di Sanger. Questo sistema è stato progettato per migliorare e facilitare la sorveglianza dello stato di infezione, della distribuzione e dell'evoluzione filogenetica dei parassiti intestinali zoonotici da più fonti, fornendo una base per allarmi accurati e sensibili in una fase precoce. L'obiettivo è quello di costruire un ponte tecnico per raggiungere l'obiettivo One Health attraverso le interfacce uomo-animale-ambiente.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il Cryptosporidium, l'Enterocytozoon bieneusi, il Blastocystis e la Giardia sono protozoi patogeni comuni e facilmente trascurati con prevalenza globale. Negli ultimi anni, a causa di fattori quali la bonifica e l'intrusione nelle nicchie ecologiche dei focolai naturali, la popolarità dell'allevamento di animali da compagnia e lo sviluppo dell'allevamento di bestiame e pollame, la prevalenza di malattie parassitarie intestinali zoonotiche multi-fonte nei roditori, negli animali da compagnia (cani e gatti) e nel bestiame (bovini e ovini) è diventata sempre più un punto focale delle emergenze, epidemie e malattie infettive riemergenti nelle aree domestiche e rurali, mettendo seriamente in pericolo la salute umana e la sicurezza della salute pubblica globale 1,2,3,4.

Questi parassiti hanno specie complesse intra-generiche e un'ampia adattabilità dell'ospite. Possono infettare non solo roditori, animali da compagnia, ruminanti, pollame e uccelli, ma anche specie zoonotiche, che possono infettare l'uomo, causando sintomi clinici come dolore addominale, diarrea e vomito. Sono particolarmente suscettibili tra i bambini, gli anziani, le donne in gravidanza e le popolazioni immunocompromesse e possono essere trasmessi attraverso l'acqua, il cibo e l'aria, ponendo significativi rischi zoonotici per la salute pubblica 3,5,6.

Attualmente, l'identificazione dei quattro parassiti di cui sopra si basa principalmente sulla morfologia, che è soggetta a errori di identificazione a causa delle somiglianze morfologiche all'interno dei generi e dei fattori soggettivi, in particolare nella distinzione tra specie e genotipi. Le tecniche di biologia molecolare sono state ampiamente utilizzate per identificare specie, generi e genotipi di questi parassiti. Per Blastocystis e Cryptosporidium, il rilevamento si concentra principalmente sul gene 3,7,8 dell'acido ribonucleico ribosomiale a piccola subunità (SSU rRNA); per Enterocytozoon bieneusi, il gene dello spaziatore trascritto interno (ITS) 4,9; e per la Giardia, i geni della beta-giardina (BG), della glutammato deidrogenasi (GDH) e della trioso fosfato isomerasi (TPI)10,11. Sebbene la reazione a catena della polimerasi convenzionale (PCR) nidificata abbia notevolmente migliorato le capacità di identificazione e tipizzazione di questi quattro parassiti, non è sufficiente nel rilevare i casi mancati e nell'identificare nuove specie o quasispecie con caratteristiche genetiche significative. Ciò spesso influisce sull'efficienza dell'indagine epidemiologica, della trasmissione e del controllo delle malattie nell'uomo, negli animali e in altri ospiti, ponendo grandi sfide alla sicurezza della salute pubblica negli esseri umani, negli animali e nell'ambiente.

A causa delle somiglianze nei sintomi, nelle vie di trasmissione e nella gamma di ospiti di questi quattro parassiti, non esiste ancora un sistema molecolare integrato per un rilevamento efficiente, evitando di mancarne il rilevamento e identificando con precisione nuove specie o quasispecie con differenze genetiche significative. Questo studio ha stabilito un sistema di rilevamento molecolare integrato maturo basato sulla tecnologia di sequenziamento PCR-high-throughput esaminando la letteratura, per il rilevamento simultaneo dei quattro parassiti intestinali zoonotici in campioni multi-fonte (topi selvatici, animali da compagnia, bovini e ovini). In combinazione con l'analisi bioinformatica, questo sistema è stato applicato per identificare parassiti intestinali zoonotici multi-fonte, monitorare fattori epidemiologici come la distribuzione delle infezioni e l'evoluzione filogenetica e l'allerta precoce di infezioni umane e animali e contaminazione ambientale.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo studio è stato approvato e condotto dal comitato etico animale del Centro provinciale per il controllo e la prevenzione delle malattie di Jiangsu. Questo studio è stato condotto in conformità con l'edizione 2020 delle linee guida dell'American Veterinary Medical Association sull'eutanasia animale, i principi guida dei regolamenti sulla somministrazione degli animali da esperimento (ordine n. 2 della Commissione statale per la scienza e la tecnologia della Repubblica popolare cinese, 1988) e i principi guida per il trattamento umano degli animali emessi dal Ministero della scienza e della tecnologia della Repubblica popolare cinese.

1. Preparazione di feci fresche da topi selvatici, animali da compagnia e bestiame (bovini e ovini)

  1. Anestetizzare i topi mediante inalazione di anidride carbonica da una fonte di anidride carbonica compressa in scatola in una scatola di plastica ermetica trasparente, con un tasso di sostituzione del 30%-70% del volume del contenitore al minuto. Dopo l'anestesia completa e il coma, eseguire la lussazione cervicale sui topi.
  2. Raccolta di campioni fecali freschi: Raccogli campioni fecali da cani, gatti, bovini e ovini entro 1 ora dalla defecazione, con una provetta per feci dell'animale, ed evita la contaminazione incrociata.
    1. Cattura i roditori utilizzando gabbie per esche con dispositivi di rilascio in diversi habitat selvatici. Metti i topi catturati in sacchetti per topi e trasportali prontamente in laboratorio. Durante il funzionamento sterile in una cappa di biosicurezza, sezionare i topi per raccogliere il retto contenente feci, metterlo in una crioprovetta da 2 ml e conservarlo a -80 °C per un successivo rilevamento.
    2. Seleziona cani e gatti da negozi di animali in diverse regioni come oggetti di ricerca. Raccogliere immediatamente le feci appena escrete, in crioprovette da 5 mL, etichettate con le informazioni complete sul campione, e trasportarle prontamente in laboratorio per la conservazione a -80 °C.
    3. Selezionare bovini e ovini provenienti da allevamenti di bestiame (intensivi o allevati allo stato brado) come oggetti di ricerca. Raccogliere immediatamente le feci appena escrete in crioprovette da 50 mL, etichettate con le informazioni complete sul campione, e trasportarle prontamente in laboratorio per la conservazione a -80 °C.

2. Estrazione del DNA totale da feci fresche di topi selvatici, animali da compagnia e bestiame (bovini e ovini)

  1. Pretrattamento fecale:
    NOTA: È stato utilizzato il mini kit QIAamp Fast DNA Stool.
    1. Durante il funzionamento sterile in una cappa di biosicurezza, aggiungere circa 200 mg di feci provenienti da fonti diverse nel tampone salino tamponato con fosfato (PBS), aggiungere perline di acciaio e omogeneizzare accuratamente utilizzando un trituratore di tessuti.
    2. Scaldare a 70 °C per 5 minuti e centrifugare a 10.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente (15-25 °C).
    3. Aggiungere 600 μL di surnatante a una provetta da centrifuga da 2 mL contenente 25 μL di proteinasi K, aggiungere 600 μL di tampone AL e agitare per 15 s.
    4. Incubare a 70 °C per 10 min. Aggiungere 600 μl di etanolo anidro al 100% al lisato e frullare a vortice.
  2. Aggiungere con cautela 600 μl di lisato a una colonna di centrifuga, centrifugare a 14000 × g per 1 minuto e posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta di raccolta da 2 mL. Ripeti questo passaggio ancora una volta.
  3. Aprire con cautela la colonna di centrifuga, aggiungere 500 μL di tampone AW1, centrifugare alla massima velocità per 1 minuto e posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta di raccolta da 2 mL. Aprire con cautela la colonna di centrifuga, aggiungere 500 μl di tampone AW2 e centrifugare alla massima velocità per 3 minuti.
  4. Posizionare la colonna centrifuga in una nuova provetta di raccolta da 2 mL (preparata separatamente) e centrifugare a 14000 × g per 3 minuti. Posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml etichettata e aggiungere 100 μl di tampone di eluizione direttamente alla membrana della colonna di rotazione.
  5. Incubare a temperatura ambiente (15-25 °C) per 1 minuto e centrifugare a 14000 × g per 1 minuto per eluire il DNA.
  6. Determinare la concentrazione e la purezza del DNA utilizzando uno spettrofotometro ultra-micro. Utilizzare il DNA estratto per il rilevamento successivo o conservarlo a -20 °C per la conservazione a lungo termine.
    NOTA: Il rapporto A260/A280 deve essere 1,8-2,0 per garantire l'integrità e la purezza del DNA estratto.

3. Rilevamento PCR convenzionale nidificato di Cryptosporidium e Blastocystis che hanno come bersaglio l'RNA ribosomiale a piccola subunità (RSU rRNA)

NOTA: Per questo passaggio è stato utilizzato il Dream Taq Green PCR Mix.

  1. Preparare il sistema di reazione PCR su ghiaccio utilizzando PCR Mix: 25 μl di tampone Taq 2×, 2 μl di ciascuno dei primer diretti e inversi, 16 μl di ddH2O e 5 μl di stampo, con un volume totale di 50 μl.
  2. Per Cryptosporidium, seguire i passaggi 3.2.1-3.2.2.
    1. Utilizzare F1R11 e F-1R1-1 8,11 come inneschi di reazione del primo round. Impostare il programma di reazione: denaturazione iniziale a 94 °C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 40 s, ricottura a 55 °C per 40 s ed estensione a 72 °C per 90 s, con allungamento finale a 72 °C per 7 min.
    2. Utilizzare F2R21 e F-1R2-1 8,11 come inneschi di secondo giro, con il seguente programma di reazione: denaturazione iniziale a 94 °C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 40 s, ricottura a 55 °C per 40 s ed estensione a 72 °C per 1 min, con allungamento finale a 72 °C per 7 min.
  3. Per la blastocisti, seguire i passaggi 3.3.1-3.3.4.
    1. Utilizzare F1R13 e F1-1R-1 3,12 come inneschi di reazione del primo round. Impostare il programma di reazione per F1R1 come segue: denaturazione iniziale a 94 °C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 40 s, ricottura a 60 °C per 40 s ed estensione a 72 °C per 100 s, con un allungamento finale a 72 °C per 7 min.
    2. Impostare il programma di reazione per F1-1R-1 come segue: denaturazione iniziale a 94 °C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 40 s, ricottura a 55 °C per 40 s ed estensione a 72 °C per 1 min, con un allungamento finale a 72 °C per 7 min.
    3. Utilizzare F2R23 e F2-1R-1 3,12 come inneschi del secondo turno. Impostare il programma di reazione per F2R2 come segue: denaturazione iniziale a 94 °C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 40 s, ricottura a 60 °C per 40 s ed estensione a 72 °C per 1 min, con un allungamento finale a 72 °C per 7 min.
    4. Impostare il programma di reazione per F2-1R-1 come segue: denaturazione iniziale a 94 °C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 40 s, ricottura a 55 °C per 40 s ed estensione a 72 °C per 50 s, con un allungamento finale a 72 °C per 7 min.
      NOTA: Le sequenze di primer sono mostrate nella Tabella 1 1,3,8,11,12.
PatogenoDimensioni previste del prodotto (bp)Sequenze di primer (5′-3′)Referenze
Criptosporidio830F1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA1
R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
F2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
607F-1: GACATATCATTCAAGTTTCTGACC8,11
R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
Blastocystis600F1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC3
R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
R2: GAGCTTTTTAACTGCAACAACG
460F1-1: TGCTTTCGCACTTGTTCATC3,12
F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

Tabella 1: Sequenze di primer per l'rRNA SSU di Cryptosporidium e Blastocystis.

4. Rilevamento PCR convenzionale nidificato del gene ITS di Enterocytozoon bieneusi e dei geni Giardia BG, GDH e TPI

NOTA: Per questo passaggio è stato utilizzato il Dream Taq Green PCR Mix.

  1. Preparare il sistema di reazione PCR su ghiaccio utilizzando la miscela PCR: 25 μL di tampone Taq 2×, 2 μL ciascuno di primer diretti e inversi, 16 μL di ddH2O e 5 μL di stampo, con un volume totale di 50 μL.
  2. Per Enterocytozoon bieneusi, seguire i passaggi 4.2.1-4.2.2.
    1. Utilizzare F1R19 e F1-1R1-12 come inneschi di reazione del primo round. Impostare il programma di reazione come segue: denaturazione iniziale a 94 °C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 40 s, ricottura a 55 °C per 40 s ed estensione a 72 °C per 50 s, con allungamento finale a 72 °C per 7 min.
    2. Utilizzare F2R29 e F2-1R2-12 come inneschi di secondo giro, con il seguente programma di reazione: denaturazione iniziale a 94 °C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 40 s, ricottura a 55 °C per 40 s ed estensione a 72 °C per 50 s, con allungamento finale a 72 °C per 7 min.
  3. Per Giardia, seguire i passaggi 4.3.1-4.3.3.
    1. Utilizzare BG-F1R1, GDH-F1R1 e TPI-F1R1 2,10 come primer di reazione di primo turno per i tre geni bersaglio. Impostare il programma di reazione del primo ciclo per tutti come segue: denaturazione iniziale a 94 °C per 5 minuti, 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 40 secondi, ricottura a 50 °C per 40 secondi ed estensione a 72 °C per 1 minuto, con allungamento finale a 72 °C per 7 minuti.
    2. Impostare il programma di reazione del secondo ciclo per BG-F2R2 2,10 e TPI-F2R2 2,10 come segue: denaturazione iniziale a 94 °C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 40 s, ricottura a 55 °C per 40 s ed estensione a 72 °C per 50 s, con un allungamento finale a 72 °C per 7 min.
    3. Impostare il programma di reazione di secondo ciclo per GDH-F2R2 2,10 come segue: denaturazione iniziale a 94 °C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 40 s, ricottura a 60 °C per 40 s ed estensione a 72 °C per 50 s, con un allungamento finale a 72 °C per 7 min.
      NOTA: Le sequenze di primer sono mostrate nella Tabella 2 2,9,10.
PatogenoDimensioni previste del prodotto (bp)Sequenze di primer (5′-3′)Referenze
Enterocitozoo bieneusi390F1: GGTCATAGGGATGAAGAG9
R1: TTCGAGTTCTTTCGCGCTC
F2: GCTCTGAATATCTATGGCT
R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
390F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT2
R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG
R2-1: AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
Giardia511BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC2,10
BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGGACGAC
BG-F2: GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
BG-R2: CTCGACGAGCTTCGTGTT
530GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC2,10
GDH-R1: ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGATGCA
530TPI-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG2,10
TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

Tabella 2: Sequenze primer per il gene ITS di Enterocytozoon bieneusi e i geni Giardia BG, GDH e TPI.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Risultati dei test PCR di Cryptosporidium, Blastocystis SSU, Enterocytozoon bieneusi e Giardia BG gene PCR
Tutti i 95 campioni fecali rettali di topi sono stati testati per il gene ITS di Enterocytozoon bieneusi utilizzando due serie di primer, risultando 5 campioni positivi per ciascun metodo, risultando 6 campioni positi...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il Cryptosporidium, l'Enterocytozoon bieneusi, il Blastocystis e la Giardia sono comuni parassiti zoonotici intestinali; i primi due sono classificati come agenti patogeni biologici di categoria B dal National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti e tutti e quattro sono elencati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) come 24 dei più importanti parassiti di origine alimentare in tutto il mondo. Possono potenzialmente infettare esseri uma...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato sostenuto dalla Commissione sanitaria provinciale di Jiangsu (sovvenzione n. Ym2023024), Progetto di ricerca medica municipale di Yancheng (sovvenzione n. YK2023085) e il Fondo aperto del Laboratorio chiave di microbiologia patogena per le malattie infettive emergenti e riemergenti (Centro provinciale di Jiangsu per il controllo e la prevenzione delle malattie) (PM202402).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Qingke TechTSJ001
Kit di estrazione gel QiaquickQiagen 28704Kit di estrazione del gel di DNA
Scala di 100 bp più DNATransGen  BiotechBM311Scala del DNA
Colorante 4S Green Plus Acidi NucleiciBBIA616696-0500Colorazione del DNA
10 e volte; TBE BufferSolarbioT1051Buffer di elettroforesi
Qubit 4.0Termohttps://www.thermofisher.com/in/en/home
/industrial/spectroscopy-elemental
-isotopica-analisi/spettroscopia molecolare/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html?
ef_id=:G:s&; s_kwcid=AL!3652!10!77515
785702067!!!! 77516061528018!! 380468
453!1240249321530142& CID=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		Strumento quantitativo a fluorescenza
MINI Space 1000Tanonhttp://en.biotanon.com/PRODUCT/
PRODUCTLIST?ID=3040&;
TYPE=DETTAGLIO		Imager gel
  Mini kit veloce per l'estrazione del DNAQIAGEN51604Kit di estrazione degli acidi nucleici
ProFlex BaseTermohttps://www.thermofisher.com/
in/en/home/life-science/pcr/
thermal-cyclers-realtime-
instruments/thermal-cyclers
/proflex-pcr-system.html		PCR
Dream Taq Green PCR MixTermoK1082Amplificazione PCR  

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