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Articolo di ricerca

Il granulo di Ganzhirong inibisce la gluconeogenesi epatica attraverso l'asse SIRT3-MPC1-PC/PDH nel diabete di tipo 2

409 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/69500

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12 dicembre 2025

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1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Research Center of Chinese Traditional Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Preventive Treatment Center, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo studio ha indagato se il granulo di Ganzhirong migliori l'iperglicemia nel diabete di tipo 2 inibindo la gluconeogenesi epatica tramite l'asse SIRT3-MPC1-PC/PDH.

Abstract

Il diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è un disturbo metabolico globale caratterizzato da resistenza all'insulina epatica e gluconeogenesi eccessiva. Il Granulo di Ganzhirong (GZRG), una formula di medicina tradizionale cinese, ha mostrato potenziale nella gestione del T2DM, ma i suoi meccanismi sottostanti, in particolare riguardo alla gluconeogenesi epatica, restano poco chiari. Questo studio ha indagato se GZRG migliora l'iperglicemia modulando la via di segnalazione mediata da SIRT3. Gli effetti antidiabetici del GZRG sono stati valutati nei topi T2DM indotti da diete ad alto contenuto di grassi (HFD) e nelle cellule HepG2 resistenti all'insulina indotte da acidi grassi liberi (FFA). Sono stati valutati parametri metabolici, tolleranza a glucosio e piruvato, sensibilità all'insulina e profili lipidici. I meccanismi molecolari sono stati esplorati attraverso la sovraespressione e il knockdown di SIRT3, esaminando l'espressione di proteine chiave (SIRT3, MPC1, PC, PDH-E2, PCK1 e G6Pase) nella via gluconeogenica. Il trattamento con GZRG ha significativamente migliorato l'iperglicemia, aumentato la sensibilità all'insulina e migliorato il metabolismo lipidico sia nei topi T2DM sia nelle cellule HepG2 resistenti all'insulina (IR). Attenuava la steatosi epatica e soppresso la gluconeogenesi. Meccanicamente, il GZRG ha ridimensionato l'espressione di SIRT3, portando a riduzioni concomitanti dei livelli di MPC1 e PC e a un aumento della PDH-E2. Questo cambiamento nell'espressione proteica ha reindirizzato il metabolismo del piruvato lontano dalla gluconeogenesi. La sovraespressione di SIRT3 invertì gli effetti soppressivi del GZRG sulla gluconeogenesi, mentre il knockdown di SIRT3 si sinergizzò con il GZRG. GZRG allevia il T2DM inibendo la gluconeogenesi epatica tramite l'asse SIRT3-MPC1-PC/PDH. Questi risultati chiariscono un nuovo meccanismo molecolare del GZRG e mettono in evidenza SIRT3 come potenziale bersaglio terapeutico per la gestione del T2DM.

Introduzione

Il diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è emerso come uno dei disturbi cronici metabolici più diffusi e debilitanti al mondo, rappresentando un notevole onere per la salute pubblica e l'economia 1,2. Caratterizzata da resistenza all'insulina (IR) e disfunzione progressiva delle cellule β pancreatiche, la T2DM è principalmente guidata da omeostasi di glucosio e lipidicompromessa 3,4. Tra i molteplici organi coinvolti nella regolazione del glucosio, il fegato svolge un ruolo centrale controllando la produzione endogena di glucosio tramite glicogenolisi egluconeogenesi 5. Una gluconeogenesi epatica eccessiva è un fattore importante che contribuisce all'iperglicemia a digiuno, un tratto distintivo della fisiopatologia di tipo 2DM, e rappresenta un bersaglio terapeutico cruciale per il ripristino dell'equilibrioglicemico 6.

Gli attuali agenti ipoglicemici — tra cuimetformina 7, tiazolidinedioni8, agonisti del recettore GLP-19 e inibitori SGLT210 — raggiungono il controllo glicemico attraverso meccanismi distinti, ma il loro uso a lungo termine è spesso limitato da effetti avversi, diminuzione dell'efficacia o intolleranza al tratto. Di conseguenza, cresce l'interesse per approcci terapeutici complementari o alternativi che possano colpire in modo sicuro ed efficace molteplici percorsi metabolici. La medicina tradizionale cinese (MTC), caratterizzata dalle sue proprietà farmacologiche multi-componente e multi-bersaglio, offre prospettive promettenti per la gestione di malattie metaboliche complesse come il T2DM 11,12,13,14,15. Diverse formulazioni classiche della MTC sono state riportate come efficaci per migliorare la resistenza all'insulina, migliorare il metabolismo lipidico e sopprimere la gluconeogenesi epatica attraverso meccanismi regolatoriintegrati 16,17.

Il granulo di ganzhirong (GZRG) è una formula standardizzata della MTC con una storia di utilizzo clinico nella gestione dei disturbi metabolici. GZRG è una formulazione erboristica composta da otto erbe medicinali. Sulla base delle nostre precedenti indagini fitochimiche e farmacologiche, è stata identificata una serie di composti bioattivi nel GZRG, tra cui ma non limitati a: acido salvianolico B, D-stachiosio, proantocianidini, acido ossalico viola, acido salvianolico A, acido salvianolico C, calicosina glucoside 7, 3′-metossipuerarina, 3′-idrossipuerina, apigenina-7-o-beta-d-pyrano, emodina-8-O-β-D-glucosio, crisofanolo-1-O-glucoside, crisofanolo-8-O-glucoside, puerarina, acido rosmarinonico, criptotanshinone, catechina, Ft-nyflavin, calicosina, Rhein, guanosina, acido oleico, emodina di aloe, formononetina, acido palmitico, crisofano, D-triptofano, danshensu, acido ferulico, manitolo, acido gallico e L-fenilalanina. Un vantaggio fondamentale della medicina tradizionale cinese (MTC) nella gestione del diabete di tipo 2 risiede nelle sue azioni sinergiche multi-componente e multi-bersaglio. Le decine di costituenti attivi contenuti nel GZRG probabilmente interagiscono con molteplici processi biologici - come le vie di segnalazione dell'insulina, il metabolismo del glicogeno e le risposte infiammatorie - producendo così un effetto di rete integrato che non può essere adeguatamente replicato da un singolo compostopurificato 18. Ricerche precedenti hanno dimostrato che il GZRG esercita effetti benefici sul metabolismo del glucosio e dei lipidi nei modellidiabetici 19; tuttavia, i meccanismi molecolari precisi alla base di questi effetti rimangono poco chiari. In particolare, non è ancora stato chiarito se GZRG eserciti le sue azioni antidiabetiche modulando la segnalazione gluconeogenica epatica.

La Sirtuina 3 (SIRT3), una deacetilasi mitocondriale dipendente da NAD⁺, è un regolatore fondamentale dell'omeostasi energeticacellulare 20. Deacetilando e attivando enzimi metabolici chiave, SIRT3 influenza la fosforilazione ossidativa mitocondriale, l'ossidazione degli acidi grassi e lagluconeogenesi 21. L'espressione aberrante di SIRT3 è stata implicata nella patogenesi della resistenza all'insulina, del fegato grasso e del T2DM22,23. Le evidenze indicano che la sovraespressione epatica di SIRT3 aumenta il flusso gluconeogeno modulando enzimi come il portatore mitocondriale di piruvato 1 (MPC1)24, piruvato carbossilasi (PC)25, piruvato deidrogenasi (PDH)26, fosfoenolpiruvato carbossichinasi (PCK1)27 e glucosio-6-fosfatasi (G6Pase)28. Pertanto, il controllo del metabolismo del piruvato mediato da SIRT3 rappresenta un nexus critico che collega la funzione mitocondriale e l'output di glucosio epatico, rendendo SIRT3 un bersaglio attraente per un intervento terapeutico nel T2DM.

Considerando gli effetti metabolici consolidati dei costituenti bioattivi nel GZRG, insieme al ruolo centrale di SIRT3 nell'omeostasi del glucosio epatico, si è ipotizzato che il GZRG migliori l'iperglicemia nel T2DM attraverso la modulazione della via gluconeogenica mediata da SIRT3. Per valutare questa ipotesi, gli effetti del GZRG sul metabolismo del glucosio e dei lipidi sono stati esaminati nei topi T2DM indotti da diete ad alto contenuto di grassi (HFD) e nelle cellule HepG2 resistenti all'insulina indotte dagli acidi grassi liberi (FFA). Ulteriori indagini hanno esaminato il coinvolgimento dell'asse di segnalazione SIRT3-MPC1-PC/PDH nella mediazione dell'effetto soppressore del GZRG sulla gluconeogenesi epatica. Questo studio mira a chiarire i meccanismi molecolari alla base dei benefici metabolici del GZRG e a fornire prove sperimentali a sostegno del suo potenziale terapeutico come modulatore multi-bersaglio per la gestione del T2DM.

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Protocollo

Il protocollo di studio sugli animali è stato approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Changchun (approvazione n. 2024396). Tutti gli esperimenti con animali sono stati condotti seguendo le linee guida nazionali e le leggi nazionali pertinenti sulla protezione degli animali.

Farmaci sperimentali
Il GZRG (batch numero 26210483) è stato fornito dall'Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese di Changchun (Jilin, Cina). I principali costituenti bioattivi e i parametri di controllo qualità del GZRG sono stati caratterizzati in uno studioprecedente 18.

Reagenti e anticorpi
I kit di analisi commerciali sono stati utilizzati per quantificare glucosio, glicogeno, acidi grassi non esterificati (NEFA), trigliceridi (TG), colesterolo totale (TC), colesterolo lipoproteico ad alta densità (HDL) e colesterolo LDL. Anche kit di immunoassorbimento legato agli enzimi (ELISA) per emoglobina glicosilata e insulina sono stati acquistati commercialmente. Sono stati inoltre acquistati commercialmente kit ELISA per piruvato deidrogenasi (PDH) e piruvato carbossilasi (PC). Per lavori su RNA e cDNA, sono stati acquisiti commercialmente il RNA Tissue/Cell Kit, il qPCR PreMix e il gDNA RT SuperMix. La trasfezione veniva eseguita utilizzando un reagente per la trasfezione. Anticorpi primari contro SIRT3 (RRID: AB_2837621), fosfoenolpiruvato carbossichinasi 1 (PCK1; RRID: AB_2838732), PDH-E2, glucosio-6-fosfatasi (G6Pase; RRID: AB_2845572), portatore mitocondriale di piruvato 1 (MPC1; RRID: AB_2836209), PC (RRID: AB_2836732), e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; RRID: AB_2833041) erano acquistati da un fornitore commerciale.

Topi e trattamenti
I maschi di topi C57BL/6J (5-6 settimane) sono stati ottenuti dalla Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. e mantenuti in condizioni standard (22 ± 2 °C, 50%-60% di umidità, ciclo chiaro/oscuro di 12 ore) con libero accesso a cibo e acqua. Dopo un periodo di acclimatazione di 1 settimana, sei topi sono stati designati casualmente come gruppo di controllo (Con) e nutriti con una dieta standard di chow food. I topi rimanenti hanno ricevuto una dieta ricca di grassi (HFD) per 12 settimane per indurre obesità e resistenza all'insulina.

Alla tredicesima settimana, topi con un livello di glucosio a digiuno (FBG) ≥ 11,1 mmol/L sono stati classificati come modelli di successo per il diabete mellito di tipo 2 (T2DM). Questi topi diabetici sono stati distribuiti casualmente in cinque gruppi sperimentali (n = 6 per gruppo): il gruppo modello HFD, il GZRG a bassa dose (L-GZRG, 3,2 g/kg/g), il GZRG a dose media (M-GZRG, 6,4 g/kg/g), il GZRG ad alta dose (H-GZRG, 12,8 g/kg/g) e la metformina (Met, 0,2 g/kg/g). GZRG e Met sono stati somministrati quotidianamente con gavage orale per 8 settimane. I gruppi modello Con e HFD ricevevano volumi equivalenti di acqua distillata. Al termine del periodo di trattamento, sono stati prelevati campioni di sangue e tessuto epatico da tutti i topi per analisi successive.

Test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (IPGTT), test di tolleranza al piruvato (PTT) e test di tolleranza all'insulina (ITT)
I test di tolleranza metabolica sono stati eseguiti tra le 6 e le 8 settimane dall'inizio dei trattamenti farmacologici. Per l'IPGTT e il PTT, i topi sono stati digiunati durante la notte (circa 16 ore). Per l'ITT, è stato implementato un periodo di digiuno più breve di 4 ore. Dopo il digiuno, i topi ricevevano un'iniezione intraperitoneale di glucosio (2 g/kg per IPGTT), piruvato di sodio (2 g/kg per PTT) o insulina normale umana (1 U/kg per ITT). I livelli di glucosio nel sangue sono stati misurati da campioni di sangue della vena caudal a 0 min, 30 min, 60 min, 90 min e 120 min dopo l'iniezione utilizzando un glucometro calibrato.

Analisi biochimica e saggi di attività enzimatica
I livelli di glicemia a digiuno (FBG), emoglobina A1c (HbA1c) e insulina (INS) sono stati determinati utilizzando kit di test commerciali secondo le istruzioni dei produttori. La valutazione del modello omeostatico della resistenza all'insulina (HOMA-IR) è stata calcolata utilizzando la formula:

HOMA-IR = [FBG (mmol/L) x INS (μU/mL)] / 22,5

I livelli circolanti di NEFA, TG, TC, LDL-C, HDL-C e le attività enzimatiche di PDH e PC nei tessuti epatici sono stati quantificati utilizzando i rispettivi kit commerciali.

Analisi istopatologica dei tessuti epatici
I tessuti epatici freschi sono stati fissati con formalina tamponata al 10% di neutro per 24 ore, seguiti dalla lavorazione standard per l'inglobamento della paraffina. Le sezioni (spesse 5 μm) sono state tagliate e colorate con Ematossilina ed Eosina (H&E) per una valutazione morfologica generale. Per la visualizzazione lipidica, alcuni campioni di fegato selezionati sono stati incorporati in un composto di Temperatura di Taglio Ottimale (OCT), congelati a scatto, crioseati e colorati con Oil Red O.

Coltura cellulare e trattamento
La linea cellulare dell'epatoma umano HepG2 è stata ottenuta dalla Collezione di Coltura Tipografica dell'Accademia Cinese delle Scienze. Le cellule sono state coltivate in Medium Essenziale Minimo (MEM) integrato con 25 mM di glucosio, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-estreptomicina. Le colture sono state mantenute a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2.

Per stabilire un modello in vitro di resistenza all'insulina (IR), le cellule con confluenza del 70%-80% sono state trattate per 24 ore con una miscela di acidi grassi liberi (FFA) composta da acido oleico e acido palmitico con un rapporto molare di 2:1, basandosi su un metodo precedentemente riportato con modificheminori 29. Dopo l'induzione con FFA, il mezzo di coltura è stato sostituito con un MEM fresco contenente la stessa miscela FFA insieme a varie concentrazioni di GZRG per un'incubazione aggiuntiva di 24 ore.

Test di vitalità cellulare (CCK-8)
Le cellule di HepG2 nella fase di crescita logaritmica sono state raccolte e seminate in piastre da 96 pozzi a una densità di 1 x 104 cellule per pozzo. I pozzi periferici furono riempiti con 100 μL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per minimizzare l'evaporazione. Dopo un'incubazione notturna per garantire l'aderenza, le cellule sono state trattate secondo il disegno sperimentale. Dopo il trattamento, sono stati aggiunti 10 μL di soluzione di CCK-8 a ciascun pozzo e le placche sono state incubate per 2 ore a 37 °C. L'assorbanza a 450 nm veniva misurata utilizzando un lettore di microplacche. La vitalità cellulare è stata calcolata come:

[(Come - Ab) / (Ac - Ab)] x 100%

dove As è l'assorbenza del campione, Ac è l'assorbenza del controllo (cellule non trattate) e Ab è l'assorbanza del vuoto (pozzi senza celle).

Trasfezione plasmidica nelle cellule HepG2
Il plasmide di sovraespressione SIRT3 (OV-SIRT3) e tre diversi plasmidi di RNA interferenti di piccole dimensioni mirate a SIRT3 (si-SIRT3-1#, si-SIRT3-2#, si-SIRT3-3#), insieme a un siRNA di controllo negativo (si-NC), sono stati costruiti da un fornitore. Le trasfezioni venivano eseguite utilizzando un reagente quando le cellule raggiungevano il 50%-60% di confluenza. Il complesso di trasfezione è stato preparato in condizioni sterili come segue: la soluzione A è stata generata diluendo 1 μg di DNA plasmidico in 250 μL di mezzo sirico ridotto con una miscelazione delicata. La soluzione B è stata preparata diluendo 2-3 μL di reagente di trasfezione in 250 μL di mezzo sirico ridotto, seguita da un'incubazione a temperatura ambiente per 5 minuti senza vortice. Le due soluzioni sono state combinate, mescolate delicatamente tramite pipetto e incubate a temperatura ambiente per 30 minuti per formare complessi DNA-lipidi. Per la trasfezione, 1 ora prima della procedura, è stato aspirato il mezzo di coltura cellulare, le cellule lavate con PBS e aggiunto 1 mL di mezzo siero ridotto (senza siero e senza antibiotici). Successivamente, 500 μL del complesso di trasfezione venivano aggiunti a goccia a ciascun pozzo e la piastra di coltura veniva delicatamente roteata per garantire l'omogeneità. Le cellule venivano incubate a 37 °C per 4-6 ore, dopo di che il mezzo veniva sostituito con un mezzo intero per mitigare la citotossicità. Successivamente, le cellule sono state coltivate per ulteriori 24-48 ore prima di ulteriori analisi. L'efficienza della trasfezione è stata valutata tramite PCR quantitativa (qPCR). L'RNA totale veniva estratto, trascritto inversamente in cDNA e amplificato utilizzando primer specifici per SIRT3 con rRNA 18S come controllo interno. I livelli relativi di espressione sono stati determinati tramite il metodo ΔΔCt e il costrutto siRNA più efficace è stato selezionato per esperimenti successivi sulla base di questi risultati.

Colorazione rosso olio per l'accumulo intracellulare di lipidi
Le cellule HepG2 nella fase di crescita logaritmica sono state seminate in piastre a 24 pozzi a una densità di 2 x 105 cellule per pozzo e indotte con un mezzo ad alto contenuto lipidico contenente 250 μM di acido oleico e 250 μM di acido palmitico per 48 ore per stabilire il modello di accumulo lipidico. Dopo i trattamenti, le cellule sono state lavate con PBS e fissate con formaldeide al 10% per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo un risciacquo con acqua distillata e una breve immersione nel 60% di isopropanolo, le cellule sono state colorate con una soluzione di lavoro di Olio Rosso O fresca (ottenuta mescolando i componenti A1 e A2 in un rapporto 3:2) per 10-15 minuti. Il colorante in eccesso veniva rimosso lavando con il 60% di isopropanolo, seguito da acqua distillata. I nuclei sono stati controcolorati con l'ematossilina di Mayer (1,0 g/L) per 1-2 minuti. Dopo un lavaggio finale, le cellule sono state montate con gelatina di glicerolo e le immagini sono state catturate con un microscopio lucico a un ingrandimento di 200x per una valutazione qualitativa delle gocce lipidiche.

Induzione della resistenza all'insulina e quantificazione del glucosio nelle cellule HepG2
Le cellule HepG2 sono state coltivate in piastre a 24 pozzi con una densità di semina di 2 x 105 cellule per pozzo per stabilire un modello in vitro di resistenza all'insulina. Dopo 24 ore di trattamento, il soprandanante della coltura è stato raccolto per ulteriori analisi. Per la misurazione del glucosio intracellulare, le sospensioni cellulari sono state centrifugate a 1000 x g per 10 minuti a 4 °C. Il soprantantante veniva scartato e la pellet cellulare veniva lavata una o due volte con un tampone isotonico, seguita dalla centrifugazione nelle stesse condizioni. Il pellet è stato poi omogeneizzato in 0,2-0,3 mL di mezzo di omogeneizzazione e sottoposto a interruzioni ultrasoniche in un bagno d'acqua ghiacciata utilizzando una sonda da 300 W, con impulsi di 3-5 secondi seguiti da intervalli di 30 secondi, ripetuti 3 volte o 5 volte. L'omogeneato risultante veniva analizzato direttamente senza ulteriori centrifugazioni. I livelli di glucosio sia nel supernatato della coltura che nell'omogenato cellulare sono stati misurati utilizzando un kit standardizzato per il test sul glucosio secondo le istruzioni del produttore per garantire una valutazione accurata e riproducibile delle risposte metaboliche.

Misurazione del contenuto cellulare di trigliceridi
Le cellule HepG2 venivano raccolte tramite centrifugazione a 1000 x g per 10 minuti, e il soprantantante veniva scartato. Il pellet cellulare è stato lavato 1 o 2 volte con un tampone fosfato isotonico (0,1 M, pH 7,0-7,4), seguito dalla centrifugazione nelle stesse condizioni. Dopo la rimozione del soprandante, il pellet è stato risospeso e omogeneizzato con 0,2-0,3 mL di etanolo assoluto. L'omogeneato è stato sottoposto a interruzioni ultrasoniche sul ghiaccio (300 W, 3-5 secondi per scoppio, intervalli di 30 secondi, ripetuto 3-5 volte). L'omogeneato risultante veniva utilizzato direttamente per analisi successive senza ulteriori centrifughe. Una piastra da 96 pozzi era allestita con pozzi vuoti, standard e campioni. Dopo una miscelazione approfondita, la piastra veniva incubata a 37 °C per 10 minuti, e l'assorbanza veniva misurata a 500 nm usando un lettore di microplacche. Il contenuto di trigliceridi nei campioni cellulari è stato calcolato sulla base di una curva standard derivata da diluizioni seriali degli standard di glicerolo.

Misurazione del contenuto totale di colesterolo
Le cellule HepG2 (5 x 106) sono state lisate in 1 mL di tampone di estrazione tramite interruzione ultrasonica sul ghiaccio. L'omogenato è stato centrifugato a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C, e il soprannatante è stato raccolto per un'analisi immediata. Una soluzione standard di stock di colesterolo (50 μmol/mL) fu preparata e diluita serialmente per generare una curva standard (0,3125 a 10 μmol/mL). Una soluzione cromogenica funzionante veniva preparata mescolando i reagenti uno, due e tre forniti nel kit di analisi del colesterolo, e preriscaldata a 37 °C. Campioni o standard venivano miscelati con la soluzione di lavoro, incubati a 37 °C per 30 minuti e l'assorbanza misurata a 500 nm. Il contenuto di colesterolo è stato calcolato sulla base della curva standard.

Colorazione immunofluorescenza
Le cellule coltivate su copertine sono state risciacquate con PBS gelato e fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo i lavaggi PBS, le cellule sono state permeabilizzate con lo 0,1% di Triton X-100 per 10 minuti e bloccate con il 5% di BSA a 4 °C durante la notte. Le cellule sono state poi incubate con un anticorpo anti-SIRT3 primario (diluizione 1:500) a 4 °C durante la notte. Dopo i lavaggi PBS, le cellule sono state incubate con un anticorpo secondario coniugato con fluorescenza (diluizione 1:2000) per 1 ora a temperatura ambiente al buio. I nuclei sono stati colorati con DAPI (0,5 μg/mL) per 10 minuti. I copricoli venivano montati su vetrini di vetro utilizzando un mezzo di montaggio anti-sfaccettatura e visualizzati al microscopio a fluorescenza.

Estrazione di RNA e PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)
L'RNA totale è stato estratto dalle cellule utilizzando il Kit di Tessuto/Cellule di RNA. Il DNA genomico è stato rimosso e il cDNA è stato sintetizzato utilizzando il kit RT gDNA. La PCR quantitativa veniva eseguita utilizzando il kit qPCR su un sistema di rilevamento PCR in tempo reale. Le sequenze di primer specifiche per geni sono fornite nella Tabella 1.

Analisi del western blot
Per l'estrazione proteica dai tessuti epatici, circa 50-200 mg di tessuto venivano pesati, tritati in una piastra di Petri e trasferiti in un omogeneizzatore. È stato aggiunto un tampone di lisi pre-raffreddato (RIPA buffer) integrato con inibitori di proteasi e fosfatasi per prevenire la degradazione delle proteine. L'omogeneizzazione è stata eseguita accuratamente sul ghiaccio per garantire una completa disgregazione tissutale, e l'omogenato è stato trasferito in un tubo centrifuga e incubato sul ghiaccio per 30 minuti per facilitare la solubilizzazione proteica. Successivamente, l'omogenato è stato centrifugato a 4 °C a 12.000 x g per 10-30 minuti, e il surnatante è stato accuratamente raccolto come estratto proteico totale, evitando la contaminazione dalla pellet. Per l'estrazione proteica cellulare, è stato aggiunto alle cellule un buffer di lisi pre-raffreddato (buffer RIPA contenente l'1% di Triton X-100 e inibitori della proteasi), seguito da incubazione su ghiaccio per 15-30 minuti per ottenere la lisi completa. La rottura delle celle era garantita tramite ripetuti raschiamenti con un raschiatore a celle o pipetting vigoroso. Il lisato veniva trasferito in un tubo centrifugo e centrifugato a 4 °C a 14.000 x g per 30 minuti, e il soprandanante veniva raccolto come estratto proteico totale. La concentrazione proteica è stata quantificata utilizzando un kit di analisi proteica BCA, e le aliquote sono state conservate a -80 °C per future analisi Western blot o utilizzate direttamente per la preparazione del campione. I campioni proteici sono stati denaturati nel tampone di Laemmli a 100 °C per 10 minuti, separati da SDS-PAGE e trasferiti sulle membrane PVDF. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% per 2 ore a temperatura ambiente e successivamente incubate con anticorpi primari specifici durante la notte a 4 °C. Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con HRP per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un substrato a chemiluminescenza potenziata (ECL). I segnali chemiluminescenti sono stati catturati e le intensità delle bande sono state quantificate tramite analisi densitometrica utilizzando il software ImageJ. Le macchie occidentali grezze sono fornite nel File Supplementare 1.

Analisi statistica
Tutti i dati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM). Confronti statistici tra due gruppi sono stati effettuati utilizzando un test t di Student non accoppiato. Per i confronti tra tre o più gruppi, è stata applicata l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA), seguita dal test post hoc di Tukey per confronti multipli. Tutte le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software GraphPad Prism (Versione 9.5.0). Un p-valore inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

Il GZRG ha migliorato la resistenza all'insulina e la gluconeogenesi nei topi T2DM indotti da HFD
Il modello murino del diabete mellito di tipo 2 (T2DM) indotto da HFD, caratterizzato da resistenza all'insulina, iperglicemia e dislipidemia, è ampiamente impiegato per indagare la patogenesi della malattia e valutare gli interventiterapeutici 30. Nel presente studio, è stato stabilito un modello T2DM indotto da HFD nei topi C57BL/6J per valutare l'efficacia e i meccanismi sottost...

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Discussione

Il presente studio dimostra che la GZRG esercita effetti antiiperglicemici e sensibilizzanti all'insulina sia in modelli in vivo che in vitro del T2DM, principalmente attraverso la soppressione della gluconeogenesi epatica tramite la modulazione dell'asse SIRT3-MPC1-PC/PDH. I dati sperimentali indicano che la somministrazione di GZRG ha attenuato l'iperglicemia a digiuno, migliorato la tolleranza al glucosio e all'insulina, ripristinato l'omeostasi lipidica e ridotto la...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dal Piano di Sviluppo Scientifico e Tecnologico della provincia di Jilin, Grant numero 20210101199JC, YDZJ202301ZYTS454.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
FastKing gDNA che dissipa RT SuperMix     Tiangen Biotech Co., Ltd. (Cina). KR118-02
Anticorpo glucosio-6-fosfatasi (G6Pase)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Cina)LJS-D-12610
Anticorpo gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Cina)LJS-T-0004
Kit ELISA per emoglobina glicosilata      Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (Cina).MM-0159M2
GZRGOspedale affiliato dell'Università di Medicina Cinese di Changchun (Jilin, Cina)26210483
Kit per il saggio del colesterolo ad alta densità di lipoproteine (HDL)Istituto di Bioingegneria Jiancheng di Nanchino (Cina)A112-1-1
Kit ELISA per insulinaJiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (Cina).MM-0579M2
Lipofectamina2000 Invitrogen, USA11668-019
Kit per il saggio del colesterolo a lipoproteine a bassa densità (LDL)Istituto di Bioingegneria Jiancheng di Nanchino (Cina)A113-1-1
Misurare i kit per il saggio del glucosioIstituto di Bioingegneria Jiancheng di Nanchino (Cina)F006-1-1
Vettore mitocondriale di piruvato 1 (MPC1) AnticorpoWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Cina)LJS-D-3852
Kit per analisi sugli acidi grassi non esterificati (NEFA)Istituto di Bioingegneria Jiancheng di Nanchino (Cina)A042-2-1
Anticorpo PCWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Cina)LJS-D-4364
Anticorpo PDH-E2Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Cina)LJS-D-14046
fosfoenolpiruvato carbossichinasi 1 (PCK1) AnticorpoWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Cina)LJS-D-6770
kit ELISA, piruvato carbossiliasi (PC), kit ELISA  Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Cina)LJS-160408H
Kit ELISA per piruvato deidrogenasi (PDH)ELISA & nbsp;  Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Cina)LJS-160300H
RNA Easy Fast Tissue/Cell Kit    Tiangen Biotech Co., Ltd. (Cina). DP451
Anticorpo SIRT3Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Cina)LJS-A-5135
Talent SYBR Green qPCR PreMix Tiangen Biotech Co., Ltd. (Cina). FP209-02
Kit per il colesterolo totale (TC) per il testIstituto di Bioingegneria Jiancheng di Nanchino (Cina)A110-1-1
Kit di analisi per trigliceridi (TG)Istituto di Bioingegneria Jiancheng di Nanchino (Cina)A111-1-1

Riferimenti

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