L'idrossicartamo giallo A (HSYA) mitiga l'artrosi del ginocchio migliorando l'autofagia e la proliferazione dei condrociti e sopprimendo l'apoptosi e l'infiammazione attraverso l'inibizione della via HIF-1α/BNIP3.
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Articolo di ricerca
L'idrossicartamo giallo A (HSYA) mitiga l'artrosi del ginocchio migliorando l'autofagia e la proliferazione dei condrociti e sopprimendo l'apoptosi e l'infiammazione attraverso l'inibizione della via HIF-1α/BNIP3.
La riduzione dell'autofagia nel tessuto cartilagineo è strettamente legata allo sviluppo dell'osteoartrite del ginocchio (KOA), ma i meccanismi attraverso i quali il giallo cartamo ossidrico A (HSYA) esercita effetti protettivi rimangono non completamente compresi. In questo studio, i condrociti KOA umani sono stati isolati e assegnati a diversi gruppi di trattamento, tra cui controllo normale, modello bianco, HSYA, inibitore del fattore 1α inducibile dall'ipossia (HIF-1α), induttore dell'autofagia, HSYA combinato con inibitore di HIF-1α e HSYA combinato con induttore dell'autofagia. Le citochine proinfiammatorie (IL-1β, TNF-α, IL-6) sono state quantificate mediante ELISA, l'espressione proteica di HIF-1α, BNIP3 e marcatori correlati all'autofagia è stata esaminata mediante Western blotting e le vescicole autofagiche nei mitocondri sono state valutate utilizzando la colorazione monodansilcadaverina e la microscopia elettronica a trasmissione. Rispetto al controllo normale, il gruppo modello in bianco ha mostrato livelli significativamente aumentati di IL-1β, TNF-α, IL-6 e HIF-1α, accompagnati da tassi di apoptosi più elevati, ridotta proliferazione e sottoregolazione delle proteine correlate all'autofagia (P < 0,05). Il trattamento con HSYA, inibitore di HIF-1α o induttore dell'autofagia ha aumentato significativamente l'espressione proteica correlata all'autofagia e ridotto i livelli di citochine infiammatorie. Inoltre, l'HSYA combinato con l'inibitore di HIF-1α o l'induttore dell'autofagia ha prodotto gli effetti più pronunciati, con marcate riduzioni del rilascio di citochine e dell'apoptosi, insieme a un aumento della proliferazione dei condrociti e della formazione di vescicole autofagiche mitocondriali (P < 0,05). Questi risultati dimostrano che l'HSYA esercita effetti condroprotettivi nella KOA, almeno in parte, attraverso l'inibizione della via HIF-1α/BNIP3, promuovendo così l'autofagia e attenuando il danno infiammatorio nei condrociti.
Essendo una condizione ortopedica cronica prevalente, l'artrosi del ginocchio (KOA) colpisce individui di mezza età e anziani, con un impatto significativo sulla loro qualità di vita 1,2. Nonostante la sua diffusione, l'eziologia precisa e i meccanismi fisiopatologici alla base della KOA rimangono poco compresi. Inoltre, sia per la prevenzione che per il trattamento curativo, sottolinea l'urgenza di svelare le intricate basi patologiche di questa condizione. Un'area di interesse emergente è il ruolo dell'autofagia nell'omeostasi della cartilagine, con prove crescenti che suggeriscono che la ridotta autofagia all'interno del tessuto cartilagineo contribuisce alla sua degenerazione nella KOA 3,4.
L'autofagia, un processo di degradazione cellulare vitale per il mantenimento dell'omeostasi cellulare, è di grande importanza nel mantenimento e nella riparazione della cartilagine. Nel microambiente ipossico prevalente all'interno della cartilagine articolare, la via di segnalazione del fattore 1α inducibile dall'ipossia (HIF-1α)/proteina 3 interagente dell'adenovirus E1B 19 kDa (BNIP3) emerge come regolatore fondamentale dell'autofagia. Un'elevata espressione di HIF-1α è stata osservata nei pazienti con KOA, suggerendo che la disregolazione di questa via può contribuire alla compromissione dell'autofagia e alla successiva degenerazione della cartilagine 5,6,7.
L'agopuntura, la moxibustione, le erbe e il massaggio sono quattro metodi classici della medicina tradizionale cinese per il trattamento dell'artrite del ginocchio. I trattamenti attuali, come i farmaci antinfiammatori non steroidei, le iniezioni di acido ialuronico e l'artroplastica, si sono dimostrati utili ma anche associati ad alcuni effetti collaterali8. Inoltre, non esiste un trattamento di routine raccomandato per l'artrosi del ginocchio. Nel corso del tempo, come terapia complementare comune per la KOA, la Medicina Tradizionale Cinese (MTC) ha sviluppato numerosi rimedi erboristici che si mostrano promettenti nel trattamento della KOA9. Tra questi, il giallo cartamo ossidrile-A ha attirato un'attenzione significativa grazie alle sue proprietà antinfiammatorie e modulanti dell'autofagia10,11. Tuttavia, i meccanismi esatti con cui l'HSYA esercita la sua influenza terapeutica sull'osteoartrite del ginocchio (KOA), in particolare in termini di regolazione dell'autofagia attraverso la via HIF-1α/BNIP3, rimangono incerti. Pertanto, studiamo il meccanismo degli effetti terapeutici dell'HSYA nella KOA, concentrandoci sul suo impatto sull'autofagia dei condrociti e sulla sua interazione con la via HIF-1α/BNIP3. Ipotizziamo che l'HSYA mitighi l'osteoartrite del ginocchio migliorando l'autofagia e la proliferazione dei condrociti, sopprimendo l'apoptosi e l'infiammazione attraverso l'inibizione della via HIF-1α/BNIP3.
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Tutte le procedure che coinvolgono campioni umani sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale Centrale del Popolo di Zhanjiang (Approvazione n. KY-YS-2021-09). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima della raccolta del campione. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Pazienti e disegno dello studio
Sono stati reclutati trenta pazienti con diagnosi di artrosi del ginocchio (KOA) e sottoposti ad artroplastica totale del ginocchio. La coorte comprendeva 14 maschi e 16 femmine, di età compresa tra 52 e 75 anni (media ± DS: 64,3 ± 12,6 anni), tutti soddisfacevano i criteri12 dell'American College of Rheumatology KOA. I pazienti sono stati esclusi se avevano ricevuto farmaci antinfiammatori non steroidei o steroidi entro 2 settimane prima dell'intervento chirurgico o iniezioni intra-articolari entro 1 mese.
2. Coltura primaria di condrociti
La cartilagine articolare è stata raccolta in condizioni sterili immediatamente dopo l'intervento chirurgico e posta in PBS freddo. Utilizzando bisturi sterili, la cartilagine è stata tagliata in frammenti di ~1 mm³ su una lastra di vetro ghiacciata e trasferita in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 10 ml di tripsina-EDTA allo 0,25%. La provetta è stata incubata in un bagno d'acqua agitato a 37 °C a 80 giri/min per 30 minuti e capovolta delicatamente ogni 5 minuti per facilitare la digestione. Il surnatante è stato aspirato e il pellet di tessuto è stato lavato una volta con PBS e centrifugato a 200 × g per 5 minuti. Il pellet è stato quindi risospeso in 10 mL di collagenasi di tipo II allo 0,02% e digerito a 37 °C per 4 ore con agitazione. La sospensione è stata pipettata su e giù ogni 30 minuti per favorire la dissociazione, fatta passare attraverso un filtro da 70 μm e centrifugata nuovamente a 200 × g per 5 minuti. Il pellet risultante è stato risospeso in DMEM integrato con FBS al 10%, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina e seminato in fiasche T25. Le cellule sono state incubate a 37 °C con CO2 al 5%, il terreno è stato sostituito ogni 2-3 giorni e le cellule dei passaggi 1-2 sono state utilizzate per gli esperimenti. I gruppi sperimentali includevano il controllo normale, il modello in bianco, HSYA (100 μmol/L), l'inibitore di HIF-1α YC-1 (10 μmol/L), la rapamicina (10 nmol/L), HSYA + YC-1 e HSYA + rapamicina.
3. HIF-lα mediato da siRNA, knockdown di BNIP3
I condrociti primari sono stati seminati in piastre a 6 pozzetti a 2-5 × 105 cellule/pozzetto e coltivati a 37 °C fino a raggiungere la confluenza del 30%-50%. Per ogni pozzetto, 5 μL di 20 μM di siRNA sono stati diluiti in 250 μL di Opti-MEM e 5 μL di reagente di trasfezione a base lipidica sono stati diluiti separatamente in 250 μL di Opti-MEM. Le due soluzioni sono state delicatamente miscelate e incubate a temperatura ambiente per 15-20 minuti per formare complessi. Il terreno di coltura è stato sostituito con 1,5 mL di DMEM fresco con il 10% di FBS e il complesso siRNA-lipidi (500 μL) è stato aggiunto goccia a goccia lungo la parete del pozzetto con un leggero vortice. Le cellule sono state incubate per 6 ore, il terreno è stato sostituito con un terreno completo e la coltura è stata continuata per 48-72 ore. L'efficienza del knockdown è stata verificata mediante qRT-PCR e Western blot prima di ulteriori trattamenti.
4. ELISA
I surnatanti delle colture cellulari sono stati raccolti, centrifugati a 200 × g per 5 minuti e, se necessario, diluiti 1:2 in tampone di saggio. I kit ELISA per IL-1β, TNF-α e IL-6 sono stati utilizzati secondo il protocollo del produttore. Standard, bianchi e campioni sono stati eseguiti in triplice copia. Dopo la reazione del substrato, l'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre entro 15 minuti.
5. Saggio MTT
I condrociti sono stati seminati in piastre a 96 pozzetti a 5.000 cellule/pozzetto in 100 μL di terreno completo e incubati per 0 ore, 24 ore, 48 ore o 72 ore. Ad ogni punto temporale, 20 μL di soluzione MTT (5 mg/mL in PBS) sono stati aggiunti direttamente a ciascun pozzetto e le piastre sono state incubate a 37 °C per 30 minuti fino a quando i cristalli viola di formazan sono diventati visibili sul fondo dei pozzetti. Il surnatante è stato aspirato con cura senza disturbare i cristalli, 150 μL di DMSO sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e le piastre sono state poste su un agitatore a 100 giri/min per 10 minuti per sciogliere completamente i cristalli. L'assorbanza è stata misurata a 490 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Il breve tempo di incubazione è stato scelto per evitare la saturazione del segnale in cellule altamente metabolicamente attive.
6. Citometria a flusso
Le cellule sono state raccolte mediante tripsinizzazione, centrifugate a 200 × g per 5 minuti e lavate due volte con PBS freddo. Sono stati risospesi in 500 μL di tampone legante a ~1 × 106 cellule/mL e sono stati aggiunti 5 μL di annessina V-FITC e 5 μL di PI. Dopo una delicata miscelazione, le cellule sono state incubate per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. I campioni sono stati analizzati su un citometro a flusso, con almeno 10.000 eventi raccolti per campione (eccitazione 488 nm, emissione FITC 530/30 nm, PI > 600 nm). Le cellule apoptotiche sono state quantificate utilizzando un software standard.
7. Western blotting
Le cellule sono state risciacquate due volte con PBS freddo e lisate in 200 μL di tampone RIPA contenente inibitori della proteasi su ghiaccio per 30 minuti. Le cellule sono state raschiate con un raschietto di plastica, pipettate su e giù per ridurre la viscosità e centrifugate a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Sono stati raccolti surnatanti e le concentrazioni proteiche sono state misurate utilizzando il test BCA. Quantità uguali di proteine (30 μg) sono state miscelate con un tampone di carico al 5×, riscaldate a 95 °C per 5 minuti e separate su gel SDS-PAGE al 10%-12%. L'elettroforesi è stata eseguita a 80 V per l'impilamento e a 120 V per la separazione, e le proteine sono state trasferite su membrane in PVDF a 300 mA per 90 minuti. Le membrane sono state bloccate in latte scremato al 5% per 1 ora a temperatura ambiente e incubate per una notte a 4 °C con anticorpi primari (1:1.000). Dopo tre lavaggi con TBST, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con HRP (1:5.000) per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate con substrato ECL e visualizzate utilizzando un sistema di rilevamento a chemiluminescenza con un'esposizione di 30-120 s. Le intensità di banda sono state quantificate utilizzando ImageJ e GAPDH è stato utilizzato come controllo del caricamento.
8. Colorazione con monodansilcadaverina (MDC)
Una soluzione di lavoro MDC da 50 μM è stata preparata dalla soluzione madre immediatamente prima dell'uso. Le cellule sono state fissate con 1 mL di paraformaldeide al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente, lavate due volte con PBS e incubate con 500 μL di soluzione di lavoro MDC per 30 minuti a 37 °C al buio. Dopo due lavaggi con PBS, i vetrini coprioggetti sono stati montati con un mezzo di montaggio anti-dissolvenza e osservati al microscopio a fluorescenza (eccitazione 355 nm, emissione 512 nm).
9. Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
Le cellule sono state raccolte e pellettate mediante centrifugazione a 200 × g per 5 minuti, quindi fissate in glutaraldeide al 2% a 4 °C durante la notte. I campioni sono stati lavati tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno e post-fissati in tetrossido di osmio all'1% per 1 ora a 4 °C in una cappa aspirante. La disidratazione è stata eseguita attraverso una serie graduata di acetoni del 30%, 50%, 70%, 90% e 100% per 10 minuti ciascuno. I campioni sono stati infiltrati con acetone/resina epossidica 1:1 per 1 ora e poi con resina pura per una notte. L'inclusione è stata eseguita in resina fresca e polimerizzata a 60 °C per 48 ore. Sezioni ultrasottili di 50-70 nm sono state tagliate con un ultramicrotomo, montate su griglie di rame da 200 maglie, colorate con acetato di uranile al 2% per 30 minuti seguito da citrato di piombo per 15 minuti, lavate con acqua distillata, essiccate all'aria ed esaminate al microscopio elettronico a trasmissione a 80 kV. Come nota di sicurezza, la glutaraldeide e il tetrossido di osmio sono tossici e volatili e devono essere maneggiati solo in una cappa aspirante con guanti e occhiali protettivi. I rifiuti devono essere smaltiti in contenitori pericolosi designati secondo i protocolli di sicurezza istituzionali.
10. Analisi statistica
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia. La significatività statistica è stata valutata utilizzando l'ANOVA unidirezionale seguita dal test post-hoc LSD, con P ±< 0,05 considerato significativo.
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Effetto di HSYA sull'espressione delle citochine pro-infiammatorie dei condrociti (IL-1β, TNF-α, IL-6)
Rispetto al gruppo di controllo normale, tutti gli altri gruppi hanno mostrato livelli significativamente elevati di citochine pro-infiammatorie (IL-1β, TNF-α e IL-6) (P < 0,05, Tabella 1, Figura 1A-G). Il trattamento con HSYA, inibitore di HIF-1α, induttore dell'autofagia, inibitore HSYA + HIF-1α o induttore dell'aut...
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L'osteoartrite (OA), una malattia cronica prevalente, compromette significativamente la qualità della vita dei pazienti. Tra i vari sottotipi di OA, la KOA è la più comune, contribuendo al carico globale della malattia. Nonostante la sua elevata incidenza, l'eziologia precisa e i meccanismi fisiopatologici sottostanti della KOA rimangono sfuggenti. L'intricata interazione tra processi meccanici e biochimici all'interno della cartilagine articolare, in particolare la regolazione della fun...
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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Ufficio di Medicina Tradizionale Cinese della Provincia del Guangdong
(Sovvenzione n. 20221446).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tetrossido di osmio all'1% | Scienze della microscopia elettronica | 19150 | Ulteriori correzioni e colorazioni campioni per l'analisi TEM |
| 2% di glutaraldeide | Sigma-Aldrich | G5882 | Corregge le cellule per la preparazione del campione TEM |
| 4% Paraformaldeide | Servicebio | G1101 | Corregge le cellule per la colorazione MDC e la preparazione dei campioni TEM |
| AG1478 | Selleck Corporation | S1005 | Iniezione endovenosa da 20 mg/kg, inibitore della chinasi del recettore ErbB nel modello ratto |
| Kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-FITC/PI | Biopalude | BS3030 | Colora le cellule apoptotiche per il rilevamento della citometria di flusso |
| Induttore di autofagia (RAPA) | Sigma Corporation | R0395 | Rapamicina, induttore di autofagia, utilizzata a 10 nmol/L in esperimenti con condrociti |
| Anticorpo di Beclin1 | Santa Cruz Biotecnologia | SC-48341 | Anticorpo primario per la rilevazione del Western blot della proteina correlata all'autofagia Beclin1 |
| Anticorpo BNIP3 | Santa Cruz Biotecnologia | SC-517348 | Anticorpo primario per la rilevazione del Western blot di BNIP3 |
| Incubatore a anidride carbonica | Yiheng | BPN-150CW | per la coltura cellulare |
| Dimetil Solfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Dissolve i cristalli di formazan nel saggio MTT |
| DMEM | Beyotime | C0001 | Mezzo di coltura cellulare, integrato con FBS al 10% per la coltura dei condrociti |
| Lettore di microplacche ELISA | Thermo Fisher Scientific | Multiskan FC | Misura i valori OD negli saggi ELISA e MTT |
| Reagente di Chimiluminescenza Potenziata (ECL) | Thermo Fisher Scientific | 32106 | Visualizza le bande proteiche nel Western blot |
| Resina epossidica (EPON812) | Scienze della microscopia elettronica | 14120 | Incorpora campioni per la sezionazione TEM |
| FBS | Beyotime | C0205 | Siero bovino fetale, aggiunto al DMEM per la nutrizione dei condrociti |
| Citometro di flusso | Beckman (menzionato per apoptosi) | CytoFLEX S | Rileva il tasso di apoptosi dei condrociti e i marcatori cellulari |
| Microscopio a fluorescenza | Olimpo | IX73 | Osserva vescicole autofagiche colorate con MDC |
| Sistema di imaging a gel | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Cattura e quantifica le bande proteiche dal Western blot |
| HIF-1 e alfa; Anticorpo | Santa Cruz Biotecnologia | SC-13515 | Anticorpo primario per la rilevazione del Western blot di HIF-1 e alfa; |
| HIF-1 e alfa; inibitore (YC-1) | Selleck Corporation | S1047 | HIF-1 e alfa; inibitore delle vie, usato a 10 e mu; mol/L negli esperimenti cellulari |
| Centrifuga refrigerata ad alta velocità | Eppendorf | 5430R | Utilizzato per separare componenti |
| Anticorpo secondario coniugato con HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | Si lega agli anticorpi primari per l'amplificazione del segnale nel Western blot |
| IL-1 e beta; ELISA Kit | Biologia dello Shenggong | C5236 | Quantifica IL-1 e beta; livelli nei supernatanti cellulari tramite ELISA |
| IL-6 ELISA Kit | Biologia dello Shenggong | C5237 | Quantifica i livelli di IL-6 nei supernatanti cellulari tramite ELISA |
| Anticorpo LC3 | Santa Cruz Biotecnologia | SC-398822 | Anticorpo primario per la rilevazione del Western blot della proteina correlata all'autofagia LC3 |
| Reagente lipofectamina 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | Reagente di trasfezione a base lipidica per la tansfezione |
| Monodansilcadaverina (MDC) | Sigma-Aldrich | D4008 | 0,05 mol/L, colora vescicole autofaghe per microscopia di fluorescenza |
| Reagente MTT | Beyotime | C0009 | 0,5 mg/mL, usata nel test MTT per valutare la proliferazione dei condrociti |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | determinare la concentrazione di RNA |
| NRG1 ELISA Kit | Abcam (Regno Unito) | ab213961 | Misura la concentrazione di NRG1 nei tessuti cardiaci tramite ELISA |
| Anticorpo P62 | Santa Cruz Biotecnologia | SC-28359 | Anticorpo primario per la rilevazione del Western blot della proteina correlata all'autofagia P62 |
| Anticorpo ErbB4 fosforilato (p-ErbB4) | Affinità | AF3445 | Anticorpo primario per la rilevazione da Western blot di ErbB4 attivata |
| Kit di reagenti PrimeScript RT | Takara | RR047A | Trascrizione inversa dell'RNA per fornire modelli per l'esperimento qPCR |
| Sistema PCR quantitativo in tempo reale | Bio-Rad | CFX96 | per il rilevamento RT-PCR |
| NRG1 umano ricombinante (rh-NRG1) | R& Sistemi D | 396-HB | Iniezione endovenosa di 5 mg/kg per attivare la via NRG1/ErbB4 nel modello ratto |
| RIPA Buffer | Meilunbio | MA0151 | Tampone di lisi con inibitori proteasi/fosfatasi per l'estrazione proteica |
| Giallo Cartofrio A (HSYA) | Chengdu Mansit Biotechnology Co., Ltd. | Must-160601 | Componente bioattivo da Carthamus tinctorius L., usato a 100 & mu; mol/L per il trattamento dei condrociti |
| Attrezzatura SDS-PAGE | Bio-Rad | Tetra Mini-PROTEANO | Separa le proteine in base al peso molecolare nel Western blot |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820A | per l'esperimento qPCR |
| TNF-α ELISA Kit | Biologia dello Shenggong | C5238 | Quantifica TNF-& alpha; livelli nei supernatanti cellulari tramite ELISA |
| Anticorpi ErbB4 totali | Proteintech | 19943-1-AP | Anticorpo primario per la rilevazione da Western blot dell'ErbB4 totale |
| Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) | Hitachi (menzionato per vescicole autofagiche) | H-7650 | Osserva vescicole autofaghe nei mitocondri a livello ultrastrutturale |
| Reagente Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | per l'estrazione di RNA |
| Tripsina-EDTA | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | Utilizzato per la digestione enzimatica della cartilagine articolare per isolare i condrociti |
| Collagenasi di tipo II (0,02%) | Worthington Biochemical | CLS-2 | Digerisce il tessuto cartilagineo per l'isolamento dei condrociti |
| Anticorpo β-catenina | Santa Cruz Biotecnologia | SC-7963 | Anticorpo di riferimento interno per la normalizzazione del Western blot |
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.