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Articolo metodologico

Un modello avanzato di co-coltura della barriera sanguigno-cerebrospinale umana per l'analisi separata dell'epitelio e dell'endotelio del plesso coroideo

424 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/69275

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28 novembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

In questo articolo

Sommario

È stata stabilita una co-coltura di cellule epiteliali ed endoteliali umane del plesso coroideo per generare un modello in vitro avanzato della barriera del liquido cerebrospinale. Descriviamo l'isolamento separato di epitelio ed endotelio per la successiva preparazione dell'RNA e l'analisi trascrizionale in condizioni selezionate.

Abstract

Il plesso coroideo (PC), altamente perfuso, situato nel sistema ventricolare del cervello, è composto da diverse componenti strutturali, tra cui un epitelio cuboide e un endotelio fenestrato, ed è la posizione della barriera sangue-liquido cerebrospinale (BCSFB). Per studiare la PC in vitro, sono possibili diversi sistemi di coltura cellulare. Un modello di filtro a coltura cellulare invertita con forte funzione barriera, basato sulle cellule papilloma epiteliale CP umano (HIBCPP), è stato stabilito dal nostro laboratorio ed è ampiamente utilizzato. Recentemente, siamo riusciti a generare una linea cellulare endoteliale CP umana stabile e immortalata (iHCPEnC). Combinando entrambe le linee cellulari, abbiamo assemblato un modello funzionale avanzato di tipo due cellule che ha sviluppato una funzione barriera aumentata rispetto alle sole cellule HIBCPP. Poiché questo modello rappresenta sia l'epitelio CP che l'endotelio, consente di indagare l'interazione tra i due tipi cellulari in condizioni selezionate, come infezione, infiammazione o altre. In questo protocollo, descriviamo metodi per impostare questo modello di tipo a due cellule con la successiva separazione delle cellule epiteliali ed endoteliali per analisi trascrizionali. Descriviamo primer PCR specifici per epitelio ed endotelio, che servono a rilevare possibili contaminazioni incrociate tra i due tipi cellulari. Per indagare un possibile impatto dell'endotelio CP sull'epitelio in questo modello in condizioni infiammatorie, sono stati analizzati i livelli di espressione di geni selezionati nel contesto del trattamento con lipopolisaccaridi (LPS) nella frazione cellulare HIBCPP. Il modello avanzato in vitro della CP e la possibilità di analizzare separatamente risposte epiteliali ed endoteliali sono di notevole interesse per la ricerca sui processi cellulari che coinvolgono funzioni biologiche e patologiche della CP.

Introduzione

Il plesso coroideo (CP) è un conglomerato altamente vascolarizzato di diverse popolazioni cellulari situato in tutti e quattro i ventricoli del cervello. Tra le altre funzioni, svolge il ruolo di barriera fisiologica, la cosiddetta barriera del liquido cerebrospinale (BCSFB), tra il sistema nervoso centrale (SNC) e il sangue, impedendo al cervello, ad esempio, di circolare sostanze infettive nel sangue. La CP è composta da diversi tipi cellulari, incluse le cellule epiteliali polarizzate, contenenti giunzioni strette e di adesione oltre a desmosomi, poggiate su una membrana basale. La superficie delle cellule epiteliali è ingrandita dalla presenza di microvilli sulla superficie luminale. I capillari endoteliali fenestrati, circondati da tessuto conlettivo come fibroblasti e cellule immunitarie, si trovano sotto la membranabasale 1,2,3. È stato recentemente riportato che le cellule endoteliali CP sono in grado di migliorare l'integrità della BCSFB insieme alle cellule epiteliali e quindi potrebbero svolgere un ruolo nella protezione cerebrale durante i processiinfiammatori 4,5.

Ad oggi, la coltura invertita di cellule di papilloma epiteliale CP umano (HIBCPP) è il modello in vitro più frequentemente utilizzato per imitare un BCSFB umano con alti valori di resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e una forte funzione barriera. Per comprendere meglio le funzioni cellulari ed evitare esperimenti sugli animali allo stesso tempo, è importante ottenere quante più informazioni possibili dagli esperimenti in vitro. La prima linea cellulare endoteliale CP umana immortalata stabile (iHCPEnC) è stata recentemente stabilitanel nostro laboratorio 6,7. Con l'aiuto delle cellule HIBCPP e dell'iHCPEnC siamo in grado di assemblare un modello di co-cultura in vitro che imita il BCSFB in modo piùavanzato 8. Utilizzando questo modello di tipo a due cellule, abbiamo potuto dimostrare che la co-coltura di cellule HIBCPP e iHCPEnC porta a un aumento dei valori TEER rispetto alle sole cellule HIBCPP. È importante notare che iHCPEnC da solo non sviluppa un TEER 7,8. Una preparazione separata e le successive analisi dei due tipi cellulari impiegati in questo modello ci permetterebbero di indagare la loro interazione in condizioni sane e malate.

Qui descriviamo due approcci diversi per raggiungere questo obiettivo. La base è che, in entrambi i casi, l'approccio si basa sul modello di coltura cellulare invertita delle celle HIBCPP (Figura 1). Il Metodo 1, il metodo della "co-coltura diretta", comprende entrambe le cellule su un unico filtro inserito. Le cellule HIBCPP vengono coltivate in modo invertito prima della semina di iHCPEnC in modo standard 7,8. Metodo 2, la coltura "membrane-in-insert", qui abbiamo aggiunto una membrana separata con le stesse proprietà di quella usata negli inserti del filtro. Questa membrana aggiuntiva viene inserita in un inserto filtro dove le cellule di HIBCPP stanno già crescendo in coltura invertita. Gli iHCPEnC vengono seminati sulla membrana aggiuntiva in modo standard della coltura.

La successiva separazione delle cellule per l'analisi dell'RNA permette di comprendere la reazione trascrizionale dell'epitelio e dell'endotelio CP in condizioni selezionate. Descriviamo primer PCR specifici per cellule HIBCPP e iHCPEnC che permettono la conferma della separazione efficace e pulita di entrambi i tipi cellulari. Dopo il trattamento con lipopolisaccaride (LPS), utilizziamo i modelli descritti per indagare le risposte distinte dell'epitelio CP in presenza dell'endotelio in condizioni infiammatorie.

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Protocollo

1. Celle HIBCPP

NOTA: Di seguito, descriviamo la coltura e il mantenimento delle cellule HIBCPP, nonché la preparazione degli inserti di filtri in coltura cellulare invertita con celle HIBCPP. Questo protocollo è progettato per la crescita di cellule HIBCPP su inserti di filtro per coltura cellulare a 12 pozzi. Un protocollo dettagliato con video accompagnato per la coltura delle cellule HIBCPP su inserti di filtri per coltura cellulare a 24 pozzi è stato pubblicato inprecedenza 9.

  1. Prelevato in coltura di cellule HIBCPP
    1. Scongelare una fiala di cellule HIBCPP a temperatura ambiente (RT).
    2. Sospendere il contenuto della fiala con 10 mL di mezzo DMEM/HAMS-F12 contenente 10% di siero fetale per vitelli (FCS) e 5 μg di insulina/mL di mezzo preriscaldato (10% di mezzo HIBCPP).
    3. Inserire le cellule HIBCPP sospense in una fiaschetta di coltura T75 e incubare per 24 ore a 37 °C con il 5% diCO2.
    4. Cambia il mezzo della fiaschetta per rimuovere il DMSO 24 ore dopo aver seminato le cellule.
    5. Coltiva le cellule fino al 90% di confluenza, questo passaggio dura circa 2 settimane. Cambia il mezzo due volte a settimana.
  2. Coltura continua di celle HIBCPP
    NOTA: Per la coltura continua, dividere le cellule HIBCPP 1:3 in nuove fiasche di coltura T75.
    1. Rimuovi il mezzo di coltura dalla fiaschetta T75.
    2. Lava le cellule una volta con 10 mL di PBS.
    3. Rimuovi il PBS.
    4. Distogliere le cellule di HIBCPP con l'aiuto di 3 mL di tripsina-EDTA allo 0,25%. Questo passaggio dura circa 10-20 minuti a 37 °C. Nel frattempo, avvolgi la fiaschetta per assicurare il completo ricoprire lo strato cellulare con tripsina-EDTA.
    5. Aggiungi 7 mL di mezzo HIBCPP e centrifuga a 50 x g per 10 minuti a RT.
    6. Risospendere il pellet cellulare in 30 mL di mezzo al 10% di HIBCPP e distribuire in 3 nuove fiasche di T75.
    7. Coltivare le cellule fino al 90% di confluenza; Le cellule raggiungeranno la confluenza in circa una settimana.
    8. Cambia il mezzo due volte a settimana.
      NOTA: Le cellule HIBCPP non sono inibite dalla crescita; di pertanto, la fiaschetta diventerà confluente e le cellule continueranno a crescere formando strati multipli.
  3. Semina di cellule HIBCPP in coltura invertita
    1. Rimuovi il mezzo di coltura dalla fiaschetta T75.
    2. Lava le cellule una volta con 10 mL di PBS.
    3. Rimuovi il PBS.
    4. Distogliere le cellule di HIBCPP con l'aiuto di 3 mL di tripsina-EDTA allo 0,25%. Questo passaggio dura circa 10-20 minuti a 37 °C. Nel frattempo, avvolgi la fiaschetta per assicurare il completo ricoprire lo strato cellulare con tripsina-EDTA.
    5. Nel frattempo, prepara gli inserti del filtro. Inserire i filtri a 12 pozzi in orientamento capovolto in una piastra di coltura cellulare a 6 pozzi con l'aiuto di pinze e riempire con un mezzo HIBCPP al 10% preriscaldato. Pre-bagna la membrana con una goccia di substrato sopra ogni inserto filtrante.
    6. Sospenso le cellule tripsinizzate con 17 mL di mezzo al 10% di HIBCPP.
    7. Centrifugare a 50 x g per 10 minuti a RT e regolare le celle HIBCPP a una concentrazione di 1 × 106 cellule/mL.
      NOTA: Le celle HIBCPP tendono a formare piccoli agglomerati. Non è necessario scioglierli completamente prima di seminarli sugli inserti filtranti. Assicurati che il 90% delle celle siano singole.
    8. Seed delle celle HIBCPP in modo invertito su inserti filtranti a 12 pozzi con una densità di 4 × 10 celleda 5 per inserto.
    9. Aspetta che la sospensione cellulare venga rimossa dalla membrana. Chiudi il coperchio della piastra di cultura cellulare a 6 pozzi.
    10. Metti le piastre con gli inserti rovesciati nell'incubatrice.
    11. 24 ore dopo la semina, si girano gli inserti con l'aiuto delle pinze nella loro orientazione corretta in una nuova piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti. Inserire 2 mL di mezzo al 10% di HIBCPP nel compartimento inferiore e 1 mL nel compartimento superiore.
    12. Lasciare le cellule per 5-6 giorni senza alcun cambiamento del substrato, e iniziare la determinazione del TEER e la preparazione della co-coltura.

2. Determinazione del TEER

NOTA: La determinazione dei valori TEER viene effettuata con l'aiuto di un MilliCell ERS2 e di un elettrodo per bacchette. Per il calcolo è necessaria una misurazione in bianco tramite filtro per coltura cellulare inserita in un mezzo senza celle (Ohm blank).

  1. Conserva l'elettrodo delle bacchette asciutto. Prima di iniziare la misurazione, metti l'elettrodo nell'etanolo all'80% per 10 minuti per la disinfezione.
  2. Dopodiché, risciacqua l'elettrodo con PBS.
  3. Inizio della misurazione: inserisci l'estremità lunga dell'elettrodo nel pozzo e l'estremità corta dell'elettrodo nell'inserto filtro contenente le celle iniziate.
  4. Registra il valore di Ohm dell'inserimento del filtro di coltura cellulare a 12 pozzi (campione di Ohm).
  5. Calcola il TEER come segue: Ohm·cm2 = (Ohm campione -Ohm vuoto) × 1,1 cm2.
  6. Dopo aver terminato la misurazione, risciacqua l'elettrodo con etanolo all'80% e poi conserva l'asciutto.
    NOTA: Tra una misurazione di diverse condizioni sperimentali o di diverse linee cellulari, l'elettrodo delle bacchette deve essere disinfettato e risciacquato con PBS per prevenire la contaminazione incrociata.

3. iHCPEnC

  1. Portare iHCPEnC nella cultura
    1. Scongela una fiala di iHCPEnC a RT.
    2. Risospendere il contenuto della fiala con 5 mL preriscaldati di Complete Classic Endothelial Medium (iHCPEnC).
    3. Centrifuga a 500 g per 5 minuti a RT.
    4. Nel frattempo, ricoprire una fiaschetta di coltura di cellule T25 con 2 mL di fattore di attacco per circa 1 minuto. Aspira il fattore di attaccamento e lascia la fiaschetta fino a quando non si semina l'iHCPEnC.
    5. Sospendere il pellet cellulare con 5 mL di mezzo iHCPEnC e inserirlo nella fiaschetta di coltura T25 preparata.
    6. Incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per 1 settimana senza cambiare il mezzo.
  2. Coltura continua di iHCPEnC
    NOTA: Per coltura continua, dividere iHCPEnC 1:4 in nuove fiasche per coltura cellulare T25.
    1. Rimuovi il mezzo iHCPEnC e lava le cellule una volta con 3 mL di PBS. Fai attenzione a evitare il distacco delle cellule.
    2. Aspira il PBS.
    3. Distacco iHCPEnC confluente con l'aiuto di 1 mL di Tripsina-EDTA. Questo passaggio richiede circa 3-5 minuti in RT.
    4. Risospendere le cellule in 5 mL di mezzo iHCPEnC.
    5. Centrifuga a 500 g per 5 minuti a RT.
    6. Nel frattempo, ricopri 4 nuove fiaschette T25 con 2 mL di fattore di attaccamento per fiaschetta.
    7. Risospendere il pellet cellulare con 20 mL di mezzo iHCPEnC.
    8. Distribuire 5 mL della sospensione della cella a ciascuna delle 4 fiaschette preparate.
    9. Ancora una volta, coltivare le cellule per una settimana senza alcun cambiamento di substrato. Raggiungeranno la confluenza in una settimana.
      NOTA: le cellule iHCPEnC sono inibite dalla crescita; di conseguenza, la fiaschetta diventerà confluente e le cellule rimanenti galleggeranno.

4. Preparativi per esperimenti di co-coltura

  1. Metodo 1: Per la "co-coltura diretta" (coltivazione delle cellule epiteliali e endoteliali su entrambi i lati di un stesso inserto), non preparare ulteriori interventi.
  2. Metodo 2: Per il metodo "membrane-in-insert", esegui i seguenti passaggi:
    1. Perforare membrane di 12 pozzi di dimensioni di inserimento di filtro per coltura cellulare con l'aiuto di un ferro perforante n. 11 (corrispondente a un diametro di 11 mm) da una membrana Din-A-4 separata.
    2. Metti membrane perforate in una piastra di Petri.
    3. Sterilizza le membrane perforate per 60 minuti usando luce ultravioletta (UV-C, 254 nm).
      NOTA: Le membrane di filtro di coltura cellulare a 12 pozzi, di dimensioni inserite, possono essere preparate in anticipo e conservate in condizioni sterili.

5. Creazione della co-cultura

NOTA: A questo stadio, le cellule HIBCPP sono già preparate per il modello di coltura in vitro a due tipologie cellulari. Le cellule HIBCPP sono state coltivate per 5-6 giorni (confronta i passaggi 1.3.8-1.3.12). Le cellule HIBCPP dovrebbero iniziare a sviluppare un TEER (circa 20 Ohm·cm 2).

  1. Per entrambi, il Metodo 1 ("co-coltura diretta") e il Metodo 2 ("membrana nell'inserto") sostituiscono il mezzo al 10% di HIBCPP con un mezzo all'1%. A tal fine, si inseriscono 2 mL di mezzo HIBCPP all'1% in un pozzo di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzi.
  2. Svuotare l'inserto filtro contenente coltura invertita con l'aiuto di una pipetta e delle pinze, e inserire l'inserto filtrante in orientamento standard nel 12-pozzo preparato.
  3. Per il Metodo 2 ("membrane-in-insert"), preparare gli inserti del filtro come segue:
    1. Inserire la membrana perforata e sterilizzata in un inserto filtro a 12 pozzi preparato con cellule HIBCPP in coltura invertita con l'aiuto di pinze.
  4. Rimettere le piastre di coltura cellulare nell'incubatore per la tripsinizzazione dell'iHCPEnC (descritta al passo 6).

6. Semina e coltivazione di iHCPEnC in co-cultura

NOTA: Nella sezione seguente viene descritta la creazione di una co-coltura di cellule HIBCPP e iHCPEnC su inserti di filtro di coltura cellulare a 12 pozzi. Un protocollo dettagliato per la co-coltura di cellule HIBCPP e iHCPEnC su inserti di filtri di coltura cellulare a 24 pozzi è stato descrittoin precedenza 8. Prima di staccare iHCPEnC, calcola quante cellule sono necessarie per eseguire la co-coltura. Una fiaschetta di coltura di cellule T25 confluente fornirà una quantità approssimativa di 5 × 105 cellule.

  1. Rimuovere il mezzo di una fiaschetta T25 confluente contenente iHCPEnC.
  2. Lava iHCPEnC con 3 mL di PBS. Evita il distacco delle cellule.
  3. Rimuovi il PBS.
  4. Distacco iHCPEnC confluente con l'aiuto di 1 mL di Tripsina-EDTA. Questo passaggio richiede circa 3-5 minuti in RT.
  5. Risospendere le cellule in una fiaschetta da 5 mL/T25 con mezzo iHCPEnC.
  6. Contare le celle in una camera di Neubauer.
  7. Centrifuga a 500 × g per 5 minuti a RT.
  8. Risospendere il pellet cellulare a una concentrazione finale di 1 × 105 cellule/mL in un mezzo iHCPEnC.
  9. Sia il Metodo 1 ("co-coltura diretta") sia il Metodo 2 ("membrana nell'inserto"): seed 700 μL iHCPEnC (7x105 cellule) in un inserimento filtrante a 12 pozzi.
  10. Monitorare i valori TEER della co-coltura e dei controlli (cioè colture solo di cellule HIBCPP e iHCPEnC) per la prima volta 24 ore dopo la semina di iHCPEnC e successivamente ogni giorno.

7. Trattamento LPS

NOTA: Le co-colture dovrebbero presentare valori TEER più elevati rispetto alle colture solo cellulari HIBCPP (fattore suggerito: 1,5 o superiore).

  1. Misurare e registrare i valori TEER degli inserti di coltura cellulare preparati per gli esperimenti.
  2. Prepara un master mix contenente 5 μg/mL LPS in un mezzo HIBCPP all'1%.
  3. Preparare nuove piastre a 12 pozzi contenenti 2 mL di mezzo HIBCPP al 1% per pozzo.
  4. Svuota gli inserti con l'aiuto di pinze e pipette.
  5. Posizionare gli inserti nei pozzi preparati.
  6. Aggiungi rispettivamente 1 mL del master mix LPS o un mezzo HIBCPP all'1% (controllo negativo).
  7. Incubare per 4 ore a 37 °C.
  8. Misurare e registrare i valori TEER prima di procedere alla sezione 8.

8. Isolamento separato dell'RNA dalle cellule HIBCPP e da iHCPEnC per un'analisi trascrizionale successiva

NOTA: Per ottenere due frazioni cellulari separate ed evitare la contaminazione incrociata da cellule coltivate nel modello di co-coltura, le frazioni cellulari vengono accuratamente raschiate dall'inserto separatamente. Eseguire tutti i passaggi dell'isolamento dell'RNA per ogni inserto filtro senza interruzioni (gli inserti non possono esaurirsi).

  1. Lava gli inserti del filtro una volta con PBS. A tal fine, preparare piastre di coltura cellulare a 12 pozzi contenenti 1,5 mL PBS/pozzo.
  2. Svuota gli inserti del filtro per coltura cellulare con l'aiuto di una pipetta e delle pinze. Inserire gli inserti nella piastra di coltura cellulare a 12 pozzi riempita di PBS.
  3. Aggiungi 1 mL di PBS nei inserti.
  4. Per preparare le cellule iHCPEnC e HIBCPP per il Metodo 1 ("co-coltura diretta"), esegui i seguenti passaggi:
    1. Rimuovi il PBS dall'inserto e mettilo in una piastra di coltura cellulare vuota e asciutta da 12 pozzi.
    2. Con l'aiuto di una punta di pipetta e la pipettatura su e giù di 10-20 μL di PBS, gli iHCPEnC vengono staccati dall'inserto tramite raschiamento.
    3. Inserire questa frazione cellulare in un tubo da 1,5 mL contenente 350 μL di tampone di lisi di RNA. Pipetta su e giù per mescolare correttamente le cellule con il buffer di lisi dell'RNA.
    4. Dopo il raccolto della frazione iHCPEnC, girare l'inserto al contrario nel coperchio di una piastra di coltura cellulare.
    5. Rimuovere le cellule di HIBCPP dalla membrana proprio come la frazione iHCPEnC e inserirle in un tubo preparato da 1,5 mL contenente 350 μL di RLT-β-mercaptoetanolo.
      NOTA: Se sono preparate più co-colture per una condizione, si assumono 350 μL di tampone di lisi di RNA per ogni inserto e frazione cellulare. Le frazioni di singola cellula preparata di una condizione specifica vengono purificate consecutivamente sulla stessa colonna.
  5. Per preparare le cellule iHCPEnC e HIBCPP per il Metodo 2 ("membrane-in-insert"), esegui i seguenti passaggi:
    1. Rimuovi la membrana aggiuntiva con l'aiuto di una pinza e mettila in un coperchio asciutto di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzi. Pipetta 100 μL di tampone di lisi RNA sulla membrana per la lisi di iHCPEnC.
    2. Inserire questi 100 μL lisato in un tubo da 1,5 mL contenente 250 μL di tampone di lisi di RNA e mescolare bene.
    3. Rimuovi il PBS dall'inserto del filtro e mettilo a testa in su nel coperchio di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzi. Aggiungere 100 μL di buffer di lisi RNA sulla membrana dell'inserto e lisare la frazione cellulare HIBCPP.
    4. Inserire questo lisato da 100 μL in un tubo da 1,5 mL contenente 250 μL di tampone di lisi di RNA.
  6. Esegui l'isolamento dell'RNA secondo il protocollo del produttore.
  7. Misura la quantità di RNA usando uno spettrofotometro.
  8. Eseguire trascrizione inversa e analisi qPCR dei campioni di RNA come descritto dal produttore.
    NOTA: Poiché le co-colture contengono quantità minori di iHCPEnC rispetto alle cellule HIBCPP, sono necessari diversi inserti filtranti a 12 pozzi per l'isolamento di una quantità sufficiente di RNA da iHCPEnC, a seconda dell'analisi successiva. I lisati di RNA degli inserti filtranti distinti devono essere aggregati. La trascrizione inversa e la qPCR possono essere eseguite come descrittoin precedenza 6.

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Risultati

In questo protocollo, descriviamo la generazione passo dopo passo di un modello di tipo a due cellule della CP umana costituito da epitelio (cellule HIBCPP) ed endotelio (iHCPEnC) su inserti di filtri per coltura cellulare, come mostrato schematicamente nella Figura 1. In questo sistema modello, le celle HIBCPP vengono coltivate in modo invertito sul lato inferiore del filtro, mentre le iHCPEnC vengono inserite o sul lato superiore del filtro dell'inserto o ...

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Discussione

La PC umana è composta da diversi tipi cellulari, tra cui un epitelio formatore di barriera e un endotelio della vascolarizzazioneestesa 3. Sebbene le cellule endoteliali della CP siano fenestrate, ricerche recenti hanno dimostrato il loro contributo alla funzione barriera al BCSFB 4,7. Per studiare le interazioni complesse tra endotelio ed epitelio negli organi come la CP, sono necessari modelli in vi...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% Tripsina-EDTALife Technologies 25200056
piastra di coltura cellulare a 12 pozzi  StarLabCC7682-7512
Inserti filtri a 12 pozzi (3 & micro; M pores)Greiner Bio One665631
piastra di coltura cellulare a 24 pozzi  StarLabCC7672-7524
inserimento filtro a 24 pozzi   (0.4 & micro; M pores)Greiner Bio One662641
Inserimento filtro a 24 pozzi (3 & micro; M pores)Greiner Bio One662631
Placca di coltura cellulare a 6 pozzi  StarLabCC7682-7506
Kit di sintesi cDNA AffinityScript (sintesi cDNA)Agilent600559
Fattore di attaccamentoSistemi Cellulari4ZO-500Fa parte del kit Complete Classic Endothelial Medium.
Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix (PCR in tempo reale)Agilent600828
Elettrodo a bacchetteMilliporeMERSSTX01Questo prodotto è stato dismesso.
Mezzo endoteliale classico completo (medium iHCPEnC)Sistemi Cellulari4ZO-500Kit contenente un substrato, integratori e fattore di attacco per il rivestimento.
DMEM/F-12 (1:1) con fenolo (medium HIBCPP al 10%)Thermo Fisher31330-038
DMEM/F-12 (1:1) senza fenoloredo (medio HIBCPP all'1%)Thermo Fisher11039-021
Siero per vitelli fetali (FCS) (1% e 10% HIBCPP medium)Thermo Fisher10270-106
Insulina (1% e 10% HIBCPP media)SigmaI9278
Lipopolisaccaride (LPS)SigmaL3024
MilliCell ERS2 MilliporeMERS00002Questo prodotto è stato dismesso.
Nanodrop (Spettrofotometro)Thermo ScientificND1000Questo prodotto è stato dismesso.
Ferro perforante n. 11Wü rth880223211
PBSLife Technologies 14190169
Strumento per la progettazione degli innelliNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Primers SigmaVC00021
Qiagen RNeasy microQiagen74004
RLT+b-ME (parte del micro kit Qiagen Rneasy)Qiagen74004
Fiaschetta di coltura cellulare T25Sarstedt AG & Co KG83,39,10,002
Fiaschetta di coltura cellulare T75Sarstedt AG & Co KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3.0 cc (membrana separata)SabeuSK4580
Luce UVCarl RothH469.1

Riferimenti

  1. Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiol Rev. 93 (4), 1847-1892 (2013).
  2. Schwerk, C., Schroten, H. In vitro models of the choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier: advances, applications, and perspectives. Hum Cell. 37 (5), 1235-1242 (2024).
  3. Ghersi-Egea, J. F., et al. Molecular anatomy and functions of the choroidal blood-cerebrospinal fluid barrier in health and disease. Acta Neuropathol. 135 (3), 337-361 (2018).
  4. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  5. Carloni, S., Rescigno, M. Unveiling the gut-brain axis:structural and functional analogies between the gut and the choroid plexus vascular and immune barriers. Semin Immunopathol. 44 (6), 869-882 (2022).
  6. Denzer, L., et al. Transcriptome and functional comparison of primary and immortalized endothelial cells of the human choroid plexus at the blood-cerebrospinal fluid barrier. Int J Mol Sci. 26 (4), 1779(2025).
  7. Muranyi, W., et al. Immortalized human choroid plexus endothelial cells enable an advanced endothelial-epithelial two-cell type in vitro model of the choroid plexus. iScience. 25 (6), 104383(2022).
  8. Herold, R., et al. Protocol for the setup and use of a human choroid plexus endothelial-epithelial two-cell-type in vitro model. STAR Protoc. 3 (4), 101816(2022).
  9. Dinner, S., et al. A choroid plexus epithelial cell-based model of the human blood-cerebrospinal fluid barrier to study bacterial infection from the basolateral side. J Vis Exp. (111), e54061(2016).
  10. Herold, R., et al. Capsule-dependent impact of MAPK signalling on host cell invasion and immune response during infection of the choroid plexus epithelium by Neisseria meningitidis. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 53(2021).
  11. Bernd, A., et al. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plexus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. 32 (9), 2973-2982 (2015).
  12. Dabbagh, F., Schroten, H., Schwerk, C. In vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier and their applications in the development and research of (neuro)pharmaceuticals. Pharmaceutics. 14 (8), 1729(2022).
  13. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nat Rev Neurosci. 16 (8), 445-457 (2015).
  14. Zhang, W. Y., Liu, Y., Zhang, H. Extracellular matrix: an important regulator of cell functions and skeletal muscle development. Cell Biosci. 11 (1), 65(2021).
  15. Clark, A. J., et al. Functional imaging in microfluidic chambers reveals sensory neuron sensitivity is differentially regulated between neuronal regions. Pain. 159 (7), 1413-1425 (2018).
  16. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  17. Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: from descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), eaal2379(2017).
  18. Furtado, A., et al. Circadian rhythmicity of amyloid-beta-related molecules is disrupted in the choroid plexus of a female Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci Res. 101 (4), 524-540 (2023).
  19. Borkowski, J. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving IκBζ in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163(2014).
  20. Wiatr, M., et al. Distinct migratory pattern of naive and effector T cells through the blood-CSF barrier following Echovirus 30 infection. J Neuroinflammation. 16 (1), 232(2019).
  21. Speidel, A., et al. Transmigration of Trypanosoma brucei across an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier. iScience. 25 (4), 104014(2022).
  22. Haas, J., et al. The choroid plexus is permissive for a preactivated antigen-experienced memory B-cell subset in multiple sclerosis. Front Immunol. 11, 618544(2020).
  23. Nishihara, H., et al. Human CD4+ T cell subsets differ in their abilities to cross endothelial and epithelial brain barriers in vitro. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 3(2020).
  24. Erb, U., Schwerk, C., Schroten, H., Karremann, M. Review of functional in vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier in leukaemia research. J Neurosci Methods. 329, 108478(2020).
  25. Ho, K. H., et al. Activation of Wnt/β-catenin signaling is critical for the tumorigenesis of choroid plexus. Neuro Oncol. 27 (1), 106-122 (2025).
  26. Wagenaars, F., et al. Characterization of thyroid hormone transport in a human choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP) as an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier model. Mol Cell Endocrinol. 597, 112449(2025).
  27. Di Tommaso, N., Santopaolo, F., Gasbarrini, A., Ponziani, F. R. The gut-vascular barrier as a new protagonist in intestinal and extraintestinal diseases. Int J Mol Sci. 24 (2), 1470(2023).

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