Qui, presentiamo un protocollo per definire chiaramente i passaggi per anastomizzare il linfonodo cervicale profondo o il suo vaso linfatico afferente con la vena facciale posteriore nel ratto, per ridurre al minimo l'influenza di altre variabili e standardizzare la conduzione della ricerca basata sulla chirurgia.
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Articolo metodologico
Protocolli chirurgici per l'anastomosi linfovenosa cervicale profonda in un modello di ratto: anastomosi linfonodali e vasi linfatici
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'anastomosi linfovenosa cervicale profonda (dcLVA) è diventata una strategia di trattamento promettente per la malattia di Alzheimer (AD), offrendo miglioramenti significativi rispetto alle attuali opzioni di trattamento limitate. Tuttavia, il meccanismo alla base della dcLVA rimane poco chiaro. Sebbene gli studi clinici siano in corso, i modelli animali che simulano la dcLVA forniscono uno strumento prezioso per esplorarne il meccanismo. Questo studio mira a sviluppare un protocollo standardizzato per la creazione di modelli di dcLVA negli animali per facilitare la ricerca di base e affrontare le sfide cliniche. Descriviamo le procedure chirurgiche e i passaggi chiave per anastomizzare il linfonodo cervicale profondo (dcLN) e il suo vaso linfatico afferente (ALV) con la vena facciale posteriore (PFV), descrivendo in dettaglio questi due distinti metodi chirurgici: anastomosi linfonodale-vena cervicale profonda (dcLnVA) e anastomosi linfatica cervicale profonda-vena (dcLaVA). Oltre a promuovere il drenaggio linfatico, il confronto di questi due metodi chirurgici ci aiuta anche a comprendere ed esplorare il ruolo del linfonodo cervicale profondo e del sistema linfatico cervicale profondo nella patogenesi dell'AD. Nel complesso, la presentazione completa e chiara della procedura chirurgica e dei punti di riferimento anatomici chiave nel ratto aiuta a standardizzare il protocollo chirurgico, che possono minimizzare i fattori confondenti e ridurre la variabilità inter-sperimentale, ponendo così una solida base metodologica per una comprensione più approfondita dei meccanismi coinvolti.
Introduzione
La malattia di Alzheimer (AD) è una malattia neurodegenerativa gradualmente progressiva che spesso provoca un declino cognitivo. Le caratteristiche patologiche distintive dell'AD sono le placche di amiloide-beta (Aβ) e i grovigli neurofibrillari, che sono formati da proteine tau fosforilate in modo anomalo. Recenti ricerche sul sistema linfatico cerebrale hanno aperto nuove strade terapeutiche per il trattamento dell'AD. Questo sistema facilita il drenaggio di Aβ dal liquido interstiziale (ISF) al liquido cerebrospinale (CSF) e successivamente ai linfonodi cervicali profondi attraverso i vasi linfatici meningei (mLV)1. Nel 2024, il team del professor Xie ha riportato il primo caso di miglioramento cognitivo in un paziente con AD a seguito di anastomosi lintrovenosa cervicale profonda (dcLVA) e successivamente ha avviato una sperimentazione clinica (NCT06530732)2.
Sebbene la dcLVA, come nuovo approccio terapeutico per l'AD, offra prospettive promettenti per i pazienti, i meccanismi precisi alla base dei suoi effetti terapeutici richiedono ulteriori chiarimenti3. I modelli animali forniscono una piattaforma indispensabile per studiare questi meccanismi. Una comprensione completa dei meccanismi terapeutici della dcLVA non solo migliorerà la nostra comprensione della patogenesi dell'AD, ma ottimizzerà anche le tecniche chirurgiche, chiarirà le indicazioni terapeutiche e, in ultima analisi, fornirà maggiori benefici clinici ai pazienti.
Il team del professor Xie ha recentemente riportato un modello dcLVA, dimostrando la fattibilità del collegamento degli affluenti della vena giugulare esterna con il linfonodo cervicale profondo4. Tuttavia, la descrizione del modello non è ancora sufficiente. In primo luogo, la descrizione del linfonodo cervicale profondo (dcLN) e dell'anatomia circostante è inadeguata. In secondo luogo, non esiste una valutazione oggettiva e quantitativa della pervietà postoperatoria. Ancora più importante, mancano descrizioni dettagliate dei passaggi per l'anastomosi del dcLN e delle vene, nonché immagini e video chiari e intuitivi che siano convenienti per l'insegnamento.
Dato che questa tecnica comporta un'intricata manipolazione chirurgica e considerando le differenze anatomiche tra ratti e esseri umani, le variazioni nelle procedure chirurgiche e nei dettagli tecnici nei modelli di ratto possono portare a discrepanze significative nei risultati sperimentali. Pertanto, è fondamentale e urgente illustrare chiaramente i punti di riferimento anatomici rilevanti nei ratti e fornire descrizioni tecniche dettagliate della procedura di anastomosi. Tali sforzi sono essenziali per migliorare la riproducibilità e la standardizzazione del protocollo chirurgico, supportando così un'applicazione più ampia da parte dei ricercatori e facendo progredire le indagini scientifiche correlate. Inoltre, data la diversità delle tecniche chirurgiche cliniche, come l'anastomosi linfonoda-vena e l'anastomosi linfaticovenosa, e il potenziale di esiti variabili a seconda dell'approccio chirurgico, sono necessari studi comparativi per valutarne l'efficacia relativa. In risposta a queste sfide, presentiamo due metodi dcLVA altamente riproducibili: l'anastomosi linfonoda-vena cervicale profonda (dcLnVA) e l'anastomosi vaso-vena linfatica cervicale profonda (dcLaVA). Questi metodi mirano a standardizzare il processo di creazione del modello e a facilitare la successiva ricerca di base.
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Protocollo
Questo studio è stato condotto con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Medicina di Harbin (Approvazione n. SYDW2025-037). I soggetti erano ratti maschi di Sprague-Dawley (SD), del peso di 400-500 g e di età compresa tra 12 e 14 settimane, forniti dal centro animali dell'università. Il centro mantiene una struttura priva di agenti patogeni specifici (SPF) ed è conforme agli standard nazionali di allevamento.
NOTA: Questo studio indaga principalmente due metodi di anastomosi tra la linfa cervicale profonda e le vene. Stabilire una connessione chirurgica tra il dcLN e la vena facciale posteriore (PFV); questa tecnica è indicata come dcLnVA. Creazione di una connessione anatomica tra il vaso linfatico cervicale profondo (dcLaV) e il PFV; questa tecnica è indicata come dcLaVA. Descriviamo in dettaglio entrambe le procedure microchirurgiche, comprese le loro metodologie operative e la valutazione post-anastomosi.
1. Preparazione preoperatoria
- Anestetizzare il ratto mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (50 mg/kg). Monitora attentamente le risposte del ratto. Procedere solo quando il riflesso del pedale è completamente assente.
- Utilizzando un ago a punta smussata, somministrare lentamente la soluzione di blu di Evans (EB) (circa 60-100 μL/kg, 5%)5 nella mucosa nasale di una cavità nasale unilaterale. Posizionare il ratto in posizione sdraiata semilaterale, con l'addome rivolto verso l'alto e la narice iniettata con EB rivolta verso il basso. Fissare la testa per evitare che l'EB entri nella narice controlaterale o nelle vie respiratorie.
- Radere i peli sul collo del topo per garantire un campo chirurgico chiaro. Applicare vaselina su entrambi gli occhi per prevenire secchezza o lesioni corneali durante l'intervento chirurgico.
2. Incisione chirurgica
- Disinfettare la linea mediana del collo del ratto tre volte con tintura di iodio per garantire un campo chirurgico sterile.
- Praticare un'incisione sulla linea mediana di circa 3 cm di lunghezza utilizzando le forbici chirurgiche.
NOTA: Fare attenzione a non danneggiare la ghiandola sottomascellare (SMG) e i vasi sanguigni durante la dissezione. - Ritrarre l'incisione chirurgica per esporre il muscolo sternotiroideo (STM), il muscolo sternocleidomastoideo (SCM) e il muscolo omoioideo (OHM).
3. Preparazione del PFV
- Identificare il PFV, un affluente della vena giugulare esterna (EJV), lungo il margine laterale del SCM.
- Alla biforcazione tra il PFV e l'EJV, occludere il PFV utilizzando una clip microvascolare.
- Continuare a sezionare bruscamente il PFV per ottenere una lunghezza sufficiente e bloccarlo all'estremità distale. Assicurarsi che il segmento PFV rimanga il più libero possibile per consentire la successiva trazione durante l'anastomosi con il dcLN.
- Creare un'incisione longitudinale parallela all'asse del vaso utilizzando le forbici microvascolari.
NOTA: Assicurarsi che l'incisione PFV sia longitudinale, poiché l'incisione trasversale può essere allargata e rotta dalla trazione. - Irrigare accuratamente il segmento vascolare isolato con soluzione fisiologica eparinizzata (0,1% di eparina sodica in 0,9% di NaCl) fino a quando gli eritrociti intravascolari non sono completamente eliminati.
4. Anastomosi linfonodale-venosa
- Esplorare ed esporre completamente dcLN e il suo vaso linfatico afferente (ALV) al centro dell'STM e dell'SCM4.
- Sezionare gradualmente il dcLN utilizzando una tecnica smussata. Incidere con cura la fascia tra il dcLN e i tessuti circostanti, evitando di danneggiare sia il dcLN che la sua ALV.
NOTA: Assicurarsi che PFV e dcLN siano vicini l'uno all'altro per ridurre al minimo la tensione dopo l'anastomosi. - Praticare un'incisione all'estremità distale del dcLN. Assicurarsi che la larghezza dell'incisione sia inferiore o simile al diametro del PFV, in modo che il flusso sanguigno PFV non ne risenta in modo significativo.
- Utilizzando una sutura di nylon 12-0, anastomosi l'estremità prossimale dell'incisione PFV all'estremità prossimale dell'incisione dcLN.
- Continuare ad espandere la lunghezza dell'incisione del PFV fino all'estremità distale in modo che sia leggermente più grande della lunghezza dell'incisione del dcLN.
- Far passare l'ago in sequenza attraverso il bordo esterno della transezione del dcLN e il bordo interno dell'incisione del PFV, tirando così la transezione del dcLN nel lume del PFV.
- Eseguire una sutura continua dal bordo inferiore a quello superiore della transezione del dcLN. Somministrare nuovamente eparina sodica appena prima di completare la sutura finale per prevenire la formazione di trombi all'interno del lume PFV. Mantenere un'adeguata tensione sulla sutura durante la chiusura continua per garantire una chiusura sicura e prevenire successive perdite.
- Posizionare le suture interrotte ovunque l'anastomosi continua sia allentata.
5. Anastomosi linfatica vaso-vena
- Sezionare l'ALV e preservare il tessuto circostante per fungere da punto di ancoraggio della sutura.
- Utilizzando un ago da sutura 12-0, inserirlo a circa 2 mm prossimalmente all'incisione PFV e farlo avanzare per uscire attraverso l'apertura dell'incisione PFV.
- Entra nel tessuto vicino al moncone di ALV con l'ago da sutura per catturare l'ALV.
- Passare l'ago nell'incisione PFV e farla uscire attraverso il suo bordo prossimale, quindi legare la sutura alla fissazione del moncone ALV all'interno del lume del PFV.
NOTA: Inserire completamente il moncone ALV nel lume del PFV, orientandolo verso la direzione prossimale per mantenere il drenaggio fisiologico. - Sutura il tessuto circostante vicino al moncone di ALV fino al bordo interno dell'incisione PFV per fornire una fissazione esterna. Somministrare eparina sodica prima dell'ultimo punto per mantenere il lume del PFV libero da coaguli.
6. Sutura e cure postoperatorie
- Eseguire suture continue per la fascia sottocutanea e suture interrotte per l'epidermide.
- Disinfettare l'area chirurgica con tintura di iodio. Quindi applicare l'unguento all'eritromicina in modo uniforme attorno all'incisione per prevenire l'infezione.
- Dopo l'intervento, somministrare penicillina sodica (800.000 unità/kg) tramite iniezione intraperitoneale una volta al giorno per cinque giorni consecutivi per ridurre il rischio di infezione.
7. Convalida dell'anastomosi
- Identificare e sezionare la vena facciale anteriore (AFV), un affluente dell'EJV, lateralmente al PFV.
- Verificare il successo dell'anastomosi osservando una colorazione significativamente più intensa nel PFV rispetto all'AFV adiacente.
- Quantifica oggettivamente i cambiamenti di colore utilizzando lo spazio colore standardizzato CIE LAB. Definisci ed estrai le regioni di interesse (ROI) nelle Figi per ottenere i valori medi CIE L*a*b*, quindi calcola l'angolo di tonalità (h°) in gradi utilizzando la formula:
h° = atan2(b, a) × (180/π)6,7.
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Risultati
Le procedure chirurgiche e gli esiti postoperatori di dcLnVA e dcLaVA sono illustrati con un caso rappresentativo ciascuno. Nel caso della dcLnVA, il PFV (2 mm di diametro) è stato identificato e dissociato dal bordo laterale dell'SCM (Figura 1A, Figura S1A). Nello spazio tra SCM e STM, a circa 4 mm medialmente dal PFV, è stato trovato un lungo dcLN ovale (5 mm × 4 mm × 2 mm) finemente separato (Figura 1B
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Discussione
Nel 2012, ILif et al. hanno descritto per la prima volta il sistema glinfatico8. Nel 2015, Louveau et al. hanno identificato aggregati di cellule T nel lume dei vasi linfatici e hanno definito queste strutture linfatiche meningee. Hanno inoltre dimostrato che i linfatici meningei sono collegati sia al sistema glinfatico che ai dcLN. In sintesi, sotto la regolazione del sistema linfatico cerebrale, che comprende sia il sistema glinfatico che i linfatici meningei, l...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82173384 e 81773161), dal Key Research and Development Program della provincia di Heilongjiang (2023ZX06C11) e dal Genertec Medical Scientific Research Fund Project (TYYLKYJJ-2024-043).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina sterile al 0,9% | Shandong Qidu Pharmaceutical Co., Ltd. | R9824041307 | |
| Pomata all'eritromicina | Sanqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H34020307 | |
| Evans Blue Dye 5% (50mL) | LEAGENE | DK0053 | |
| Soluzione di eparina sodica 0,1% | BIOSCO | BAC006 | |
| Micro pinze | ANLIXIN | AT-15 | |
| Pinza microvascolare | Tigergene | TG-AC-18-Z | |
| Penicillina Sodica | Hebei Yuanzheng Hemu Pharmaceutical Co., Ltd | JFT230602 | |
| Vaselina bianca | Tiancheng & nbsp; | 20250202 |
Riferimenti
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