Questa procedura dimostra il trasporto trasversale della corteccia tibiale nei ratti, permettendo la visualizzazione e l'analisi della rivascolarizzazione durante l'ischemia dell'arto.
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Articolo metodologico
Un modello ratto di trasporto trasversale della corteccia tibiale per il trattamento dell'ischemia dell'arto inferiore
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trasporto trasverso della corteccia tibiale (TTT) è una tecnica chirurgica emergente utilizzata per promuovere la rivascolarizzazione negli arti inferiori ischemici. Questo video mostra un modello riproducibile di TTT su topo, dettagliando la creazione chirurgica di un frammento d'osso corticale, il protocollo di trasporto e le valutazioni post-operatorie. La procedura consente il trasporto controllato verso l'alto e verso il basso di un frammento osseo per stimolare risposte angiogeniche. Le immagini a raggi X rappresentative acquisite nei giorni postoperatori 1, 7 e 12, insieme all'imaging per perfusione microvascolare eseguito al giorno 19 dopo l'eutanasia, mostrano un movimento chiaro dei frammenti ossei e un miglioramento della perfusione degli arti dopo la TTT.
Questo modello fornisce una piattaforma pratica e riproducibile per indagare i meccanismi molecolari alla base dell'angiogenesi indotta da TTT e valutare potenziali strategie terapeutiche per le malattie ischemiche. Per costruire questo modello, abbiamo simulato la procedura clinica TTT su ratti di Sprague-Dawley, che prevedeva tre principali fasi chirurgiche: legatura dell'arteria femorale superficiale, creazione e mobilitazione di un frammento osseo corticale e applicazione di un fissatore esterno personalizzato. Nel corso di 12 giorni, il frammento fu gradualmente trasportato in avanti e poi all'indietro. L'imaging per perfusione ha confermato una vascolarizzazione aumentata nell'arto ischemico dopo il completamento del ciclo di trasporto. Nel complesso, questo modello standardizzato su ratti imita da vicino le procedure cliniche TTT e offre un prezioso sistema sperimentale per studiare la meccanotrasduzione, l'angiogenesi e la rigenerazione vascolare nelle condizioni ischemiche degli arti.
Introduzione
Le malattie ischemiche degli arti inferiori, come l'arteriosclerosi obliterante (ASO), la tromboangiite obliterante (TAO) e il piede diabetico (DF), sono caratterizzate da un flusso sanguigno arterioso limitato verso gli artiinferiori 1,2. Nelle fasi iniziali, i pazienti solitamente sperimentano claudicazione intermittente e dolore a riposo. Con il progredire della malattia, l'ischemia prolungata può causare necrosi tissutale, infezioni e, nei casi gravi, amputazionedell'arto 1. I trattamenti standard attuali - inclusi la terapia farmacologica, gli interventi endovascolari e le procedure chirurgiche a cielo aperto - spesso offrono un'efficacia limitata, in particolare negli stadi avanzati dellamalattia 3.
Il trasporto trasverso della corteccia tibiale (TTT) è una strategia terapeutica innovativa per il trattamento di varie malattie ischemiche degli artiinferiori. Radicata nel metodo di Ilizarov e nella "regola tensione-stress"5,6, questa tecnica consiste nella creazione di un frammento mobile di lembo osseo corticale nella tibia tramite osteotomia. Viene quindi applicata una forza di distrazione continua, lenta e controllata per stimolare la rigenerazione di ossa, vasi sanguigni e tessuti molli circostanti. Questo processo rigenerativo facilita il ristabilimento della microcircolazione e aiuta a ristabilire l'equilibrio dell'apporto di ossigeno nell'arto colpito. In definitiva, la TTT porta a una migliore perfusione sanguigna e al recupero funzionale nei tessutiischemici 7.
Le tecniche convenzionali di ricostruzione vascolare per l'ischemia degli arti inferiori possono ripristinare il flusso sanguigno nelle grandi arterie del polpaccio, ma spesso sono inefficaci nel rivascolare le arterie più piccole del piede o nel promuovere la riparazione e la rigenerazione dei microvasi danneggiati, limitandone la capacità di risolvere completamentel'ischemia 8. La TTT applica continuamente trazione all'osso e ai tessuti molli circostanti, inducendo così il rilascio robusto di fattori chemiotattici ecitochine 9. Questi fattori chemiotattici regolano varie funzioni delle cellule staminali e, in condizioni ischemiche, vengono abbondantemente secreti nella circolazione. Reclutano attivamente cellule staminali endogene nei siti di lesione, facilitando così la riparazione e la rigenerazione vascolare senza richiedere trapianto diretto di cellule staminali. Grazie a questi vantaggi, la TTT si è affermata come una strategia terapeutica promettente per l'ischemia degli arti inferiori ed è sempre più impiegata nel trattamento di diverse condizioni ischemiche che colpiscono gli artiinferiori 7,9,10.
Sebbene conigli e cani siano comunemente utilizzati nella ricerca fondamentale sulla TTT, la mancanza di strumenti analitici adeguati per queste specie limita le indagini meccanicistiche. Al contrario, il modello TTT del ratto offre una maggiore compatibilità con le tecniche molecolari e di imaging disponibili, mantenendo al contempo praticità e costi inferiori, rendendolo una piattaforma più accessibile e riproducibile per studi meccanicistici. Tuttavia, ad oggi, nessuno studio ha descritto o valutato sistematicamente l'efficacia della TTT in un modello ratto di ischemia dell'arto inferiore.
Il modello TTT del ratto richiede abilità microchirurgiche affinate a causa della piccola dimensione tibiale e della corteccia sottile, e il suo intervallo di distrazione è limitato dallo spessore corticale. Questi vincoli pratici dovrebbero essere considerati nella valutazione dell'idoneità del modello a specifici ambienti di ricerca.
In questo studio, abbiamo sviluppato un modello TTT specifico per ratti replicando la struttura centrale e i principi operativi dell'apparato di trasporto trasverso tibiale clinico. La procedura è stata perfezionata a partire da protocolli clinicamente validati per garantire fattibilità e coerenza nei piccoli animali. Il nostro obiettivo è stabilire e convalidare un modello TTT standardizzato e riproducibile nel ratto, adatto per studiare l'angiogenesi e la meccanotrasduzione nella malattia ischemica degli arti.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico Animale del Primo Ospedale Affiliato dell'Università Medica del Guangxi (approvato n. 2025-E0642). I maschi di ratti Sprague-Dawley (300-350g) sono stati ospitati presso il Centro di Ricerca Animale dell'Università Medica del Guangxi in condizioni standardizzate. Ai ratti veniva fornita cibo normale e acqua potabile pulita ad libitum e mantenuti su un ciclo artificiale di 12 ore luce e buio. La struttura per animali veniva mantenuta a una temperatura controllata di 20-26 °C con un'umidità relativa del 40%-70%. Tutti gli strumenti chirurgici venivano completamente sterilizzati prima dell'uso. Informazioni dettagliate su tutti i reagenti e i materiali utilizzati in questo studio sono fornite nella Tabella 1.
L'eutanasia è stata eseguita tramite iniezione intraperitoneale di un'overdose di pentobarbital sodico. La morte è stata confermata dalla cessazione permanente del battito cardiaco e della respirazione, dalla dilatazione pupilare e dall'assenza di risposta a stimoli nocivi. Tutte le procedure sono state condotte da personale addestrato per minimizzare il disagio animale, e il protocollo di eutanasia è stato rivisto e approvato in anticipo dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali.
1. Fissatore esterno per TTT
- Utilizzare una versione ridotta e progettata su misura del fissatore esterno clinico della corteccia tibiale trasversale (TTT-EF), composta da un'unità di trazione a frammenti ossei e da un telaio di fissazione esterno.
- Consentire la mobilitazione verticale di entrambi i componenti incorporando un meccanismo a vite interna (Figura 1).
- Forare due fori passanti su ciascun lato delle sezioni trasversali sia dell'unità di trazione che del telaio di fissazione per consentire l'inserimento dei fili di Kirschner.
- Inserire i fili Kirschner attraverso i fori designati e fissarli lateralmente con viti esagonali per garantire la stabilità.
- Collegare la componente di trazione del TTT-EF al frammento osseo utilizzando fili Kirschner da 0,8 mm.
- Ancorare la componente di fissazione alle estremità prossimale e distale della tibia utilizzando fili Kirschner da 1,0 mm.
2. Procedura chirurgica
- Eseguire la procedura TTT su maschi di ratti Sprague-Dawley (SD) di 8 settimane. Anestetizzare i ratti con iniezione intraperitoneale di 0,35 mg/kg di pentobarbital sodio e 0,3 mg/kg di cloral idrato.
- Valuta l'effetto anestetico testando il riflesso di ritiro del pedale e il riflesso corneale. Monitorare costantemente i segni vitali e la profondità dell'anestesia durante tutta la procedura. Applicare una pomata oftalmica sugli occhi del ratto prima dell'intervento per proteggere la cornea, seguendo le Linee Guida per l'Uso degli Animali da Laboratorio.
- Radere l'area chirurgica e somministrare lidocaina allo 0,5% per minimizzare il dolore post-operatorio.
- Fai un'incisione cutanea di 10 mm nella regione inguinale destra usando un bisturi n. 11.
- Dissezionare in modo diretto la fascia per esporre l'arteria femorale superficiale.
- Isolare l'arteria tra il nervo femorale e la vena femorale superficiale usando forze oftalmiche. Legare e traseccare entrambe le estremità dell'arteria.
- Sutura l'incisione usando sutura assorbibile 4-0.
- Effettuare un'incisione verticale di 15 mm sulla tibia superiore mediale utilizzando un bisturi n. 11.
- Separare con attenzione il tessuto sottocutaneo e il muscolo sottostante per evitare lesioni periosteali. Disseziona delicatamente i tessuti molli per esporre completamente la superficie tibiale mediale.
- Delineare l'area dei frammenti ossei (8 mm × 4 mm) sulla superficie tibiale mediale utilizzando una lama chirurgica. Forare le perforazioni ravvicinate lungo il confine segnato utilizzando una punta da 0,6 mm. Creare un frammento osseo di finestra (8 mm × 4 mm) sulla tibia mediale superiore.
- Impiantare due fili Kirschner filettati da 0,8 mm nel frammento osseo, distanziati a 0,5 mm, per facilitare il trasporto. Collega i fili Kirschner al TTT-EF e fissali.
- Inserire due fili Kirschner da 1,0 mm su entrambi i lati del frammento, penetrando nella corteccia posteriore della tibia.
- Assembla e installa il TTT-EF.
- Esegui l'osteotomia lungo le linee segnate usando forbici oftalmiche.
- Sollevare delicatamente il frammento osseo per consentire la mobilità verticale, evitando lesioni al midollo.
- Irrigare il sito chirurgico con 10% povidone-iodio seguito da soluzione salina sterile.
- Sutura l'incisione a strati usando sutura assorbibile 4-0.
- Somministrare buprenorfina (0,05 mg/kg) sottocutaneamente immediatamente dopo l'intervento. Continua a somministrare ogni 12 ore per un massimo di 3 giorni per garantire un'analgesia efficace.
3. Monitoraggio postoperatorio
- Monitorare attentamente gli animali dopo l'intervento per garantire un recupero adeguato e individuare tempestivamente le potenziali complicazioni. Esaminare gli animali ogni 6-8 ore durante le prime 48 ore postoperatorie. Valuta l'attività generale, la postura, il comportamento di toelettatura, l'assunzione di cibo e acqua e la condizione dell'incisione chirurgica.
- Effettuare il monitoraggio almeno una volta al giorno dal terzo giorno postoperatorio fino alle fasi di distrazione e consolidamento. Conferma un recupero adeguato verificando la normalità della camminata, il peso corporeo stabile, l'assunzione costante di cibo e acqua e l'assenza di secrezione della ferita, gonfiore eccessivo o segni comportamentali di dolore.
- Continuare l'analgesia secondo necessità secondo le linee guida istituzionali.
- Trattare le infezioni delle ferite (ad esempio, eritema, gonfiore, secrezione purulenta) con cure locali della ferita e antibiotici sistemici, seguendo le raccomandazioni veterinarie.
- Correggere immediatamente qualsiasi allentamento o spostamento del fissatore esterno sotto breve anestesia per mantenere l'allineamento e consentire una distrazione accurata.
- Valuta e gestisci tempestivamente eventuali complicazioni. Valutare animali con gravi complicazioni che influenzano la mobilità, l'alimentazione o la guarigione delle ferite in consultazione con il personale veterinario.
- Eutanasiare gli animali in modo umano se soddisfano criteri umani predefiniti per gli endpoint.
4. Protocollo di trasporto dei frammenti ossei
- Utilizzare il fissatore esterno per trasporto trasversale della corteccia tibiale (TTT-EF) per effettuare il trasporto postoperatorio dei frammenti ossei.
- Indica il Giorno 1 dopo l'intervento come periodo di latenza.
NOTA: Non manipolare il frammento osseo durante questo periodo. - Avvia la fase di trasporto verso l'alto al secondo giorno. Avanzare il frammento osseo a una velocità di 0,5 mm ogni 12 ore per 5 giorni consecutivi (Giorno 2-Giorno 6). Mettere in pausa il processo di trasporto al Giorno 7 per permettere la stabilizzazione.
- Avvia la fase di trasporto verso il basso al giorno 8.
- Ritrae il frammento osseo alla stessa velocità di 0,5 mm ogni 12 ore per 5 giorni (giorno 8-giorno 12). Assicurati che il frammento osseo torni alla sua posizione originale entro la fine del Dodicesimo Giorno.
- Continuare con una fase di consolidamento di 2 giorni (giorni 13-14), senza ulteriori trasporti.
- Rimuovere il fissatore esterno alla fine della fase di consolidamento.
NOTA: Consulta la Figura 2 per una timeline visiva della procedura di trasporto TTT e del programma di valutazione.
5. Valutazione
NOTA: Utilizzare tecniche di imaging per valutare sia la posizione dei frammenti ossei sia il ripristino del flusso sanguigno.
- Eseguire l'imaging a raggi X degli arti inferiori nei giorni 1, 7 e 12 per monitorare la progressione e la posizione finale del frammento osseo trasportato.
- Anestetizzare i ratti in momenti di imaging designati utilizzando il 2,0% di isoflurano nell'ossigeno.
- Posizionare ogni ratto su una piattaforma di imaging a temperatura mantenuta equipaggiata con un tappeto riscaldante per prevenire l'ipotermia durante la procedura.
- Monitorare la profondità anestetica valutando la frequenza respiratoria e il riflesso pedalale per garantire un'immobilizzazione stabile.
- Posizionare gli arti e il fissatore esterno in un orientamento standardizzato su tutti gli animali per minimizzare la variabilità nell'acquisizione dei raggi X.
- Acquisire immagini a raggi X per confermare lo spostamento e il riposizionamento dei frammenti ossei.
- Eseguire l'imaging per perfusione vascolare al giorno 19 postoperatorio per valutare la perfusione microvascolare nell'arto inferiore.
- Eutanasia i ratti e perfusa l'agente di contrasto tramite l'arteria femorale per visualizzare la vascolarità.
- Posizionare i ratti eutanasiati in una posizione supina standardizzata per una configurazione di imaging coerente.
- Consentire il completo riempimento vascolare perfondendo l'agente di contrasto attraverso l'arteria femorale in condizioni a temperatura ambiente stabile.
- Effettuare imaging vascolare per valutare l'architettura microvascolare e la perfusione. Assicurarsi che tutti i campioni siano allineati in modo coerente con l'orientamento degli arti e l'allineamento dei fissatori identici per favorire la riproducibilità durante le sessioni di imaging.
- Utilizzare le immagini risultanti per valutare il ripristino del flusso sanguigno e dell'architettura vascolare negli arti inferiori.
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Risultati
La Figura 3 illustra la procedura per costruire un modello animale di ischemia dell'arto inferiore trattato con TTT. Nelle nostre mani, la procedura ha mostrato un tasso di successo chirurgico di circa il 90%. Il numero limitato di guasti era in gran parte attribuibile a problemi tecnici come l'allentamento del fissatore esterno o la frattura di frammenti ossei intraoperatori, che rendevano impossibile la distrazione successiva. Il modello è stato stabilito e...
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Discussione
Tutte le procedure che coinvolgevano anestesia e interventi chirurgici venivano eseguite con attenzione alla sicurezza degli animali e alle linee guida istituzionali per la cura degli animali. La profondità dell'anestesia è stata confermata prima dell'incisione tramite test di ritiro del pedale o riflesso corneale ed è stata monitorata regolarmente durante tutta la procedura. È stato fornito un adeguato supporto termico (come un cuscinetto riscaldante) per prevenire l'ipotermia e è stata...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Micro Trasversale Ritrattore | Tianjin Xinzhong Medical Equipment Co., Ltd | A61B17/66 | Eseguire trazione dei frammenti ossei |
| Piccolo trapano ortopedico | Yancheng Ruiao Technology Co. LTD | RA-II | Per l'osteotomia a perforazione tibiale |
| Punta per trapano in acciaio inossidabile da 0,6 mm | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Per l'osteotomia a perforazione tibiale |
| Filo Kirschner da 0,8 mm | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Per l'attacco delle alette ossee e del retrattore |
| filo Kirschner da 1,0 mm | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Per la fissazione del retrattore |
| Pentobarbital sodio | Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd | - | Per gli animali anestetizzati |
| Chiave di Allen | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Per fissare viti |
| Buprenorfina | Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd | Per animali analgesici | |
| MICROFIL | Flow Tech, Inc Co., Ltd | Angiografia degli animali | |
| Isoflurano | Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd. | Per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia inalatoria | |
| Lidocaina Cloridrato (0,5%) | Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd. | Utilizzato per l'infiltrazione locale per ridurre il dolore post-operatorio e minimizzare l'irritazione dei tessuti durante le procedure chirurgiche |
Riferimenti
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