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Sistema di rilevamento molecolare integrato basato su PCR per il rilevamento simultaneo di quattro parassiti intestinali zoonotici da più fonti

DOI:

10.3791/69180

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October 28th, 2025

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1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

In This Article

Summary

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Qui, presentiamo un protocollo per rilevare quattro parassiti intestinali zoonotici da più fonti contemporaneamente basato su una combinazione di un sistema di rilevamento molecolare integrato basato sulla reazione a catena della polimerasi (PCR).

Abstract

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Le malattie infettive sono fattori critici che influenzano la salute umana, lo sviluppo economico e la stabilità sociale. Tra queste, le malattie parassitarie zoonotiche intestinali sono diventate sempre più al centro dell'attenzione globale come malattie infettive emergenti e riemergenti, in particolare Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis e Giardia. Sono stati pubblicati solo pochi studi sull'epidemiologia dei parassiti di cui sopra, accompagnati da problemi come bersagli di rilevamento singoli, bassi tassi di rilevamento e alti tassi di rilevamento mancati. Questo studio mira a stabilire un sistema integrato di rilevamento molecolare basato su una combinazione di test PCR per il rilevamento simultaneo dei suddetti quattro parassiti zoonotici intestinali in campioni raccolti da topi selvatici, animali da compagnia e bestiame (bovini e ovini), al fine di fornire un supporto tecnico efficiente per il rilevamento di routine dei parassiti in molteplici scenari, comprese le interfacce animale-ambiente in particolare nelle strutture di sorveglianza locali.

In questo studio, prendendo come test primario la rilevazione di Enterocytozoon bieneusi nelle feci di 95 topi selvatici e 30 cani e gatti (25 da gatti e 5 da cani), quando sono stati utilizzati due set di primer per amplificare il gene ITS, i risultati positivi di ciascuna PCR sono stati esattamente gli stessi (5,26%), ma la combinazione di 2 set di test di reazione a catena della polimerasi (PCR) ha prodotto un tasso di positività più elevato (6,32%) per Enterocytozoon bieneusi. Per Giardia, 9 campioni positivi sono stati rilevati utilizzando il gene beta-giardina (BG), mentre nessun positivo è stato rilevato utilizzando i geni della glutammato deidrogenasi (GDH) e della trioso fosfato isomerasi (TPI). I risultati di cui sopra hanno dimostrato che una combinazione di test PCR per più segmenti genetici target ha migliorato la capacità di rilevamento di agenti patogeni designati, rispetto a qualsiasi singolo test PCR. Le sequenze target sono state confermate dal sequenziamento di Sanger. Questo sistema è stato progettato per migliorare e facilitare la sorveglianza dello stato di infezione, della distribuzione e dell'evoluzione filogenetica dei parassiti intestinali zoonotici da più fonti, fornendo una base per allarmi accurati e sensibili in una fase precoce. L'obiettivo è quello di costruire un ponte tecnico per raggiungere l'obiettivo One Health attraverso le interfacce uomo-animale-ambiente.

Introduction

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Il Cryptosporidium, l'Enterocytozoon bieneusi, il Blastocystis e la Giardia sono protozoi patogeni comuni e facilmente trascurati con prevalenza globale. Negli ultimi anni, a causa di fattori quali la bonifica e l'intrusione nelle nicchie ecologiche dei focolai naturali, la popolarità dell'allevamento di animali da compagnia e lo sviluppo dell'allevamento di bestiame e pollame, la prevalenza di malattie parassitarie intestinali zoonotiche multi-fonte nei roditori, negli animali da compagnia (cani e gatti) e nel bestiame (bovini e ovini) è diventata sempre più un punto focale delle emergenze, epidem....

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Protocol

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Lo studio è stato approvato e condotto dal comitato etico animale del Centro provinciale per il controllo e la prevenzione delle malattie di Jiangsu. Questo studio è stato condotto in conformità con l'edizione 2020 delle linee guida dell'American Veterinary Medical Association sull'eutanasia animale, i principi guida dei regolamenti sulla somministrazione degli animali da esperimento (ordine n. 2 della Commissione statale per la scienza e la tecnologia della Repubblica popolare cinese, 1988) e i principi guida per il trattamento umano degli animali emessi dal Ministero della scienza e della tecnologia della Repubblica popolare cinese.....

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Results

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Risultati dei test PCR di Cryptosporidium, Blastocystis SSU, Enterocytozoon bieneusi e Giardia BG gene PCR
Tutti i 95 campioni fecali rettali di topi sono stati testati per il gene ITS di Enterocytozoon bieneusi utilizzando due serie di primer, risultando 5 campioni positivi per ciascun metodo, risultando 6 campioni positi.......

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Discussion

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Il Cryptosporidium, l'Enterocytozoon bieneusi, il Blastocystis e la Giardia sono comuni parassiti zoonotici intestinali; i primi due sono classificati come agenti patogeni biologici di categoria B dal National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti e tutti e quattro sono elencati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) come 24 dei più importanti parassiti di origine alimentare in tutto il mondo. Possono potenzialmente infettare esseri uma.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo studio è stato sostenuto dalla Commissione sanitaria provinciale di Jiangsu (sovvenzione n. Ym2023024), Progetto di ricerca medica municipale di Yancheng (sovvenzione n. YK2023085) e il Fondo aperto del Laboratorio chiave di microbiologia patogena per le malattie infettive emergenti e riemergenti (Centro provinciale di Jiangsu per il controllo e la prevenzione delle malattie) (PM202402).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Qingke TechTSJ001
Kit di estrazione gel QiaquickQiagen 28704Kit di estrazione del gel di DNA
Scala di 100 bp più DNATransGen  BiotechBM311Scala del DNA
Colorante 4S Green Plus Acidi NucleiciBBIA616696-0500Colorazione del DNA
10 e volte; TBE BufferSolarbioT1051Buffer di elettroforesi
Qubit 4.0Termohttps://www.thermofisher.com/in/en/home
/industrial/spectroscopy-elemental
-isotopica-analisi/spettroscopia molecolare/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html?
ef_id=:G:s&; s_kwcid=AL!3652!10!77515
785702067!!!! 77516061528018!! 380468
453!1240249321530142& CID=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		Strumento quantitativo a fluorescenza
MINI Space 1000Tanonhttp://en.biotanon.com/PRODUCT/
PRODUCTLIST?ID=3040&;
TYPE=DETTAGLIO		Imager gel
  Mini kit veloce per l'estrazione del DNAQIAGEN51604Kit di estrazione degli acidi nucleici
ProFlex BaseTermohttps://www.thermofisher.com/
in/en/home/life-science/pcr/
thermal-cyclers-realtime-
instruments/thermal-cyclers
/proflex-pcr-system.html		PCR
Dream Taq Green PCR MixTermoK1082Amplificazione PCR  

References

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  1. Zhao, Q., et al. Cryptosporidium spp. in large-scale sheep farms in China: prevalence and genetic diversity. Sci Rep. 14 (1), 11218(2024).
  2. Li, F., Wang, R., Guo, Y., Li, N., Feng, Y., Xiao, L. Zoonotic potential ....

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PCR DetectionZoonotic ParasitesIntestinal ParasitesMolecular DetectionCryptosporidium DetectionEnterocytozoon BieneusiBlastocystis DetectionGiardia DetectionSanger SequencingOne Health

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